OBTENCIÓN DE MATERIALES DE REFERENCIA DE TRABAJO EN

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TITULO: OBTENCIÓN DE MATERIALES DE REFERENCIA DE TRABAJO EN EL
INSTITUTO FINLAY
AUTORES: Brenda Serrano, Argentina Cruces, Mario Landys, Tania Barrios, Ivis
Ontivero, Tatiana Mahy, Niurka Gutiérrez, Lucy Herrera, Patricia Hernández, Deborah
Cisneros.
INSTITUCIÓN: Instituto Finlay
RESUMEN
La preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia (MRs) es
un elemento esencial en la implementación y el mantenimiento de un sistema de
mediciones coherente y de aplicación universal. Un MR es un material o sustancia de
la cual una o más propiedades están suficientemente bien establecidas para ser
usadas en diversas funciones de medición relacionadas con la calibración de
instrumentos, métodos de evaluación y en la asignación de valores. Los MRs deben
ser adecuados para el uso específico que fueron concebidos y los mismos deben
reunir requisitos indispensables para su uso: ser suficientemente homogéneos, deben
ser estables por un espacio de tiempo aceptable bajo condiciones reales de
almacenamiento, transportación
y uso, deben estar constituidos por matrices
similares a la de las muestras y requieren de una rigurosa caracterización que permita
establecer el valor real de la propiedad de interés y su intervalo de incertidumbre.
Debido al alto costo en el mercado mundial de los Materiales de Referencia
Internacionales o Certificados (MRC) y a la escasa disponibilidad de MRs comerciales
que se ajusten a nuestras producciones y permitan un adecuado control de calidad, se
hizo necesario la preparación y caracterización de Materiales de Referencia de Trabajo
(MRT), que estuvieran a la disposición de todos los laboratorios de nuestra
Institución,
garantizando
la
confiabilidad
y
exactitud
en
las
determinaciones
realizadas. El presente trabajo describe de forma general la metodología a seguir para
la preparación y
caracterización de los Materiales de Referencia de Trabajo
necesarios en el control de Calidad de nuestro Instituto.
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INTRODUCCIÓN
La preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia (MRs) es
un elemento esencial en la implementación y el mantenimiento de un sistema de
mediciones coherente y de aplicación universal. Se define como MR un material o
sustancia de la cual una o más propiedades están suficientemente bien establecidas
para ser usadas en diversas funciones de medición relacionadas con la calibración de
instrumentos, métodos de evaluación, control de calidad de productos y en la
asignación de valores a otros materiales (1). Es por esto que el proceso de producción
de los MRs debe ser llevado a cabo usando métodos de medición bien caracterizados,
que tengan una alta exactitud y precisión y que suministren valores trazables a las
unidades fundamentales de medición, siempre que sea posible. Cada propiedad de
interés de un MRT ha sido establecida y
determinada con una incertidumbre bien
definida, por lo que este valor es usado como un valor de referencia para propósitos
de intercomparación o de transferencia. Los MRs deben ser adecuados para el uso
específico que fueron concebidos y los mismos deben reunir requisitos indispensables
para su uso: ser suficientemente homogéneos para que los valores propios medidos
en una porción del lote puedan ser aplicados en cualquier otra porción dentro de
limites aceptables de incertidumbre y tanto el MR como sus valores propios deben ser
estables
por
un
espacio
de
tiempo
aceptable
bajo
condiciones
reales
de
almacenamiento, transportación y uso (2).
Los MRs pueden estar constituidos fundamentalmente por matrices químicas o
biológicas. Dentro de las matrices químicas podemos encontrar las sustancias
obtenidas con un alto grado de pureza, las cuales se adquieren mediante la compra
de reactivos químicos comerciales (Ej.: Seroalbumina Bovina (BSA), Cloruro de
Acetilcolina, Tiomersal) y las matrices biológicas, constituidas por productos derivados
de organismos biológicos tales como sustancias liberadas por microorganismos y
sueros obtenidos a partir de la inmunización de animales. Los MRs se pueden
clasificar en materiales de referencia Químicos (MRQ) o Biológicos (MRB) sobre la
base de la naturaleza del ensayo en que serán empleados.
