determinación de la concentración de alfa y beta amilasas

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS
COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. Enero 11 del 2009
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS
COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Enero 11 del 2009
NOTA DE ADVERTENCIA:
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS
COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
APROBADO
_________________________
_________________________
HELBERTH ESPITIA RIVERA
IVONNE GUTIERREZ ROJAS
Ingeniero Químico
Bacterióloga M. Sc
Director
_______________________
ADRIANA MATIZ
Bacterióloga M. Sc
Jurado
Asesor
_______________________
ANDREA AGUIRRE
Bacterióloga M. Sc
Jurado
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS
COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE
CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae
LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA
APROBADO
_______________________
INGRID SCHULER
_______________________
JANETH ARIAS
Bióloga, Ph.D.
Bacterióloga, M. Sc–M. Ed
DECANA ACADEMICA
DIRECTORA DE CARRERA
Este trabajo lo dedico a Dios por darme la sabiduría y fortaleza en cada paso de
este proceso formativo. A mis padres por su amor, esfuerzo y apoyo. También
quiero agradecer a mis amigos que me acompañaron durante la carrera por toda su
colaboración y amistad que fueron muy importantes para lograr esta meta.
Carolina.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo es el resultado del interés de la empresa Destilería Premier
LTDA., en especial del Ingeniero Helberth Espitia, director técnico de la misma, por
su continua búsqueda de alternativas de mejoramiento del proceso a nivel de de
rendimientos, calidad y rentabilidad, así como también por proponer, financiar y
dirigir este trabajo.
Agradezco especialmente la colaboración y asesoría permanente e incondicional de
la Doctora Ivonne Gutiérrez de la Pontificia Universidad Javeriana. También al
Ingeniero Axel, director del laboratorio de Bromatología de la Secretaría de Salud
del Tolima de la ciudad de Ibagué, por su asesoría y colaboración en la realización
de los análisis de este proyecto.
Por último agradezco a mi madre por su interés compartido por este trabajo,
acompañándome siempre con una voz de ánimo y disposición de ayuda para poder
lograr esta meta.
vii TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 18 2. MARCO TEORICO .................................................................................................... 19 2.1 LA CEBADA .............................................................................................................. 19 2.1.1 Taxonomía ................................................................................................................ 19 2.1.2 Características generales ........................................................................................ 19 2.2 CEBADA MALTEADA ............................................................................................... 20 2.3 ALMIDON DE CEBADA ............................................................................................ 21 2.3.1 Amilosa...................................................................................................................... 21 2.3.1.1 Amilopectina ............................................................................................................. 23 2.4 MÉTODOS HIDROLÍTICOS DEL ALMIDÓN ............................................................ 23 2.4.1 Método químico ........................................................................................................ 23 2.4.2 Método enzimático ................................................................................................... 24 2.4.2.1 α-Amilasa .................................................................................................................. 27 2.4.2.2 -amilasa ..................................................................................................................... 28 2.4.2.3 Glucoamilasas .......................................................................................................... 29 2.4.2.4 Pululanasa ................................................................................................................ 29 2.5 PROCESO DE PRODUCCIÓN DE ALCOHOL ......................................................... 30 2.5.1 Sustrato: mosto ........................................................................................................ 30 2.5.2 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ....................................................... 31 2.5.2.1 Morfología ................................................................................................................. 31 2.5.2.2 Reproducción ........................................................................................................... 32 2.5.2.3 Requerimientos nutricionales ................................................................................. 32 2.5.2.3.1 Fuente de Carbono ................................................................................................ 32 2.5.2.3.2 Fuente de nitrógeno .............................................................................................. 32 2.5.2.3.3 Macro y Micronutrientes ....................................................................................... 33 2.5.2.3.4 Vitaminas ................................................................................................................ 33 2.5.2.4 Requerimientos ambientales ................................................................................. 34 2.5.2.4.1 Temperatura ........................................................................................................... 34 2.5.2.4.2 Oxigeno................................................................................................................... 34 2.5.2.4.3 pH ............................................................................................................................ 34 2.5.2.5 Metabolismo ............................................................................................................. 34 2.5.2.5.1 Azúcares ................................................................................................................. 34 2.5.2.5.2 Nitrógeno ................................................................................................................ 35 viii 2.5.2.5.3 Fósforo.................................................................................................................... 35 2.5.3 FERMENTACIÓN ...................................................................................................... 36 2.6 PRODUCCIÓN DE ALCOHOL EN DESTILERÍA PREMIER LTDA. ........................ 37 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .......................................... 39 4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 40 4.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 40 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 40 5. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 41 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................ 41 5.1.1 Población de estudio ............................................................................................... 41 5.1.2 Materiales .................................................................................................................. 41 5.1.3 Enzimas y levadura .................................................................................................. 41 Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L son enzimas comerciales de Genencor
Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilería Premier LTDA. para
el desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidrolítico del
almidón de cebada. Multifect® AA 21L es una α-amilasa estable a altas
condiciones de calor y a un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional
para operar bajo condiciones de licuefacción industrial. Las condiciones
recomendadas de licuefacción primaria son 105-110ºC por 5-7 minutos y
secundaria 95ºC por 90-120 minutos (molido húmedo) ó 85-93ºC por 90-120
minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8......................................................... 41 5.2 MÉTODOS ................................................................................................................. 42 5.2.1 Proceso hidrolítico del almidón .............................................................................. 42 5.2.1.1 Control de comparación .......................................................................................... 43 5.2.1.2 Control negativo ....................................................................................................... 44 5.2.2 Rendimiento del proceso de hidrólisis .................................................................. 44 5.2.3 Condiciones de fermentación ................................................................................. 44 5.2.3.1 Pruebas preliminares ............................................................................................... 44 5.2.3.2 Preparación de inóculo............................................................................................ 45 5.2.3.3 Fermentación ............................................................................................................ 45 5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA ............................................................................. 46 5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Y
ALMIDÓN. .................................................................................................................. 46 5.4.1 Determinación del título de la solución de Fehling. ............................................. 46 5.4.2 Valoración de la muestra ......................................................................................... 47 5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores ............................................................................. 48 ix 5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL .................................. 48 5.5.1 Destilación ................................................................................................................ 48 5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica.......................................................................... 50 5.6 VARIABLES DE ESTUDIO........................................................................................ 50 5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN .................................................................. 51 5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN .................................................................................. 51 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 52 6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS ............................................................... 52 6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR .............. 53 6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN ................................................................. 58 6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE
CEBADA SIN MALTEAR .......................................................................................... 61 6.4.1 Consumo de sustrato .............................................................................................. 66 6.4.2 Producción de etanol ............................................................................................... 69 6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN .................................................................................... 73 7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 75 8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 77 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 78 10. ANEXOS .................................................................................................................... 88 x INDICE DE TABLAS
Pág
Tabla 1.
Composición del grano de cebada………………………………..…20
Tabla 2.
Acción que ejerce sobre el almidón la fosforilasa, α-glucosidasa,
α-amilasa,
β-amilasa
y
enzimas
desramificadoras…………………………………….………………....25
Tabla 3.
Composición típica del mosto……………………………………….30
Tabla 4.
Resumen del diseño experimental…………………………............42
Tabla 5.
Resultados de la concentración de almidón realizados a la
cebada
mateada
y
sin
matear…………………………………………...…………….………..…52
Tabla 6.
Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso
hidrolítico…………………………………………………………..…….56
Tabla 7.
Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato
bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de
comparación
y
(C-)
control
negativo……………..………………………………………………........68
xi INDICE DE GRÁFICAS
Pág
Gráfica 1.
Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de
de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo
después
de
la
hidrólisis
por
8h…………………………………………………………………….……54
Gráfica 2.
Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de
hidrólisis en función
de la concentración de enzimas, (C+)
control
comparación
de
y
(C-)control
negativo……………………………………………………………….…57
Gráfica 3.
Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el
ensayo previo de experimentación…………………………………..59
Gráfica 4.
Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de
fermentación
con
las
diferentes
concentraciones
de
enzimas…………………………………………………………..……….62
Gráfica 5.
Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo
de obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función
de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y
(C-)
control
negativo………………………………………………………...............65
Gráfica 6.
Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y
final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la
concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-)
control
negativo…………………………………………………………………...67
xii Gráfica 7.
Consumo total de sustrato bajos las diferentes concentración de
enzimas,
(C+)
control
de
comparación
y
(C-)
control
negativo…………………………………………………………………..69
Gráfica 8.
Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de
enzimas,
(C+)
control
de
comparación
y
(C-)
control
negativo…………..……………………………………………………….70
Gráfica 9.
Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las
diferentes
concentración
comparación
y
de
enzimas,
(C-)
(C+)
control
de
control
negativo…………………………………………………….…...............71
Gráfica 10.
Relación entre la concentración de etanol producido y
productividad producto-sustrato en función en función de la
concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-)
control
negativo……………………………………………………….…………72
xiii INDICE DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Representación de las dos formas de almidón que se dan en la
cebada…………………………………………………………………...22
Figura 2. Degradación del almidón…………………………………..…………..26
Figura 3. Coloración de Gram Saccharomyces cerevisiae..…………..…….31
Figura 4. Reproducción del inóculo…………………………………..…………45
Figura 5. Reacción de Fehling……………………………………..……………..47
Figura 6. Destilación de las muestras………………………………..………….49
Figura 7. Determinación del peso del destilado……………………….…..….50
xiv INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Soluciones de trabajo…………………………………………..…………..88
ANEXO 2. Determinación del porcentaje de almidón…………………..………….89
ANEXO 3. Método para recuento celular en cámara de Newbauer……..……….90
ANEXO 4. Tablas complementarias del proceso hidrolítico………………..…….92
ANEXO 5. Figuras complementarias del proceso hidrolítico………………….....93
ANEXO 6. Tablas complementarias de fermentación……………………………...95
ANEXO 7. Gráficas complementarias de fermentación…………………………101
ANEXO 8. Figuras complementarias del proceso fermentativo………………105
ANEXO 9. Análisis estadístico………………………………………………………106
ANEXO 10. Costos de producción………………………………………………......109
ANEXO 11. Ficha técnica Multifect® AA 21L………………………………….........110
ANEXO 12. Ficha técnica Multifect® AA 23L………………………………………112
ANEXO 13. Ficha técnica Saccharomyces cerevisiae…………………..……….114
xv RESUMEN
Destilería Premier LTDA dentro de sus procesos productivos emplea cebada sin
maltear como sustrato para la producción de etanol en conjunto con la cebada
malteada, con el fin de equilibrar los costos de producción, por lo que en este
trabajo se probó la concentración de α y β amilasas que se deben adicionar al grano
de cebada sin maltear como alternativa para disminuir el uso de la cebada maltada
en el proceso de obtención de etanol. Para lo anterior se realizo ensayos a nivel de
laboratorio variando las concentraciones de α y β amilasas, Multifect® AA 21L y
Multifect® AA 23L, respectivamente, que se agregaron al medio para la etapa de
hidrólisis del almidón de cebada. La concentración de enzimas óptima fue 20 ml/L,
lo cual permitió mejorar el rendimiento de hidrolisis con 89,44 % en comparación
con las concentraciones que obtienen con la cebada malteada empleada en la
planta (41.85%) además de producir mayor cantidad de alcohol.
ABSTRAC
Premier LTDA distillery within their manufacturing processes used unmalted barley
as a substrate for the production of ethanol in conjunction with malted barley, in
order to balance the costs of production, so that this work was tested in the
concentration of α and β amylases to be added to the grain of unmalted barley as an
alternative to reduce the use of barley malt in the process of obtaining ethanol. For
the foregoing tests was performed at the laboratory by varying concentrations of α
and β amylases, Multifect ® 21L and Multifect® AA 23L AA, respectively, which were
added to the medium stage for the hydrolysis of starch from barley. The optimal
concentration of enzymes was 20 ml / L, which helped improve the performance of
hydrolysis with 89.44% compared with the concentrations obtained with malted
barley used in the plant (41.85%) in addition to producing larger quantities of alcohol.
1. INTRODUCCIÓN
Destilería Premier LTDA, es una empresa dedicada a la producción, maduración,
fabricación, destilación, decantación y comercialización de vinos, champañas,
aperitivos y licores en general.
Tradicionalmente en el proceso de elaboración de whisky o de cerveza se requiere a
la cebada cómo materia prima esencial, utilizada para la obtención de malta
mediante el proceso de malteado, que es la sustancia que da origen al extracto
fermentable. Hacia el final del proceso de malteado, las diversas enzimas líticas o
degradativas se hacen solubles y además son transferidas al endospermo del grano
en donde causan la modificación del almidón a un sustrato más sencillo, debido a la
acción de alfa y beta amilasas.
Los mayores inconvenientes a los que se enfrenta la industria licorera Colombiana
es la falta de malterias que comercialicen malta o cebada malteada, lo que hace
necesario la importación de la cebada ya transformada, generando de esta forma
trámites y costos para las empresas que requieren la cebada en estas condiciones.
Destilería Premier importa cebada malteada de Chile y adquiere cebada de
producción nacional sin maltear de la región cundiboyacense, con el fin de realizar
una mezcla de las cebadas para la generación de productos de calidad a un menor
precio.
Como consecuencia de esto, surge la necesidad de buscar alternativas eficaces
para reducir el uso de la cebada malteada. Por tal motivo, la empresa pretende
utilizar cebada nacional como única materia prima esencial del proceso, empleando
enzimas amilolíticas comerciales Multifect® AA 21L (α -amilasa) y Multifect® AA 23L
(β -amilasa), para sustituir el paso de sacarificación y licuefacción enzimática del
almidón llevado a cabo por las enzimas de la cebada malteada, por el empleo de
enzimas comerciales de microorganismos amilolíticos para la degradación total o
parcial del almidón contenido en los granos de esta cebada, con el propósito de
disminuir tiempos de producción y mejorar la rentabilidad del proceso. Para lograr
este objetivo se propone determinar la concentración óptima de las enzimas con el
fin de obtener la mayor producción de etanol, estableciendo de esta forma una
alternativa eficaz de producción para la empresa.
18 2. MARCO TEORICO
La fermentación alcohólica a partir de cereales ha sido investigada por varios años,
considerando a la cebada, en términos de producción, el cereal más importante en
el mundo, constituido por un 63-65% de almidón (Varman, 1997). Las empresas de
alimentos y bebidas muestran un interés cada día por este almidón, que es utilizado
en la fermentación de las azúcares, utilizando levaduras que contienen enzimas
catalizadoras que transforman los azúcares en alcohol y dióxido de carbono (Routh
et al, 1984). Sin embargo, las levaduras no tienen la capacidad de acceder a esta
fuente de carbono directamente, por lo que durante el malteado de la cebada, el
almidón de la cebada se degrada fundamentalmente a una mezcla de poliglucosa,
obteniendo el mosto de fermentación (Varman, 1997). Actualmente en el mercado
se
encuentra
una
variedad
de
enzimas
comerciales
producidas
por
microorganismos y que son usadas en la industria de alimentos y bebidas. En la
industria de bebidas las enzimas de mayor importancia son las amilasas ya que se
ven implicadas desde el proceso de elaboración del mosto. El uso de α-amilasas, βamilasas y glucoamilasas producidas por diferentes microorganismos ha beneficiado
la industrial por proveer una alternativa y un método más eficiente para la
producción de dextrinas, maltosa y glucosa (Beltran y Maldonado, 2002).
