Diapositiva 1 - Sociedad Española de Anatomía Patológica

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Estudio de proteínas musculares por Western blot y técnicas de
genética aplicadas a las enfermedades neuromusculares: PCR,
RFLP y secuenciación
Dra. IRENE VIÉITEZ GONZÁLEZ
Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología – Hospital Meixoeiro
Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI)
Instituto de Investigación Biomédica de Vigo
Cádiz, 21-24 Mayo 2013 - XXVI Congreso Nacional de la SEAP-IAP, XXI Congreso Nacional de la
SEC, II Congreso Nacional de la SEPAF
Consideraciones generales sobre ácidos
nucleicos y proteínas
FUNDAMENTO CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
• La información genética, contenida en el ADN, se mantiene y es trasferida a su descendencia por su
capacidad de REPLICACIÓN
•El ADN transfiere la información al ARN mediante la TRANSCRIPCIÓN en el núcleo.
•El ARN mensajero se desplaza al citoplasma con la información del ADN y, mediante la
TRADUCCIÓN, sintetiza las proteínas
•Las proteínas son las encargadas de desarrollar las diferentes funciones de las células
Núcleo
Citoplasma
Replicación
Transcripción
ADN
Traducción
ARN
Proteína
• Excepciones:
- Retrovirus  Transcripción inversa (transcriptasa inversa)
- Virus de ARN  Duplicación del ARN (ARN polimerasa)
- Ribozimas: ARN con propiedades autocatalíticas, que son capaces de modificarse y replicarse por si mismos.
- Priones: Proteínas que se autoreplican
ADN: Ácido didesoxirribonucleico
- NUCLEÓTIDOS de desoxirribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Timina (T)
- ENLACE FOSFODIÉSTER
- Dirección 5’  3’
- Estructura en DOBLE HÉLICE y ANTIPARALELA
- COMPLEMENTARIEDAD:
A – T (2 puentes de H2) / G – C (3 puentes de H2)
Nucleótido
ARN: Ácido ribonucleico
- NUCLEÓTIDOS de ribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U)
-De cadena sencilla (5’  3’) : MONOCATENARIO (excepto reovirus)
- Complementariedad con el ADN molde (la Adenina se combina con Uracilo)  TRANSCRIPCIÓN
- Tipos de ARN  Distintos papeles en la transmisión de la información
ARN Mensajero: sirve de molde para la síntesis de las proteínas y transporta la información
desde el DNA (núcleo) hasta el centro de producción de la síntesis proteica (ribosoma)
ARN Ribosómico: forma parte de los ribosomas que llevan a cabo la traducción
ARN Transferente: sirve para el transporte de los aminoácidos específicos desde las reservas
citosólicas hasta los ribosomas y aseguran su correcto alineamiento
Otros ARNs se emplean en la elaboración del RNA y en la exportación extracelular de
proteínas
RNA ribosomal
(rRNA)
RNA mensajero
(mRNA)
RNA de transferencia
(tRNA)
LAS PROTEÍNAS
- Combinación de AMINOÁCIDOS (20 diferentes)
- Compleja organización estructural: Cadena aminoacídica > Estructura cuaternaria (Complejo proteico)
- Funciones muy diversas: Estructurales, Enzimas, Receptores, Hormonas, Anticuerpos…
EL CÓDIGO GENÉTICO
Relación entre la secuencia de nucleótidos del ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína
Organizado en tripletes o CODONES: cada
tres nucleótidos corresponden a un
aminoácido.
Los codones TAA, TAG y TGA indican la
parada de la síntesis proteica.
DEGENERADO: existe más de un triplete
que codifica por el mismo aminoácido.
ESPECÍFICO: ningún codón codifica más de
un aminoácido
CONTÍNUO: el cuadro de lectura de los
tripletes se realiza sin espacios en sentido 5’-3’
desde el codón de inicio hasta el de parada.
UNIVERSAL: el mismo triplete en diferentes
especies codifica para el mismo aminoácido.
¿ Qué es un Gen?
