PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS POR MEDIO DE

Producción de mellizos idénticos
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PRODUCCION DE MELLIZOS IDENTICOS POR MEDIO DE MICROCIRUGIA
G.A. Palma & G. Brem
Introducción
La transferencia de embriones constituye para la hembra un progreso reproductivo equivalente a la
inseminación artificial para el macho. Per se permite aumentar el progreso genético a través del
incremento de la capacidad reproductiva de la hembra bovina. El desarrollo biotecnológico posterior, a
partir de la manipulación de los embriones recolectados, convirtió a esta técnica en una valiosa
herramienta para la producción de una cantidad supernumeraria de embriones y su retorno al ambiente
uterino. A partir de la década de 1980 se inició en Cambridge (WILLADSEN, 1981) una nueva fase con
el desarrollo de la microcirugía de embriones (MC) con la producción de mellizos idénticos. Esta
comprende la micromanipulación de embriones en estadio de mórula o blastocisto, obtenidos por
lavajes no quirúrgicos, con la división en 2 partes iguales (hemi-embriones). Sus particularidades la
convierten en una técnica interesante no solamente por aumentar la eficiencia reproductiva de un
individuo o factor determinado (por ejemplo, ausencia de cuernos en la raza Fleckvieh), sino también
por permitir la disponibilidad de animales idénticos en un programa de TE como así también para ser
empleados como modelo de investigación (BREM, 1986), cuadro 1, capítulo XX. Esta técnica fue
rápidamente adoptada y es aplicada actualmente en los programas convencionales de TE en países
con alta disponibilidad tecnológica (GRAY y col., 1991, KIPPAX y col., 1991; LANGE y col., 1991).
Existe sin embargo escasa información sobre la aplicabilidad de esta técnica en países bajo
condiciones extensivas de producción y con el empleo de receptoras de razas productoras de carne o
sus cruzas, cuya rusticidad las hace más adecuadas a esos sistemas de producción que las razas
lecheras, pero cuya capacidad de gestar y criar dos individuos constituye un interrogante. En el
presente capítulo se presentarán, junto con los resultados obtenidos en la micromanipulación
(rendimiento embrionario) y sobrevivencia de las mitades producidas, aquellos logrados a partir de
embriones bovinos de raza para producción de carne (Aberdeen Angus): tasa de parición después de
una transferencia uni- o bilateral de los hemi-embriones producidos (HE) a receptoras cruza Aberdeen
Angus x Criollo como así también el efecto de una gestación doble sobre la supervivencia y desarrollo
corporal de los terneros producidos.
Cuadro 1: Particularidades de los mellizos homocigotas producidos por medio de microcirugía frente a
los mellizos naturales (BREM, 1986).
Particularidades según el modelo de aplicación
- Disminución de la varianza
- Aumento del progreso genético en la línea madre-hija
- Aumento de la exactitud del valor genético
- Aumento de la eficacia de los núcleos de producción (MOET)
- Aumento del número de terneros (30-50%) producidos en un programa de TE
- Disminución de los costos de la TE
Particularidades metodológicas
Ventajas
Desventajas
- Libre elección de los padres
- No requiere estudios diagnósticos
- Permite planear el momento de la
producción de los mellizos
Biotecnología de la Reproducción
- El éxito de la manipulación no puede
ser previsto individualmente
- Requiere de personal calificado en
micromanipulación y transferencia
- La organización es compleja
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Técnicas microquirúrgicas
Existen diversas técnicas para dividir los embriones. La mayoría de ellas emplean micromanipuladores
(WILLIAMS y col., 1983; BREM y col., 1983; MASSIP y col., 1985; STEINMEYER, 1986; SEIKE y col.,
1989), otras no los requieren (PINTER y col., 1986). Los micromanipuladores se emplean en un número
que varía entre 2 (WILLIAMS y col., 1982; 1983) y 4 (BREM y col., 1983; 1987) y se colocan a ambos
lados de la lupa estereoscópica o del microscopio, foto 1.