2.1 LA CEBADA
2.1.1
Taxonomía
Botánicamente, la cebada pertenece a la familia de las Gramíneas, plantas
herbáceas con flores, que en los antiguos sistemas naturales de clasificación se
situaron en la sub-clase Glumaceae ó Glumiflorae. Las cebadas se incluyen en el
género Hordeum, del que existen varias especies, siendo H. vurgare y H. distichon
las especies más importantes en la industria cervecera (Hornsey, 2003).
2.1.2
Características generales
El uso predominante de la cebada para la elaboración de malta se basa en una
serie de factores tales como ser tradicionalmente el cereal de elección; crece en una
variedad de ambientes, con una germinación rápida y uniforme; el 60% del peso
19 seco total del grano es almidón; contiene proteínas, generalmente en cantidades
necesarias para proporcionar los aminoácidos necesarios para el crecimiento de la
levadura; y posee una dotación enzimática satisfactoria (Hough, 1990).
En el proceso de elaboración de cerveza o de whisky se emplea como materia
prima esencial cebada que se caracteriza por tener carbohidratos fermentables,
proteínas, minerales y una alta actividad enzimática (Ver Tabla 1), sin embargo
estas características también favorecen el desarrollo de microorganismos capaces
de producir diferentes metabolitos y enzimas que pueden modificar las propiedades
finales del mosto y por consiguiente del desarrollo de elaboración de alcoholes de
cebada (Beltrán, y Maldonado, 2002).
Tabla 1. Composición del grano de cebada por 100 g de sustancia.
Componentes
Porcentajes (%)
Proteínas
10
Materia grasa
1.8
Hidratos de carbono
66.5
Celulosa
5.2
Materias minerales
2.6
Agua
14
Fuente: http://fenalce.net/pagina.php?p_a=50
Aunque son varios los granos de cereal que pueden ser satisfactoriamente
malteados, los de cebada son los que generalmente presentan menos problemas
técnicos. Sus cáscaras ayudan a proteger el grano del malteado, además son útiles
como coadyuvantes de filtración en etapas posteriores (Hoseney, 1991).
2.2 CEBADA MALTEADA
Se entiende exclusivamente por cebada malteada o malta al grano de cebada
sometido a germinación parcial y posterior deshidratación y/o tostado en
condiciones tecnológicas adecuadas. El malteado es la germinación controlada de
20 la semilla, seguida por su desecación también controlada, durante éste se considera
a la semilla de cebada como un sistema complejo fisiológico donde los principales
procesos son la síntesis de enzimas amilolíticas y proteolíticas y la degradación de
las estructuras del endospermo. El objetivo del mateado es producir alta actividad
enzimática y el sabor característico, con una mínima pérdida de peso seco. El grano
seleccionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo y estar
libre de pajas, granos rotos y hongos (Hoseney, 1991).
El cereal que se maltea con más frecuencia es la cebada, aunque también se
emplean cantidades apreciables de trigo y centeno, y en algunas partes de África se
maltea sorgo. En teoría al menos, se podría utilizar cualquier cereal. No obstante, el
tipo y cantidad de las enzimas producidas, varían de uno a otro cereal (Hoseney,
1991).
2.3 ALMIDON DE CEBADA
El almidón es un polímero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la
naturaleza, por lo que se considera una buena fuente de obtención de este azúcar
para una fermentación económica y rentable (Navarro y Sossa, 2003). La cantidad
de almidón contenido en el grano de cereal varía, pero generalmente oscila entre el
60 y 75% del peso del grano. El almidón presente en los granos es el más
importante de los carbohidratos para fines industriales resultando preciso degradarlo
enzimáticamente con una gelatinización previa por acción de calor o sometetiendolo
a un intenso trabajo mecánico. El almidón de cebada gelatiniza a 58-90ºC, pero
durante la germinación la temperatura alcanzada es de sólo 15ºC, por lo tanto las
enzimas que degradan el almidón, las amilasas, operan en el malteado sin
gelatinización previa (Hoseney, 1991). El almidón consta de dos fracciones: amilosa
(20 %(p/p)) que es soluble en agua y amilopectina (80%(p/p)) que es insoluble en
agua con un alto peso molecular (Ver Figura 1) (Navarro y Sossa, 2003).
2.3.1
Amilosa
Es un polímero de glucosa que contiene de 1.000 a 4.000 unidades de éste
monómero, tiene por tanto un peso molecular de 200.000-800.000 daltons, valor que
varía no sólo según la especie de planta, sino también dentro de la misma especie y
21 d
depende
de
el estado de maduración
n (Hoseney, 1991). Cad
da unidad de
e glucosa esstá
u
unida
a la próxima por un enlace
e glucosídico α-1,4 (Ve
er Figura 1)). Este enla
ace
d
determina
que el grupo reductor de
e la glucosa,, situado en la posición uno, pierda la
f
funcionalida
ad, una mo
olécula de amilosa
a
no tiene máss poder red
ductor que el
c
correspondie
ente a una
a sola molé
écula de glu
ucosa, porq
que sólo tie
ene un grupo
r
reductor
funcional, situa
ado en un exxtremo (Houg
gh, 1990).
ntación de las dos forrmas de alm
midón que se dan en la
Figura 1. Represen
milosa y (b) amilopectina
a
a ramificada
a. Cada círcu
ulo
cebada (a) cadena lineal de am
nta una unidad de gluco
osa y posible
es puntos de
e ataque para las amilassas
represen
α y β; NR
RE indica un
n extremo no
o reductor.
Fuente: Hough, 199
90
G
Generalmen
nte, es un po
olímero linea
al aunque se cree que solamente
s
p
para
una parte
d la amilos
de
sa, siendo liigeramente ramificado el
e resto. Cuando se lixivia el almidón
p
para
separa
ar la amilosa
a calentando ligeramen
nte por encima de la te
emperatura de
g
gelificación
del almidó
ón, la amilosa solubilizada es esencialmen
e
nte lineal. La
n
naturaleza
lineal
l
y de gran longitud, confiere
e a la amilo
osa algunass propiedades
ú
únicas,
por ejemplo: su
u capacidad
d para forma
ar complejoss con yodoss, alcoholess o
á
ácidos
orgá
ánicos. Estoss complejoss se llaman clatratos o compuestoss de inclusión
h
helicoidal
(H
Hoseney, 19
991). A tem
mperatura am
mbiente, la cadena de moléculas de
22 glucosa adopta una conformación en espiral cuyas hélices permiten albergar en su
interior una molécula de yodo. Cuando se trata de la amilosa con yodo, disuelto en
una disolución de yoduro potásico, el yodo se ubica en las hélices, formando un
complejo amilosa-yodo que tiene un color azul negruzco. Si el complejo se calienta
se desintegra transitoriamente la espiral de amilosa y el yodo deja de teñirla
(Hoseney, 1991).
2.3.1.1 Amilopectina
Es un polisacárido cuyas cadenas principales son restos de glucosa unidos en
enlace α-1,4, como en la amilosa, y que presentan esporádicamente ramificaciones
α-1,6, localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa (Ver Figura 1). Su peso
molecular es muy alto ya que algunas fracciones llegan a alcanzar hasta 200
millones de daltons. La amilopectina constituye alrededor del 75% de los almidones
más comunes (Bailey y Bailey, 1998). La consecuencia de los enlaces α-1,6 es la
formación de una molécula ramificada que al igual que la amilosa, tiene un sólo
grupo funcional. (Hough, 1990).
2.4 MÉTODOS HIDROLÍTICOS DEL ALMIDÓN
El principal inconveniente para la producción de etanol a partir de almidón, radica en
que la levadura no produce enzimas amilasas y no es capaz de fermentar el
almidón, por consiguiente es necesario realizar una sacarificación previa. La
sacarificación se puede realizar por dos métodos: uno químico y uno de conversión
enzimática (Chica, 1996).
2.4.1
Método químico
El almidón puede ser hidrolizado por ácidos como el ácido clorhídrico, (hidrólisis
ácida), llegando a una conversión parcial del almidón a D-glucosa. Este método es
utilizado para preparar jarabes de glucosa a partir de suspensiones que contienen
20%(p/p) de almidón a pH 2 y a una temperatura de 140ºC (Glazer y Nikaido, 1998).
Tras el tratamiento, se neutraliza y se recupera el almidón no hidrolizado por
filtración (Hoseney, 1991).
23 Durante la reacción, el ácido penetra libremente por las partes amorfas del grano de
almidón, e hidroliza los enlaces glucosídicos. El ácido no puede penetrar por las
áreas cristalinas, quizás a causa de la doble hélice, permaneciendo por ello intactas.
El efecto principal del ácido es reducir el peso molecular de las moléculas de
almidón, dejando intacta la estructura cristalina del grano (Hoseney, 1991).
Esta sacarificación química presenta serios inconvenientes tales como: un bajo
rendimiento en la producción de etanol, los residuos líquidos que quedan de la
hidrólisis no son utilizados como alimento para el ganado y por último requiere un
mantenimiento costoso a causa del mayor deterioro de las instalaciones por
corrosión. Por lo anterior, los métodos enzimáticos se han convertido en una buena
alternativa (Chica, 1996).
2.4.2
Método enzimático
La hidrolisis enzimática ha desplazado a la hidrólisis ácida en los últimos 30 años,
debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en día la mayor parte de la
hidrólisis de almidón se realiza usando enzimas, ya que esta técnica presenta
ventajas como: control de la formación de productos no deseables y mayor
flexibilidad del producto (Chica, 1996).
Durante el malteado, el almidón de la cebada se degrada fundamentalmente a una
mezcla de moléculas de poliglucosa, algo menos complejas que las originales. Para
los procesos respiratorios y biosintéticos embrionarios, sólo se libera una cantidad
limitada de azúcares simples. La amilopectina es más fácilmente degradada que la
amilosa. Las enzimas capaces de degradar el almidón no gelatinizado de la cebada
son las siguientes: fosforilasa, α-glucosidasa, α-amilasa, β-amilasa y enzimas
desramificadoras (Ver Tabla 2). Durante la deshidratación de la malta, las
actividades de estas enzimas se reducen de un modo drástico a excepción de la αamilasa y β-amilasa (Hough, 1990).
Hay tres tipos de descomposición enzimática de los glucanos: fosforólisis, hidrólisis
y transglicosilación. La fosforólisis por la α-1,4-glucanfosforilasa sólo ocurre
intracelularmente. La transglicosilación es la formación de ciclodextrinas con 6-8
unidades de glucosa a partir del almidón, por acción de Bacillus macerans y otros.
24 El ataque extracelular del almidón es debido a la acción hidrolítica de las amilasas
(Ver Figura 2) (Schlegel, 1993).
Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón de la fosforilasa, α-glucosidasa, αamilasa, β-amilasa y enzimas desramificadoras.
Enzima
Microorganismos
productores
Acción
α-glucosidasa
Necesita agua para la hidrólisis, ataca
enlaces α-1,4 ó α-1,6 con menos
frecuencia.
Exoenzima que acorta las cadenas de
almidón en una unidad, partir del
extremo no reductor y libera glucosa.
Aspergillus niger,
Rhizopus niveus,
Aspergillus oryzae
Necesita agua para la hidrólisis, ataca
enlaces α-1,4.
Bacillus megaterium,
Bacillus cereus,
Acorta las cadenas de almidón en dos
Streptomyces
sp.
unidades, partir del extremo no reductor,
β-amilasa
las que libera como maltosa
Necesita agua para la hidrólisis, ataca
enlaces α-1,4.
α-amilasa
Endoenzima que rompe las cadenas al
azar generando una mezcla de maltosa
y oligosacáridos
Bacillus subtillis,
Bacillus
amyloliquefaciens,
Bacillus polymixa,
Bacillus
licheniformis
Clostridium
Necesita agua para la hidrólisis, ataca thermodyrosulfurico,
Enzimas
enlaces α-1,4. Desramificación de la
Leuconostoc,
desramificadoras
amilopeptina produciendo una mezcla
Enterobacter
(Pululanasa)
de dextrinas y unos pocos azúcares.
aerogenes, Bacillus
polymixa
Fuente: González, 2002.
Normalmente la hidrólisis enzimática de los granos de almidón presenta bajos
rendimientos
de
conversión
a
azúcares
fermentables,
a
pesar
que
las
macromoléculas del almidón pueden ser hidrolizadas en estado granular, sin
embargo, los ensayos de hidrólisis de los gránulos naturales a menudo dan como
resultado un lento y deficiente producto de hidrólisis (Oates, 1997). Normalmente
25 estos ensayos de hidrólisis analizan los azúcares reductores liberados tras un
proceso hidrolítico empleando el método de Fehling. Este método se basa en las
propiedades reductoras de los azúcares presentes en la muestra sobre una solución
alcalina de cobre. Los azúcares totales son la suma de los azúcares reductores y no
reductores. Los azúcares reductores son los monosacáridos como glucosa, fructosa,
galactosa, etc. y disacáridos como lactosa y maltosa, los cuales reaccionan con
oxidantes suaves, como los reactivos de Fehling, Tollens y Benedict (NTC 5146,
2008). El reactivo de Fehling tiene una coloración azul y al reaccionar con los
azúcares reductores, forma un precipitado rojizo de óxido cuproso (Cu2O) y el ácido
carboxílico del respectivo aldehído (NTC 5146, 2008).
En general, la acción de α y β-amilasas en gránulos de almidón natural no es muy
eficaz, porque son muy resistentes a la digestión amilolítica y se necesita un largo
período de hidrólisis para poder degradar el almidón (Sarikaya et al., 2000). Con los
nuevos avances tecnológicos en los últimos años, se han descubierto una nueva
generación de enzimas como la α-amilasa de Aspergillus kawachi y la glucoamilasa
de Aspergillus niger. Estas enzimas trabajan sinérgicamente para hidrolizar almidón
granular que directamente puede hidrolizar el almidón en un solo paso, a una
moderada temperatura muy por debajo de la temperatura de gelatinización (Shariffa
et al., 2008).
Figura 2. Degradación del almidón.
Fuente: Schlegel, 1993.
26 Estas enzimas tienen la ventaja de exo-actividad como la glucoamilasa, que es
capaz de perforar fuerte y profundamente orificios, así como la endo-activitividad de
la α-amilasa, que permite la ampliación de los orificios (Shariffa et al., 2008). Esta
combinación mejora la liberación continua de glucosa fermentable a partir de los
granos de almidones. Franco et al., (1988) reportaron, que se puede obtener una
mayor degradación hidrolizando el almidón con α-amilasa junto con la glucoamilasa.
La modificación se puede realizar con el fin de aumentar la eficiencia de hidrólisis
del almidón natural. Oates (1997) sugirió que se puede lograr una mejor hidrólisis de
almidón
nativo
mediante
el
aumento
de
la
temperatura
de
incubación
aproximadamente a 60º C. Si el grado de conversión de almidón nativo se puede
incrementar aún más, sería muy útil en el proceso industrial de fermentación de
azúcares y de bioetanol.
2.4.2.1 α-Amilasa
Cataliza la hidrólisis al azar los enlaces α-1,4 glucosídicos de la región central de la
cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las moléculas cercanas a la
ramificación, obteniendo como resultando maltosa y oligosacáridos de varios
tamaños (Cruger y Cruger, 1993).
Esta enzima tiene un peso molecular de 50.000 Daltons, es estable a pH de 5.5-8.0
con una actividad óptima de 5.9. Las α-amilasas son enzimas dependientes de
calcio, aunque el catión no esté integrado en el centro activo de la enzima, se
encuentra fuertemente unido a la enzima y sólo pueden ser removidos a pH bajos
por el uso de agentes quelantes. La completa remoción del calcio conlleva a una
pérdida total de actividad (Pedroza, 1999).