Unidad física y funcional básica de información contenida en el ADN
Exón: Región del gen que se mantiene en el ARN mensajero tras su maduración (Splicing). Parte
codificante del gen
Intrón: Región del gen que no se mantiene en el ARN mensajero tras el proceso de Splicing. Parte no
codificante del gen.
GEN
Maduración del
ARNm
¿ Qué es un Alelo?
En organismos diploides es cada una de las dos copias del gen presente en su genoma
ALELO DOMINANTE: Alelo que enmascara la expresión fenotípica del otro alelo del mismo locus.
ALELO RECESIVO: Alelo que para expresarse debe estar en ambos locus.
HOMOCIGOTO: Los dos alelos iguales para un locus.
HETEROCIGOTO: Los dos alelos distintos para un locus.
MUTACIÓN: Tipos de mutaciones
Cambio en la información genética que puede ser transmitido a la descendencia
MUTACIONES PUNTUALES: Se produce el cambio de un único nucleótido
“Missense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por otro distinto.
Secuencia normal
Secuencia mutada
5’ ACTGCATTTAGC 3’
T A F
S
5’ ACTGCATCTAGC 3’
T A S
S
“Nonsense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por un codón de parada
(TAG, TAA o TGA).
Secuencia normal
5’ AGCTGCAGCAAT 3’
S C S N
Secuencia mutada
5’ AGCTGAAGCAAT 3’
S
X
MUTACIONES FRAMESHIFT (Cambio en la pauta de lectura): Se produce un cambio total en el
sentido del mensaje genético a partir del sitio de la mutación. Se sintetiza una proteína inactiva, a menudo
truncada.
Se debe a: DELECIONES, INSERCIONES, INDELS, DUPLICACIONES
MUTACIONES IN-FRAME: Si el cambio afecta a un triplete o varios, la proteína solo pierde los
aminoácidos implicados.
MUTACIONES DE SPLICING (de corte y empalme) : Mutaciones que alteran el proceso de maduración
de los ARNm generando transcriptos alterados que codifican por proteínas truncadas.
Patrones de Herencia Genética
Herencia Autosómica Dominante
Herencia Ligada a X dominante
Herencia Autosómica Recesiva
Herencia ligada a X recesiva
ANÁLISIS GENÉTICOS:
Extracción de ácidos nucleicos
PCR y PCR-RFLP
Secuenciación
Extracción ADN: Método de extracción por Fenol-Cloroformo
Biopsia músculo
Sangre en EDTA
Otros tejidos
Lisis de la muestra
Protección del ADN y eliminación
de material proteico y lipídico
Precipitación o concentración
Eliminación de inhibidores
de las reacciones sucesivas
Resuspensión
Cuantificación
• Tampón de Lisis de Rojos
• Tampón de lisis de Blancos
• Proteinasa K
• SDS
• Lavados con Fenol
• Lavados con Cloroformo
•Isopropanol
•NaCl, EtOH
•Lavados con EtOH 70%
•Secado
• H2O o TE
• Espectrofotometría
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• Consiste en la replicación de un fragmento de ADN de forma sucesiva  Crecimiento exponencial
• Tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar y manipular el fragmento de ADN a análisis
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• ADN molde (20ng-1μg)
• Cebadores específicos (Primers)
• Nucleótidos (dNTPs 0.8 mM)
• DNA-Polimerasa
• MgCl2 (1.5-4 mM)
• Tampón
• ddH2O
• PCR-MULTIPLEX: Amplificación con varios sets de primers de un ADN molde  Productos de
distintos tamaños.