Los Materiales de Referencia Certificados son aquellos MRs donde uno o más de sus
valores
propios
son
certificados
por
un
procedimiento
técnicamente
válido,
acompañado de un certificado u otra documentación trazable, la cual es expedida por
un órgano de certificación (3). Esto implica un proceso de producción exhaustivo y
riguroso, generalmente
a largo plazo y de alto costo. Debido al alto costo en el
mercado mundial de los Materiales de Referencia Internacionales o Certificados (MRC)
y a la escasa disponibilidad de MRs comerciales que se ajusten a nuestras
producciones y permitan un adecuado control de calidad, se hizo necesario la
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preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia de Trabajo
(MRT), que estuvieran a la disposición de todos los laboratorios de nuestra Institución
y de otras adyacentes, que garantizaran la confiabilidad y exactitud en las
determinaciones realizadas. Estos MRT se caracterizan exhaustivamente y se hacen
trazables a
MRC o a patrones de referencia internacionales, en la medida de lo
posible, reduciendo los indicadores económicos por la compra de los mismos y el
tiempo de producción y asegurando la calidad de nuestras producciones. El presente
trabajo describe de forma general la metodología a seguir para la preparación,
caracterización e identificación de Materiales de Referencia de Trabajo empleados en
el control de Calidad de nuestra Institución.
Preparación, caracterización e identificación de los MRT
Para la preparación de un MRT se tuvieron en cuenta las siguientes etapas: Obtención
de la Materia Prima Activa (MPA), Control de Calidad de la MPA, Proceso de
Formulación y Llenado y Proceso de Liofilización.
Obtención de la Materia Prima Activa: La MPA se obtiene a partir de la solicitud
directa al área de producción (Ej. Vesículas de membrana externa de Neisseria
Meningitidis, Polisacáridos capsulares, Toxoides, etc.); mediante la compra de
reactivos comerciales (BSA, Cloruro de Acetilcolina, Tiomersal) y por la obtención de
antisueros mediante la inmunización de determinadas especies animales (suero
hiperinmune de ratón, conejo y curiel inmunizados con VAMENGO-BC®, vaxTyVi® y
vax-TET®
respectivamente). Los volúmenes del material obtenido deben ser
suficientemente grandes para garantizar la realización de 200-300 unidades por lote
como mínimo.
Control de Calidad de Materia Prima Activa: Una vez recibida la MPA se
selecciona bajo condiciones asépticas la cantidad de muestra necesaria para la
realización de los respectivos ensayos de control de calidad y se verifica el grado de
cumplimiento en el material de partida de los parámetros de calidad definidos en las
especificaciones.
La materia prima activa para ser utilizada en la formulación de los lotes de MRT debe
pasar los ensayos de control de calidad necesarios y los resultados de los mismos
deben ser satisfactorios según las especificaciones de cada MPA. Si esto se cumple se
procede a la formulación del lote a partir de la misma.
Proceso de Formulación y Llenado: Los materiales de envase utilizados para todos
los lotes de MRT producidos son bulbos de vidrio neutro, clase hidrolítica I y de fondo
plano, tapones de goma y sellos de aluminio. Los materiales de envase, así como la
cristalería necesaria y las misceláneas son esterilizados y el proceso se realiza
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estrictamente bajo condiciones asépticas, en áreas con presión y temperatura
controladas o en gabinetes de seguridad biológica (GSB) calificados.
Se efectúa la formulación del lote, teniendo en cuenta el ajuste de la materia prima a
la concentración o actividad requerida, utilizando el disolvente adecuado de acuerdo
al tipo de Material de Referencia que se formula. Para esto se realizan los cálculos
correspondientes, de acuerdo al material en cuestión y utilizando como valor de
referencia el estimado de la característica de interés obtenido en el ensayo de control
de calidad de la MPA.
Previo al proceso de llenado se somete el material a una agitación lenta y moderada
durante 15 minutos en agitador magnético evitando la formación de espuma. Las
unidades del lote se enumeran consecutivamente a medida que se realiza el proceso
de llenado, al igual que los contenedores metálicos que contienen los bulbos del MRT.
Se dispensa un volumen de muestra suficiente para la realización de un solo ensayo.
El llenado se realiza de forma automática o manual, utilizando un dispensador-dilutor
automático o una pipeta automática de volumen adecuado respectivamente y
previamente calibrados. Finalmente se identifica el conjunto de frascos con el nombre
del MRT, su código como candidato a MRT y la fecha de preparación del lote.