Se cree que el Ca+2 estabiliza la
conformación global de la enzima, encontrándose hasta 10 iones por molécula de
enzimas (GodFey y Reinchelt, 1993). La importancia radica en que mantiene la
molécula de la enzima en la configuración óptima para generar una máxima
actividad y estabilidad. A menudo se nombra la α amilasa como enzima licuante,
debida a su rápida acción para disminuir la viscosidad de las soluciones de almidón
(Pedroza, 1999).
27 La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminución de
la capacidad de la solución de almidón para formar el color azul característicos con
el yodo o midiendo la disminución de la viscosidad de la suspensión de almidón
(GodFey y Reinchelt, 1993).
Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el almidón
consisten en la conversión del almidón de jarabes que contienen glucosa, maltosa y
oligosacáridos, en la producción de azúcares fermentables en cervecería y en la
obtención de bebidas alcohólicas y en la modificación de la harina de panadería.
Entre las enzimas comercialmente utilizadas se destacan las alfa amilasa de
Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens y Aspergillus oryzae (Owen, 1989).
Entre los microorganismos que producen α amilasa, se encuentran tanto bacterias
como hongos tales como Bacillus subtilis, B. cereus, B. amyloliquefaciens,
Pseudomonas, Proteus, y Serratia; algunos géneros de hongos como Aspergillus,
Penicillium, Cephalosporium, y Mucor (Crueger y Crueger, 1993)
Se han obtenido enzimas termoestables a partir de Bacillus subtilis y Bacillus
licheniformis, permitiendo llevar a cabo la sacarificación a altas temperaturas,
acelerando el proceso y minimizando la contaminación microbiana (Chica, 1996).
2.4.2.2 β-amilasa
La β -amilasa ó α-1,4 glucan-maltohidrolasas es una exoenzima que ataca los
enlaces α 1,4 glucosídicos en la parte externa de la cadena de almidón, la β amilasa
separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de esta por
hidrólisis alterna de enlaces glucosídicos (Pedroza, 1999). Las β amilasas atacan la
amilosa solo desde un extremo a la vez, y, a causa de ello, son mucho menos
efectivas que las α amilasas (Baker, 1994).
Debido a que está enzima esta imposibilitada para hidrolizar los puntos ramificados
α-1,6 en la molécula de almidón, los productos finales de la acción sobre el sustrato
son maltosas y dextrinas, formándose pocas cantidades de maltotriosa y glucosa
(Mariño, 1989).
28 Las β-amilasas contienen un grupo sulfidrílo esencial para la actividad enzimática,
que se lleva acabo de forma óptima en un rango de pH entre 4 y 5. La actividad de
la enzima se analiza mediante métodos colorimétricos que miden la cantidad de
azúcares reductores, liberados a partir del almidón. Estas enzimas están presentes
en gran número de bacterias Gram positivas formadoras de esporas (González,
2002).
Algunos
microorganismos
productores
son:
Bacillus
polymyxa,
B.
cereus,
Streptomyces sp. y Rhizopus japonicus. Aunque el rendimiento en las cepas
silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes que producen 200
veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993).
2.4.2.3 Glucoamilasas
Las glucoamilasas o α-1,4-glucan-glucohidrolasas son enzimas carbohidrolasas no
especificas, de acción externa, rompen enlaces glucosídicos α-1,3, α-1,4 y α-1,6,
generando glucosa a partir de los enlaces terminales no reductores de la cadena de
almidón, por tanto son enzimas sacarificantes. Sin embargo, la glucoamilasa es
incapaz de hidrolizar el almidón por completo a glucosa, ya que la ruptura requiere
la participación de una enzima de acción interna. La glucoamilasa puede ser
separada en dos fracciones glucoamilasa I y glucoamilasa II. La glucoamilasa I
posee alta actividad desramificante la cual se acelera en presencia de α-amilasas,
por otro lado la glucoamilasa II posee una baja actividad desramificante (Chica,
1996).
Las glucoamilasas frecuentemente denominadas amiloglucosidasas, son producidas
por hongos como Aspergillus niger, además siempre contienen cierta actividad
transglucosidasa, la cual cataliza la reacción reversa, que conduce a la
polimerización de la glucosa a maltosa (Byong, 2000).
2.4.2.4 Pululanasa
La pululanasa es una enzima desramificante que actúa sobre los enlaces α-1,6 de la
amilopeptina liberando como único producto la maltosa (Byong, 2000). Son
29 utilizadas para mejorar la sacarificación, elevando el rendimiento de la liberación de
glucosa (Maarel et al., 2002).
2.5 PROCESO DE PRODUCCIÓN DE ALCOHOL
2.5.1
Sustrato: mosto
Es la solución en agua potable de carbohidratos, proteínas, sales minerales y
demás compuestos resultantes de la degradación enzimática de la malta (Ver Tabla
3), con o sin adjuntos, como arroz, sorgo, trigo, etc., realizada mediante procesos
tecnológicos adecuados.
Tabla 3. Composición típica del mosto.
Componente
Cantidad
(gl-1)
Fructosa
2,1
Glucosa
9,1
Sacarosa
2,3
Maltosa
52,4
Maltotriosa
12,8
Carbohidratos
fermentecibles
no
23,9
Nitrógeno total
0,8
Aminoácidos
(nitrógeno)
totales
0,30
Aminoácidos totales
1,65
Componentes fenólicos totales 0,25
Isoácidos α
0,035
Iones calcio
0,065
Fuente: Hough, 1990.
30 2.5.2
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae
En la industria se utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae, al ser considerada
como la mayor productor de etanol a nivel mundial. Este hecho se evidencia en un
sin número de atributos que para tal fin presenta esta levadura, como por ejemplo
su capacidad de respiración tanto aerobia como anaeróbica, y la utilización de
sustratos como glucosa, fructuosa, galactosa, maltosa, entre otros (Tuite y Oliver,
1991). Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos más atractivos
para trabajar, se ha comprobado a través de la historia que no es patógeno, ya que
se ha utilizado en las industrias alimentarias y ha sido clasificado como un
organismos GRAS (Generally Recognized As Save) (Ostergaard et al., 2000). Así
mismo, posee un gran potencial para la producción de etanol fermentando la
glucosa, soportando altas concentraciones de la misma, logrando altos niveles de
producción y rendimiento (Chandrakant y Bisaria, 2000).
2.5.2.1 Morfología
Es un hongo unicelular levaduriforme que presenta células alargadas, globosas,
elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales de 3-10 x 4,5-1 μm que
al microscopio se ven refringentes (Ver imagen 3). Presenta ascos con hasta cuatro
ascosporas esféricas o elipsoides y de pared lisa en su interior. Las colonias en agar
Sabouraud son cremosas, blandas, de color crema o blanco, con apariencia
húmeda y brillante y con bordes irregulares (White, 1995).
Figura 3. Coloración de Gram Saccharomyces cerevisiae
Fuente: www.ual.es/.../myco-ual/galeria04/figura8.htm.
31 2.5.2.2 Reproducción
Su reproducción puede ser asexual por gemación. Cuando las condiciones son
adversas la mayor parte de las levaduras pueden reproducirse sexualmente
generando ascosporas (Mesas y Alegre, 1999). Durante la gemación, la célula hija
inicia crecimiento formando una yema en la célula madre, posteriormente ocurre la
división nuclear, la síntesis de la pared y finalmente la separación de las dos células
(White, 1995).
2.5.2.3 Requerimientos nutricionales
2.5.2.3.1
Fuente de Carbono
Esta levadura tiene la habilidad para fermentar la glucosa, fructosa, maltosa,
maltotriosa presentes en los medios regulares. La sacarosa es hidrolizada
primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular.
Los azúcares son transportados a través de la membrana celular por transporte
activo o pasivo, mediado por permeasas producidas constitutivamente o indecibles.
La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas intracelularmente por la α-glucosidasa
(Kretzschmar, 1990). Las dextrinas, que comprenden la maltotriosa y productos de
degradación mayores, no son metabolizados. Algunas cantidades mínimas de
azúcares pentósicos tampoco son fermentados (Hornsey, 2003).
2.5.2.3.2
Fuente de nitrógeno
Las levaduras no pueden asimilar el nitrógeno elemental ni los iones nitrato. Algunas
cepas pueden utilizar los iones de amonio, pero la mayor parte de nitrógeno
requerido para la síntesis de constituyentes celulares esenciales, procede de los
aminoácidos y de los di- y tri-péptidos del mosto. Estos han sido originados
proporcionalmente por la propia malta. Como en el caso de la utilización de
carbohidratos
por
levaduras,
los
aminoácidos
son
captados
y
utilizados
consecuentemente, de acuerdo con la presencia de enzimas adecuadas de
transferencia en la membrana. Un mosto de malta total, contiene 19 aminoácidos
(Hornsey, 2003). La propia célula produce aminoácidos por transaminación y/o
32 síntesis a partir de un conjunto de diferentes ácidos y cetácidos. En algunas cepas
de levadura, determinados aminoácidos son
siempre sintetizados dentro de la
células, incluso aunque se encuentren presentes en cantidad abundante en el
mosto, como en el caso de la arginina, histidina y lisina (Hornsey, 2003).
2.5.2.3.3
Macro y Micronutrientes
El más importante de los macronutrientes es el fosforo el cual está involucrado en la
síntesis de proteínas y en los fosfolípidos que permiten la resistencia a altas
concentraciones de etanol; además las levaduras sintetizan polifosfatos como
reservas de energía. El fósforo puede ser tomado en forma monobásica (H2PO4) y
puede ser añadido al medio como ácido o como sal de amonio, sodio o potasio y se
debe encontrar de un 1 a 2% en el medio (Kretzschmar, 1990).
El sulfuro es
requerido en la levadura para la síntesis de metionina y cisteína, dos aminoácidos
que contienen azufre. Se necesita más o menos de 0.3 a 0.5% del medio. Los
microelementos cobalto, boro, cadmio, yodo, molibdeno y níquel se requieren en
concentraciones de 0.1 a 100µM (Kretzschmar, 1990).
2.5.2.3.4
Vitaminas
El mosto proporciona una rica fuente de vitaminas y aunque las levaduras difieren
mucho en sus necesidades de vitaminas para el crecimiento, normalmente existe un
aporte adecuado en variedad como de cantidad en la cuba de maceración. El mosto
debe contener biotina, tiamina (B1), ácido nicotínico, riboflavina, pantotenato cálcico,
inositol, piridoxina, piridoxal y piridoxamina. Con la excepción del inositol, que
interviene o participa en la síntesis de la membrana (fosfolípidos), es decir
desempeña un papel estructural. Todas las vitaminas tienen función catalítica como
parte de alguna coenzima en el metabolismo (no-funcional). Los factores de
crecimiento que comúnmente requiere la levadura son: biotina, ácido pantoténico e
inositol importantes para la resistencia del microorganismo a altas concentraciones
de etanol (Jaccques et al., 1999).
33 2.5.2.4 Requerimientos ambientales
2.5.2.4.1
Temperatura
Las temperaturas óptimas de la fermentación, respiración y crecimiento celular de
las levaduras son claramente diferentes. La velocidad de fermentación aumenta
generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35°C, así como también los
niveles de glicerol, acetona, bueteno-2-3-diol, acetaldehído, piruvato y 2cetoglutarato (Ward, 1991).
2.5.2.4.2
Oxigeno
Los requerimientos de oxigeno para la reproducción y para la fermentación son
diferentes, mientras para la reproducción se necesitan grandes cantidades de
oxigeno para la producción de células hijas y para la síntesis de ácidos grasos que
serán los responsables de la resistencia a grandes concentraciones de etanol; la
fermentación se realiza en condiciones anaerobias pues la producción de etanol
necesita de ausencia de oxigeno (Ward, 1991).
2.5.2.4.3
pH
Los valores comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de las veces favorables al
crecimiento y actividad fermentativa; esta última es mayor cuanto mayor sea el pH
(Santander, 2006).
2.5.2.5 Metabolismo
2.5.2.5.1
Azúcares
Las levaduras son consideradas microorganismos anaerobios facultativos, ellos son
capaces de crecer en presencia o ausencia de oxigeno, cuando el oxigeno es
suficiente y el sustrato está lo suficientemente diluido, ellas consumen los azúcares
para el crecimiento de las células y para su reproducción; en cambio cuando el
oxigeno es reducido y los niveles de glucosa exceden 0.1% p/v, ocurre el proceso
de fermentación (Santander, 2006). S. cerevisie usa la vía glicolítica o EmbdenMeyerof-Parnas para metabolizar las moléculas de azúcar y obtener la energía
necesaria para su supervivencia (Jaccques et al., 1999). Cuando la levadura
34 encuentra las condiciones necesarias para la producción de etanol, el piruvato es
descarboxilado y convertido en Acetaldehído, el cual tras la adición de hidrógeno se
transforma en etanol (Stryer, 1995).
2.5.2.5.2
Nitrógeno
La levadura prefiere los compuestos nitrogenados fácilmente difusibles a través de
la membrana celular, sobre todo los aminoácidos, sus amidas, la urea y las bases
hexónicas (Santander, 2006). La degradación no transcurre de un modo regular,
sino que guarda estrecha relación con la acidez de la fermentación. La curva de
acidez empieza de manera alcalina ya que se hace necesario agregar un exceso de
nitrógeno al medio en forma de sales amoniacales que reaccionan con las sales
alcalinas y amoniacales orgánicas presentes en el medio. Las sales de amonio
entran a la célula y allí se disocian, liberando ácido sulfúrico, el cual fatalmente
lesiona la pared celular, aunque las otras sales ayudan a neutralizar la acción de
éste ácido. De esta manera el medio pasa de ser alcalino a ser ácido, paso que se
acelera cuando empieza la degradación de los aminoácidos orgánicos, ya durante la
fermentación la levadura toma el nitrógeno de estos compuestos de manera que los
aminoácidos van perdiendo su carácter anfótero y convirtiéndose en ácidos.
Nuevamente la acidez disminuye cuando los ácidos orgánicos van siendo
metabolizados y la levadura ha logrado asimilar la mayor parte del azúcar y del
nitrógeno. No obstante queda un resto de nitrógeno amínico no disociado
(Kretzchmar, 1990).
2.5.2.5.3
Fósforo
La levadura introduce este elemento a la célula en su forma inorgánica y adentro
obtiene ácido fosfórico, cuyo metabolismo varía a lo largo del proceso de
fermentación. Poco después de iniciada la fermentación comienza la esterificación
del azúcar con el ácido fosfórico, el cual sale del interior de la célula de la levadura
para unirse con el azúcar y hacerlo asimilable. Durante todo el proceso el ácido
fosfórico permanece entrando y saliendo, presentando un ritmo alternativo adaptado
a la germinación de la levadura y al crecimiento de las células hijas (Kretzchmar,
1990).
35 2.5.3
FERMENTACIÓN
Una fermentación es una reacción de oxidación-reducción interna equilibrada en la
que algunos átomos se reducen mientras otros se oxidan, y la energía se produce
por fosforilación a nivel de sustrato. Una ruta bioquímica muy usada para la
fermentación de la glucosa es la glucólisis, también denominada vía de EmbdenMeyerhof (Madigan et al., 2003). La fermentación anaeróbica constituye el tipo más
sencillo y primitivo de mecanismo biológico que permite la obtención de energía de
las moléculas nutritivas, mediante reacciones de oxidación y reducción. En este
proceso, el etanol es una molécula relativamente reducida que se produce junto con
el CO2 que es una molécula relativamente oxidada (Reinier, 2005).