- Detección rápida de deleciones en un gen (Distrofina, 1988)
Análisis de una PCR: Electroforesis de Agarosa
• Técnica para separar fragmentos de ADN mediante la aplicación de un campo eléctrico
• El ADN tiene carga negativa por lo que se dirigirá al polo positivo
• Separación de los fragmentos de ADN en función del peso molecular
• Visualización por unión ADN – Bromuro de Etidio
• También permite cuantificar y/o aislar el producto de PCR
PCR SIMPLE
PCR MULTIPLEX
1
2
3
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
• Estudio de una mutación conocida
• Identificación de mutaciones en el fragmento amplificado utilizando enzimas de restricción (ER)
y analizando los productos en gel de agarosa
• Las ER cortan la cadena de ADN en sitios específicos dando un patrón de bandas característico
• La presencia de una mutación modifica este patrón de bandas
Fragmento amplificado: 576bp
5’GCGACCTCTTCAACCTCTCGGCGCCCCTGGCCCGGCCGGT
GGGCACCAGCCTCTTTCTGCAGACCGCCCTTCGCGGCTGGGC
GGTGCAGCTGCTGGACTTGACCTTCGCCGCGGCGCGCCAGCC
CCCGCTGGCCACGGCCCACGCGCGCTGGAAGGCTGAGCGCGA
GGGACGCGCTCGGCGGGCGGCGCTGCTCCGCGCGCTGGGCAT
CCGCCTAGTGAGCTGGGAAGGCGGGCGGCTGGAGTGGTTCGG
CTGCAACAAGGAGACCACGCGCTGCTTCGGAACCGTGGTGGG
CGACACGCCCGCCTACCTCTACGAGGAGCGCTGGACGCCCCC
CTGCTGCCTGCGCGCGCTGCGCGAACCGCCCGCTATGTGGTG
GGCGTGCTGGAGGCTGCGGGCGTGCGCTACTGGCTCGAGGGC
GGCTCACTGCTGGGGGCCGCCCGCCACGGGGACATCATCCCA
TGGGACTACGACGTGGACCTGGGCATCTACTTGGAGGACGTG
GGCAACTGCGAGCAGCTGCGGGGGGCAGAGGCCGGCTCGGTG
GTGGATGAGCGCGGCTTCGTATGGGAGAAGGC 3’
Sustitución de C > A
Bfa I
212bp
M
N
HT
HM
576 bp
364bp
364 bp
212 bp
SECUENCIACIÓN DEL ADN
La secuenciación permite realizar un análisis en profundidad del ADN y desvelar la
información básica presente en el fragmento a estudio
La secuenciación automática:
• Método de Sanger  DIDEXOSINUCLEÓTIDOS
• Pasos de la reacción de Secuencia:
I.
Purificación del producto PCR  Exosap ®
II.
Amplificación con un solo primer, ADN
polimerasa, dNTPs + ddNTPs (Big Dye®)
III. Desnaturalización de los fragmentos
IV. Separación por electroforesis capilar
V.
Lectura de la secuencia
REACCIÓN DE SECUENCIA
96°
96°
50°
60°
4°
1’
10’’
5’’
4’
∞
25 ciclos
SECUENCIACIÓN DEL DNA
SECUENCIACIÓN DEL DNA
CÓDIGO DE COLOR:
ADENINA
TIMINA
ALELO 1  C
GUANINA
ALELO 2  C
CITOSINA
Normal
Homocigoto
ALELO 1  T
ALELO 1  C
ALELO 2  T
ALELO 2  T
Heterocigoto
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS:
Western Blot
WESTERN BLOT
Técnica analítica para detectar proteínas específicas en extractos celulares o de tejido
Obtención y preparación de la muestra
Obtención y preparación de la muestra
Etapas:
Separación por electroforesis
Trasferencia de proteínas
Immunoblot
Revelado
Análisis de Resultados
• Toma de la muestra (músculo – 20µg)
• Lisis (Solución PIK + Inhibidores)
• Homogenización
• Sonicación
• Separación de las fracciones de interés (Centrifugación)
• Desnaturalización para SDS-Page (Adicción del tampón de Leemli
