PEPTIDASAS

PEPTIDASAS
Peptidasas: Hidrolizan la unión entre el carboxilo de un aminoácido y
el α-amino del siguiente (unión peptídica) en una proteína.
Pueden ser exopeptidasas, si hidrolizan a partir del extremo Nterminal
(aminopeptidasas)
o
del
extremo
C-terminal
(carboxipeptidasas), o endopeptidasas, si hidrolizan en cualquier
unión peptídica (según su especificidad).
Existen también dipeptidasas, dipeptidil-peptidasas, etc.
El término peptidasas suele reservarse para las enzimas que cortan
péptidos pequeños, en tanto que el de proteasas o proteinasas se
aplica más frecuentemente a las endopeptidasas capaces de
hidrolizar péptidos grandes y proteínas.
1
FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS.
1) Función digestiva.
a) Extracelular.
b) Intracelular.
2) Turnover proteico.
3) Procesamiento post-traduccional de proteínas.
a) Proteasas del péptido señal.
b) Proteasas de procesamiento de pro-Hormonas
y otras proteínas.
c) Dominio pro- en muchas proteinasas.
4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales).
2
CLASIFICACION DE LAS PEPTIDASAS.
Se las suele clasificar según los siguientes criterios:
1) Por la reacción catalizada: Son pocos los casos en que se
conoce exactamente la reacción catalizada, en términos de qué
unión es hidrolizada en el substrato.
Se aplica sobre todo a exopeptidasas.
2) Por el mecanismo catalítico: Es la más usada, desde su
propuesta por Brian Hartley hace más de 30 años. Se basa en
cuáles son los grupos que intervienen en la catálisis y en cómo
actúan.
3) Por su secuencia y estructura: Es la clasificación más moderna,
propuesta por Alan Barrett, y complementa a la anterior.
3
4
5
ENDOPEPTIDASAS.
Pueden ser denominadas en base a la preferencia por un determinado
residuo en P1 o en P1´ (por ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidillisil endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual especificidad,
hay que distinguirlas (glutamil endopeptidasas I y II).
En la gran mayoría de los casos, la especificidad es demasado
compleja, y se usan nombres triviales (pepsina, tripsina,
quimotripsina, papaína, termolisina)
6
REACCIONES CATALIZADAS POR LA QUIMOTRIPSINA.
Benzoil-L-tirosilglicinamida
+
OH2
Hidrólisis
Benzoil-L-tirosina + Glicinamida
Benzoil-L-tirosina + Glicinanilida
Síntesis
Benzoil-L-tirosilglicinalida
+
OH2
Benzoil-L-tirosinamida + glicinamida
Transferencia
Benzoil-L-tirosilglicinamida
+
NH3
Acetil-L-tirosina etil ester +
OH2
Hidrólisis de ester
Acetil-L-tirosina
+
etanol
7
CLASES DE PROTEINASAS
Serin proteinasas.
Intermediario covalente con el OH de Ser.
Inhibidas por DIFP, PMSF, TLCK, TPCK,
leupeptina, quimostatina, inhibidores proteicos (serpinas).
Cistein proteinasas.
Intermediario covalente con el SH de Cys.
Inhibidas por E-64, organomercuriales, TLCK,
TPCK, leupeptina, inhibidores proteicos (cistatinas).
Aspartil proteinasas
Dos residuos de Asp, que en las de mamíferos
provienen uno de cada uno de dos dominios
homólogos, y en las virales (HIV) de dos subunidades.
pH óptimo muy ácido. Inhibidas por pepstatina.
Metaloproteinasas
Atomo metálico (frecuentemente Zn) ligado por dos
His y un Glu. Resto de la molécula en general poco
conservado. Inhibidas por quelantes de metales
(o-fenantrolina, EDTA).
Treonin proteinasas
Proteasoma (proteinasa multicatalítica). Treonina
en el sitio activo. Inhibidor: lactacistina.
Mecanismo desconocido:
"lista de espera de las proteinasas".
8
9
CLASIFICACION POR RELACION EVOLUTIVA
(Alan J. Barrett, Cambridge, U.K.)
Comparación de secuencias proteicas.
Clasificación en
Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína
ancestral por evolución divergente. Tienen homología
estadísticamente significativa, al menos en el dominio catalítico
(es decir, en el que tiene actividad de proteasa).
Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común.
La homología de secuencia entre ellas es mucho mas baja, pero
se conservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y los
pequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen
una estructura terciaria similar.
