Alteraciones moleculares en las metástasis ganglionares y sus

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231.807
■ ARTÍCULOS ORIGINALES
Alteraciones moleculares en las metástasis
ganglionares y sus tumores primarios
en los carcinomas epidermoides de laringe
Juan Pablo Rodrigoa, Rubén Cabanillasa, María Dolores Chiaraa, Juana García Pedreroa, Manuel Florentino Fresnob y Carlos Suárez Nietoa
Servicio de Otorrinolaringología. Hospital Universitario Central de Asturias. Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias
(IUOPA). Universidad de Oviedo. Oviedo. Asturias. España.
b
Servicio de Anatomía Patológica. Hospital Universitario Central de Asturias. Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias
(IUOPA). Universidad de Oviedo. Oviedo. Asturias. España.
a
Introducción y objetivos: Presentar alteraciones moleculares sucesivas determina la progresión tumoral. Durante
esta progresión, el desarrollo de metástasis ganglionares es
uno de los determinantes más importantes del pronóstico
de los carcinomas de laringe. En este estudio se analizará si
en estos carcinomas las alteraciones moleculares en las metástasis ganglionares difieren de las de su correspondiente
tumor primario.
Material y método: Se estudian muestras apareadas de tumor y metástasis ganglionares de 51 pacientes con carcinoma epidermoide supraglótico. Se determina, mediante inmunohistoquímica, la expresión de las proteínas p53,
E-cadherina, anexina A2, FAK, y HIF-1␣, y además la actividad apoptótica (mediante la expresión de caspasa-3 activada) y el grado de vascularización (identificando los vasos por la expresión del antígeno CD34).
Resultados: Se apreció una marcada correlación en la expresión de las proteínas estudiadas en las metástasis y su
correspondiente tumor primario, con la excepción de la expresión de HIF-1␣ y el grado de vascularización tumoral.
Conclusiones: La mayoría de las alteraciones moleculares
en las metástasis ganglionares ya están presentes en el tumor primario, lo que indica que estas alteraciones suceden
de forma temprana en la carcinogénesis.
Palabras clave: Carcinoma epidermoide. Laringe. Metástasis. Marcadores moleculares.
Molecular Alterations in Nodal Metastases and
its Primary Tumors in Squamous Cell Carcinomas
of the Larynx
Introduction and objectives: The successive acquisition of
molecular alterations determines tumour progression. During this progression, the development of nodal metastases
is one of the most important prognostic factors in laryngeal
squamous cell carcinomas. The aim of this study is to analyze if, in these carcinomas, the molecular alterations in the
nodal metastases are different from those present in the primary tumour.
Material and method: Paired samples of primary tumour
and nodal metastases from 51 patients with squamous cell
carcinoma of the supraglottic larynx were studied. Using
immunohistochemistry, we analyzed the expression of p53,
E-cadherin, FAK, annexin A2 and HIF-1␣ proteins. In addition, the apoptotic index (measuring activated caspase-3)
and the degree of vascularization (identified by CD34 antigen expression) were also studied.
Results: A close correlation in the expression of the proteins
studied was observed in the nodal metastases and the corresponding primary tumour, with the exception of HIF-1␣
expression and the degree of vascularization.
Conclusions: Most of the molecular alterations in the nodal
metastases are already present in the primary tumour, suggesting that these alterations are early events in carcinogenesis.
Key words: Squamous cell carcinoma. Larynx. Metastasis.
Molecular markers.
Este estudio fue financiado con ayudas a la investigación del FIS
(PI03/0463 y PI04/1537). J.P. Rodrigo es beneficiario del Programa de
Intensificación de la Actividad Investigadora del Instituto de Salud
Carlos III. El IUOPA está financiado por la Obra Social de Cajastur.
Correspondencia: Dr. J.P. Rodrigo.
Servicio de Otorrinolaringología.
Hospital Universitario Central de Asturias.
Celestino Villamil, s/n. 33006 Oviedo. Asturias. España.
Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 20-11-2007.
Aceptado para su publicación el 22-11-2007.
114 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(3):114-9
INTRODUCCIÓN
La principal vía de diseminación de los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello son las metástasis a los ganglios linfáticos regionales. Además, la presencia de enfermedad metastásica en los ganglios cervicales es el factor
más importante que determina el tratamiento y el pronóstico de estos pacientes1. Por tanto, es fundamental conocer
los mecanismos implicados en el desarrollo de estas metástasis si queremos avanzar en el control de la enfermedad.