Con un manipulador (foto 1, 5) es posible, con ayuda de una micropipeta de vidrio, fijar el embrión por
aspiración de la zona pelúcida. El micromanipulador del lado opuesto (foto 1, 3) está provisto del
instrumento cortante que puede ser una micropipeta de vidrio, un trozo de hoja de afeitar o un escalpelo
para cirugía ocular. Los manipuladores suplementarios (LEITZ, fotos 1, 2) pueden estar equipados con
microinstrumentos adicionales que permiten diferentes manipulaciones del embrión y las mitades como
así también su desplazamiento en la placa. Una microaguja permite seccionar o separar aquellas
mitades que no fueron divididas en su totalidad por el microescalpelo. Un brazo de mortero permite
desplazar los embriones denudados sin provocar traumatismos. Una micropipeta, en forma de gancho
permite abrir la zona pelúcida para extrar el embrión de su interior, fig. 1. Los instrumentos, con
excepción del microescalpelo, deben ser confeccionados a partir de finos tubos de vidrio con ayuda de
un estirador de pipetas (foto 5), este instrumento permite producir micropipetas con diámetro interno
deseado. La microfragua (foto 6) posibilita el corte exacto como así también las curvaturas de las
pipetas puede, además, redondear los bordes de las pipetas (de sostén) a fin de hacerlas atraumáticas.
La lijadora (foto 8) permite pulir los bordes de la pipeta en los ángulos deseados.
A pesar que la unidad de micromanipulación con un número de 4 micromanipuladores y 5
microinstrumentos (BREM, 1983) simplifica las maniobras operativas, su uso no se ha difundido porque
su costo aumenta de la misma forma con el creciente número de micromanipuladores sin mejorar los
resultados obtenidos con el empleo de dos micromanipuladores con dos microinstrumentos. Además es
más engorroso transportar y armar esta unidad de micromanipulación en un laboratorio ambulante de
TE. El éxito de la técnica dependerá fundamentalmente de la pericia del operador, razón por la cual no
existe un modelo, número de manipuladores o técnica de elección.
División
La división de los embriones se lleva a cabo con una lupa estereoscópica (120 x, foto 1) o un
microscopio invertido. Los embriones pueden seccionarse fijados con la pipeta de sostén (foto 2) o
adheridos al fondo de la placa. Para ello se coloca, en primer lugar, el embrión en un medio
conteniendo suero (20% SFB) y luego en el medio de micromanipulación sin suero. La carga eléctrica
del embrión, producida por las proteínas séricas, lo fijarán al fondo de la placa. En este caso se requiere
de mayor destreza que con la ayuda de una pipeta de sostén. Sin embargo no requiere del uso de
micropipetas. La microcirugía del embrión, fijado con la pipeta de sostén, con un microescalpelo de
cirugía ocular o un trozo de hoja de afeitar se lleva a cabo conformando un ángulo de 90 entre la pipeta
y el microescalpelo. En el caso de dividir el embrión con una micropipeta esta se dipone en el mismo
sentido que la pipeta de sostén (foto 3a). Una vez abierta la zona se extrae el embrión con ayuda de la
microaguja o del brazo de mortero. De esta forma el embrión puede ser dividido fuera de la zona
pelúcida (foto 3b). Una forma más simple es la división del embrión y de la zona pelúcida
simultáneamente. Esta variante se practica en aquellos casos en los que el embrión se adhiere al fondo
de la placa de Petri.
La manipulación de los embriones puede llevarse a cabo en PBS + 20% de SVE. De la misma forma
puede emplearse el mismo medio para el posterior cultivo de los embriones durante algunas horas, a fin
de evaluar la evolución de los mismos y establecer si son transferibles.
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1
2
3
5
4
Figura 1: Tipo y distribución de los microinstrumentos según BREM (1986)
1= pipeta de sujeción, 2= microescalpelo, 3= punta, 4= brazo de mortero, 5= gancho
1. Pipeta de sostén: los bordes de la punta son redondeados con ayuda de la microfragua (Fonbrune),
externo 110 µm, interno 25-30 µm
2. Microescalpelo: escalpelo para cirugía ocular o fragmento de hoja de afeitar con la punta afinada por
medio de lijado, en la punta 1-2 µm aproximadamente
3. Pipeta tipo estilete: 2 µm
4. Brazo de mortero: varilla de vidrio con una bolilla de vidrio en su extremo. Radio de la bolilla 20 m
aproximadamente.
5. Gancho: micropipeta de vidrio doblada, radio de 40 µm
Los microinstrumentos se confeccionan con fraguas, piedras de lijar y estiradores ad hoc (fotos 5,6 y 8).