y ebullición)
WESTERN BLOT: Separación por electroforesis
• Separación de las proteínas aplicando un campo eléctrico
• Gel de Poliacrilamida  Rápido y Versátil (Acrilamida/Bisacrilamida)
• Gel Desnaturalizante (SDS- Page): Pérdida de la estructura 3D
• Tampón de Electroforesis  Mantener pH constante
• Discontinua
Gel Concentrador: < %Acrilm+Bisacrilm
pH 6.8 (+ácido)
Gel Separador: > %Acrilm+Bisacrilm
pH 8.8
Las proteínas se
separan solamente
en función de su
PESO
MOLECULAR
WESTERN BLOT: Transferencia de proteínas
• Gel Poliacrilamida  Membrana de Nitrocelulosa o PVDF
• Accesibilidad de las proteínas a su detección con Anticuerpos
• Electrotransferencia:
- Sandwich: Filtro – Gel – Membrana – Filtro
- Tampón de Transferencia
- Corriente eléctrica: Cátodo (+)  Ánodo (-)
Gel
Poliacrilamida
Membrana
Nitrocelulosa
WESTERN BLOT: Inmunoblot
Leche en polvo o BSA
en tampón TTBS
Bloqueo
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Monoclonoal o Policlonal
Dilución 1:200-1:2000
Tiempo de incubación
Reconoce la inmunoglobulina de la
especie en el que se ha producido el
primario. Son conjugados con un
sistema de revelación (HRP o AP)
Detección
Reacción de un sustrato (ej. luminol)
catalizada por la Horseraddish peroxidase
con emisión de luz.
WESTERN BLOT: Análisis de Resultados
•Se compara la altura de la banda obtenida con un marcador de pesos moleculares para confirmar que
hemos detectado el producto de interés.
•Cuando es necesario valorar la cantidad de proteína para comparar la expresión en diferentes tejidos o
pacientes es necesario realizar una comparación con una proteína endógena cuya expresión no varia en
las diferentes muestras (GAPDH, IgG, Actina).
Aplicación al estudio de
Enfermedades Neuromusculares
ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Biopsia muscular
+
Historia clínica
Datos paraclínicos
Laboratorio Miopatología
Banco de
Tejidos
Disección – Orientación
M/E
Inmunogold
Sangre
Congelación
Cortes criostato
Extracción de DNA
Histoquímica
Inmunohistoquímica
Microscopía Confocal
DIAGNÓSTICO
Wb
Bioquímica
Banco de DNA
PCR multiplex
PCR-RFLP
Secuenciación
Otras
Consejo genético
DISTROFINOPATÍAS
Fenotipos:
Distrofina: Nexo de unión entre citoesqueleto y matriz extracelular
Distrofia muscular de Duchenne
Distrofia muscular de Becker
1987: Gen DMD localizado en Xp21 => 79 exones
Herencia ligada a X recesiva: Mujeres portadoras y hombres afectos
Estudio de exones de zona caliente del gen
PCR MULTIPLEX
PCR I
PCR II
1
1
2
PCR multiplex detecta más del 95% de las
deleciones en DMD
2
WESTERN BLOT
Exón 45
Exón 48
Expresión de la Distrofina
1
2
3
4
5
6
7
427 kDa
Exón 47
Exón 44
DMD
DMB
DMB
8
DISTROFIAS DE CINTURAS
LGMD1C: Caveolinopatía
Caveolina 3 (21kDa): Proteína integral de membrana para la
formación de caveolas en el músculo
Gen CAV3 (3p25) => 2 exones
Herencia AD: Heterocigoto  Afecto
