Efecto del ANA en combinación con BAP y CIN en la organogénesis

Resumen: A-005
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Efecto del ANA en combinación con BAP y CIN
en la organogénesis in vitro de Arachis Burkartii (Leguminosae)
Kobelak, Andrea C. - Rey, Hebe Y. - Mroginski, Luis A.
Trabajo subsidiado parcialmente por el CONICET, CABBIO y la SGCyT (UNNE)
Facultad de Cs. Agrarias - IBONE - UNNE.
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Introducción
El género Arachis consta de 69 especies, entre las que se destaca por su importancia económica el maní, A. hypogaea L.
(Krapovickas y Gregory, 1994). Las especies silvestres son una fuente importante de genes para el mejoramiento del
maní (Krapovickas y Gregory, 1994; Gagliardi et al., 2002), y por ello existe un gran interés en la preservación de estas
especies. La conservación de germoplasma de maní se hace normalmente en bancos de semillas que requieren
renovación periódica de los mismos. El inconveniente reside en que algunas especies silvestres tienen semillas que
presentan corta viabilidad y se comportan como sub-ortodoxas (Gagliardi et al., 2002), y otras, como A. Burkartii,
pocas veces producen semillas en su hábitat natural y se propagan mayoritariamente de manera vegetativa. En estos
casos, el desarrollo de procedimientos que permitan la multiplicación in vitro es un auxiliar valioso y un suplemento de
conservación de recursos genéticos.
A. Burkartii, (2n=2x=20 cromosomas), es la única especie rizomatosa diploide y presenta un aislamiento genético
bastante notable, ya que no se pudo obtener ningún híbrido en los numerosos intentos realizados, ya sea con especies
de su misma sección o con especies de otras secciones (Gregory & Gregory, 1979).
En este trabajo se describe el procedimiento empleado para la obtención de plantas a partir de explantes foliares.
Materiales y Métodos
Las plantas empleadas fueron colectadas por Seijo et al. en Monte Caseros (Dpto. Monte Caseros), Corrientes
(ejemplar de herbario Seijo 2872 depositados en CTES).
Para el cultivo se utilizaron hojas jóvenes, las que fueron desinfestadas por inmersión en etanol 70% durante 30
segundos y seguidamente se sumergieron en una solución de NaOCl al 0,82% más una gota de Tween 20 durante 12
minutos. Posteriormente se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril. Se tomaron porciones de hojas de
aproximadamente 3 mm2, tanto de la parte central que incluye a la nervadura media como los bordes, y fueron
colocadas con la cara abaxial hacia abajo (un explante por tubo) sobre 3 cm3 de medio de cultivo en tubos de vidrio de
11 cm3 de capacidad.
El medio estaba compuesto por las sales minerales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962) (MS) con 3% de sacarosa
y 0.65% de Agar Sigma (A-1296), suplementado con ácido naftalenacético (ANA) en concentraciones de 0.1 y 1 mg/L;
bencilaminopurina (BAP) y cinetina (CIN) ambas en concentraciones de 1, 3 y 5 mg/L (Tabla 1). Para el subcultivo se
utilizó MS + ANA 0.1 mg/L + BAP 3 mg/L + CIN 3 mg/L. Posteriormente los vástagos obtenidos fueron transferidos a
MS + Carbón activado (CA) 0.2 g/L.
El pH de los medios fue ajustado a 5,8 con KOH y/o HCl antes de adicionar el agar. Los tubos fueron obturados con
papel de aluminio y esterilizados en autoclave a 0,101 MPa durante 20 minutos.
Cada tratamiento fue aplicado a 10-15 explantes. Una vez cultivados los explantes, los tubos fueron obturados con
Resinite AF 50 (Casco SACIF Bs. As.) y se incubaron en un cuarto climatizado a 27 ± 2ºC con un fotoperíodo de 14
hs y una intensidad lumínica de 116 µmol m-2 s-1. Se realizaron 3 repeticiones por experimento.
Tabla 1: Composición de los seis medios de cultivo utilizados
Medios de Cultivo
Composición del medio de cultivo
MS + ANA 0.1 + BAP 1 + CIN 1 mg/L
1
MS + ANA 0.1 + BAP 3+ CIN 3 mg/L
2
MS + ANA 0.1 + BAP 5 + CIN 5 mg/L
3
MS + ANA 1 + BAP 1 + CIN 1 mg/L
4
MS + ANA 1 + BAP 3+ CIN 3 mg/L
5
MS + ANA 1 + BAP 5 + CIN 5 mg/L
6
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Resultados y Discusión
Entre la segunda y tercer semana de cultivo comenzaron a formarse callos en el borde de los explantes, que inicialmente
eran friables y de color blanco-verdoso, para luego volverse compactos y de color verde con áreas marrones, a partir de
las cuales se originaron yemas. Los callos que no dieron lugar a la formación de yemas tenían color amarillo o marrón
claro, de consistencia friable algunos y compacto, otros. Posteriormente (durante la cuarta y quinta semana de cultivo)
los explantes dieron origen a yemas, en distintos medios de cultivo.