Sin embargo es posible también hacerlas a mano (BREM, 1986), aspecto que debe ser considerado
particularmente en la aplicación de la técnica en razas cuyo valor agregado no compensen los costos.
Foto 1: Unidad de micromanipulación transportable con 4 micromanipuladores. 1: lupa estereoscópica
Wild M8, 2 = micromanipulador Leitz, 3: micromanipulador a control remoto AM3M, 4: control
remoto ST1, 5: micromanipulador mecánico, 6: jeringa con tubo de goma para la pipeta de
sostén (BREM, 1986).
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Foto 2: Mórula fijada con la pipeta de sostén. La zona pelúcida es abierta con un microcapilar recto
Foto 3a: División de la mórula fuera de la zona pelúcida
Foto 3b: División de la mórula fuera de la zona pelúcida
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Foto 4: Hemi-embriones después de la división. La pérdida de algunos blastómeros es inevitable
Factores que afectan el éxito de la división
La calidad de los embriones influye sobre el éxito de la división. Embriones de buena y muy buena
calidad alcanzan el 80% de sobrevivencia y el 25% de mellizos idénticos. Embriones de calidad media y
regular 43% y 15% respectivamente. De la misma forma se observó una sobrevivencia superior de los
HE de muy buena y buena calidad frente a los de calidad media y regular (tablas 1 y 2).
Foto 5: Estirador automático de pipetas, Bachofer, Alemania
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Tabla 1: Influencia de la calidad de los embriones de raza Fleckvieh sobre la gestación y producción
de mellizos (BREM, 1986)
Calidad del
embrión
Embriones
Fetos
Pares
muy buena
buena
mediana
regular
(n)
26
78
45
5
(n)
23
67
21
2
(%)
88,5
85,9
46,7
40,0
(n)
5
21
7
-
(%)
19,2
26,9
15,6
-
Σ
154
113
73,4
33
21,4
Tabla 2: Influencia de la calidad de hemi-embriones de raza Fleckvieh sobre la taza de preñez (BREM,
1986)
Calidad de las
mitades
muy buena
buena
mediana
regular
HE
(n)
21
116
98
73
308
Fetos
(n)
16
45
34
18
113
(%)
76,2
38,8
34,7
24,7
36,7
Estos resultados indican la necesidad de destinar a la micromanipulación sólo aquellos embriones de
buena a excelente calidad. La sección de los embriones provoca una pérdida celular embrionaria de
aproximadamente 10%, que segura-mente compromete la sobrevivencia de los embriones de calidad
inferior (McEVOY and SREENAN, 1990).
El rendimiento de un tratamiento superovulatorio, expresado en la relación de embriones
dividibles/recolectados es variable y depende de la calidad de la reacción superovulatoria. En buenas
respuestas superovulatorias es posible destinar más de la mitad de los embriones a la
micromanipulación (tabla 3). En este caso 64% de los embriones obtenidos fueron calificados como
dividibles. Sólo 39% conservó una calidad apropiada para ser transferido (13/33). Es interesante
señalar, sin embargo, que la división hubiese permitido aumentar la eficiencia de la TE, realizando 34
transferencias (26 HE + 8 E transferibles pero no divisibles), sin tener en cuenta los HE de calidad III,
que por razones experimentales no fueron incluidos en el ensayo.
