agentes antimicrobianos en productos vegetales frescos cortados

Bacteriocinas: agentes antimicrobianos en productos vegetales frescos
cortados
A. Allende1, B. Martínez2, M.V. Selma1, M.I. Gil1 y A. Rodríguez2
1
Grupo de Calidad, Seguridad y Bioactividad de Alimentos Vegetales, Departamento de
Ciencia y Tecnología de los Alimentos. CEBAS-CSIC, Apartado de Correos 164,
Espinardo, 30100, Murcia.
2
Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Apartado de Correos 85,
Villaviciosa, 33300, Asturias.
Palabras claves: Lactococcus lactis sbsp. lactis, Lactobacillus paraplantarum C23,
Listeria monocytogenes, lechuga, higienizantes, lavado.
Resumen
La industria de productos frescos cortados, se encuentra en una permanente
búsqueda de tratamientos alternativos al uso de higienizantes químicos, con el fin de
sustituirlos por otros más aceptados desde el punto de vista del consumidor. En el
presente trabajo se ha estudiado la capacidad de varias bacterias ácido lácticas,
productoras de bacteriocinas, de crecer y producir compuestos antimicrobianos en
un caldo de zumo de lechuga a distintas temperaturas. Se ha observado que todas las
cepas estudiadas (Lactococcus lactis sbsp. lactis IPLA 1064 y C270, Lactobacillus
plantarum y paraplantarum y Pediococcus acidilactici) fueron capaces de crecer en el
caldo vegetal a 4, 10 y 32 ºC. Sin embargo, sólo L. lactis IPLA 1064 fue capaz de
producir compuestos antimicrobianos a 4 y 10ºC, mientras que el resto de cepas sólo
inhibió el crecimiento de las bacterias indicadoras a 32 ºC. Además, se ha estudiado
la posible aplicación de bacteriocinas como agentes de lavado de hortalizas frescas
cortada, observándose reducciones iniciales tanto de la microflora normal como de
Listeria monocytogenes previamente inoculada.
INTRODUCCIÓN
La gran aceptación de las frutas y hortalizas frescas cortadas ha incrementado
considerablemente la cantidad de productos consumidos crudos, lo que también ha tenido
repercusión en el número de toxiinfecciones alimentarias causadas por este tipo de
alimentos (O’Sullivan y col., 2002). En particular, los microorganismos psicrotrofos
alterantes y patógenos son el principal motivo de preocupación, ya que poseen
mecanismos que les permiten crecer a temperaturas de refrigeración, necesarias en la
conservación de los productos vegetales con el fin de prolongar su vida útil. Además, los
consumidores son cada vez son más exigentes y buscan alimentos frescos y naturales, que
no estén sometidos a tratamientos muy severos ni contengan productos químicos
perjudiciales. El uso de bacterias ácido lácticas y/o sus metabolitos con actividad
antimicrobiana como agentes naturales en productos hortofrutícolas, ya ha sido descrita
por su potencial uso en la industria alimentaria (Breidt y Fleming, 1998). El propósito de
este estudio ha sido la evaluación de la capacidad de crecimiento y de producir sustancias
antimicrobianas de varias cepas de bacterias ácido lácticas (Lactococcus lactis sbsp. lactis
IPLA 1064 y C270, Lactobacillus plantarum y paraplantarum y Pediococcus
acidilactici) a distintas temperaturas, con el fin de determinar su posible adaptación a los
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productos vegetales refrigerados. Además, se ha estudiado la posible aplicación de las dos
de las bacteriocinas seleccionadas (coagulina y nisina) como agentes antimicrobianos en
el lavado de productos vegetales frescos cortados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas, medios y condiciones de cultivo.
Se utilizó un total de cinco bacterias ácido lácticas, capaces de producir
bacteriocinas (Tabla 1), así como tres cepas indicadoras (Listeria innocua, Lactobacillus
fermentum y Lactococcus lactis MG1614). Las cepas de Lactococcus fueron incubadas en
caldo M17 (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) suplementado con 0,5% de lactosa a
32 ºC, excepto L. lactis ssp. cremoris MG1614, para la cual se utilizó caldo M17
suplementado con glucosa al 0,5%. Las cepas de Pedioccocus y Lactobacillus se
incubaron en caldo MRS (Scharlau, Barcelona) a 32 ºC y el crecimiento de las cepas de
Listeria se llevó a cabo en caldo TSB (Scharlau, Barcelona) a 37 ºC.
Crecimiento de bacterias productoras de bacteriocinas en un sistema modelo.
Las cepas bacteriogénicas seleccionadas se crecieron en un caldo de zumo de
lechuga (Jacxsens y col., 2003) a 4, 10 y 32 ºC. Los datos experimentales de crecimiento
de cada cepa se ajustaron al modelo de Baranyi y col. (1993) para determinar la tasa de
crecimiento máxima de cada cepa. Además, se evaluó la capacidad de producción de
compuestos antimicrobianos mediante bioensayos antimicrobianos.
Bioensayos antimicrobianos.
La detección de la presencia y cuantificación de la actividad antimicrobiana de las
bacteriocinas de interés en los sobrenadantes de cultivos se realizó mediante la técnica de
difusión en agar (Cintas y col. 1995).