La fermentación alcohólica es el proceso por el que los azúcares contenidos en el
mosto se convierten en alcohol etílico. Para llevar a cabo este proceso es necesaria
la presencia de levaduras, la cuales extraen energía química de las moléculas de
glucosa y de otros combustibles en ausencia de oxigeno molecular para producir
etanol. La fermentación alcohólica transcurre por la misma ruta enzimática de la
glucólisis, pero necesita dos etapas adicionales. En la primera parte, el átomo de
carbono del piruvato es atacado por el pirofosfato de tiamina y experimenta una
descarboxilación; la coenzima queda en la forma de 2- hidroxietil, derivado que
puede considerarse una forma del acetaldehído activado o ligado a la coenzima. En
la etapa final al acetaldehído se reduce a etanol y el potencial de reducción es
proporcionado por el NADH+, en una reacción catalizada por la alcoholdeshidrogenasa. Las reacciones de la fermentación alcohólica se consideran
completas cuando hay formación de ATP a partir de fosfatos. En realidad, este
proceso no puede ocurrir sin la simultánea fosforilación oxidativa del ADP (Reinier,
2005).
Durante la etapa de crecimiento de los cultivos, los mismos son sometidos a una
oxigenación fuerte, mediante la aireación del medio, lo que permite la utilización de
la glucosa por oxidación completa. Este proceso genera una gran cantidad de
energía que en parte es fijada mediante el sistema ADP-ATP y posibilita el
desarrollo de reacciones de síntesis celular, que consumen gran cantidad de
energía. Una vez que el cultivo en el fermentador ha alcanzado el número de células
36 necesario para la degradación óptima de la materia prima se elimina la aireación y
las condiciones anaeróbicas se establecen en el medio por el consumo de oxígeno
remanente y el desprendimiento de CO2. En las condiciones anaerobias, el aporte
de energía a las células es muy pequeño comparado con el de la respiración y con
las necesidades energéticas de la síntesis lo que implica que en estas condiciones
no se produzca el crecimiento celular. La experiencia indica, no obstante, que aún
en condiciones anaerobias existe una mínima reproducción celular a expensas y
acorde con el pequeño aporte energético recibido por la célula. Este fenómeno es
conocido como "Efecto Pasteur" (Reinier, 2005).
2.6 PRODUCCIÓN DE ALCOHOL EN DESTILERÍA PREMIER LTDA.
La producción se inicia con la molienda donde se trituran los granos de cebada de
tal forma que el contenido de almidones quede pulverizado, para el proceso de
inversión y conversión a azúcar.
En el reactor se carga e hidrata la cebada molida con agua potable, en este paso se
utilizan mezclas de cebada nacional con cebada malteada o importada. El sistema
de agitación y calentamiento con vapor del reactor permite llevar a cabo la hidrólisis
de los almidones, y posterior transformación en azúcares. Cuándo todos los
almidones han sido transformados en azúcares, se procede a separar el mosto de
cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a fermentar
esté libre de cascarilla, obteniéndose así un mosto disponible para realizar el
proceso de fermentación.
El mosto proveniente de la hidrólisis de la cebada es pasado a un esterilizador con
un volumen de 1.500 litros donde se mantiene por 40 minutos a temperatura de
esterilización, seguido de un enfriamiento hasta 28 °C, garantizando de esta forma
la inocuidad del mismo durante la siembra de la levadura. La cepa empleada es
Saccharomyces cerevisiae, durante la pre-fermentación las levaduras se reproducen
en el mosto, manteniéndose las condiciones óptimas para la propagación de la
misma, para esto macro y micronutrientes, como el fosfato de amonio, vitamina B1 y
tiamina, son adicionados paulatinamente.
37 Una vez se obtienen los grados Brix y la población de levadura requerida, se pasa
alternadamente a la batería de cubas madres, dónde se realiza el pie de cuba y se
controla temperatura, población y calidad de la fermentación. Una vez iniciada la
fermentación en la cuba madre se procede al cargue de esta al tanque de
fermentación, alimentándose con un mosto de 15 a 18º Brix hasta llenar el tanque
para dar paso a la fermentación por espacio de 8 a 10 días.
Se dice que la fermentación llega a su fin cuando los azúcares de la cebada son
consumidos y convertidos a alcohol, la temperatura disminuye y cesa la producción
de gas carbónico y de esta forma la biomasa se deposita en el fondo del recipiente.
En esta etapa se realizan trasiegos para la separación de los sólidos en el líquido,
realizándose de tanque a tanque con bombas y mallas. Finalizada la fermentación y
trasiegos se determina la calidad producida del producto durante el proceso
fermentativo realizando análisis para determinar los parámetros fisicoquímicos.
Una vez el mosto ha fermentado se pasa al destilador de columna rellena, donde se
realiza la extracción de cabezas y colas. La extracción de cuerpos que es la fracción
deseada se pasa a un rectificador empacado y se efectúan nuevamente
extracciones de cabezas y colas.
El alcohol de cereales, son los cuerpos de la rectificación los cuales presentan un
delicado aroma y excelente sabor. Este destilado es analizado para determinar sus
características fisicoquímicas, el producto analizado se dispone para la preparación
de lotes de producción normalmente de 10.000 litros donde se realizan mezclas de
los diferentes lotes existentes para su caracterización para su trasladado a los
procesos de añejamiento en barriles de roble.
38 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Actualmente se presenta un fuerte incremento en la demanda e implementación del
proceso productivo de etanol a partir de diferentes materias primas y diversas
tecnologías, desarrollándose estudios que mejoran el proceso de producción de
etanol (Romero et al., 2005). Por tal motivo el presente estudio pretende encontrar
una alternativa rentable para Destilería Premier LTDA en su producción de etanol a
partir de almidón de cebada.
Destilería Premier LTDA dentro de su proceso de producción de alcohol de cereales
no realiza el malteo de la cebada, importa la materia prima para la elaboración de
sus diferentes productos, por lo tanto, el presente trabajo pretende emplear cebada
nacional no malteada como materia prima principal del proceso. Debido a que esta
contiene cantidades inferiores de enzimas amilolíticas en relación a la cebada
malteada, se busca establecer la concentración más eficiente de enzimas Multifect®
AA 21L (α -amilasa) y Multifect® AA 23L (β -amilasa), para la degradación total o
parcial del almidón contenido en los granos de la cebada, con el fin de reducir
costos de producción sin alterar la calidad final de los productos.
El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: son de origen natural y por lo tanto no
son tóxicas, son muy específicas en su manera de actuar, por lo que no propician
reacciones secundarias indeseables, funcionan en condiciones moderadas de
temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drásticas que
puedan alterar la naturaleza del alimento, ni del equipo, actúan a bajas
concentraciones y son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de
transformación deseado (Hough, 1990).
El obtener un producto estable sin alteraciones organolépticas utilizando una
materia prima nacional representaría una disminución de costos para la empresa,
así como también la eliminación del almacenamiento de grandes volúmenes de
cebada importada, al poder realizar los pedidos de cebada nacional en función de la
demanda de producción planificada y no por la oferta de cebada malteada en el
exterior.
39 4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer la concentración de α y β amilasas comerciales en la obtención de etanol
a partir de cebada sin maltear, como una alternativa de producción, empleando
Saccharomyces cerevisiae.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Establecer las concentraciones de las enzimas comerciales Multifect® AA 21L y
Multifect® AA 23L, mediante la determinación de la concentración de azúcares
fermentables y etanol producido utilizando como sustrato cebada sin maltear.
•
Medir parámetros físicoquímicos (pH, temperatura) durante el proceso
degradativo y
fermentativo del almidón de cebada que favorezcan la actividad
de las enzimas y crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
•
Observar el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en las diferentes
concentraciones de enzimas probadas, teniendo en cuenta la formación de
biomasa, consumo de sustrato y producción de etanol en el medio de
fermentación.
•
Comparar el desempeño durante el proceso hidrolítico y fermentativo entre los
tratamientos con cebada sin maltear y las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect®
AA 23L; y el tratamiento con cebada malteada desarrollado tradicionalmente por
la Destilería, con el fin de establecer la utilización de las enzimas comerciales
como una alternativa para disminuir el volumen de importación de la cebada
malteada.
•
Determinar la dosis óptima de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L
para la etapa amilolítica del proceso de producción de alcohol cuando se emplea
como sustrato cebada sin maltear, con el fin de establecer la rentabilidad del litro
de etanol obtenido a partir de cebada sin maltear en relación al costo del litro de
etanol que se obtiene normalmente con la cebada malteada usada en planta, sin
arriesgar el aumento de costos.
40 5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
En el presente trabajo se realizó un estudio experimental, con el fin de obtener la
concentración óptima de alfa y beta amilasas comerciales en el proceso de hidrólisis
del almidón de cebada sin maltear, que permitan obtener etanol por procesos
fermentativos empleando Saccharomyces cerevisiae.
5.1.1
Población de estudio
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de control de calidad de la Destilería
Premier LTDA., ubicado en el centro industrial Chapeton (Vía Nevado) de la ciudad
de Ibagué, sobre muestras de cebada mateada y sin maltear para uso productivo en
la industria del etanol, inoculadas con una concentración conocida de enzimas
amilolíticas. Además se contó con el respaldo técnico
del
laboratorio de
Bromatología de la Secretaría de Salud del Tolima de la ciudad de Ibagué.
5.1.2
Materiales
Los ensayos se realizaron empleando cebada no malteada de la región
cundiboyacense y cebada malteada importada de Malterías Unidas, Chile.
5.1.3
Enzimas y levadura
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L
son enzimas comerciales de Genencor
Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilería Premier LTDA. para el
desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidrolítico del almidón de
cebada. Multifect® AA 21L es una α-amilasa estable a altas condiciones de calor y a
un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional para operar bajo condiciones
de licuefacción industrial. Las condiciones recomendadas de licuefacción primaria
son 105-110ºC por 5-7 minutos y secundaria 95ºC por 90-120 minutos (molido
húmedo) ó 85-93ºC por 90-120 minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8.
Multifect® AA 23L es una β-amilasa que exhibe excelente estabilidad a pH 5.5 o
mayor y a una temperatura de 60º C. Estas enzimas cumplen con las actuales
41 condiciones de calidad de la FAO / OMS y el Codex para alimentos y productos
Químicos y son GRAS (Generally Recognized As Safe) en los Estados Unidos (Ver
Anexos 11 y 12).
La levadura utilizada para la fermentación alcohólica fue Saccharomyces cerevisiae
Safwhisky M-1 de la casa comercial Fermentis en una presentación de levadura
seca instantánea (Ver Anexo 13).
5.2 MÉTODOS
5.2.1
Proceso hidrolítico del almidón
Teniendo en cuenta la diferencia en cuanto a la concentración de enzimas entre la
cebada mateada y la cebada no malteada para el proceso de hidrólisis, el trabajo
experimental se desarrolló estableciendo la influencia de las concentraciones de
enzimas en la liberación de azúcares reductores, formación de biomasa y alcohol.
Durante esta etapa se realizó un control de comparación con las materias primas
estandarizadas por la empresa para la producción de alcohol de cereales y un
control negativo utilizando cebada sin maltear y sin presencia de enzimas
amilolíticas (Ver Tabla 4).
Tabla 4. Resumen del diseño experimental
Concentración de
Sustrato
Ensayo
1
2
3
4
5
Control De
Comparación
Control Negativo
Concentración de
Enzimas
Cebada
Malteada
Cebada
Sin
Maltear
α-amilasa
β-amilasa
-
250g/L
250g/L
250g/L
250g/L
250g/L
5 mL/L
10 mL/L
15 mL/L
20 mL/L
25 mL/L
5 mL/L
10 mL/L
15 mL/L
20 mL/L
25 mL/L
250g/L
-
-
-
-
250g/L
-
-
Fuente: Autor.
42 Todos los ensayos de hidrólisis se llevaron a cabo en un erlenmeyer de 2 litros en
shaker termostatado, bajo las mismas condiciones de experimentación (Cáceres et
al., 2008) (Ver Tabla 4). Para esto se tomaron 250 g, (25 % (p/p)) de cebada sin
maltear y se mezclaron con 500 mL de agua destilada tibia durante 15 minutos,
seguidamente se adicionó un volumen de 500 mL de buffer de acetato de sodio
0.05M (pH 5.5) (Frigard et al., 2002). La hidrólisis del almidón se realizó en dos
etapas. En la primera o licuefacción, se añadió la α-amilasa termoestable durante 2
horas a 95ºC y pH 5.5. Para la sacarificación se adicionó la β- amilasa a 57ºC y pH
5.5 durante 6 horas (Linde et al., 2008). La hidrólisis de la mezcla se detuvo por
adición de HCl 2M hasta pH 1.5-1.6. Finalmente se ajustó el pH a 5-6 (Shariffa et
al., 2008) y las muestras se almacenaron
a -20ºC para la determinación de
azúcares reductores al final del proceso (Ebrahimi et al., 2007). Este procedimiento
se realizó por duplicado.
Las concentraciones de enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L evaluadas
fueron 5, 10, 15, 20 y 25 mL/L, establecidas de acuerdo a ensayos previos
realizados en la destilería bajo las mismas condiciones, en los cuales el manejo de
una concentración inferior a 2 ml/L no representaría un mejoramiento en el proceso
hidrolítico del almidón de cebada no malteada, Sin embargo, este rango de
concentraciones también se establecieron por propuesta por parte del personal de
calidad en base a la experiencia que estos poseen e interés de experimentar bajo
este rango de concentraciones. A su vez se tuvieron en cuenta los resultados
obtenidos por Chen et al. (2007) y Kolusheva y Marinova (2007), los cuales
reportaron rendimientos de hidrólisis satisfactorios.
5.2.1.1 Control de comparación
Se tomaron 250 g, 25 % (p/p) de cebada malteada mezclándolos en un 1 L de
agua destilada a 45ºC durante 55 minutos, seguidamente se realizó la escala de
temperatura establecida por la experiencia de la empresa de la siguiente forma:
52°C por 30 min, 62°C por 1 hora y 72°C por 30 min, con el fin de asegurar que los
almidones de la cebada se transformen en azúcares, posteriormente se separó el
mosto de cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a
fermentar esté libre de cascarilla, obteniéndose así un mosto o hidrolizado para
43 realizar el proceso de fermentación. Las muestras fueron almacenadas a -20ºC
para la determinación de azúcares reductores (Ebrahimi et al., 2007). Finalmente el
mosto obtenido se fermentó bajo las mismas condiciones de experimentación con
las enzimas comerciales.
5.2.1.2 Control negativo
Este control se desarrolló bajo las mismas condiciones amilolíticas y fermentativas
del control de comparación utilizando cebada sin maltear y sin adición de enzimas
durante el proceso hidrolítico.
5.2.2
Rendimiento del proceso de hidrólisis
El rendimiento de la hidrólisis enzimática fue calculada de acuerdo a la formula
reportada por Chen et al. (2007):
Azúcares reductores x 0,9x 100
Rendimiento de Hidrólisis (%) =
Polisacárido en el sustrato
5.2.3
Condiciones de fermentación
5.2.3.1 Pruebas preliminares
Se
realizó
una
fermentación
previa
bajo
las
mismas
condiciones
de
experimentación de los tratamientos de hidrólisis con enzimas, empleando como
sustrato mosto producto de la hidrólisis de cebada malteada, el cual se preparó bajo
las mismas condiciones del control de comparación, con el fin de determinar el
tiempo de duración de la fase aeróbica empleando tapón de algodón para los
erlenmeyes; y durante la fase anaeróbica empleando tapón de caucho con filtro de
salida de gases, para asegurar el crecimiento y fermentación de Saccharomyces
cerevisiae Safwhisky M-1. La determinación de las fases se realizó cuantificando la
concentración de biomasa en células/mL con cámara de Neubauer durante la
fermentación, con el fin de establecer la duración de la fase exponencial o aeróbica
y de esta forma observar el momento en el cual el crecimiento de la levadura se
44 vuelve estacionario dando lugar a la producción de alcohol en un ambiente
anaerobio.