Tabla 3: Número de cuerpos lúteos (CL), Embriones (E) y hemi-embriones (HE) producidos de raza
Aberdeen Angus (PALMA y col., 1991)
n
5
%
Vacas superovuladas
CL palpados
36
100
E obtenidos
33
91,6
100
E divididos
29
80,5
87,9
Pares de E producidos
13
36,1
61,9
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%
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Las tasas de preñez obtenidas con la transferencia de HE variaron con el desarrollo de la técnica y los
autores desde 16,6% (LAMBETH y col., 1983) hasta 79% (WILLADSEN y col., 1981). En general la tasa
media de preñez con la transferencia de HE varía entre 50-60% (LEIBO y RALL, 1987; TAKEDA y col.,
1987) y es necesario dividir 3-4 embriones para producir un par de mellizos idénticos (BREM, 1986). Es
decir que entre 25 y 30% de los pares de h-embriones transferidos darán lugar a mellizos idénticos. La
exactitud en la división microquirúrgica se verifica a través de la relación entre el tamaño de las mitades
obtenidas. Por esa razón fueron puestos a prueba diferentes microinstrumentos para dividir a los
embriones. Los resultados obtenidos con la microaguja no difirieron con los obtenidos con el
microescalpelo cuando fueron divididos embriones en estadio de mórula, (BREM, 1986; AGRAWALA,
1987). En el caso particular de los blastocistos no se observaron diferencias significativas entre ambos
microinstrumentos, pero si mayor simplicidad en la operación con el uso del microescalpelo y una
tendencia a obtener mayores tasas de preñez particularmente con blastocistos tempranos y medianos
(BREM, 1986, tabla 4). Las posibles razones serían que en los blastocistos (temprano y mediano) las
estructuras celulares (trofoblasto y masa celular) se pueden diferenciar con ayuda del microscopio. La
unión celular de las células de los blastocistos, mantiene a las mitades compactas después de la
división. Por último el microescalpelo es más filoso que la micropipeta, y permitiría un corte más preciso
del botón embrionario de los blastocistos.
Cuando la diferencia de tamaño, entre las mitades obtenidas, no existe (relación 50-50%) o ésta es muy
pequeña (relación 55-45%) es de esperar una óptima tasa de preñez (80%). Si la relación se desvía en
20% la preñez disminuye consecuente-mente (60-18%).
Tabla 4: Resultados obtenidos con la división de embriones por medio de microescalpelo (BREM,
1986)
Estadio
Embriones
n
n
Fetos
%
n
Pares
%
M
Bt
B
Be
102
27
19
6
62
28
19
4
61
104
100
67
12
13
7
1
12
48
37
17
Σ
154
113
73
33
21
La ausencia de zona pelúcida de los hemi-embriones no afecta la gestación (tabla 5, Agrawala, 1987).
Esta particularidad contribuyó a simplificar la técnica, de forma tal que en la actualidad éstos pueden ser
transferidos sin membrana pelúcida. Los 2 h-embriones obtenidos pueden ser transferidos en forma
bilateral y no quirúrgica a una receptora o separados: cada mitad al cuerno ipsilateral al ovario c/cuerpo
lúteo de una receptora. WILLADSEN y col. (1981) lograron una preñez de 79,0% después de la
transferencia bilateral de las 2 mitades de un embrión dividido, BREM (1986) alcanzó 96,3% con la
misma técnica. OZIL (1983) y LAMBETH y col. (1983) obtuvieron una marcada diferencia con la
transferencia de una mitad (45,4 y 16,6% respectivamente) y 2 mitades (72,7% y 62,5%
respectivamente) a una receptora.
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Foto 6: Microfragua de Fonbrune, Alemania
Tabla 5: Tasa de preñez obtenida con hemi-embriones transferidos con y sin zona pelúcida
Transferencia de
las mitades
Con zona pelúcida
Embriones
divididos
n
19
Sin zona pelúcida
10
20
8
40
Sin zona pelúcida
21
21
10
48
23
13
57
23
23
57
Con zona pelúcida
Receptoras
Receptoras
preñadas
n
36
n
18
%
50
46
Sin zona pelúcida
Autor
AGRAWALA,
1987
McEVOY y
SREENAN,
1990
KIPPAX y
col., 1991
Luego de la transferencia de los HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen Angus x Criolla
parieron 9 de 17 receptores (52,9%), de las cuales 7 fueron simples y 2 dobles (tabla 6). No se
encontraron diferencias en la parición entre diferentes estadios de los embriones divididos (Mc 7/8,
87,5%; B 4/5, 80.0%)
Tabla 6: Preñez después de la transferencia de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras Aberdeen
Angus x Criolla (PALMA y col., 1991)
HE
transferidos
(pares)
13
(n)
17
Receptoras
paridas
(n)
9
(52,9%)
Nacimientos
simples
dobles
(n)
(n)
7
2
(77,9%) (22,2%)
Teniendo en cuenta el tipo de transferencia, se observó una mayor tasa de preñez con la transferencia
bilateral (66,6%) frente a la unilateral (37,5%) aunque no fueron encontradas diferencias significativas
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(tabla 7). No se registraron nacimientos de mellizos después de la transferencia unilateral, posiblemente
debido al reducido número de pares transferidos. De los HE transferidos en forma bilateral el 22,2%
fueron mellizos homicigotas. En este trabajo no se alcanzaron los resultados logrados por WILLIAMS y
col. (1984); BREM (1986); AGRAWALA (1987); SEIKE (1989); quienes alcanzaron una tasa próxima al
30%. Se determinó, sin embargo, la presencia de 3 gestaciones dobles (33,3%), en la palpación rectal
realizada a los 70 días post transferencia. Por razones no determinadas una de ellas no llegó a término,
lo que motivó los resultados de parición mencionados.