SECUENCIACIÓN
A45T (exón 2)
R26Q (exón 1)
Control
Heterocigoto
Control
Heterocigoto
LGMD2C: Gamma-sarcoglicanopatía
Gen SGCG (13q12) => 8 exones
Gamma-sarcoglicano: 35kDa
Etnia Gitana: Elevada prevalencia mutación C283Y (mutación fundacional)
Población Mediterránea: Elevada prevalencia mutación del521T
PCR-RFLP
SECUENCIACIÓN
C283Y → Rsa I
del521T (exón 6)
Control
Homocigoto
Heterocigoto
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
•
•
•
•
•
Glucogenosis más frecuente
Miofosforilasa: Degradación del glucógeno
PYGM (11q13)  20 exones
Herencia AR
Gran heterogeneidad alélica
MUTACIONES MÁS FRECUENTES
“ nonsense” R50X ( exón 1)
Arginina > Stop (CGATGA)
Mutación más frecuente
“missense” W798R (exón 20)
Triptófano > Arginina (TGGCGG)
Mutación privada de España
(2ª mutación más frecuente)
MUTACIÓN
Nº Total
Missense/nonsense
69
Splicing
9
Pequeñas Inserciones
1
Pequeñas Deleciones
15
Grandes Deleciones
2
Duplicaciones
2
Indels
3
“ missense” G205S ( exón 5)
Glicina > Serina (GGCAGC)
2ª mutación más frecuente
en la población general
R50X, W798R y G205S
78% alelos mutantes en pacientes
españoles
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
PCR-RFLP: Análisis de las mutaciones R50X, W798R y G205S
Nonsense R50X
Missense W798R
Missense G205S
Exón 1
Exón 20
Exón 5
CGA > TGA
Arg > Stop
TGG > CGG
Trp > Arg
GGC > AGC
Gly > Ser
1: Marcador peso molecular
2: Producto PCR sin digerir
3: Caso Normal
4: Caso Homozigoto
5: Caso Heterozigoto
SECUENCIACIÓN
Inserción en el Exón 8
Inserción T entre nucleótidos 892-893
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro
35 aminoácidos después
Tyr
Phe
Val
Secuencia normal: 5’ GAGTATTTCGTGGT… 3’
Secuencia mutada: 5’ GAGTTATTTCGTGG… 3’
Leu
Phe
Arg
GLUCOGENOSIS II: Enfermedad de Pompe
Maltasa ácida (105kDa): Degradación glucógeno lisosomal
Gen GAA (17q25)  20 exones
Herencia autosómica recesiva
Diagnóstico Prenatal:
CONCLUSIONES
• CONFIRMACIÓN Y EXACTITUD EN EL DIAGNÓSTICO
• MÉTODO DIAGNÓSTICO NO INVASIVO
•DETECCIÓN PRECOZ DE LA ENFERMEDAD
•DETECCIÓN DE HETEROCIGOTOS Y FAMILIARES AFECTOS
•CONSEJO GENÉTICO:
- Prevención de futuros casos
- Diagnóstico prenatal o preimplantacional
•CONOCIMIENTO DEL DEFECTO MOLECULAR:
- PRONÓSTICO (correlación genotipo – fenotipo)
- POSIBLES TERAPIAS GÉNICAS
Muchas Gracias por su atención
Grupo de Neurociencias NC-CHUVI
Instituto de Investigación Biomédica de Vigo (IBIV)
Coordinadora: Carmen Navarro
Investigadores:
• Saida Ortolano
• Susana Teijeira
• Irene Viéitez
• Beatriz San Millán
• Carlos Spuch
Personal de apoyo:
• Olga Souto
• Soraya Barrera
• TaniaVázquez-Santos
DIAGRAMA GENERAL DE ESTUDIO GENÉTICO
Muestra biológica
Extracción DNA
DNA
PCR
(Polymerase chain reaction)
Análisis por
Secuenciación
Producto de
PCR
Análisis por RFLP
(Restriction fragment length
polymorphism)
Reacción Secuencia
Digestión (ER)
RESULTADO
DISTROFIAS DE CINTURAS
ENFERMEDAD