En la Fig. 1 puede observarse que los explantes produjeron callos en todos los medios de cultivo, en diferentes
porcentajes. Estos presentaron gran variedad de colores, texturas y tamaños, dependiendo del medio de cultivo
empleado. También hubo diferenciación de yemas en diferentes porcentajes dependiendo del medio de cultivo. Así, los
constituidos por MS + ANA 0,1 mg/L + BAP 3 mg/L + CIN 3 mg/L brindaron el 25% de callos con yemas, sin
embargo, al emplear un medio similar con concentraciones más elevadas de BAP y CIN (5 mg/L) el porcentaje de
explantes con yemas disminuyó a 15%. De igual manera se observó que al aumentar la concentración de ANA a 1 mg/L
en combinación con dosis más bajas de citocininas (BAP y CIN 1 mg/L) hubo una disminución en el porcentaje de
explantes que brindan yemas.
Fig. 1. Efecto de seis medios de cultivo en la inducción de múltiples yemas a partir de explantes de folíolos de
Arachis Burkartii a los 50 días de cultivo.
100
Respuestas (%)
75
50
25
0
ANA
B AP
C IN
0.1
1
1
0.1
3
3
0.1
5
5
1
1
1
1
3
3
EXPLA NTES CON CALLOS Y Y EMA S
1 mg /L
5
"
5
"
EXPLA NTES CON CA LLOS
La mayoría de las yemas en estos experimentos eran vigorosas, de color verde claro y tenían entre 2 y 5 mm de altura
(Fig. 2a). También se observó que, el número de yemas promedio por explante fue ligeramente mayor en los medios de
cultivo suplementados con MS + ANA 0.1 mg/L + BAP 3 mg/L + CIN 3 mg/L (8 yemas), mientras que en el medio
con MS + ANA 0.1 mg/L + BAP 5 mg/L + CIN 5 mg/L fue menor (3 yemas). Este efecto también fue observado por
Rey y Mroginski (1996) en Aeschynomene americana, donde al cultivar porciones de hojas e incrementar las
concentraciones de BAP de 1 a 3 mg/L, en combinación con ANA 0,1 mg/L, disminuyó el número y porcentaje de
explantes con yemas y/o vástagos.
Fig. 2.a) Múltiples yemas de Arachis Burkartii en MS + ANA 0.1 mg/L + BAP 3 mg/L + CIN 3 mg/L a los
50 días de cultivo. b) Vástago elongado subcultivado al medio de MS + CA 0.2 g/L para su enraizamiento.
c) Vástago enraizado en MS + CA 0.2 gr/L (respuestas a los 35 días). La barra vertical indica 5 mm.
a
b
c
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Además de las respuestas descriptas, hubo explantes oxidados (20%) o bien sin respuesta e infectados (10%).
Las yemas obtenidas en el cultivo primario con A. Burkartii, fueron subcultivadas al mismo medio fresco, con el
propósito de lograr su elongación. Los vástagos fueron subcultivados a MS + CA 0.2 g/L (Fig. 2b). Al cabo de 35 días
se pudo observar los vástagos enraizados (Fig. 2c). Las plantas obtenidas fueron exitosamente transferidas al suelo.
Los resultados hallados en este trabajo difieren de los obtenidos por McKently et al. (1991) con Arachis hypogaea y A.
glabrata, quienes observaron regeneración de yemas y vástagos utilizando ANA y BAP, porque en A. Burkartii, para
obtener yemas, es necesaria la adición de CIN además de ANA y BAP.
Conclusiones
1) Es posible diferenciar yemas y vástagos a partir del cultivo de explantes provenientes de folíolos de la primer hoja
desplegada de Arachis Burkartii, mediante el empleo de MS + ANA 0.1 mg/L + BAP 3 mg/L + CIN 3 mg/L.
2) Los vástagos obtenidos se enraízan en medios conteniendo MS + 0,2 g/L de CA.
3) Las plantas obtenidas se transfieren a suelo exitosamente.
Bibliografía
Gagliardi, R. F.; Pacheco G. P.; Valls J. F. M. & E. Mansur. 2002. Germplasm preservation of wild Arachis species and
axillary buds from in vitro plants. Biologia Plantarum 45: 353-357.
Gregory M. P.; Gregory W. C. 1979. Exotic germplasm of Arachis L. intraspecific hybrids. J. Hered. 70: 185-193
Krapovickas, A. y Gregory W. 1994. Taxonomía del género Arachis (Leguminosae). Bonplandia 8: 1-186.
McKently, A. H.; Moore, G. A.; Gardner, F. P. 1991. Regeneration of Peanut and Perennial Peanut from Cultured Leaf
Tissue. Crop Sci. 31:833-837.
Murashige, T.; Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Rey, H. Y. & Mroginski, L. A. 1996. Regeneration of plants from callus tissue of Aeschynomene spp. (Leguminosae).
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 45: 185-190.