1 Producción y evaluación de anticuerpos fluorescentes contra

Producción y evaluación de anticuerpos fluorescentes
contra Clostridium chauvoei y septicum
Cattáneo, M.1,2; Paris, N.2; Puentes, R.3; Assis, R.4; Bermúdez, J.1,2
Resumen
La mancha y la gangrena gaseosa son enfermedades infecciosas causadas por
bacterias del género Clostridium, principalmente C. chauvoei, C. septicum, C.
sordellii, C. perfringens y C. novyi. Son enfermedades presentes en el Uruguay,
afectando principalmente a bovinos y ovinos. El objetivo de este trabajo fue el
desarrollo de anticuerpos fluorescentes para el diagnóstico de C. chauvoei y C.
septicum. La producción de
anticuerpos contra estos patógenos se realizó en
conejos, luego se purificaron y se conjugaron. Se obtuvieron conjugados
fluorescentes contra C. chauvoei y C. septicum con alta sensibilidad y especificidad,
no observarse reacciones cruzadas entre ellos ni con anticuerpos contra otras
especies de clostridios.
Summary
Black leg and gas gangrene are infectious diseases caused by bacteria of the genus
Clostridium, mainly C. chauvoei, C septicum, C. sordellii, C. perfringens and C. novyi.
These diseases are present in cattle and sheep in Uruguay. The objective of this
study was the development of fluorescent antibodies for the diagnostic of C.
chauvoei and C. septicum. The antibodies were obtained in rabbits and then were
purified and conjugated. High sensitive and specific fluorescent antibodies were
obtained. No corss reactions were observed between these antibodies and with other
clostridial antibodies.
Introducción
La mancha y la Gangrena gaseosa son enfermedades producidas por bacterias del
género Clostridium, son de distribución mundial y están presentes en nuestro país.
La mancha o carbunco sintomático es una enfermedad producida por Clostridium
chauvoei (C. chauvoei) y se presenta en bovinos de 6 meses a 2 años de edad con
una morbilidad de 5-25 % y una mortalidad del 100 %. Es una infección endógena,
es decir que la bacteria está presente en la musculatura del animal previamente a
1
Área de Bacteriología. Departamento de Microbiología. Facultad de Veterinaria. UdelaR. Uruguay.
[email protected]
2
Laboratorio de Investigación y desarrollo . CCA. Laboratorios Santa Elena. Uruguay.
3
Área de Inmunología. Departamento de Microbiología. Facultad de Veterinaria. UdelaR.Uruguay.
4
LaboratorioNacionalAgropecuario. LANAGRO. Minas Gerais. Brasil.
1
que se desencadene la enfermedad. Una vez que se dan las condiciones la bacteria
se multiplica en los músculos produciendo toxinas que causan una miositis
hemorrágica grave (Sterne, 1978; Lobato, 1997; Riet, 1999).La gangrena gaseosa o
edema maligno ocurre por contaminación de heridas, siendo C. septicum, C.
chauvoei, C.sordellii, C. perfringens y C. novyitipoB, los principales agentes
causantes de la enfermedad (Sterne, 1978). Las heridas de esquila, descole,
castración e inyecciones son la puerta de entrada más común y el lugar donde se
crean las condiciones adecuadas de anaerobiosis para que la bacteria comience a
reproducirse y a producir toxinas, llevando posteriormente a la muerte del animal
(Lobato, 1997; Riet, 1999).El diagnóstico de laboratorio se basa en el aislamiento del
agente,
tinción
de
Gram,
tinción
de
esporas,
pruebas
bioquímicas,
inmunofluorescencia directa, inmunohistoquímica, PCR y titulación de toxinas por la
técnica de DLM en ratones (Batty, 1963; Wood, 1965; Pinto, 1992; Takeuchi, 1997;
Kojima, 2001).
Objetivo
El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de anticuerpos fluorescentes anti C.
chauvoei y C. septicum para su utilización en el diagnóstico de laboratorio.
Materiales y método
Para la obtención de los sueros hiperinmunes se utilizaron las cepas de C. chauvoei
Nº 10092 de ATCC (American Type Culture Collection) de USA y C. septicum 61.10
del Instituto Pasteur de Francia. Ambas cepas se cultivaron en medios que
contenían peptona bacteriológica, infusión cerebro corazón y glucosa. Se incubaron
a 37 ºC y cuando llegaron a una densidad óptica de 1,5 a 600 nm se inactivo con
formol al 0,8%. Se realizaron controles de inocuidad y se adyuvaron ambos
antígenos por separado con hidróxido de aluminio. Se inocularon dos conejos Neo
Zelandeses por cada antígeno en forma subcutánea el volumen de 1 mL. Las
vacunaciones se realizaron el día O, 14, 28 y 56. Los animales fueron sangrados el
día 0 y a los 56 días para medir el título de anticuerpos por el método de aglutinación
en placa según Jain 1987. 15 días luego de la última inoculación los animales fueron
sangrados por punción de la vena de la oreja y los sueros obtenidos se conservaron
a -20 ºC hasta su procesamiento. La purificación de los anticuerpos se realizó
utilizando una columna de Proteina A HyperDF de 1 mL de volumen (AcroSep
Chromatography Columns, PallCorporation, USA). Las muestras fueron observadas
por espectrofotómetro a 280 nm, se graficaron y tomaron las muestras eluidas que
2
corresponden al segundo pico para concentrar. La concentración se realizó
utilizando centricones de corte de 30 kDa (Pall Corporation, USA)). La muestra de
C. chauvoei fue concentrada x2 y C. septicum x3 quedando un volumen final de 1
mL en ambos casos. A estas muestras se le determinó los mg de proteínas por mL
por el método de Bradford a595 nm. Las inmunoglobulinas de C. chauvoei se
conjugaron con 25 ug/mg de proteína con isotiocianato de fluoresceina (AMRESCO,
USA)
y para C. septicum con 50 ug/mg de isotiocianato de rhodamine
B(AMRESCO, USA). Ambos conjugados fueron evaluados por la técnica de
inmunofluorescencia directa según Batty (1963) en cultivos e improntas de tejido de
C. septicum y C. chauvoei para determinar la sensibilidad utilizando diluciones
crecientes de cada conjugado entre ½ y 1/3200. Se seleccionó la mayor dilución de
los conjugados que produjo fluorescencia de los mircroorganismos con mínima
coloración de fondo. Luego de conocer la dilución de trabajo los conjugados se
enfrentaron a cultivos e improntas de tejido de 3 cepas de C. chauvoei (ATCC-10092
y dos aislamientos de campo) y 3 de C. septicum (Instituto Pasteur, 61.10 y dos
aislamientos de campo), los aislamientos pertenecen al Departamento de Ciencias
Microbiológicas. Posteriormente se evaluó la especificidad enfrentando los
conjugados a cultivos e improntas de tejido de C. chauvoei (ATCC- 10092), C.