10
11
12
PURIFICACION DE PROTEINASAS
13
SUSTRATOS USADOS PARA PEPTIDASAS
1. Proteínas o péptidos grandes, de origen natural.
2. Dipéptidos o tripéptidos con grupos cromogénicos o fluorogénicos.
3. Péptidos sintéticos.
Problemas que pueden presentarse si las enzimas no estan puras:
Z-Ala-Ala-Phe-- NHMec
Enzima con especificidad de quimotripsina
Aminometilcumarina
Neprilisina
Z-Ala-Ala + Phe-- NHMec
(fluorescente) + Z-Ala-Ala-Phe
Aminopeptidasa
Phe + Aminometilcumarina
14
DESCRIPCION DE LA ESPECIFICIDAD DE LAS PEPTIDASAS.
15
SUSTRATOS PROTEICOS.
1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina,
caseína)
a) Precipitación de proteína no digerida y determinación
de A280 nm en el sobrenadante.
b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante.
2)
Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína,
azoalbúmina)
Precipitación y lectura de la A440 nm de los azopéptidos.
3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales (FITC-caseína).
4) Proteínas específicas.
a)Colágenos para colagenasas.
b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción
in vitro de su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.
16
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en Tyr).
Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante.
6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada.
a) HPLC en fase reversa.
b) SDS-PAGE.
c) Filtración por gel.
7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos,
inmovilizados).
a) Electroforesis en gel de poliacrilamida.
i) Actividad determinada in situ después de la electroforesis.
- Métodos histoquímicos: β-naftilamidas y Fast Garnet.
- Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno.
ii) actividad determinada poniendo el gel electroforético en
contacto con otro que contiene el sustrato ("réplica blotting").
- Geles de agarosa embebidos en solución de la proteína.
- Transferencia por capilaridad a nitrocelulosa y reacción
histoquímica.
b) Ensayos de ELISA
i) Determinación de colagenasa.
17
SUSTRATOS SINTETICOS:
Péptidos cromogénicos o fluorogénicos.
a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni
carboxilo libres).
b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el
carboxilo bloqueado).
c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino
bloqueado).
Grupos bloqueantes del amino:
Benzoil (Bz); Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil
(Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc).
18
Ensayos espectrofotométricos:
a) 4-nitroanilidas (NH-Nan):
Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A400 nm
difiere en aprox. 10.000 M-1cm-1 entre las 4-nitroanilidas
y la 4-nitroanilina a pH 8.0.
Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas.
b) 2-naftilamidas (NH-Nap):
La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm,
y difiere de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M-1cm-1. Esto
depende del pH: por debajo de 5.5 no hay diferencia.
Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la
naftilamina libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato,
o por reacción con una sal de diazonio estable, el Fast Garnet,
que da un producto insoluble (requiere un detergente para
mantenerse en solución).
c) Amidas y ésteres:
La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o
siguiendo la liberación de aminoácidos con ninhidrina.
Baja sensibilidad.
19
Ensayos fluorimétricos:
a) 2-naftilamidas:
3 ordenes de magnitud más sensible que la
diazotación. Sensible al pH. Excitación a 335 nm
y emisión de 410 nm.
b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec):
Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente
que el conjugado. Excitación a 380 nm, emisión
a 460 nm.
c) Sustratos fluorogénicos "quencheados"
intramolecularmente.
Abz-L-gly-Phe(NO2)-Pro. Excitación a 310 nm,
emisión a 410 nm.
20
21
22
23
DETERMINACION DE LA CLASE MECANISTICA
A LA CUAL PERTENECE LA PROTEINASA.
Métodos actuales:
1) Susceptibilidad a inhibidores.
2) Secuenciación de la proteína.
3) Estudios de mutagénesis dirigida.
4) Cristalografía de Rayos X.
Métodos “históricos”
1) Identificación de intermediarios de la reacción.
2) Dependencia de la actividad con el pH.
3) Determinación del efecto de la sustitución de H20 por D20.
4) Estudios de modificación química.
24
INHIBIDORES DE PEPTIDASAS
1) Moléculas pequeñas, naturales o sintéticas, basadas en una estructura
peptídica con el agregado de un grupo químicamente reactivo.
2) Moléculas pequeñas, sintéticas, sin estructura peptídica, pero con grupos
capaces de ligarse al sitio activo.
3) Quelantes de metales, en el caso de las metalopeptidasas.
4) Inhibidores proteicos naturales:
Serpinas para algunas serin proteinasas.
Cistatinas para algunas cistein proteinasas.
TIMPs para algunas metaloproteinasas.
Inhibidores sin distinción de clase catalítica: α-2-macroglobulina.
25
26
27
28