Tabla 7: Tasa de parto con transferencia uni- o bilateral de HE de raza Aberdeen Angus a receptoras
Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col., 1991)
Tipo de
transferencia
(n)
Unilateral
8
Bilateral
9
Receptoras
total paridas
(n)
3
(37%)
6
(67%)
Pares de
mellizos
(n)
0
2
(22%)
El rendimiento de la división microquirúrgica, expresado a través de los terneros nacidos por embrión
empleado fue próximo a 1,0 (tabla 8).
Tabla 8: Eficacia de la producción de mellizos idénticos de raza Aberdeen Angus con receptoras
Aberdeen Angus x Criollo (PALMA y col, 1991)
Tipo de
transferencia
Embriones
transferidos
(n)
Terneros
obtenidos
(n)
ET/tn1
Unilateral
Bilateral
4
9
3
8
0,75
0,88
Total
13
11
0,86
1 ET/Tn= relación embrión empleado ternero nacido
LAROCCA y col. (1992) observaron un aumento significativo de la muerte embrionaria cuando las dos
mitades fueron transferidas en un solo cuerno uterino.
Nacimientos simples y dobles
No hubo problemas de parto ni retención de placenta en las receptoras AA x Criollo que parieron
mellizos (foto 7). El análisis de los pesos fue realizado en los terneros del mismo sexo, para no
introducir ese factor de variación en el bajo número de animales estudiados. Se estudió el peso inicial y
su evolución en 5 terneras nacidas de gestaciones simples y 4 productos de gestaciones dobles. El
peso al nacimiento fue de 26±3,9 Kg para las primeras y de 21±1 Kg para las segundas (p>0,05). La
falta de una diferencia estadística significativa entre los pesos medidos pudo estar dada por la variación
observada en los pesos de los animales nacidos de gestaciones simples. Por el contrario, la ganancia
de peso observada durante los primeros 5 meses de vida fue diferente (0,758±0,07 kg y 0,637 ± 0,025
kg/día para los nacimientos simples y dobles respectivamente, (p<0,01). Los pesos a una edad próxima
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al destete tendieron a ser diferentes (135±12,5 kg los simples y 118 ± 3,3 Kg los dobles) a favor de las
gestaciones simples, sin embargo se obtuvo una mayor cantidad total de Kg de ternero destetado (236
Kg. vs. 135) con las receptoras melliceras. Por otra parte, con respecto al peso individual, es de esperar
una recuperación del peso de los mellizos después del destete suficiente como para alcanzar a los
simples antes del año de edad (MAULEON y col., 1970).
Foto 7: Dos pares de mellizos idénticos de la raza Aberdeen Angus producidos por medio de
microcirugía (PALMA y col. 1991)
Foto 8: Piedra de lijar micropipetas y microescalpelos
Conclusiones
La producción de mellizos idénticos por medio de micromanipulación permite aumentar de 0,6-0,7 a 1,01,1 terneros por embrión obtenido, incrementando la eficacia de un programa de TE entre 30-40%,
disminuyendo sus costos y posibilitando la obtención de mellizos idénticos. En la actualidad, la
transferencia doble de embriones se efectúa en receptoras de gran tamaño (razas lecheras y de doble
propósito) que cuentan con mayor capacidad uterina para albergar dos gestaciones. Las receptoras
Aberdeen Angus x Criollo no respondieron de la misma forma a las características mencionadas,
pudiendo este hecho haber afectado los resultados obtenidos. Es necesario, en consecuencia, realizar
más estudios para aclarar la importancia de la receptora en el éxito de esta técnica. Las receptoras para
producción de carne, por otra parte, no incorporan problemas adicionales al no presentarse dificultades
de parto ni alterarse la crianza de los terneros.
Bibliografía
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Biotecnología de la Reproducción
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