septicum (ATCC-12464), C. perfringens (ATCC-3624), C. sordellii (ATCC-9714), C.
novyi tipo B (CUB-APHIS, USA, IRP 307) y C. haemolyticium (CUB-APHIS, USA,
IRP 315).
Resultados
Los títulos aglutinantes obtenidos para C. chauvoei fueron 1/50 y 1/8000 para el día
0 y 57 respectivamente y de 1/50 y 1/4000 para C. septicum. Los títulos luego de la
purificación fueron de 4000 y 2000 para C. chauvoei y septicum. Se obtuvieron
resultados positivos de los conjugados hasta una dilución de 1/800 y 1/400 C.
chauvoei y septicum respectivamente. No se obtuvieron reacciones cruzadas en los
cultivos e improntas de tejidos entre los conjugados evaluados ni no con otras
especies de clostridios utilizadas.
Discusión y conclusión
Se obtuvieron anticuerpos fluorescentes contra C. chauvoei y septicum con alta
sensibilidad y especificidad, al no observarse reacciones cruzadas entre ellos ni con
otras especies de clostridios. La técnica de purificación por columna de Proteína A y
concentración por centricom resulto ser rápida y satisfactoria para la elaboración de
3
este tipo de conjugados en comparación con las técnicas de sulfato de amonio y
ácido caprílico/sulfato de amonio utilizadas por otros autores para la producción de
este tipo de anticuerpos (Batty, 1963; Pinto, 1992;Assis, 2001) Los altos títulos
aglutinantes obtenidos luego de la vacunación de los animales fueron superiores a
los encontrados por Batty, 1963, Pinto, 1992 y Assis, 2001 lo que puede explicar la
mayor sensibilidad del conjugado. Los títulos aglutinantes bajaron luego de la
purificación lo que pudo deberse a la pérdida de estos por el pequeño volumen de la
columna (1 mL) y/o la alta cantidad de anticuerpos presentes en el suero, paso que
hay que estandarizar. El costo de estos reactivos son muy altos y su elaboración
demanda mucho trabajo, pero tiene la ventaja de que estos se pueden conservar a 20 ºC durante tiempos prolongados.
Referencias bibliográficas
Assis, R.A; Lobato, F.C.F.; Dias, L.D. et al. (2001) Producción y evaluación de
conjugados fluorescentes para el diagnóstico de mancha y gangrena gaseosa. Rev.
Med. Vet., v.82, p.68-70.
Batty. I. y Walker, P. (1963) Differentiation of Clostridium septicum and Clostridium
chauvoei by use of fluorescent labelled antibodies. J. Pathol. Bacteriol. 85, 517-520.
Harlow, E. and Lane, D. (1988).Antibodies.A laboratory Manual.Cold Spring Harbor
Laboratory.1st edition.
Kojima, A.; Uchida, I.; Sekisaki, T. et al. (2001) Rapid detection and identification of
Clostridium chauvoei by PCR based on flageline gene sequence. Vet. Microbiol.,
v.78, p. 363-371.
Lobato, F. y Almeida, A. (1997). Clostridioses. Rev. Bras. Reprod. Animal 21, 61-69.
Pinto. M y Abreu. V. (1992). Comparacao de técnicas para preparo de conjugados
anti
Clostridium
septicum
e
anti-Clostridiumchauvoei.
Arq.
Bras.
Med.Vet.Zoot.44,513-520.
Riet – Correa, F. (1999). Doenças de rumiantes y equinos. Doenças bacterianas.
Carbunco sintomático y edema maligno. Págs. 177-178 y 197-198.
Sterne, M. (1978) Clostidiospatógenos.Editorial ACRIBA. Zaragoza. España.
Wood. B. T.; Thompson. S..H. y Goldstein. G (1965). Fluorescent antibody staining.
III. Preparation of fluorescein-isothiocyanate-labelled antibodies. J.lmm. 95, 225-229.
Takeuchi, S.; Hashizume, N.; Kinoshita, T. et al. (1997) Detection of Clostridium
septicumhemolysin gene by polymerase chain reaction.J. Vet. Med. Sci., v.59, p.853855.
4