[E][S] [E][S]

Métodos espectrofotométricos cinéticos
Los métodos cinéticos para análisis difieren en una manera fundamental de los métodos
de equilibrio o estequiométricos. Las mediciones se efectúan en condiciones dinámicas en las
que las concentraciones de reactivos y productos están cambiando en función del tiempo. En
cambio, las titulaciones o procedimientos que utilizan agentes complejantes para formar
productos absorbentes se ejecutan en sistemas que tienen que llegar al equilibrio o al estado
estable de modo que las concentraciones estén estáticas. La mayor parte de los métodos
cinéticos se apoyan en la espectrofotometría como técnica para supervisar la reacción.
En los métodos cinéticos se pueden emplear diversos tipos de reacciones. Las reacciones
catalizadas están entre las más populares; en ellas se determina un catalizador de acuerdo con
la manera en que influye en la velocidad del reacción, o bien, se elige uno de los reactivos. Por
ejemplo, el yoduro es un catalizador en la reacción de Ce(IV) con As(III). Las cantidades traza de
I- se pueden determinar al medir la velocidad de esta reacción en función de la concentración de
I-. Por lo general, se usa el método de patrones externos para preparar una curva de calibración
de velocidad contra la concentración de yoduro. Más de 40 cationes inorgánicos y más de 15
aniones se han determinado con base en su efecto catalítico.
También mediante métodos cinéticos se han determinado catalizadores orgánicos. Las
aplicaciones más importantes de las reacciones catalizadas en los análisis orgánicos requieren el
uso de enzimas como catalizadores.
El comportamiento de una gran cantidad de enzimas es compatible con el mecanismo general
k1
E + S ¿=≫ ES ¿ P + E
k −1
Este proceso es denominado mecanismo de Michaelis-Menten, la enzima E reacciona en
forma reversible con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES. Entonces, este
complejo se descompone en forma irreversible para formar los productos y la enzima
regenerada. Este modelo solo es válido cuando la concentración del sustrato es mayor que la
concentración de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, o sea que la
concentración del complejo enzima-sustrato es constante.
El estudio cinético de una reacción puede ser usado para la caracterización del sistema o
bien para cuantificar a uno de los componentes que participan en ella.
Caracterización. Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la
concentración del sustrato, [S], se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formación
del producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de la enzima. En este caso, los sitios activos de
la enzima están saturados con sustrato.
Con concentraciones crecientes de sustrato [S], la enzima se acerca asintóticamente a su
velocidad máxima Vmax, pero nunca la alcanza. Por esta razón, no hay una [S] para la Vmax. De
todas formas, el parámetro característico de la enzima está definido por la concentración de
sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima (Vmax/2). La concentración de
sustrato a la cual se cumple esta condición se conoce como constante de Michaelis-Menten, KM.
Siguiendo la aproximación del estado estacionario, que señala que la concentración del
complejo enzima-sustrato (ES) es pequeña y se mantiene casi constante a lo largo de la reacción
enzimática:
k 1[ E ] [ S ]
d [ ES ]
= k 1 [ E ][ S ] −k −1 [ ES ] −k 2 [ ES ] entonces [ ES ] =
k −1 +k 2
dt
Se define
Km =
k −1 +k 2
k1
entonces
[ ES ] =
La velocidad de reacción es:
[E] [S]
d [ P]
= k 2 [ ES ]
dt
La concentración total de la enzima:
Por lo tanto:
[ E ] = [ E ] 0−[ ES ]
Km
[ E ] 0 = [ E ] [ ES ]
Al sustituir esta concentración en la expresión de la ecuación correspondiente a la concentración
del intermediario
[ ES ] =
 [ E ]0− [ ES]  [ S ]
Km
Reordenando:
k m [ ES ] [ S ][ ES ] =[ E ]0 [ S ] entonces [ ES ] =
Sustituyendo esta expresión en d[P]/dt obtenemos:
[ E ]0 [ S ]
K m [ S ]
d [ P ] k 2 [ E ]0 [ S ]
=
dt
K m[ S ]
[E]0 es el total de enzima. No es práctico medir la cantidad de complejo enzima-sustrato
durante la reacción, por lo que debe escribirse su concentración en términos de cantidad
total o inicial de enzima, que es una cantidad conocida.
 d[P]/dt es la velocidad de producción de producto.
 k2[E]0 = Vmax es la velocidad máxima

Cuantificación. En el caso en el que la enzima está saturada con sustrato, [S] » Km, la
velocidad d[P]/dt es directamente proporcional a la concentración inicial de la enzima [E]0:
d [ P]
= k 2 [ E ]0
dt
Por lo tanto, las mediciones de la velocidad se pueden usar para obtener la actividad de la
enzima (concentración), [E]0.
Asimismo, los sustratos se pueden determinar mediante métodos cinéticos. Para poder
realizar esto se debe cumplir que [S] « KM, y la ecuación del mecanismo de Michaelis-Menten se
reduce a
k
d [ P]
= 2 [ E ]0 [ S ] = k' [ S ]
dt
Km
En este caso, la velocidad de la reacción es directamente proporcional ala concentración
del sustrato [S]. Si las medidas se toman cerca del inicio de la reacción (<5% de la reacción), [S]
~ [S]0 y la velocidad es directamente proporcional a la concentración inicial del sustrato.
Por lo tanto, se puede concluir que la velocidad inicial es proporcional a la concentración
del sustrato a muy bajas concentraciones, pero la velocidad es proporcional a la concentración
de la enzima cuando la concentración del sustrato es muy alta.
Los métodos cinéticos pueden ser más selectivos que los de equilibrio si los reactivos y
las condiciones se escogen de tal manera que se lleven al máximo las diferencias en las
velocidades a las cuales reaccionen el analito y los posibles interferentes. En los métodos que se
basan en el equilibrio, la selectividad se efectúa al aumentar las diferencias en las constantes de
equilibrio.
Tipos de los métodos cinéticos para cuantificación. Los métodos cinéticos se
pueden clasificar de acuerdo con la manera en que se efectúen las mediciones. Con los métodos
diferenciales se calcula la velocidad de reacción y se le relaciona con la concentración del
analito. Las velocidades se determinan a partir de la pendiente de la curva de absorbancia contra
tiempo. En el caso de los métodos integrales, se utiliza una forma integrada de la ecuación de la
velocidad y se determina la concentración del analito a partir de los cambios de absorbancia que
se producen en varios tiempos.
Fuente: D. A. Skoog, F. J. Holler, S. R. Crouch, Principios de análisis instrumental, 6ta edición,
Cengage Learning, México, 2008.