Precisión del llenado: La imprecisión del llenado se realiza con el objetivo de
determinar la variación existente entre los bulbos durante el proceso de llenado. Para
esto se tiene en cuenta el número de unidades que integran el lote y se selecciona
del 1-2 % del total de bulbos (4). Esto se evalúa a través del coeficiente de variación
(CV) existente entre las muestras seleccionadas aleatoriamente y el mismo debe dar
un valor menor del 1% para la aceptación del lote.
Los bulbos se seleccionan aplicando la herramienta de generación de números
aleatorios que brinda el Programa Excel. Estos bulbos son tarados con el tapón de
goma, previo al llenado, en una balanza analítica y se llenan a lo largo del proceso,
alternando con el resto de los frascos del lote. Al final se pesan nuevamente y se
calcula el contenido del producto por la diferencia entre el peso final y el peso inicial.
Se obtiene el promedio, la desviación estándar y el coeficiente de variación de estos
valores. Para nuestros MRT obtuvimos valores de coeficiente de variación menores del
1 % en todos los casos, tanto en los procesos de llenado con dispensador automático
como en aquellos donde se realizó el llenado manual.
Proceso de Liofilización: Generalmente las formas liofilizadas le confieren mayor
estabilidad a los productos biológicos en el tiempo (5). Por lo general se recomienda
la liofilización de los Materiales de Referencia siempre que la sustancia en cuestión no
sufra alteraciones durante el proceso. Entre los MRT liofilizados de mayor estabilidad
podemos mencionar los MRQ (Acetilcolina, Seroalbumina Bovina, Polisacárido C) y los
MRB (Antitoxinas y Toxinas Tetánicas y Diftéricas). En la mayoría de los casos los
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lotes de MRT fueron liofilizados a continuación del proceso de llenado, en una sesión
de trabajo y respetando la ubicación de los frascos en los contenedores metálicos. En
aquellos casos donde el número de unidades es muy grande y no es posible liofilizar
el lote en un mismo proceso se considerará como un lote diferente. Los parámetros
de congelación y secado para la ejecución del proceso de liofilización son específicos
de cada MRT y estos deben ser estrictamente controlados por el personal encargado
de realizar esta operación.
Estudio de Homogeneidad: Un material es aceptado como homogéneo con respecto
a una característica dada, si la diferencia entre el valor de esta característica de una
parte o unidad a otra no puede ser detectada experimentalmente. La técnica escogida
debe medir de forma eficiente una característica relacionada con la homogeneidad del
o los componentes de interés del material bajo estudio (6).
Para
el
desarrollo
del
estudio
se
toman
12
muestras
del
MRT
escogidas
aleatoriamente. Se realizan de 2-3 réplicas de cada muestra, teniendo en cuenta que
el tamaño de la misma sea suficiente para estos fines. El método a emplear debe
lograr una precisión igual o mejor que la del ensayo en el que se pretende usar el
material de referencia candidato.Todos los bulbos seleccionados son evaluados en
condiciones de repetibilidad, siempre que el número de muestras que es posible
analizar en cada tipo de ensayo lo permita. En aquellos casos que no se cumpla lo
anterior se aplica un diseño anidado. Una vez obtenidos los resultados se realiza el
procesamiento estadístico de los resultados para determinar la homogeneidad del lote (7).
La prueba de homogeneidad da positiva en aquellos casos donde no se encuentran
diferencias significativas desde el punto de vista estadístico entre los bulbos. Esto se
evalúa a partir del valor de probabilidad (p) correspondiente al efecto de los bulbos.
Para los MRT donde se obtiene un valor mayor o igual que 0.05, el material se
considera suficientemente homogéneo. Si por el contrario, p es menor que 0.05,
desde el punto de vista estadístico existen diferencias significativas entre los bulbos.
En este caso, se determina si estas diferencias son intrascendentes con relación al
uso previsto para el material de referencia. En caso contrario el lote debe desecharse
por falta de homogeneidad (7).
Estudio de Caracterización: Existen diferentes vías técnicamente válidas para la
caracterización de un material de referencia. Estas incluyen la caracterización por uno
o más métodos involucrando uno o varios laboratorios. Dependiendo del tipo de
material de referencia, de sus requisitos para el uso final, de la calificación de los
laboratorios involucrados y de la calidad del método seleccionado, se escoge una de
las vías como más apropiada. Debido a la poca disponibilidad de MRC y que los MRT
son usados en otros laboratorios de forma rutinaria es necesario la realización de un
estudio interlaboratorio para la caracterización. Este estudio tiene como principio que
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los
laboratorios
sean
igualmente
competentes
en
la
determinación
de
las
características del MRT para proporcionar resultados con una exactitud aceptable. En
aquellos casos en donde se disponga de un MRC, este se utiliza para la asignación de
unidades al MRT. Cada media de laboratorio es considerada un estimado de la
característica del material. Usualmente la media de los laboratorios se asume como el
mejor estimado de esta característica (6).