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Rodrigo JP et al. Alteraciones moleculares en metástasis
El proceso de metástasis es complejo y necesita una serie
de pasos secuenciales con múltiples interacciones entre el
tumor y el tejido huésped: una célula o un grupo de células deben abandonar el tumor primario, migrar a través de
los tejidos adyacentes, invadir los vasos linfáticos o sanguíneos, sobrevivir en ellos, y ser capaces de instalarse y proliferar en los ganglios linfáticos u órganos a distancia2,3.
Para llevar a cabo estos pasos, las células tumorales deben
poseer una serie de características adquiridas a través de
sucesivas alteraciones genéticas. Pero también hay que tener en cuenta la interacción con las células vecinas y estructuras adyacentes.
En el modelo convencional de metástasis, el potencial
metastásico se presentaría de forma tardía en la carcinogénesis como resultado de alteraciones selectivas en un pequeño grupo de células dentro de la masa tumoral4. Sin
embargo, los estudios de expresión genética han mostrado
que las metástasis muestran perfiles genéticos similares al
de los tumores primarios de los que proceden, lo que indica que el potencial metastásico se adquiere precozmente
durante la carcinogénesis y es mantenido durante la progresión tumoral5. Más aún, se ha demostrado que las metástasis pueden predecirse por los patrones de expresión
genética presentes en el tumor primario6,7.
Recientemente se ha descrito que también las metástasis
ganglionares de los carcinomas epidermoides de cabeza y
cuello muestran perfiles de expresión genética muy similares a los del tumor primario8. Esto indicaría que, además de
permitir la diseminación metastásica, los genes expresados
en el tumor primario también tienen un papel importante en
la supervivencia y la proliferación de las células en la metástasis. Es de esperar, por tanto, que los genes implicados en la
carcinogénesis y las metástasis controlen procesos como la
supervivencia, la proliferación, la adhesión y la migración
celulares. La expresión alterada de estos genes se puede estudiar por su reflejo en la expresión de las proteínas cuya
síntesis controlan. En este estudio analizamos la expresión
de varias proteínas implicadas en los procesos potencialmente relacionados con metástasis en un grupo de metástasis ganglionares y sus correspondientes tumores primarios
para determinar si hay correlación entre ambas. Las proteínas seleccionadas son p53 (relacionada con el control de la
proliferación y la supervivencia celular), E-cadherina (proteína clave en la adhesión celular), FAK (cinasa de adhesión
focal, que permite la supervivencia independiente de anclaje a la matriz extracelular), HIF-1␣ (subunidad 1␣ del factor
inducible por hipoxia, que participa en la adaptación de las
células a esta situación) y anexina A2 (proteína relacionada
con la diferenciación y la adhesión celulares). Además, se
analizan dos fenómenos que tienen lugar durante la carcinogénesis y son importantes en la diseminación metastásica:
la angiogénesis y la apoptosis.
MATERIAL Y MÉTODO
Pacientes
Se estudian las muestras de 51 pacientes con carcinoma
epidermoide de laringe supraglótica, que presentaban me-
tástasis ganglionares cervicales, intervenidos entre 1988 y
1994. En todos los casos se trataba de tumores primarios
que no habían recibido tratamiento previamente. Los pacientes fueron intervenidos con intención curativa, mediante laringectomía supraglótica o laringectomía total,
más vaciamiento ganglionar bilateral en todos ellos. Todos
los pacientes eran varones, con una media de edad de 63
(intervalo, 46-81) años. Todos ellos, excepto uno, tenían antecedentes de consumo habitual de tabaco, y 44, además de
alcohol. Los pacientes fueron estadificados según la clasificación de la Unión Internacional Contra el Cáncer (5.ª edición). Las características clinicopatológicas de los pacientes
se muestran en la tabla I. Se obtuvieron muestras del tumor
primario y las correspondientes metástasis ganglionares de
los archivos de anatomía patológica.