5.2.3.2 Preparación de inóculo
Se sembró 1 g de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 en 1 litro de mosto
producto de la hidrólisis del almidón de la cebada malteada preparado bajo las
mismas condiciones del control de comparación, no estéril, sin complementos
nutricionales o ajuste de pH, en erlenmeyer, incubando con agitación a 30ºC, 100
rpm por 24 h (Siqueira et al, 2008).
Figura 4. Reproducción del inóculo.
Fuente: Autor.
5.2.3.3 Fermentación
Las fermentaciones se llevaron a cabo en erlenmeyers de vidrio de 2L con un
volumen de trabajo de 1L (incluido el inóculo). Se inoculó un 10 % de inóculo a una
concentración de 1, 06 x106 UFC/mL de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1
en el producto de las hidrólisis con las diferentes concentraciones de enzimas y
controles (Ebrahimi et al., 2007). Se adicionó sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno en una concentración de 1,5 g/L y se incubó en aerobiosis a 35 ± 2ºC con
agitación de 100 rpm, durante el tiempo determinado en el ensayo previo de
fermentación (numeral 5.2.3.1) (Cáceres et al., 2008). Pasado este tiempo se
45 cambió el tapón de algodón por un tapón de caucho con filtro de salida de CO2, para
dar inicio a la fase de fermentación en condiciones anaeróbicas. Se tomaron
muestras cada 12 horas para determinar biomasa (Cáceres et al., 2008). La
concentración de azúcares reductores y etanol se determinaron al final del proceso
de fermentación. Todos los ensayos se realizaron por duplicado.
5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA
La concentración de biomasa en células/mL se cuantificó con cámara de Neubauer
(Alfenore et al., 2002) (Ver Anexo 3).
5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES
Y ALMIDÓN.
5.4.1
Determinación del título de la solución de Fehling.
Se valoró la solución de Fehling con la solución de glucosa al 0.5% (p/v) a partir de la
cual se calculó el contenido de azúcares reductores (NTC 5146, 2008).
Se vertieron 5 mL de solución de Fehling A y 5 mL de solución de Fehling B (Ver
Anexo 1) en un erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de agua destilada, agregando
perlas de ebullición, para regular la ebullición, llevándose posteriormente a ebullición
sobre la estufa con malla de asbesto durante 1.5-2 minutos. Mientras se va agitando
el vaso se añade la disolución de glucosa al 0.5 % (p/v) desde una bureta hasta que
solo quede una coloración azul suave, añadiendo 5 gotas de azul de metileno al 1 %
y se continua la valoración (Ver Figura 5). El punto final corresponde al cambio de
coloración de azul de metileno a rojo ladrillo. Entre el comienzo de la ebullición y la
terminación de la valoración no deben transcurrir más de 3 minutos, además se
debe mantener la ebullición durante la valoración (NTC 5146, 2008).
La determinación se debe repetir hasta que los resultados no difieran en ± 0.2 mL.
El título se calculó mediante la siguiente ecuación (NTC 5146, 2008):
T = (Pg) x (Vg) 100 mL de la solución 46 T = Título: gramos de glucosa empleados para titular la solución de Fehling.
Pg = Peso de glucosa empleado para preparar la solución patrón, en gramos.
Vg = volumen del patrón para titular la solución de Fehling, en mL.
Figura 5. Reacción de Fehling.
Fuente: Autor.
5.4.2
Valoración de la muestra
En un erlenmeyer limpio se agregó 5 mL de solución A, 5 mL de solución B de
Fehling, 150 mL de agua destillada y unas perlas de vidrio. Procediéndose como se
47 indico el numeral 5.4.1, pero empleando como titulante el filtrado recogido de las
muestras con las diferentes concentraciones de enzimas y controles (NTC 5146,
2008).
5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores
El volumen de muestra y los gramos de solución de glucosa gastados para titular la
solución de Fehling, son equivalentes (NTC 5146, 2008).
Azúcares reductores expresados en gramos de glucosa/ L de producto (NTC 5146,
2008):
Gramos glucosa/L =
1000 mL x Título
V gastado x V alícuota 5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL
Para la determinación de la concentración de etanol
se utilizó el método por
destilación y estimación del contenido alcohólico por determinación de la gravedad
específica. En este método el producto se sometió a destilación en condiciones
especificadas, determinándose la densidad del destilado y con este valor y
utilizando tablas correspondientes se calculó el grado alcoholimétrico (NTC 5113,
2008).
5.5.1
Destilación
Utilizando un matraz aforado de 250 mL, se llenó casi hasta la marca con la muestra
y colocándose en un baño a temperatura constante a 20ºC por una hora.
Manteniéndolo en el baño, se completó el volumen con la cantidad necesaria de
muestra, a 20ºC. Teniendo instalado el destilador, se vertió en el matraz con la
ayuda de un embudo la muestra contenida en el balón aforado; lavándose el
recipiente que contiene la muestra y el embudo, con tres porciones de 15 mL de
agua destilada, las cuales se añaden al matraz de destilación, retirando el embudo y
agregando una pequeña cantidad de regulador de ebullición, tapando y dando
comienzo a la destilación, recogiendo el destilado en el mismo matraz en que se
48 midió la muestra. El matraz en el que se recoge la muestra debe tener previamente
10 mL a 20 mL de agua, en los que se sumerge la punta de un tubo que prolonga el
refrigerante (NTC 5113, 2008).
Figura 6. Destilación de las muestras.
Fuente: Autor.
El calentamiento se reguló de tal forma que la destilación ocurra sin sobresaltos de
manera lenta pero continua. Se continúo la destilación hasta que el destilado llegue,
aproximadamente, hasta los hombros del matraz. Se suspendió la destilación, se
retiró el tubo colocando en la parte interior del refrigerante y lavando con agua, por
dentro y por fuera, sobre el mismo matraz pero sin llegar al cuello de éste. Se colocó
el matraz en el baño de temperatura contante a 20ºC por una hora y, sin retirarlo del
baño, se completó a volumen con agua a 20ºC. Una vez terminada la destilación y
completado a volumen el destilado, se procedió a determinar su gravedad específica
por el método del picnómetro, para lo cual se pesó un picnómetro vacío, limpio y
seco (NTC 5113, 2008).
49 Se llenó con agua a 20ºC y se pesó para obtener el peso del agua contenida. Se
desocupó el picnómetro, se lavó varias veces con pequeñas cantidades del
destilado, llenandolo con el destilado a 20ºC y volviéndolo a pesar para obtener el
peso del destilado (NTC 5113, 2008).
Figura 7. Determinación del peso del destilado.
Fuente: Autor.
5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica
La gravead específica se calculo por la siguiente fórmula (NTC 5113, 2008):
Peso del destilado
Gravedad específica =
Peso del agua
Con los resultados obtenidos se calcularon los grados alcoholimétricos, por medio
de las tablas correspondientes (NTC 5113, 2008).
5.6 VARIABLES DE ESTUDIO
•
Las variables independientes de estudio son la concentración de α y β amilasas.
50 •
Las variables dependientes son la concentración de azúcares reductores,
formación de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, y producción de etanol.
5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN
Se realizó una revisión bibliográfica en el compendio de norma técnicas y guías de
implementación de normas del sector bebidas alcohólicas del ICONTEC, libros,
artículos científicos, revistas especializadas en el tema y normas relacionadas con la
elaboración y calidad microbiológica de las bebidas alcohólicas, específicamente
para aquellas producidas a partir de cebada. Así mismo, la preparación de reactivos,
medios de cultivo y el desarrollo de los métodos se realizaran según Procedimientos
Operativos Estándar.
Todos los resultados obtenidos serán llevados en una bitácora, anotando la fecha
de montaje experimental, evolución, observaciones, fecha de análisis y los
resultados obtenidos.
5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó un análisis de varianza
y se aplicó la prueba de Tukey para determinar si entre los niveles de cada factor
hay diferencias significativas. Las variables de respuesta fueron biomasa,
concentración de azúcares reductores y producción de etanol.
La hipótesis nula será que hay igualdad de medias entre los niveles para cada
factor, así:
Para el factor α amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes
Para el factor β amilasa:
Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25
Ha: Al menos dos son diferentes.
51 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS
Para poder iniciar el estudio, fue necesario determinar la concentración de almidón
presente en cada una de las cebadas empleadas, en donde se encontró que la
cebada malteada posee un 80% de almidón y la cebada sin maltear un 60%, como
se puede observar en la Tabla 5.
Tabla 5. Resultados de la concentración de almidón realizados a la cebada mateada
y sin matear.
Tipo
% Almidón
Representación
Cebada
malteada
80
Cebada sin
maltear
60
Estos valores concuerdan con los mencionados en el marco teórico (Ver Tabla 1).
Descartándose
que cualquier irregularidad en los ensayos sea ocasionada por
limitación de la concentración de almidón. En el trabajo realizado por Chen et al.
52 (2007), se describe que la concentración de sustrato resulta ser un factor crítico en
el momento de la liberación de azúcares reductores, sustentando de manera
confirmativa lo descrito anteriormente, es decir, a mayor concentración de sustrato
la cantidad de azúcares reductores disponibles para la levadura se incrementan.
Considerando de esta forma a estas cebadas como sustratos manejables para la
levadura, y su fermentación (Santander, 2006), debido a que la concentración de
azúcares fermentables producidos en el proceso de hidrólisis de almidón de cebada
determinarán más adelante las condiciones de fermentación para la producción de
etanol.
6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR
Para establecer la concentración óptima de α y β amilasas comerciales en la
obtención de etanol a partir de cebada sin maltear empleando Saccharomyces
cerevisiae, se tuvieron en cuenta los siguientes factores: concentración de azúcares
reductores, pH, temperatura, formación de biomasa y producción de etanol.
En orden a lo citado anteriormente, se experimentó con una concentración de
cebada de 250 g/L, estipulada como la dosis equivalente en una base de cálculo de
un litro, a la concentración empleada a escala industrial determinada en base a la
experiencia práctica y teórica de la destilería, asegurando de esta forma el consumo
total de los azúcares por parte de la levadura. Esta concentración se confirma con lo
reportado por Kolusheva y Marinova (2007), quienes obtuvieron la mejor condición
de hidrólisis de almidón con una concentración de sustrato de 250 g/L, ya que
evidenciaron una inhibición generada por los azúcares reductores obtenidos durante
la hidrólisis del sustrato en concentraciones superiores al 250 g/L. Para probar esta
hipótesis, investigaron la influencia de la concentración de la glucosa añadida al
sustrato sobre el tipo de reacción enzimática, concluyendo que la adición de glucosa
en el inicio del proceso de hidrólisis, reduce significativamente la velocidad de
reacción del proceso, y
el porcentaje de esta reducción es proporcional a la
cantidad de glucosa añadida.
Como es conocido, la tasa máxima de reacción enzimática es proporcional a la
concentración de enzimas (Kolusheva y Marinova, 2007), por lo tanto, se determinó
53 la concentración de alfa y beta amilasas comerciales necesaria para degradar el
almidón presente en la cebada no malteada, de tal forma que
Saccharomyces
cerevisiae utilice los productos de la hidrólisis como fuente de energía. Se examinó
esta influencia en un rango de concentraciones entre 5-25 mL enzimas por litro de
suspensión. En la Gráfica 1 se observa la relación obtenida entre la concentración
de azúcares reductores y las dosis de enzimas adicionadas para el proceso
hidrolítico, evidenciando cómo la concentración de azúcares reductores aumenta a
medida que se incrementa la dosis de enzima, hasta la concentración de de 20
mL/L, como respuesta a la hidrólisis de almidón, demostrándose que el medio y las
condiciones utilizadas para el proceso hidrolítico, llevado a cabo por
la acción
catalítica de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L fueron los
adecuados. Sin embargo, Kolusheva y Marinova (2007) reportan, que la mayoría de
las veces la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con α-amilasas y con menos
frecuencia son empleadas las β-amilasas, demostrándose con los resultados
obtenidos que estas dos enzimas pueden llegar realizar una labor sinérgica para
hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear. Además, de acuerdo con lo reportado
Eglinton (1998), las beta-amilasas son enzimas claves en la degradación del
almidón de la cebada germinada (Hordeum vulgare L.), la cual es sintetizada
durante el desarrollo de la cebada grano, en contraste con otras importantes
enzimas hidrolíticas que son sintetizados durante la germinación.
Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de
enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la
hidrólisis por 8h.
54 En la Gráfica 1 se observa, que el valor obtenido de azúcares reductores en el
control negativo, fue inferior en relación a los valores obtenidos en todos los
ensayos con enzimas, demostrando que efectivamente se logró hidrolizar el almidón
de la cebada sin maltear reflejándose en el aumento de la concentración de
azúcares reductores, desaparición del característico color azul con yodo (Ver Figura
Anexo 5.2), y en la turbidez y color del medio (Ver Figura Anexo 5.1) (Norris y
Richmond, 1981).Por lo que se podría considerar el uso estas como una ayuda para
mejorar el rendimiento hidrolítico del almidón de la cebada sin maltear, utilizada en
el proceso de producción de la destilería.
Teniendo en cuenta, que generalmente la acción de α y β amilasas sobre el almidón
natural de los granos no es muy efectiva por que estos presentan una resistencia a
la digestión amilolítica (Sarikaya et al., 2000), los valores obtenidos de las
concentraciones de azúcares reductores, demuestran lo reportado por Lauro (2001),
donde la acción hidrolítica de las amilasas sobre el almidón de granos de cebada se
lleva a cabo porque estas enzimas erosionan la superficie del grano o digieren
canales en puntos seleccionados en la superficie hacia el centro del grano,
permitiendo la difusión de la enzima hacia el sustrato, la adsorción de la enzima
sobre el sustrato y el evento catalizador.
En la Gráfica 1, se evidencia una caída en los valores de la concentración de
azúcares reductores entre la concentración con 20 mL/L y 25 mL/L, la causa de este
hecho según lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), se debe a que entre
mayor sea la concentración de enzimas y menor sea el sustrato disponible, la tasa
de reacción disminuye, porque hay menos lugares de reacción activos disponibles
para hidrolizar el almidón, generando una limitante por exceso de enzimas.
Comparando los resultados anteriores, se determinó que la concentración óptima
de enzimas para producción del mosto ó hidrolizado de fermentación es 20 mL/L, ya
que la utilización de concentraciones mayores no se traduce en un aumento de la
tasa de reacción enzimática (Tabla Anexo 4.1).
Kolusheva y Marinova (2007), reportan en su trabajo que los parámetros básicos
que afectan al proceso de hidrólisis son la temperatura, el tiempo de hidrólisis, el pH
55 del medio, la concentración del sustrato y la concentración de la enzima, los cuales
varían dependiendo de la enzima. Teniendo en cuenta lo anterior, todos los ensayos
se desarrollaron bajo las mismas condiciones de pH (5.5), temperatura (95oC para
α- amilasa y 57oC para β-amilasa), y tiempo de hidrólisis (8 horas). Los resultados
obtenidos del proceso hidrolítico, concuerdan con los obtenidos en el estudio de la
influencia de la temperatura sobre la tasa de hidrólisis por Kolusheva y Marinova
(2007), quienes determinaron que la tasa de la reacción enzimática es casi idéntica
a 90°C y 100°C, eligiendo 90°C como la temperatura óptima. De igual forma, Hill et
al. (1997) reportaron que la mayor tasa de hidrólisis obtenida con una α-amilasa fue
pH 5.5. En cuanto al tiempo de hidrólisis, Kolusheva y Marinova (2007) en sus
resultados sobre la influencia del tiempo de hidrólisis en la concentración de
azúcares reductores, obtuvieron la máxima concentración de azúcares reductores y,
por ende, el nivel máximo de hidrólisis después de 4 horas y 15 minutos. Sin
embargo, reportan que el comportamiento hidrolítico de otra amilasa termoestable,
sintetizada por B. licheniformis MB-80 tuvo una duración superior a 7 horas, lo que
concuerda con el tiempo empleado para la hidrólisis del almidón de cebada, y
confirmándose con los valores de las concentraciones de azúcares reductores de la
Grafica 1.
Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidrolítico.
Dosis de Enzimas
Rendimiento de
(mL/L)
hidrólisis (%)
5
66.9964
10
67.3686
15
73.1762
20
89.4376
25
65.3359
Control de
41.8491
comparación
Control Negativo
3.8570
56 Otro parámetro evaluado fue el rendimiento de hidrólisis, estos datos están
presentados en la Tabla 6, exhibiendo que la prueba con el mejor rendimiento de
hidrolisis fue con la dosis con 20 mL/L (89,44%), seguida de la dosis con 15 mL de
enzimas (73.17%), demostrándose que la presencia de enzimas es fundamental
para la obtención de un mejor rendimiento hidrolítico, ya que en todos los
tratamientos con enzimas y en el control de comparación se obtuvo un rendimiento
satisfactorio en relación al control negativo, en el cual la concentración de amilasas
es insuficiente para la degradación completa del almidón presente en la cebada,
razón por la cual el valor del rendimiento de hidrólisis es bajo.
Al igual que en la liberación de azúcares reductores, la tendencia seguida por el
rendimiento de la hidrólisis enzimática es similar, tal como se aprecia en la Gráfica
2, coincidiendo con lo reportado por Chen et al. (2007), quienes reportaron este
parámetro para la determinación del efecto de la concentración de sustrato y de
enzimas en el proceso de hidrólisis enzimática, donde la concentración de azúcares
reductores tenía una tendencia de variación similar al rendimiento de hidrólisis,
aumentando ambas a medida que la concentración de enzimas era mayor.
Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en
función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control
negativo.
57 Los análisis estadísticos fueron realizados por medio del programa computarizado
SPSS vs 10, en donde se cumplió la hipótesis alterna (ver numeral 5.8),
presentando diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.1 y
9.2), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
concentración de azúcares reductores (p<0,005) y del rendimiento de la hidrólisis
enzimática (p<0,005), obteniendo la mayor concentración de estos en el tratamiento
con 20 mL/L de enzimas.
6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN
La conversión de glucosa a etanol es llevada a cabo por muchas levaduras, pero
muy pocas bacterias. En los procesos industriales generalmente es utilizada
levadura del género Saccharomyces, ya que posee un rendimiento teórico de 51.1%
(p/p) (Glazer y Nikaido, 1998), además de ser un microorganismo no patógeno
anaerobio facultativo (Navarro y Sossa, 2003). Por esta razón y por ser esta la
levadura empleada en Destilería Premier LTDA. en su proceso productivo, se
seleccionó Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1 para la fermentación de
los mostos generados en el proceso de hidrólisis (Ver Anexo 12).
Para predecir el desarrollo de la fermentación fue necesario conocer la curva de
crecimiento de la levadura (UFC/mL), determinado los intervalos de tiempo para la
fase aerobia y anaeróbica, debido a que las levaduras en aerobiosis oxidan los
azúcares simples como la glucosa hasta gas carbónico y agua por la vía de Embden
Meyerhoff Parnas y después el ciclo de Krebs, para producir ATP, NADH+H+ y
formar radicales carbonados intermediarios en la biosíntesis celular. Mientras que
en anaerobiosis se produce etanol y CO2 (Madigan et al., 2003). Razón por la cual,,
se realizó una fermentación previa, empleando un hidrolizado de cebada obtenido
bajo las mismas condiciones de experimentación del control comparación tal como
se observa en la Gráfica 3, evidenciando que a partir de la hora 6 empieza una fase
logarítmica hasta la hora 36 de fermentación. Navarro y Sossa (2003), reportan que
la glucosa (azúcar reductor) que es la fuente principal de carbono en el medio
disminuye con el paso del tiempo, reflejándose en el aumento de la biomasa. A la
hora 48 de fermentación se presenta la mayor cantidad de UFC/mL con un recuento
58 de 2,88x 109 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Sin embargo el
recuento entre la hora 36 y 48 no presentó un aumento significativo, como se puede
ver en la Gráfica 3, determinando que la fase aeróbica de fermentación de los
tratamientos con enzimas y controles seria durante las primeras 36 horas de
crecimiento de S. cerevisiae Safwhisky M-1, teniendo en cuenta que muchas
fermentaciones anaeróbicas requieren una fase inicial de crecimiento aeróbico como
es el caso de la producción de dextranos, alcoholes y 2,3 etilenglicol, y sólo
después, en la fase de producción se generan condiciones reductoras (Rhodes y
Fletcher 1969).
Gráfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo
previo de experimentación.
En la gráfica 3, se observa una fase estacionaria corta, con una duración de 24
horas, es decir entre la hora 36 y a la 60. A partir de la hora 60 empieza la fase de
muerte de la levadura, donde disminuye la viabilidad celular hasta finalizar con un
recuento de 8,0 x 108 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Estudios
han demostrado el papel que tienen los esteroles en la fermentación de cerveza y
whisky, estando conectados con la necesidad de oxígeno en el proceso de
fermentación. En el estudio realizado por Aries et al. (1977), observaron que el
oxígeno durante la fermentación es necesario para la ciclización del escualeno a
59 lanosterol. En ausencia de oxígeno, el escualeno se acumula y el contenido de
esteroles disminuye, reduciendo el crecimiento de la levadura, mientras que en
presencia de oxígeno conduce a una mayor síntesis de ergosterol, concurrente con
el aumento en el crecimiento de la levadura. En otro estudio, realizado por
Hayashida y Ohta (1980), se demostró el papel del ergosterol sobre la tolerancia del
etanol, complementando las células con ergosterol solo y ergosterol con ácido oleico
durante 48 h, evaluándose la indurabilidad de las células y la acción fermentativa
en presencia de alcohol (20%). Se observó que el oleato de ergosterol ligeramente
promueve el crecimiento, mientras que en alcohol la indurabilidad de las células fue
notablemente mayor. Aunque el ácido oleico y el ergosterol en combinación mejoran
el crecimiento y el alcohol indurabiliza, ninguno de estos puede aumentar la
actividad fermentativa de las células. Por lo tanto, se sugirió que los esteroles son
cruciales para la promoción de la indurabilidad de células en presencia de alcohol
mediante el suministro de rigidez a la membrana. Una disminución en el contenido
de ergosterol de la membrana de la célula también ha sido directamente relacionada
con disminución de la viabilidad celular en presencia de etanol (Larue et al. 1980;
Lees et al., 1980).
Por último, de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo previo de
fermentación, se determinó que para los tratamientos con enzimas y controles, se
suspendería la entrada de aire a partir de las 36 horas, empleando un tapón de
caucho y filtro de salida de gases hasta terminar la fermentación, considerando que
partir de este punto inicia la fase estacionaria en donde la ausencia de oxigeno
favorece la fermentación de azúcares hasta etanol, terminado la fermentación a las
84 horas. A pesar que esta fermentación se dé durante un tiempo prologado, el
objetivo de dejar hasta la hora 84 fue recuperar el mayor volumen de etanol que las
levaduras pudieran producir, además de poder observa el comportamiento de las
levaduras durante este tiempo, a su vez se estableció este periodo de fermentación
en base a la experiencia de experimentación obtenida por parte del personal en la
destilería.
60 6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE
CEBADA SIN MALTEAR
Las levaduras son comúnmente los microorganismos más utilizados para la
fermentación alcohólica. El cultivo anaeróbico de Saccharomyces cerevisiae, genera
además de etanol, dióxido de carbono, glicerol y biomasa como los más importantes
subproductos (Brandberg et al., 2007). Siqueira et al. (2008), reportan en su trabajo
que para la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, realizaron la
propagación del inóculo bajo condiciones de agitación de 100 rpm y 30°C durante
24 horas. Condiciones que se adoptaron para la producción del inóculo de
Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1, con el fin de asegurar una gran
producción de biomasa, obteniendo un recuento de 1,06 x 106 UFC/mL. Para
evaluar el comportamiento de la levadura se evaluaron durante la fermentación
diferentes parámetros tales como la producción de biomasa (UFC/mL), y la
concentración de azúcares reductores y etanol al final de la fermentación.
En orden a lo mencionado anteriormente, de cada repetición de un tratamiento, se
sacó una curva de crecimiento promedio que permitió observar el comportamiento
de S. cerevisiae Safwhisky M-1 a lo largo de la fermentación en el hidrolizado de
cebada, producto de las diferentes concentraciones de amilasas comerciales
estudiadas. En la Gráfica 4, se observan las curvas de crecimiento obtenidas,
evidenciando que las células no necesitaron de una fase de adaptación, desde la
hora cero empezaron un crecimiento exponencial que terminó en la hora 48, a partir
de la cual la población empezó a disminuir, en este caso no se evidenció la fase de
muerte.
Reducir la fase de adaptación a cero horas, implica alcanzar en menos tiempo la
concentración de células necesaria para iniciar el proceso de fermentación, lo cual
es muy bueno para optimizar la reproducción llevada a cabo en planta (Santander,
2006). Además, la razón por la cual, a partir de la hora 48 la formación de biomasa
muestra un comportamiento estacionario, donde los valores de los recuento tienden
a disminuir, como se aprecia en las Tablas Anexo 6, es debido a que la glucosa
presente en el medio entra a un proceso glicolítico, seguido por uno fermentativo,
61 Gráfica 4. Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de
fermentación con las diferentes concentraciones de enzimas.
donde solo se genera un ATP en la primera etapa (glicolisis), lo que representa un
rendimiento más bajo que el obtenido por vía aerobia (Glazer & Nikaido 1998),
además del agotamiento de este azúcar en el medio.
La Gráfica 4, muestra el comportamiento obtenido de la población durante el
proceso de fermentación de 84 horas en los mostos resultantes de la hidrólisis con
las amilasas. Al comparar los datos obtenidos, no se observa que una diferencia
significativa entre los recuentos de los diferentes ensayos, sin embargo las curvas
con mejor desempeño fueron aquellas donde el medio fue tratado con las
concentraciones más altas de enzimas (Ver Tablas Anexo 6 y Gráficas Anexo 7). La
población de todos los ensayos tienden a aumentar con el transcurso del tiempo
durante las primeras horas de fermentación aproximadamente hasta la hora 48, con
excepción del ensayo con 5mL/L (Hora 54); momento en el cual se obtiene la
biomasa máxima para todos los tratamientos, a partir de este punto se evidencia un
descenso de la población, debido al agotamiento del sustrato, en este caso glucosa,
ya que los valores obtenidos de la concentración de azúcares reductores al final de
la fermentación son inferiores a los obtenidos al inicio de la fermentación (Ver Tabla
Anexo 6.9). Además, S. cerevisiae tiene la capacidad de alcanzar tasas de glicolisis
62 y de producción de etanol en condiciones óptimas en poco tiempo, pero esta tasa se
mantiene sólo por un breve período durante la fermentación y disminuye
progresivamente a medida
que el etanol se acumula en el medio (Casey y
Ingledew, 1977; Ingram y Buttke, 1984; Moulin et al., 1984). Estudios anteriores han
identificado una necesidad esencial de lípidos (Beavan et al., 1982; Casey et al.,
1984; Thomas et al., 1978) u oxígeno molecular para la biosíntesis de los lípidos
(Andreason y Stier, 1954; Buttke et al., 1980; Buttke y Pyle, 1982) en muchos
medios de fermentación para el mantenimiento de una actividad fermentativa alta. El
suministro de estas necesidades nutricionales reduce, pero no elimina la
disminución de la actividad fermentativa durante la fermentación. Se conoce que el
etanol altera la permeabilidad de membrana y la función de la membrana en una
variedad de sistemas biológicos (Casey y Ingledew, 1986; Ingram y Buttke, 1984).
En levaduras, el etanol provoca un aumento en el flujo de iones de hidrógeno a
través de la membrana plasmática de las células suspendidas en agua (Cartwright,
et al., 1986). Este aumento de flujo de iones de hidrógeno se ha propuesto como el
responsable de la inducción del etanol, disminuyendo las tasas de transporte
observadas en condiciones similares (Beavan, 1982; Leao y Van Uden, 1982; Leao
y Van Uden,1984; Leao y Van Uden,1984). Demostrándose que la acumulación de
etanol no puede ser el único factor responsable para la disminución de la actividad
fermentativa, ya que la sustitución del medio de fermentación que contiene etanol
por uno nuevo que carece de este, no restablece inmediatamente la actividad
fermentativa (Dombek y Ingram, 1986.). Millar et al. (1982) demostró que las
concentraciones de etanol por debajo del 12% (v/v) no desnaturaliza las enzimas o
causa una inhibición de la actividad apreciable in vitro. Dado a que el etanol no se
acumula dentro de levadura, pero si se difunde rápido en toda la membrana celular
(Dombek y Ingram, 1985; Guijarro y Lagunas, 1984), inhibiendo directamente las
enzimas glicolíticas intracelulares, sin embargo, reportan que es poco probable que
durante la fermentación se produzca una concentración del 12% (v/v) de etanol o
menos.
En la gráfica 4 también se observa, que las curvas de crecimiento de todos ensayos
con enzimas están muy cercanas a la curva de control de comparación, en especial
los tratamientos con concentraciones de enzimas mayores, lo que demuestra que
63 los hidrolizados de cebada fueron medios con concentraciones de azúcares
adecuadas para el desarrollo de Saccharomyces, logrando tener un comportamiento
muy cercano al establecido tradicionalmente por la destilería (control de
comparación). Sin embargo, teniendo en cuenta el valor obtenido de azúcares
reductores en el control de comparación (Ver Gráfica 1), se puede decir que en este
medio los azúcares liberados al medio son fácilmente asimilados por las levaduras,
favoreciendo una mayor formación de biomasa en relación a las curvas de
crecimiento obtenidas en los tratamientos con enzimas en los cuales todos
presentaron valores de azúcares reductores superiores a este control, no obstante,
este valor no indica que toda esta concentración sea aprovechable para las
levaduras, ya que de acuerdo con lo reportado por Hornesey (2003), estas enzimas
pueden producir altos niveles de monosacáridos pero relativamente poco azúcar
fermentecible.
En la Gráfica 5 se evidencia, que las barras que representan el valor de la biomasa
máxima alcanzada en los diferentes ensayos, tienden a alcanzar la misma altura, lo
anterior no expresa que todos los ensayos tengan el mismo valor de biomasa
máxima, por ejemplo el tratamiento con una concentración de enzimas de 25 mL/L
presento la población máximas más alta a la hora 48 (2,35 x 109 UFC/mL), seguido
por el control positivo (2,33x 109 UFC/mL), y las concentraciones de 20 mL/L,10
mL/L y 15 mL/L(2,15x109 UFC/mL, 1,98x109 UFC/mL, 1,83x109 UFC/mL,
respectivamente),
mientras que los valores más bajos fueron obtenidos en la
concentración de 5 mL/L (8,0x108 UFC/mL) a la hora 54 y en el control negativo
(7,75x108 UFC/mL). Aunque el ensayo llevado a cabo con 25 mL/L de α y βamilasas alcanzó el valor de biomasa máxima mayor y sabiendo que este es un
factor importante, no se escogió a esta dosis por la baja concentración de azúcares
reductores liberados en la hidrólisis del almidón de cebada, al descartarla le sigue
la concentración con 20 mL/L, en la cual se obtuvo la mayor concentración de
azúcares reductores, y el valor de biomasa máxima para esta no está tan alejado al
de la concentración con 25 mL/L, alcanzando la biomasa máxima, también a las 48
horas de fermentación.