Se selecciona el método de ensayo necesario para la realización del estudio de
caracterización. En aquellos MRT donde se selecciona más de un método de ensayo
para determinar una característica de interés se tuvo en cuenta que tuvieran
principios claramente diferentes. Se toma la cantidad de muestra suficiente para la
realización de seis ensayos independientes, por duplicado. Se ejecuta el número de
determinaciones indicado por tipo de MRT, incorporando en la evaluación el MRT en
uso y/o aquellos Materiales de Referencia Certificados primarios o secundarios ya
sean internacionales, regionales, de fabricantes reconocidos e incluso de trabajo. Se
identifican los laboratorios que realizan las diferentes técnicas relacionadas con cada
tipo de MRT específico y se selecciona el analista de mayor experiencia en cada uno
de los laboratorios. Se confecciona un protocolo específico de caracterización para
cada tipo de MRT y este es entregado a todos los laboratorios participantes en el
estudio. Cada laboratorio realiza igual número de determinaciones y evalúa igual
número de muestras. Los datos obtenidos por cada laboratorio son sometidos a un
análisis estadístico para determinar el valor de la característica de interés estudiada y
la incertidumbre de la caracterización (8).
Para el procesamiento estadístico de los resultados se elabora una tabla resumen con
todos los resultados. Se le realiza la prueba de normalidad a todos los datos y en
aquellos casos donde se rechaza la hipótesis de normalidad se analizan las causas de
este comportamiento y la posibilidad de aplicar alguna transformación para hacer
normales los valores. Se eliminan los valores detectados como atípicos, si existen, por
cada laboratorio. Se le realiza las pruebas de homogeneidad de varianzas y de las
medias para detectar si existen diferencias significativas entre los laboratorios
incluidos en el estudio. Se determina el valor de caracterización como el promedio de
las medias por laboratorio y su incertidumbre.
Una vez concluida la etapa anterior se comprueba el desempeño del nuevo MRT en el
sistema de ensayo correspondiente, utilizando para esto el MRT en uso y las muestras
controles. Se realizaron 3 determinaciones como mínimo y se verificaron los criterios
de aceptación del MRT y del ensayo en cuestión.
Posteriormente se confecciona un gráfico de control de valores individuales para el
seguimiento de la estabilidad del MRT considerando la media y la desviación estándar
calculada con los datos de caracterización.
7
Determinación de la humedad residual: Esto solo se aplica para los MRT que se
conserven en forma liofilizada. El resultado del ensayo no debe exceder el 5 %. Se
escogen 10 muestras al azar del MRT y se les determina la humedad residual
mediante el método de Karl Fisher (9). Todos los lotes de MRT preparados cumplieron
con este criterio.
Estudio de la hermeticidad: Se realiza con el objetivo de garantizar que exista una
hermeticidad total en los bulbos liofilizados, logrando de esta forma estabilidad e
integridad en la pastilla liofilizada durante su conservación. El criterio de aceptación
de este ensayo es que se mantenga la coloración original del material liofilizado. Si se
observa coloración azul de la pastilla liofilizada, indica falta de hermeticidad,
implicando el rechazo del bulbo. Se realiza mediante la inmersión del total de los
bulbos en una solución indicadora de bromofenol azul al 0.1 % por un período de
tiempo de 10 minutos (2). En los lotes analizados de MRT se obtuvo que todos los
bulbos pasaron la prueba satisfactoriamente.
Puesta de prueba del MRT: Este estudio tiene como objetivo evaluar los MRT en los
laboratorios consumidores de los mismos y en las condiciones de ensayo especificas
de cada uno. El MRT que se encuentra en uso y el de nueva producción en estudio
deben asegurar un adecuado desempeño del método de ensayo. Los lotes de MRT son
puestos a prueba en los diferentes laboratorios y se evalúa su desempeño mediante la
utilización de muestras controles. Posteriormente se comparan los valores obtenidos
de estas muestras con el MRT en uso y con el nuevo y se verifica la existencia de
diferencias significativas entre los mismos. Esto nos permite establecer el buen
funcionamiento del MRT y verificar la estimación de la característica de interés y su
incertidumbre.