Estudio inmunohistoquímico
Las muestras tumorales incluidas en parafina fueron
cortadas en secciones de 4 ␮m y adheridas a portas siliconados (DakoCytomation). Las secciones fueron desparafinadas e hidratadas de forma convencional. La recuperación antigénica se realizó calentando las secciones en
tampón citrato 10 min en una olla a presión. Las reacciones
de tinción se realizaron a temperatura ambiente de forma
automatizada en una estación de trabajo TechMate 1000
(BioTEK Solutions) en una sola sesión para cada anticuerpo. Las muestras estuvieron 15 min en un medio bloqueante (peróxido de hidrógeno al 3 %) y posteriormente
reaccionaron con el anticuerpo primario a temperatura ambiente. Los anticuerpos empleados se muestran en la tabla II. La inmunodetección se realizó con el sistema Envision (Envision Plus, Dako) empleando como cromógeno
diaminobenzidina. Una tinción con hematoxilina durante
1 min fue el paso final. Tras la tinción, las secciones fueron
deshidratadas y montadas con un cubreobjetos empleando
un medio estándar. Los controles positivos consistieron en
muestras de tejidos que se sabía expresaban las proteínas
Tabla I. Características clinicopatológicas de los casos estudiados
Característica
Pacientes (n)
Clasificación pT
T1
T2
T3
T4
4
15
22
10
Clasificación pN
N1
N2
N3
19
20
12
Estadio
III
IV
16
35
Grado histológico
Bien diferenciado
Moderadamente diferenciado
Pobremente diferenciado
18
19
14
Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(3):114-9
115
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Rodrigo JP et al. Alteraciones moleculares en metástasis
Tabla II. Anticuerpos empleados en el estudio inmunohistoquímico
Anticuerpo
Clon
Compañía
Dilución
p53
DO-7
DakoCytomation
1:200
HIF-1␣
54
Becton-Dickinson
1:50
E-cadherina
36
Becton-Dickinson
1:2.000
FAK
4.47
Upstate Biotechnology
1:250
Anexina A2
–
Zymed
1:400
Caspasa-3
5A1
Cell Signaling Technology
1:200
CD34
QBEnd/10
Novocastra
1:50
de estudio. También se incluyeron controles negativos con
omisión del anticuerpo primario.
Dos de los autores (JPR, RC) estudiaron las preparaciones al azar, sin datos clínicos. Los tumores primarios y las
metástasis fueron analizados en diferentes sesiones. En todos los casos, para hacer las comparaciones entre el tumor
primario y la metástasis, se realizó una dicotomización en
el grado de expresión de las proteínas analizadas, según estudios y análisis estadísticos previos. En el caso de p53, se
cuantificó el número de células tumorales con tinción nuclear a una magnificación intermedia (×100), los tumores se
clasificaron como positivos, de acuerdo con estudios previos9,10, cuando había más de 10 % de células tumorales teñidas. HIF-1␣ se cuantificó de forma similar (porcentaje de
células tumorales con tinción nuclear); también se estableció el punto de corte en el 10 % de células teñidas11. Para la
E-cadherina, a cada muestra se le asignó una puntuación
según la intensidad de la tinción de membrana (0-4) y el
porcentaje de células tumorales teñidas (0 %-100 %). Se
multiplicaron los dos componentes para obtener una puntuación total entre 0 y 400; se consideraron positivos los casos con puntuación por encima de la media y negativos los
casos con puntuación por debajo12. Se cuantificó la anexina
A2 asignando una puntuación solamente por el porcentaje
de células tumorales con tinción membranosa (0 %-100 %),
dado que la mayoría de las células, cuando eran positivas,
exhibían una tinción intensa. En este caso se consideraron
positivos los casos con puntuación por encima de la mediana. En el caso de FAK, como todas las células tumorales
de cada muestra mostraban una tinción similar, los tumores se clasificaron según la intensidad de la tinción citoplasmática en tres categorías: tinción débil, tinción moderada y tinción fuerte; con fines estadísticos se agruparon
los casos con tinción moderada y fuerte como positivos y
los de tinción débil como negativos12. La determinación de
la tasa de apoptosis se realizó mediante el análisis de la expresión de la proteína caspasa-3 activada; para la cuantificación se contaron las células tumorales teñidas en 5 campos elegidos al azar a una magnificación de ×400; se
consideraron positivos los casos con puntuación por encima de la media13. La angiogénesis se evaluó determinando
la vascularización de los tumores y sus metástasis; para
ello se tiñeron los vasos sanguíneos con el anticuerpo
anti-CD34, y se cuantificó el número de vasos existentes a
200 aumentos en las 4 áreas tumorales con mayor número
116 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(3):114-9
de vasos teñidos (“puntos calientes”). La mayor puntuación de vasos entre las 4 cuantificadas se consideró el grado de vascularización14. Se calificaron como positivos los
casos con puntuación por encima de la mediana.