Ensayos en lechuga fresca cortada inoculada con L. monocytogenes y tratada con
bacteriocinas
En este estudio se utilizaron lechugas iceberg obtenidas de un supermercado local
(Asturias) y se procesaron siguiendo los pasos que normalmente se llevan a cabo en la
industria. Una vez las hojas externas fueron eliminadas y el producto cortado, los trozos
de lechuga se inocularon con un cocktail de L. monocytogenes (CECT 940, 4032, 5672)
(6.3 ± 0.17 log ufc/g) mediante la técnica de inmersión durante 30 min a 10 ºC. A
continuación se llevó a cabo los tratamientos con distintas soluciones de lavado: (1)
solución acuosa de nisina (50 AU/ml), (2) solución acuosa de coagulina (50 AU/ml), (3)
solución acuosa compuesta por la combinación de ambas bacteriocinas (1:1; vol/vol) y (4)
lavado con agua (control). La duración de los lavados fue de 1 min. La eficacia de los
distintos tratamientos se evaluó mediante recuento de los mesófilos aerobios totales
mediante las técnicas estándares de cultivo.
RESULTADOS
Todas las cepas fueron capaces de crecer en el caldo vegetal a las temperaturas
seleccionadas (Tabla 1). Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las
tasas de crecimiento máximas obtenidas para cada una de las cepas. A 4 ºC, las cepas de
Lb. paraplantarum y P. acidilactici fueron las cepas con mayor tasa de crecimiento,
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seguidas de Lb. plantarum y L. lactis IPLA 1064. Sin embargo, Lb. plantarum mostró la
mayor tasa de crecimiento a 32 ºC. Por otro lado, ninguna de las cepas seleccionadas fue
capaz de sintetizar compuestos antimicrobianos a temperaturas de refrigeración (4 y 10
ºC), exceptuando L. lactis IPLA 1064. Solo a la temperatura óptima de incubación (32
ºC), se observó actividad antimicrobiana en todas las cepas, siendo Lb. paraplantarum
C23 la cepa con mayor actividad inhibitoria (200 AU/ml).
Cuando la lechuga fresca cortada fue tratada con las distintas soluciones de
bacteriocinas, la carga de mesófilos totales se vio claramente reducida en todos los
tratamientos utilizados, incluido el agua. Sin embargo, los tratamientos con bacteriocinas
inhibieron el crecimiento de la microflora natural de una forma más efectiva,
observándose reducciones de hasta 2 unidades logarítmicas con el uso de una solución
acuosa de coagulina. Por otro lado, el lavado con agua sólo inhibió ligeramente el
crecimiento de L. monocytogenes, mientras que los tratamientos con bacterocinas
redujeron los recuentos en aproximadamente 1,5 unidades logarítmicas. Se puede concluir
que pese a que el lavado con agua reduce la microflora natural de la lechuga fresca
cortada, éste no es un tratamiento que pueda garantizar la seguridad del producto, ya que
no es eficaz en la reducción de patógenos, comúnmente presente en los productos
vegetales frescos cortados, como es el caso de L. monocytogenes (Sapers, 2003). Por ese
motivo, el uso de tratamientos higienizantes, como es el caso de las bacteriocinas,
suponen una alternativa con el fin de garantizar la reducir la carga de microorganismos
patógenos.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido financiada por el proyecto CICYT AGL 2004-03060.
Referencias
Baranyi, J., Roberts, T.A. y McClure, P. 1993. A non-autonomous different equation to
model bacterial growth. Food Microbiol, 10, 43–59.
Breidt, F. y Fleming, H.P. 1998. Modeling of the competitive growth of Listeria
monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth. Appl Environ Microbiol,
64, 3159–3165.
Cintas, L. M., Rodrıguez, J. M., Fernandez, M. F., Sletten, K., Nes, I. F., Hernandez, P. E.
y Holo, H. 1995. Isolation and characterization of pediocin L50, a new bacteriocin
from Pediococcus acidilactici with a broad inhibitory spectrum. Appl Environ
Microbiol, 61, 2643–2648.
Jacxsens, L., Devlieghere, F., Ragaert, P., Vanneste, E. y Debevere, J. 2003. Relation
between microbiological quality, metabolite production and sensory quality of
equilibrium modified atmosphere packaged fresh-cut produce. Int J Food Microbiol,
83, 263– 280.
O’Sullivan, L., Ross, R.P. y Hill, C. 2002. Potential of bacteriocin-producing lactic acid
bacteria for improvements in food safety and quality. Biochimie, 84, 593–604.
Sapers, G.M. 2003. Washing and sanitizing raw materials for minimally processed fruit
and vegetable products. En: Novak, J.S., Sapers, G.M., Juneja, V.K., (Eds),
Microbial safety of minimally processed foods, CRC Press. Boca Raton, London,
New York, Washington, D.C. 221–253.
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Tabla 1. Tasas de crecimiento máximo (µmax) y actividad antimicrobiana de las cepas
bacteriogénicas en caldo de zumo de lechuga incubadas a distintas temperaturas (4,
10 y 32 ºC).
Temperatura de incubación (ºC))
Cepa
32 ºC
10 ºC
4 ºC
µmax.
AU/mL
µmax.
AU/mL
µmax.
AU/mL
Lb. paraplantarum C23
0.066±0.001
200
0.064±0.001
0
0.105±0.002
0
Lb. plantarum LL441
0.040±0.003
0
0.054±0.015
0
0.171±0.001
0
L. lactis IPLA 1064
0.042±0.007
100
0.037±0.002
50
0.056±0.006
50
L. lactis C270
0.022±0.003
50
0.028±0.001
0
0.055±0.001
0
P. acidilactici 347
0.061±0.001
100
0.093±0.004
0
0.096±0.003
0
Reducciones logarítmicas
2.5
Mesófilos totales
Listeria
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Control Coagulina
Nisina
Cocktail
Tratamientos de lavado
Figura 1. Reducciones logarítmicas después de los lavados de lechuga iceberg fresca
cortada con agua y diferentes soluciones de bacteriocinas.
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