64 Gráfica 5. Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo de
obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función de la concentración de
enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
En la Gráfica 5 se observa, que al incrementar la dosis de enzimas se favorece la
producción de biomasa a pesar que la diferencia entre ensayos no es
representativa. También se evidencia que el tiempo en el que alcanza S. cerevisiae
su biomasa máxima, se ve influenciado por la concentración de enzimas, como por
ejemplo, en el medio con 5 mL/L de enzimas S. cerevisiae alcanzó su biomasa
máxima a la hora 54 de fermentación, en comparación al tiempo en el cual S.
cerevisiae alcanzó su biomasa máxima en todos los demás tratamientos, el cual fue
a las horas 48 horas de fermentación.
Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de biomasa, se comprueba
que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.3 y
9.4), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la
formación de biomasa (p<0,005). Además se demostró, que la concentración de
enzimas no influye en el tiempo en el cual la levadura alcanza su biomasa máxima ,
ya que no se presentaron diferencias significativas, razón por la cual, S. cerevisiae
65 presentó una tasa de crecimiento diferente en cada tratamiento con una
determinada concentración de enzimas, debido a que en cada ensayo se obtuvo
una
concentración
diferente
de
azúcares
disponibles
para
la
levadura,
consumiéndolos como fuente de carbono y energía, independiente del tiempo de
fermentación.
6.4.1
Consumo de sustrato
La glucosa (azúcar reductor) es la fuente principal de carbono en los hidrolizados de
cebada, disminuyendo con el tiempo de fermentación, como se observa en la
Gráfica 6, evidenciando que las concentraciones de azúcares reductores obtenidas
en el proceso de hidrólisis caen drásticamente hasta una concentración determinada
para cada ensayo, especialmente en los tratamientos con las concentraciones de
enzimas más altas. Este descenso o consumo de sustrato, es causado por que los
azúcares disponibles en el medio son utilizados por la levadura como fuente de
carbono. Se observa también, que el consumo de sustrato es proporcional a la
concentración de azúcares reductores iníciales de la fermentación, entre mayor sea
la fuente de carbono disponible, mayor será el consumo de sustrato por parte de la
levadura. Demostrando que la variación observada a nivel de población de S.
cerevisiae en los diferentes tratamientos con enzimas, se debe a la concentración
de azúcares disponibles, valor que está directamente determinado por la
concentración de enzimas presente en el medio.
El consumo de sustrato observado, demuestra que los azúcares reductores
presentes en el hidrolizado son fácilmente metabolizados por la levadura, ya que,
Saccharomyces cerevisiae posee una baja batería enzimática, donde solo puede
fermentar hexosas como: D-glucosa, D-fructosa y D-manosa, aunque no todas las
utiliza a la misma velocidad (Tuite y Oliver, 1991), indicando también que el azúcar
que posiblemente pueden estar presente en el hidrolizado es principalmente la
glucosa, a demás de ser el monómero constituyente del almidón.
66 Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de
la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Tabla 7, se observa que la variación entre los valores de la biomasa máxima
obtenidos, no es tan grande como la del consumo de sustrato, en relación a la
concentración de enzimas, por lo que se puede decir que la presencia de las
enzimas influye en el aprovechamiento del sustrato para producir biomasa
(Santander, 2006). Sin embargo, al comparar el tratamiento con 15 mL/L de
enzimas, y el de 25 mL/L, el consumo de sustrato obtenido para estos es muy
parecido (42,312 g/L, 41,084 g/L, respectivamente), pero la biomasa producida con
ese mismo consumo es más alta cuando la concentración de enzimas es mayor.
Según estos resultados, adicionar una dosis de enzimas mayor al medio, hace más
eficiente el consumo de sustrato, la célula aprovecha los azúcares para producir
más
biomasa
que
para
otras
funciones
fisiológicas
(Santander,
2006),
demostrándose con los resultados obtenidos de formación de biomasa (Ver Gráfica
4), donde Saccharomyces cerevisiae incrementa su tasa de crecimiento a medida
que aumenta la concentración de enzimas, ya que en los tratamientos con dosis de
enzimas mayores, se obtuvieron las concentraciones de azúcares reductores y
consumos de sustrato más altos, confirmando que la levadura toma los azúcares
67 reductores presentes en el medio como fuente de carbono y energía (Navarro y
Sossa, 2003).
Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las
diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control
negativo.
Concentración
de enzimas
mL/L
Log
Biomasa
máx
(UFC/mL)
Sustrato
Consumido
(g/L)
5
8,902
36,159
10
9,295
38,274
15
9,261
42,312
20
9,332
53,400
25
9,371
41,084
C+
9,366
34,208
C-
8,889
0,159
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de biomasa máxima de 8,889 Log UFC/mL, mostrando una mínima
diferencia de 0,013 Log UFC/mL con el tratamiento de 5 mL/L de enzimas, teniendo
en cuenta que en este control no hay un elemento enzimático que realizara la
hidrólisis del almidón, se considera que este comportamiento se da, por la presencia
de fuentes de carbono diferentes a los azúcares liberados del almidón y de fácil
asimilación para la levadura, porque los valores obtenidos de azúcares reductores y
del consumo de estos para este control fueron muy bajos, razón por la cual, la
concentración de azúcares obtenida no tiene una correlación con el valor de
biomasa obtenido .
Como se observa en la Gráfica 7, el aumento de la dosis de enzimas influye en el
consumo de sustrato, mostrando un comportamiento de variación similar. Se
evidencia que la concentración de enzimas con mayor consumo de sustrato es la
recomendada en este estudio, 20 mL/L (53,4 g/L), sin embargo, en los tratamientos
68 70
Sustrato Consumido (g/L)
60
50
40
30
20
10
0
5
10
15
20
25
C+
C-
Dosis de Enzimas (ml/L)
Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajo las diferentes concentraciones de
enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo.
con las diferentes concentraciones de enzimas se observan consumos no tan
lejanos a los obtenidos en esta concentración, pero si superiores al control de
comparación (Ver tabla ANEXO 6.9), demostrándose, que el empleo de este tipo
enzimas favorece a la liberación de azúcares reductores en la hidrólisis del almidón
de la cebada sin maltear, los cuales serán asimilados por la levadura para su
mantenimiento celular. Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de
consumo de sustrato, se comprueba que existe diferencias significativas entre los
tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.5), confirmando que las dosis de enzimas influyen
significativamente en la formación de biomasa, obteniendo el mayor consumo en el
tratamiento con 20 mL/L de enzimas (p<0,005).
6.4.2
Producción de etanol
En la Gráfica 8 se observa, la concentración de etanol obtenido en la fermentación
con S. cerevisiae Safwhisky M-1 en función de la concentración de enzimas
utilizadas en el proceso hidrolítico. Se evidencia, que la tendencia que tiene la
concentración etanol es aumentar, a medida que se incrementa la dosis de enzima
69 (Ver tabla Anexo 6.11). El tratamiento con mayor producción de etanol fue con 20
mL/L de enzimas, comprobando que el aumento de la dosis de enzimas, favorece la
obtención de etanol. Sin embargo, los valores de etanol obtenidos en
la
concentración de 15 mL/L, en relación a los de la concentración de 20 mL/l
presentan una variación de solo 0,58% de etanol, por lo que el rendimiento de esta
concentración es muy cercano al mejor (20mL/L).
Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas,
(C+) control de comparación y (C-) control negativo.
En la gráfica 9, se observa que la producción de etanol en la concentración de
25/mL fue la menor en relación a los demás ensayos y al control de comparación,
indicando que en este caso, la levadura utilizó gran parte del sustrato para formar
biomasa y el remanente lo utiliza para la formación de producto, porque la biomasa
producida en este ensayo no tuvo mayor diferencia a la de los demás resultados
obtenidos, pero la influencia de esta concentración si se refleja en el sustrato
consumido y porcentaje de alcohol producido. De la misma forma, se observa que
para los demás tratamientos y control de comparación, la producción de etanol
requiere un consumo mayor de sustrato, observando una proporción directa entre
estos dos parámetros.
70 Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las
diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control
negativo.
Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae
alcanza un valor de etanol de 0,46 %, considerando que este valor, a pesar de ser
muy bajo, es obtenido posiblemente por la fermentación de azúcares liberados por
hidrólisis enzimática por acción de alfa y beta amilasas de la cebada, las cuales se
encuentran en concentraciones tan bajas que para un proceso productivo no son
representativas en relación a la concentración presente en la cebada malteada, sin
embargo, como se observa en la grafica 8, la concentración de enzimas presentes
en esta cebada tuvo la capacidad de liberar azúcares del almidón para producir este
valor de etanol, pero la naturaleza de estos azúcares son diferentes a la glucosa, ya
que el valor de azúcares reductores obtenido y el consumo de sustrato, reflejan un
comportamiento muy bajo, por lo que la levadura pudo realizar la fermentación a
partir de una fuente de carbono diferente a los azúcares cuantificados por el método
de Fehling.
Con el análisis estadístico se comprobó que existe diferencias significativas entre
los cinco tratamientos (p<0,005), (Ver Tabla Anexo 9.6), demostrando que los
tratamientos con una concentración de enzimas entre 15 y 20 mL/L, producen
71 mayor concentración de etanol, que en los tratamientos donde se utilizan dosis
menores o mayores a estas.
5
3
Etanol (%)
4
3
2
2
1
1
0
5
10
15
20
25
C+
C-
Y p/s (g de etanol/g azúcares reductores)
4
0
Dosis de enzima (ml/litro)
Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad
producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+)
control de comparación y (C-) control negativo.
En la Gráfica 10 (Ver Tabla Anexo 9.7) se observa la productividad del proceso, en
la cual, la relación de gramo de etanol producido por gramo de azúcar consumido no
presenta una diferencia considerable entre ensayos, sin embargo la influencia de las
dosis de enzimas si afecta este valor, ya que la producción de etanol depende de la
cantidad de azúcar consumido y por ende la concentración de azúcares producidos
en la hidrólisis por acción de una determinada concentración de enzimas. Estos
resultados concuerdan con lo referenciado por Siqueira et al. (2008) obteniendo
resultados donde el porcentaje de etanol generado, por gramo de sustrato
consumido en cada ensayo no presenta diferencias considerables. Por lo tanto se
concluye que la productividad con mejor comportamiento es para las dosis con 15 y
20 mL/L de enzimas, confirmando los demás resultados presentados donde el
desempeño de estas enzimas fue el óptimo para este estudio. Por otro lado, al
observar la Gráfica 9 y 10, se evidencia que la mayor concentración de etanol
obtenida fue con una concentración de enzimas de 20 mL/L, confirmando a esta
72 como la mejor concentración de alfa y beta amilasas, para la obtención de una alta
concentración de azúcares reductores fácilmente asimilables por Saccharomyces
cerevisiae.
Finalmente, se sometieron a una prueba sensorial los diferentes destilados
obtenidos en los diferentes tratamientos con las concentraciones de enzimas, con el
fin de determinar una posible alteración en la calidad organoléptica del alcohol
obtenido en estos ensayos, determinado que en ninguno de los ensayos se
presentó una alteración de sabor y olor, resultado que favorece y respalda la
propuesta de este ensayo, como lo es la utilización de enzimas comerciales como
alternativa en el proceso de producción en Destilería Premier, teniendo en cuenta
también experiencias similares en la destilería que presentaron un producto picante
y con deficiente aceptación por el panel de evaluación sensorial.
6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN
Chen et al. (2007), reportaron como el costo de las enzimas contribuye
significativamente al costo total del proceso de conversión de biomasa, donde la
dosis de enzimas debe ser minimizado tanto como sea posible. Teniendo en cuenta
esto, las concentraciones empleadas en este estudio se establecieron basándose
en las recomendaciones del proveedor, y en un ensayo previo con una dosis de 1
mL/L, dando este último un resultado desfavorable a nivel de hidrólisis y generando
un medio muy viscoso para la fermentación. La reducción de los costos de
producción son la esencia de la adopción de medidas contundentes en la mejora del
proceso manufacturero de la industria de destilería (Kłosowski, 2006), por lo tanto,
se calculó el costo de un litro de etanol producido en la destilería para un lote de
10.000 litros, el cual es de 4.428 pesos/litro como resultado de la destilación de un
volumen de 1.000 litros de etanol (Ver Anexo 10). Además, se determinó el costo
del mismo litro de alcohol, pero empleando una contracción de 20 mL/L de enzimas
para un lote de producción de 10.000 litros, dando como resultado que el litro de
alcohol tendría una equivalencia de 15.936 pesos/litro de etanol, en base a los
resultados obtenidos del presente estudio. Además, la propuesta de este estudio de
emplear únicamente cebada nacional como materia prima para el proceso hidrolítico
73 y fermentativo, presenta ventajas como ser 2.500 pesos/kilo más económica que la
cebada malteada, asimismo su disposición no requiere un proceso de importación.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se considera que el empleo de
las enzimas en una concentración de 20 mL/L como única herramienta hidrolítica
sustituyente de la cebada importada, no se favorece a nivel de rentabilidad en el
proceso productivo de las destilería. Sin embargo, la utilización de estas enzimas
como ayudante en el proceso de hidrólisis, especialmente para la degradación del
almidón de cebada sin maltear, favorecería el rendimiento de este proceso y tiempo
de producción, además de ser una posible solución a los problemas que en
ocasiones se presenta en el proceso productivo en la destilería, a nivel de tiempos
muy largos en la hidrólisis del almidón, incremento de la viscosidad, generando
apelmazamiento del medio y retraso en la producción, teniendo en cuenta que estas
enzimas contribuyeron en la disminución de la viscosidad del medio, de acuerdo con
los resultados obtenidos en el proceso hidrolítico (Ver Anexo 5)
Por otro lado, en este estudio se demostró que las enzimas empleadas para el
proceso amilolítico, realmente degradaron el almidón de la cebada sin maltear, por
lo que se podría considerar para futuros estudios el empleo de concentraciones de
sustrato mayores, empleando las mismas concentraciones de enzimas de este
estudio durante periodos de tiempo más largos y a su vez, concentraciones de
enzimas menores tales como las reportadas por Kolusheva y Marinova (2007), las
cuales fueron 6, 8, 10, 12 y 14 unidades de enzimas por mL, obteniendo un 30,2 %
de rendimiento de hidrólisis, teniendo en cuenta que entre mayor sea el uso de la
cebada nacional o sin maltear en el proceso productivo, mayor será el ahorro para la
destilería.
74 7. CONCLUSIONES
Con la concentración de enzimas propuesta (20 mL de enzimas/L suspensión) se
logró mejorar el rendimiento de hidrólisis en un 89,44 % en relación al que se
obtiene normalmente en la planta 41.85 %, considerando a esta como la dosis
óptima para la etapa hidrolítica del proceso de producción de alcohol cuando se
emplea como sustrato cebada sin maltear.
Las condiciones de experimentación en el proceso hidrolítico favorecieron la
degradación del almidón de cebada, logrando un medio con una temperatura y pH
favorable para la actividad de las enzimas, reflejándose en los valores de azúcares
reductores obtenidos en todos los tratamientos.