Este procedimiento se realiza durante los primeros 3 ensayos para pruebas biológicas
y los primeros 10 ensayos para las pruebas químicas e inmunoquímicas.
Estudios de estabilidad: El uso de los estudios de estabilidad tiene como objetivo
determinar si el MRT mantiene su valor de referencia durante el tiempo de producción
y hasta el momento de ser usado. La frecuencia de estos ensayos depende del riesgo
que presente el material de sufrir cualquier cambio con el transcurso del tiempo. Para
llevar a cabo estudios de estabilidad es necesario tener en cuenta diferentes aspectos
como son el método de ensayo, la selección del número de muestras, condiciones de
ensayo, frecuencia de ensayo y procesamiento estadístico.
En todos los estudios de estabilidad se toma como criterio de aceptación que el valor
obtenido
a
una
temperatura
y
tiempo
determinado
no
muestre
variaciones
significativas con respecto al valor de referencia y/o se encuentre dentro de la
incertidumbre de la medición. Los estudios de estabilidad comprenden la estabilidad
acelerada y el estudio de vida de estante.
8
Estabilidad Acelerada: El estudio de estabilidad acelerada se lleva a cabo cuando se
produce un MRT de nuevo tipo para recomendar las condiciones óptimas de su
manipulación y transportación. Además se realizan en aquellos MRT que no tienen
historia confiable sobre la estabilidad de los lotes precedentes. Primeramente se
identifica la propiedad de interés del MRT, teniendo en cuenta su valor estimado y la
incertidumbre correspondiente, para que estos valores sirvan como punto de
referencia. Se selecciona el mismo método de ensayo utilizado en la caracterización y
las temperaturas del estudio según la naturaleza del MRT (10).Se seleccionan 3
muestras por cada lote de MRT estudiado para evaluarlas por duplicado, por cada
temperatura y tiempo de estudio. Esto se
realiza en paralelo con las muestras
controles conservadas a la temperatura óptima de almacenamiento del MRT. Las
muestras
son
identificadas
cuidadosamente
e
incubadas
a
las
temperaturas
establecidas en equipos previamente calibrados y fijados a la temperatura específica.
Estabilidad de vida de estante: El estudio de vida de estante se lleva a cabo a la
frecuencia de muestreo establecida de cada material. Se seleccionan las muestras
aleatoriamente y se realizaron 3 ensayos por cada tiempo, a razón de 3 muestras por
cada ensayo evaluadas por duplicado. El ensayo se realiza bajo condiciones similares
a las que se emplean en la caracterización del MRT. Algunos MRT muestran pérdida
de actividad o degradación imprevista en los estudios de estabilidad de vida de
estante que se realizan periódicamente. Ante este comportamiento, se investigan las
causas más probables con el objetivo de descartar la posibilidad de errores analíticos
en los ensayos realizados durante el estudio.
Identificación de MRT: Los lotes de MRT deben tener una adecuada identificación
para facilitar su localización y distribución a los laboratorios consumidores, por esto se
deben etiquetar una vez que se concluyan todas las etapas de caracterización y
procesamiento estadístico. La etiqueta debe reflejar el nombre del centro elaborador,
nombre del MRT, identificación del lote, fecha de fabricación, valor estimado de la
característica de interés, volumen por frasco y temperatura de conservación.
Para la oficialización del MRT una vez concluidas las fases de caracterización, de
estabilidad y de puesta a prueba del MRT se elabora un certificado de ensayo de
Materiales de Referencia y el mismo debe acompañar al producto cada vez que este
sea distribuido. El certificado contiene la siguiente información: nombre del MRT,
número de lote, fecha de fabricación, origen de la materia prima, descripción del MRT,
método de preparación, uso, valor estimado de la característica de interés,
incertidumbre del valor estimado y las instrucciones para su uso.
9
CONCLUSIONES
El presente trabajo estableció la metodología del proceso de obtención de los MRT
involucrados en las diferentes producciones del Instituto Finlay. Además se
describieron los aspectos fundamentales de cada etapa con sus correspondientes
análisis estadísticos.
BIBLIOGRAFÍA
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6. Brookman B. y cols. 1998. Guidelines for the in-house production of reference
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Neidle S, Fuller W. Topics in molecular structural biology. London, Macmillan
Press, 45-49, 1993
10. Kikrwood, T.B.L. Design and análisis of accelerated degradation tests for the
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