Algunos casos no pudieron ser evaluados para todos los
marcadores por mala calidad de la tinción o insuficiente
cantidad de tumor en la muestra.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante el programa
SPSS versión 11.0. Para analizar la asociación entre la expresión de las proteínas estudiadas, la tasa de apoptosis y
la vascularización en los tumores primarios y sus correspondientes metástasis se empleó la prueba de la ␹2. Los valores < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
RESULTADOS
Los patrones de expresión de las proteínas analizadas en
los carcinomas epidermoides de laringe ya han sido descritos en estudios previos11,15-18 y coinciden con los hallados en
este trabajo. Cuatro de las 5 proteínas estudiadas (p53,
E-cadherina, FAK y anexina A2) mostraron una expresión
similar en la metástasis ganglionar y el correspondiente tumor primario (fig. 1); la asociación estadística fue muy significativa en la mayor parte de los casos (tabla III). La única excepción fue la expresión de HIF-1␣. De los otros dos
parámetros analizados, el índice apoptótico (determinado
por la expresión de la caspasa-3 activada) también presentaba una correlación significativa entre el tumor primario y
las metástasis, mientras que no hubo correlación para el
grado de vascularización tumoral (tabla III).
La proteína que mostró una mayor correlación en su expresión entre el tumor primario y la metástasis fue p53
(sólo había discrepancia en un caso). Para las restantes proteínas que presentaban una correlación positiva (E-cadherina, FAK, anexina A2, y caspasa-3), sólo en unos pocos casos la expresión en la metástasis se hallaba incrementada o
disminuida respecto a la del tumor primario. Además, en
la mayor parte de los casos en que había discrepancia, se
apreció que se trataba de casos con expresión cercana al
punto de corte elegido para la dicotomización, por lo que
pequeñas variaciones en la expresión entre el tumor primario y la metástasis pudieron explicar los resultados discrepantes.
Se observó además que para las proteínas E-cadherina y
anexina A2, en los casos en que había concordancia entre el
primario y las metástasis, predominaban los casos con expresión disminuida o negativos (el 67 y el 65 % de los casos, respectivamente). Además, cuando había discrepancia,
en las metástasis también predominaban los casos negativos (tabla III). En el caso de la expresión de FAK y el índice
apoptótico, entre los casos concordantes, predominaban los
que tenían expresión aumentada o positivos (el 76 y el 85 %
de los casos, respectivamente). La expresión de FAK en las
metástasis de los casos discordantes también era predominantemente positiva (tabla III). Respecto a la expresión de
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Rodrigo JP et al. Alteraciones moleculares en metástasis
A
C
B
D
Figura 1. Ejemplo de la correlación
de la expresión de la anexina A2
en el tumor primario y las metástasis.
La expresión positiva en el tumor
primario (A) se reproduce en la
correspondiente metástasis (B), al igual
que la expresión negativa en otro
tumor (C) también se corresponde
con la de su metástasis (D).
Magnificación, ×5.
p53, había prácticamente el mismo número de casos positivos que negativos.
En cuanto a la expresión de HIF-1␣ y el grado de vascularización, aunque el número de casos con concordancia
también era mayor que el de casos con discrepancia, no había una correlación significativa. En los tumores primarios
la expresión de HIF-1␣ era predominantemente positiva (el
68 % de los casos), pero no en el caso de las metástasis (el
54 % de los casos). Respecto al grado de vascularización, no
había una tendencia clara respecto a un predominio de los
casos positivos o negativos (tabla III).
DISCUSIÓN
Actualmente se sabe que los perfiles de expresión genética en las metástasis son muy similares a los de los tumores primarios de los que se originan, tal como se ha demostrado en carcinomas de mama y carcinomas epidermoides
de cabeza y cuello5,8. Esto indica que las alteraciones genéticas que confieren la capacidad metastásica se adquieren
precozmente en la carcinogénesis, y que ya el tumor primario presenta las alteraciones que permiten a las células
metastásicas sobrevivir y proliferar en un ambiente extraño. Además, dado que las alteraciones genéticas que permiten las metástasis se pueden detectar en el tumor primario, se puede emplearlas para identificar a los pacientes con
un alto riesgo de presentarlas7.
Como la expresión alterada de los genes no siempre tiene la misma repercusión en la expresión de las proteínas
que codifican (por ejemplo, puede haber una regulación
postranscripcional o postransduccional), en este estudio
Tabla III. Resultados de la expresión en el tumor primario
y las metástasis de las proteínas analizadas
n
Primario
Metástasis
Concordancia
Discordancia
+
+
–
–
+
–
–
+
p (␹2)
p53
43
20
22
1
0
< 0,001
E-cadherina
46
13
27
4
2
< 0,001
FAK
46
26
8
5
7
< 0,014
ANXA2
29
8
15
6
0
< 0,001
Caspasa-3
23
17
3
2
1
< 0,031
HIF-1␣
44
18
8
12
6
< 0,342
hemos empleado la detección de las concentraciones de
proteína para comparar su expresión en las metástasis ganglionares y el correspondiente tumor primario. Las proteínas seleccionadas participan en la regulación de procesos
potencialmente implicados en la diseminación metastásica,
como el control de la proliferación (p53), la adhesión
(E-cadherina), la diferenciación (anexina A2), y la supervivencia (p53 y FAK) celulares, y en la respuesta celular a la
hipoxia (HIF-1␣)2,11,12,14-18. También se estudian otros dos
procesos relacionados con las metástasis: la apoptosis y la
angiogénesis. La primera se estudia mediante la determinación de la expresión de la caspasa-3 activada, un indicador muy fiable de apoptosis19, y la segunda, determinando
el número de vasos mediante tinción con el antígeno endotelial CD3420.
Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(3):114-9
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Rodrigo JP et al. Alteraciones moleculares en metástasis
Tal como sucedía en la expresión génica, en el estudio de
Roepman et al8, hallamos que la expresión de las proteínas
analizadas muestra una notable correlación entre el tumor
primario y las metástasis, con la excepción de la expresión
de HIF-1␣ y la angiogénesis. En la expresión proteínica,
sólo hay un estudio previo que haya analizado varias alteraciones moleculares en un número elevado de casos21. En
dicho estudio también se encuentra una expresión similar
en las metástasis y el tumor primario para la mayoría (8 de
10) de los marcadores analizados. Además, los hallazgos
son coincidentes con los de nuestro estudio en el caso de
los dos marcadores comunes a ambos, p53 y E-cadherina.
En conjunto, los tres estudios demuestran que las alteraciones genético-moleculares que determinan las metástasis ya
están presentes en el tumor primario.
La proteína que mostró una mayor correlación en nuestro estudio (sólo había un caso discrepante) fue p53, lo
cual es congruente con que sus alteraciones son un evento
precoz en la carcinogénesis y que se mantendrían durante
su desarrollo. Además, no había un predominio claro de
casos positivos ni negativos, lo que indica que las alteraciones de esta proteína no tienen un papel favorecedor de
las metástasis, tal como confirman estudios previos15. Sin
embargo, el mantenimiento del funcionamiento anómalo
de p53 en las metástasis permitiría la proliferación celular
incontrolada, al igual que en el tumor primario22. Respecto
a las otras proteínas que mostraron correlación entre el tumor primario y las metástasis, la expresión de E-cadherina
y anexina A2 fue predominantemente negativa y la de
FAK positiva, así como el índice apoptótico. Estos resultados están en consonancia con los estudios previos que han
mostrado que la disminución de la expresión de E-cadherina en el tumor primario se relaciona con metástasis ganglionares12,17, así como la disminución de la expresión de
anexina A218 y el aumento de la expresión de FAK16. Sin
embargo, el elevado número de casos con índice apoptótico por encima de la media en esta serie de casos está en
discrepancia con otros estudios que muestran que la inhibición de la apoptosis se relaciona con tumores más agresivos y mayor incidencia de metástasis23,24. Estas discrepancias podrían explicarse por el hecho de que en nuestro
estudio sólo se incluye a pacientes con metástasis, por lo
que sería necesario analizar el índice apoptótico mediante
la expresión de caspasa-3 en pacientes con y sin metástasis
ganglionares.
Al contrario que las anteriores proteínas, la expresión de
HIF-1␣ variaba con frecuencia entre el tumor primario y las
metástasis. HIF-1␣ es una proteína sujeta a una fuerte regulación de su expresión por la hipoxia25, por lo que, además de la influencia de otros factores genético-moleculares
que podrían modificar su expresión, las diferentes condiciones de oxigenación en el tumor primario y las metástasis también podrían explicar estas discrepancias. Relacionado con esto también estarían las diferencias halladas en
el grado de vascularización entre el tumor primario y las
metástasis, que explicarían una diferente oxigenación de
ambos y podrían influir en la expresión de HIF-1␣. Además, es probable que el diferente microambiente celular
existente en el tumor primario y las metástasis podrían in118 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(3):114-9
fluir en los fenómenos de angiogénesis e hipoxia y explicar
las diferencias halladas en estos aspectos en este estudio26.
En conclusión, nuestro estudio confirma que la mayoría
de las alteraciones moleculares existentes en las metástasis
ganglionares ya están presentes en el tumor primario. Esto
indica que la capacidad metastásica se adquiere ya precozmente durante la carcinogénesis y se mantiene durante la
progresión tumoral. Desde el punto de vista práctico, dado
que las alteraciones moleculares que favorecen la diseminación metastásica están presentes en el tumor primario,
su detección permitiría identificar a los pacientes con mayor riesgo de tener metástasis.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer a Marta Sánchez y Olivia
García, del laboratorio de Anatomía Patológica del IUOPA, la
inestimable colaboración en la realización de las tinciones inmunohistoquímicas.
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