LOCUS (OMIM)
PROTEÍNA
MW (kDa)
LOCALIZACIÓN
LGMD1A
5q31
Miotilina
57
LGMD1B
1q21
Laminina A/C
74/65
LGMD1C
3p25
Caveolina 3
17
Transmembrana
LGMD1D
7q
Desmina
53
Citoplasma
LGMD1E
6q23
DNAJB6
37
Citoplasma/Disco Z
LGMD1F
7q32.1
TPNO-3
104
Membrana Nuclear
LGMD1G
4q21 (Starling et al. Europ J Hum Genet 2004; 12: 1033-1040)
Sarcómero
Membrana Nuclear
DISTROFIAS DE CINTURAS
ENFERMEDAD
LOCUS (OMIM)
PROTEÍNA
MW (kDa)
LOCALIZACIÓN
LGMD2A
15q15
Calpaina 3
94
Citoplasma
LGMD2B
2p13
Disferlina
230
Membrana
LGMD2C
13q12
- sarcoglicano
35
Transmembrana
LGMD2D
17q11-q12
-sarcoglicano
50
Transmembrana
LGMD2E
4q12
-sarcoglicano
43
Transmembrana
LGMD2F
5q33-34
-sarcoglicano
35
Transmembrana
LGMD2G
17q11-q12
Teletonina
19
Sarcomérica
LGMD2H
9q31
TRIM32
72
Citoplasma
LGMD2I
19q13
FKRP
60
Aparato de Golgi
LGMD2J
2q 24-31
Titina
4200
Sarcomérica
LGMD2K
9q34
POMT1
(Balci et al. Neuromusc Disord 2005; 15: 271-275)
LGMD2B: Disferlinopatía
Fenotipos:
Disferlina (230kDa): Mantiene la integridad del sarcolema
Gen DYSF (2p13) => 55 exones
LGMD2B
Miopatía distal de Miyoshi
DMAT
Cierta correlación Genotipo – Fenotipo:
WESTERN BLOT
230 kDa
1
2
3
4
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
I83F
Y85X
R94Q
R94W
N102Dfs
L153R
L153P
G157V
G159R
R161C
G174D
P230R
V239del
S246P
A364V
A365E
W366X
T379M
E383K
A384D
E386Afs
W388Sfs
L397P
L292P
Y298Lfsx35
c.1000 -1G>T
c.681 -2A>G
M1V
M1L
L5RfsX20
L5Vfs
V16Ffs
E26Afs
L36R
H37QfsX33
R50X
Y53X
A55GfsX21
Q73Hfs
c.855 +1G>C
G486D
T488N
T488I
R490W
R490Q
R490Afs
R491C
W492X
V494Sfs
c.1239 +1G>A
11 mutaciones
E541X
K543T
K543X
R570W
R570Q
Y574X
K575E
R576X
Q577R
L587P
R650EfsX8
R650X
E655K
E796Vfs
W798R
Y733X
K754Nfs
Q755X
R771Q
c.1970-2177del
c.1768 +1G>A
c.1092 +1G>A
T808P
S809FfsX6
D815A
W826S
c.2380 -1G>A
c.1769 -1G>A
L116P
E125X
L132WfsX163
N134Kfs
G136D
R139W
12 mutaciones
R194W
G205S
G205D
R270X
E337R
E349K
L354P
W362X
R428C
G449R
S450L
A452Rfs
G455R
V456M
P454_L464
D511Tfs
D534Vfs
Hotspots in exons 1, 14 y 17
(32% mutations)
23 nuevas mutaciones
R590H
F599Lfs
R602W
R602Q
K609K
A660D
D662A
Q666E
A670V
N685Y
G686R
G686R
A687P
T692Kfs
A704V
G705Rfs
F710del
R715W
14 mutaciones
C784X
Q785X
SECUENCIACIÓN
PYGM
Deleción 5 nucleótidos
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro (PTC)
21 aminoácidos después
Deleción T14
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro (PTC) 20
aminoácidos después
GLUCOGENOSIS IIb: Enfermedad de Danon
•
•
•
•
LAMP2  Xq24
Herencia dominante ligada a X
9 exones
Splicing alternativo exón 9:
- Isoforma LAMP2a
- Isoforma LAMP2b  Músculo estriado y cerebro
MUTACIÓN
Nº Total
Sustituciones nucleotídicas
(Missense/Nonsense)
10
Pequeñas Inserciones
3
Pequeñas Deleciones
9
Grandes Deleciones
5
Splicing
10
Small Indel
1
Q359PfsX13 (c.1074InsC)
Secuencia Normal
Viéitez I et al. Human Genetics 2008.
Secuencia Mutada
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