Todos los resultados obtenidos en el estudio, muestran que se puede producir
etanol a partir de almidón de cebada sin maltear empleando las enzimas Multifect®
AA 21L y Multifect® AA 23L, considerando el uso de α y β-amilasas comerciales
como una alternativa viable para la degradación del almidón de cebada sin maltear,
especialmente cuando se presentan problemas de hidrolisis del almidón de cebada
(apelmazamiento) en el proceso de producción, pero la producción del hidrolizado
requiriere más estudios de optimización para la obtención de una mayor gran
cantidad de azúcares reductores que sean asimilados rápidamente por la levadura y
así obtener mayores niveles de producción de etanol.
En etapa fermentativa, aumentar la concentración de enzimas de 15 a 20 mL/L
ayuda a incrementar la obtención de producto, sin embargo con la dosis de 25 mL/L
se presenta el hecho de tener más concentración de células en el medio,
generándose más necesidades nutricionales para el mantenimiento de la levadura y
menos disponibilidad de sustrato para la producción de alcohol.
El empleo concentraciones de enzimas comerciales en el medio de cultivo de
reproducción mejora la eficiencia de consumo de sustrato, elimina la fase de
adaptación del microorganismo y asegura la rápida obtención
75 de la biomasa
máxima a las 48 horas de fermentación dependiendo de la cantidad de enzimas
presentes en el medio.
El porcentaje de etanol obtenido al final de la fermentación fue de 4,98 % v/v por
destilación utilizando a Saccharomyces cerevisiae en hidrolizado de cebada sin
maltear con una concentración de enzimas de 20 mL/L, mostrando una
productividad de producto en sustrato de 0,0951 g de etanol/ g de azúcares
reductores.
Las pruebas realizadas mostraron que la ausencia de enzimas en la cebada no
malteada, puede ser reemplazada por amilasas comerciales donde el aumento en la
concentración de estas se ve reflejado en la obtención de concentraciones mayores
de producto, siempre y cuando esta concentración libere los azúcares reductores
necesarios para que la levadura pueda generar un buen nivel de etanol
La realización de este tipo de trabajos permite entender el proceso de producción de
alcohol y por lo tanto saber cómo influyen factores tales como la temperatura y el
tiempo de hidrólisis, concentración de azúcares reductores, tiempo de fermentación,
concentración de inóculo y por su puesto la concentración de enzimas,
obteniéndose así herramientas para solucionar los problemas que se puedan
presentar y bases para la optimización del proceso.
76 8. RECOMENDACIONES
Es necesario realizar al menos un ensayo de la concentración de enzimas
propuestas a nivel piloto en la planta, con el fin de confirmar la correspondencia de
los resultados obtenidos en el laboratorio, debido a que los resultados que se
obtienen en el proceso industrial son el punto definitivo para considerar a estas
enzimas como una alternativa rentable para la empresa, ya que en el laboratorio se
trato de simular al máximo el proceso de la destilería, las condiciones ambientales,
separación de afrecho, control de temperatura no se llevaron a cabo de forma igual,
por lo que los resultados pueden generar variaciones.
Realizar el proceso de hidrolítico bajo tiempos de hidrólisis más prolongados, con el
fin de poder obtener rendimientos interesantes empleando concentraciones
de
enzimas inferiores a la sugerida en este estudio.
Debido a que en este estudio no se determinó la concentración de
azúcares
reductores al durante el proceso de hidrólisis, al iniciar la fermentación y en la
fermentación, así como también la realización de un seguimiento de la producción
de etanol durante toda la fermentación, sería muy valioso continuar con la
investigación teniendo en cuenta estos aspectos, puesto que estos factores en la
industria de producción de alcohol son puntos de suma importancia que podrían
reportar resultados más significativos.
Es necesario realizar una cromatografía para conocer el tipo y cantidad de
componentes del hidrolizado, para identificar la naturaleza de las fuente
nutricionales que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae en la fermentación del
hidrolizados de cebada.
Establecer un procedimiento para la determinación de la actividad enzimática de las
enzimas, con el fin de determinar la tasa de reacción de estas a diferentes
concentraciones y en presencia del almidón de cebada no malteada.
77 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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87 10. ANEXOS
ANEXO 1. SOLUCIONES DE TRABAJO (NTC 5146, 2008)
1.1 Solución de glucosa al 0.5% (p/v)
•
Pesar 0.5 g de glucosa anhidra r.a.
•
Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 100 mL.
1.2 Solución A de Fehling
•
Disolver 34.639 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 .5H2O) en 500 mL
de agua destilada.
•
Dejar en reposo hasta que clarifique.
•
Filtrar empleando vacio, a través de asbesto o de un filtro Gooch.
1.3 Solución B de Fehling
•
Disolver 173 g de la sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) y 50 g de
hidróxido de sodio (NaOH) en 500 mL de agua destilada.
•
Dejar en reposo hasta que clarifique (alrededor de 48 horas).
•
Filtrar empleando vacio, a través de asbesto o de un filtro.
1.4 Solución indicadora de azul de metileno al 1%
•
Pesar 1g de azul de metileno.
•
Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 100 mL.
88 ANEXO 2. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE ALMIDÓN (NTC 5146,
2008)
•
Pesar 10g de la muestra.
•
Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 750 mL.
•
Adicionar 50 mL de HCl.
•
Poner en reflujo durante 5 horas.
•
Enfriar y neutralizar a pH 7 con NaOH 40%.
•
Pasar a balón aforado de 500 mL y completar volumen con agua destilada.
•
Filtrar si es necesario.
•
Titular la solución de almidón con Fehling de acuerdo al numeral 5.4.1.
•
Cálculo:
500 x T % Almidón = V x M
T: título de Fehling.
V: volumen gastado.
M: peso muestra.
89 ANEXO 3. METODO PARA RECUENTO CELULAR EN CÁMARA DE
NEWBAUER (Santander, 2006).
•
Tomar 1mL de la muestra a evaluar y depositarla en un balón aforado de 100
mL.
•
Agregar agua destilada al balón hasta el enrase, agitar y transferir el contenido a
un erlenmeyer de 125 mL.
•
Alegra al erlenmeyer 2 gotas de azul de metileno al 1% y homogenizar.
•
Limpiar cuidadosamente la cámara de newbauer y el cubreobjetos.
•
Colocar el cubreobjetos sobre la cámara de recuento.
•
Agitar el erlenmeyer con la muestrea.
•
Con un capilar se toma la muestra del erlenmeyer.
•
Llevar cuidadosamente la punta del capilar, junto a la unión del cubreobjetos y la
cámara de contaje.
•
Dejar fluir el líquido por capilaridad hasta llenar de muestra el área de conteo.
•
Evitar la formación de burbujas entre el cubre objetos y la cámara, o derramar
muestra fuera de la cámara y que esto es causa de errores del conteo real de
células de la muestra.
•
Si esto ocurre se debe lavar la cámara y reiniciar de nuevo el montaje.
•
Una vez montada la muestra en la cámara, llevar la cámara al microscopio y
enfocar en el área de recuento con el objetivo de 10X.
•
Una vez enfocada el área de recuento (Cuadro del centro), centrarla y pasarla al
objetivo de 40x.
•
El área utilizada para el recuento corresponde a 1mm2, el recuento se puede
hacer de 2 formas:
ƒ
Contando el número de células presentes en los 25 cuadros= 1/9 de la
cámara 1 mm2.
ƒ
Contando 1/5 del área de 1 mm2 o sea los cuatro cuadros de los
extremos y el cuadro del centro y el número obtenido se multiplica por 5.
•
Contar el número de células de la forma ya mencionada con ayuda de un
contador manual.
90 •
En número obtenido corresponde al número de células que hay en un área de 1
mm2.
Cálculos:
Concentración celular (# de Células x 106/mL)= X * EC*D*F
X: # de células en 1 mm3
C: Espesor de la cámara = 10
D: Dilución de la muestra = 100
F: Factor de conversión de mm3 a cm3 = 1000
91 ANEXO 4. TABLAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLÍTICO
Tabla4.1 Concentración de azúcares reductores del proceso de hidrólisis.
Concentración de
enzimas (mL/L)
AR (g glucosa/L)
Rendimiento de
hidrólisis (%)
5
42,6528
63,9792
10
44,8590
67,2884
15
48,1819
72,2728
20
59,1323
88,6984
25
43,3637
65,0455
Control de
comparación
37,1689
41,8150
Control Negativo
2,5710
3,8565
92 ANEXO 5. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLÍTICO
Figura 5.1. (a) Aspecto físico de los ensayos antes de la hidrólisis; (b) después
de la hidrólisis.
a b 93 Figura 5.2. Reacción de hidrólisis de almidón con yodo.
94 ANEXO 6. TABLAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIÓN
Tabla 6.1 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae durante el ensayo
preliminar.
Tiempo
(horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+06
6,033
6
1,18E+07
7,072
12
1,22E+08
8,086
24
1,30E+09
9,114
36
2,83E+09
9,451
48
2,88E+09
9,458
60
2,28E+09
9,357
72
1,73E+09
9,237
84
8,00E+08
8,902
Tabla 6.2 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
3,45E+07
7,536
24
6,25E+07
7,796
36
5,75E+08
8,756
48
7,50E+08
8,871
60
7,10E+08
8,851
72
5,50E+08
8,739
84
4,15E+08
8,480
95 Tabla 6.3 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 10 mL/L
de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
4,28E+07
7,630
24
6,05E+07
7,782
36
9,00E+08
8,954
48
1,98E+09
9,295
60
7,25E+08
8,860
72
5,50E+08
8,739
84
8,25E+08
8,916
Tabla 6.4 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 15 mL/L
de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
3,45E+07
7,536
24
6,25E+07
7,796
36
5,75E+08
8,756
48
7,50E+08
8,871
60
7,10E+08
8,851
72
5,50E+08
8,739
84
4,15E+08
8,480
96 Tabla 6.5 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 20 mL/L
de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
Tiempo (Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
6,25E+07
7,536
24
7,63E+07
7,796
36
1,33E+09
8,756
48
2,15E+09
8,871
60
9,00E+08
8,851
72
9,50E+08
8,739
84
1,05E+09
8,480
Tabla 6.6 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 25 mL/L
de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
8,40E+07
7,924
24
9,30E+07
7,968
36
1,68E+09
9,224
48
2,35E+09
9,371
60
9,00E+08
8,954
72
1,03E+09
9,007
84
9,25E+08
8,962
97 Tabla 6.7 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada
malteada (control de comparación).
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (células/mL)
Log Recuento celular
promedio (células/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
1,19E+08
8,074
24
1,29E+08
8,109
36
2,28E+09
9,357
48
2,33E+09
9,366
60
1,98E+09
9,296
72
1,43E+09
9,154
84
1,63E+09
9,211
Tabla 6.8 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no
malteada (control negativo).
Tiempo
(Horas)
Recuento celular
promedio (UFC/mL)
Log Recuento celular
promedio (UFC/mL)
0
1,08E+07
7,033
12
2,55E+07
7,405
24
2,88E+07
7,455
36
5,00E+08
8,699
48
7,75E+08
8,889
60
1,50E+08
8,151
72
1,50E+08
8,151
84
1,00E+08
8,000
98 Tabla 6.9 Datos concentración de azúcares reductores y consumo de sustrato
Concentración de
enzimas (mL/L)
Azúcares
Reductores
Iniciales (g/L)
Azúcares
Reductores
Finales (g/L)
Consumo de
Sustrato
(g/L)
5
42,664
6,5052
36,159
10
44,912
6,6380
38,274
15
48,784
6,4723
42,312
20
59,625
6,2246
53,400
25
43,557
2,4734
41,084
Control de
comparación
37,199
2,9914
34,208
Control Negativo
2,571
2,4124
0,159
Tabla 6.10 Datos biomasa máxima y tiempo de biomasa máxima
Concentración de
enzimas (mL/L) Biomasa máx
promedio
(UFC/mL)
Log Biomasa
máx promedio
(UFC/mL)
Tiempo
Biomasa Max
promedio
5
7,30E+08
8,9020
54
10
1,98E+09
9,2953
48
15
1,83E+09
9,2609
48
20
2,15E+09
9,3320
48
25
2,35E+09
9,3707
48
Control de
comparación
2,33E+09
9,3664
48
Control Negativo
7,75E+08
8,8891
48
99 Tabla 6.11 Datos concentración de etanol y productividad producto/sustrato
Concentración de
enzimas (mL/L)
% OH
Yp/s
5
3,015
0,083
10
3,435
0,090
15
4,44
0,107
20
5,02
0,095
25
2,98
0,073
Control de
comparación
3,76
0,110
Control Negativo
0,43
3,217
100 ANEXO 7. GRÁFICAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIÓN
Gráfica 7.1 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
10
Log UFC/ml
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)
Gráfica 7.2 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 10 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
10
Log UFC/ml
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
101 60
72
84
Gráfica 7.3 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 15 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
9,5
9,0
Log UFC/ml
8,5
8,0
7,5
7,0
6,5
6,0
5,5
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)
Gráfica 7.4 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 20 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
10
Log UFC/ml
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
102 60
72
84
Gráfica 7.5 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 25 mL/L de
Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L.
10
Log UFC/ml
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
60
72
84
Tiempo (horas)
Gráfica 7.6 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada
malteada (control de comparación).
10
Log UFC/ml
9
8
7
6
5
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
103 60
72
84
Gráfica 7.7 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no
malteada (control negativo).
10
Log UFC/ml
8
6
4
2
0
0
12
24
36
48
Tiempo (horas)
104 60
72
84
ANEXO 8. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO FERMENTATIVO
Figura 8.1. Sistema de incubación del crecimiento y fermentación de
Saccharomyces cerevisiae.
105 ANEXO 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Tabla 9.1. Resultados del análisis de varianza (ANOVA)
Tabla 9.2 Resultados del analisis estadistico para la concentración de
azúcares reductores.
106 Tabla 9.3 Resultados del analisis estadistico para Biomasa
Tabla 9.4 Resultados del analisis estadistico para el tiempo de biomasa
máxima
Tabla 9.5 esultados del analisis estadistico del Consumo de sustrato
107 Tabla 9.6 Resultados del analisis estadistico para la concentración de etanol
Tabla 9.7 Resultados del analisis estadistico de la productividad YP/S
108 ANEXO 10. COSTOS DE PRODUCCIÓN
Tabla 10.1. Cálculos de los costos de etanol sin enzimas comerciales.
Materia
Prima
Carge
Valor
para
Presentación
Total
10.000L
(Kilo)
(Pesos)
(Kilos)
Costo
Costo
Etanol
Litro
lote para
Producido
OH
10.000L
(Litros)
(Pesos)
(Pesos)
Cebada
Nacional
1
1.000
600
600.000
Cabada
Importada
1
3.500
600
2.100.000
Azúcar
50
72.000
1.200
1.728.000
1.000
4.428
Tabla 10.2. Cálculos de los costos de etanol con enzimas comerciales.
Valor 20
Valor
mL de
Presentación
Total
Enzima
enzimas
(Litros)
(Pesos)
(Pesos)
Costo de
OH
Costo
enzimas
OH
producido
litro de
para un producido
para
alcohol
lote de
(%)
10.000L
(Pesos)
10.000
(litros)
Multifect
AA 21L
1
8.000.000
Multifect
AA 23L
1
40.000
800
5,02
40.000
800
8.000.000
109 502
15.936
ANEXO 11. FICHA TÉCNICA Multifect® AA 21L
110 111 ANEXO 12. FICHA TÉCNICA Multifect® AA 23L
112 113 ANEXO 13. FICHA TÉCNICA Saccharomyces cerevisiae
114