ME_712_02_008_V7_recuento_coliformes_medio_solido

MÉTODO DE ENSAYO PARA EL
RECUENTO DE COLIFORMES Y E. coli EN
MEDIO SÓLIDO
(ex PRT-712.02-008 y PRT-712.02-037)
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
ME-712.02-008
Emisión:
1992
Versión: 7
Actualización:
02-04-2014
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OBJETIVO
Este método es utilizado para realizar recuento de bacterias del grupo coliformes, y E. coli
presentes en una muestra de alimento
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a muestras de alimentos en los cuales se sospecha una carga
bacteriana alta y en muestras en las que se requiera realizar un método rápido de Recuento de
E. coli.
3.
FUNDAMENTO
Violet Red Bilis Agar (VRBA) también conocido como Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV),
se utiliza en la enumeración de coliformes. Contiene peptona como fuente de carbono y
nitrógeno. Además, contiene extracto de levadura como fuente de complejo vitamínico B, el
cual estimula el crecimiento bacteriano. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
desarrollo de Gram positivos. Lactosa como fuente de carbohidrato y rojo neutro como
indicador de pH.
Los organismos fermentadores de lactosa, como los coliformes crecen formando colonias rojas
con o sin zona de precipitación, en cambio los no fermentadores de lactosa se desarrollan
formando colonias incoloras a transparentes con o sin zona de precipitación.
Para la confirmación de coliformes se debe traspasar colonias aisladas a Caldo Bilis Verde
Brillante.
La incorporación de 4-methylumbelliferyl- beta- D- glucoronide (MUG) en Agar Rojo Neutro
permite la detección de E. coli de entre otras colonias coliformes a través de la detección de la
actividad beta-glucoronidasa. E. coli produce la enzima beta-glucoronidasa la cual hidroliza el
MUG produciendo un compuesto fluorogénico detectable con luz UV a 366 nm.
Las cepas típicas de E. coli, colonias rojas con precipitación biliar, muestran fluorescencia. Los
coliformes que no son E. coli pueden producir colonias rojas con zonas de precipitación biliar
pero son MUG negativas.
4.
4.1
DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
Bacteriological Analytical Manual Online. September 2002. Capítulo 4 punto G.
DUEÑO DE PROCESO:
Jefa de Sección Microbiología
de Alimentos
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE DE
“DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
MÉTODO DE ENSAYO PARA EL
RECUENTO DE COLIFORMES EN MEDIO
SÓLIDO
(ex PRT-712.02-008 y PRT-712.02-037)
Sección Microbiología
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5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Grupo coliformes
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El grupo coliformes incluye bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 48 horas a 35ºC. Este
grupo incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.
6.
REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
6.1.1 Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)
6.1.2 Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
6.1.3 Agua de dilución Butterfiel.
6.1.4 Agua peptonada 0,1%
6.1.5 Reactivos Tinción de Gram
6.1.6 Agar VRB-MUG (100 ug. de MUG/ ml. de medio)
6.2
INSUMOS
6.2.1 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.
6.2.2 Placas Petri de 100 mm de diametro
6.2.3 Tubos de fermentación de 20 x 150 mm y 16 x 160 mm
6.2.4 Asa de 3 mm de diâmetro
6.2.5 Propipeta
6.2.6 Lentes UV
6.3
EQUIPOS
6.3.1 6.3.1 Incubadora a 35º ± 1ºC
6.3.2 Lámpara UV 6 Watt
6.4
CEPAS CONTROL
6.4.1
Caldo BVB
Control positivo: Escherichia coli ATCC 25922 o 8739 o equivalente.
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 o 19433 o equivalente.
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6.4.2
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Agar RNCV y agar VRB-MUG.
Control positivo: Escherichia coli ATCC 25922 o 8739 o equivalente.
Control negativo: S. aureus 6538 o equivalente.
7.
7.1
DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
Muestreo(Si aplica)/Muestra
No Aplica.
7.2
Preparación de reactivos (Si aplica)
Preparar los medios y reactivos, de acuerdo a la referencia o a las instrucciones del
fabricante.
7.3
Preparación de curva de calibración (Si aplica).
No aplica
7.4
Preparación de controles (Si aplica).
7.4.1 En cada etapa de incubación se deben incluir cultivos control, se usa Escherichia coli
como control positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular
siempre el control negativo antes del positivo. Incluir placas de medios de cultivo sin
inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo.
7.4.2 Anotar los resultados de los cultivos control y de esterilidad de los medios en el registro
RG-712.00-072.
7.5
Preparación de la muestra o etapas previas a realizar la medición
7.5.1 Preparar la muestra y diluciones, según IT-712.00-112, Instructivo Procesamiento de
las muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico.
7.6
Análisis de la muestra o realización de la medición. Condiciones instrumentales.
(cuando corresponda).
7.6.1 Sembrar 2 diluciones en duplicado de la muestra, en profundidad con agar Rojo Neutro
Cristal Violeta (RNCV). Inocular 4 placas Petri, dos con 1 ml. de la dilución 10-1 y dos
con 1 ml. de la dilución 10 -2.
7.6.2 Verter en cada placa 10 mL de agar RNCV temperado a 48º C.
7.6.3 Mover las placas con movimientos rotatorios, para mezclar la muestra y el medio de
cultivo.
7.6.4 Cuando el agar este solidificado agregar aproximadamente 5 ml. de agar RNCV
temperado, sobre la superficie del agar, formando una capa superficial para prevenir el
crecimiento invasivo.
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7.6.5 Si se requiere realizar la resucitación, agregar una capa basal de 8 a 10 mL de agar
soya tripticase temperado a 48ºC. Agitar para mezclar e incubar a temperatura
ambiente por 2 ± 0,5 horas. Luego agregar una capade 8 a 10 mL de agar
7.6.6 Alternativamente para recuento de E. coli, se puede utilizar agar VRBA suplementado
con MUG en una concentración de 100 µg/mL
7.6.7 Dejar solidificar el agar, e incubar las placas invertidas a 35º ± 1ºC durante 18 a 24 hrs.
En alimentos lácteos incubar a 32 ° C.
TEST CONFIRMATIVO PARA GRUPO COLIFORMES
7.6.8
Seleccionar por lo menos 10 colonias sospechosas e inocular en caldo BVB
conteniendo tubo de fermentación.
7.6.9
Incubar los tubos de caldo BVB a 35º ± 1ºC. Examinar los tubos por producción de gas
a las 24 y 48 horas.
7.6.10
Al término del período de incubación observar la formación de gas en los tubos de
fermentación. Registrar como positivo aquellos tubos que presenten gas, la ausencia
de gas es considerado un test negativo. Registrar lectura y controles en RG-712.00072.
Nota: Si los tubos de caldo BVB muestran una película realizar tinción Gram para
asegurar que la producción de gas no fue debido al desarrollo de bacilos
fermentadores de lactosa Gram positivos.
7.7
Cálculo de resultados
7.7.1 Al término del período de incubación, seleccionar la dilución cuyas placas contengan
entre 25 y 250 colonias, contar las colonias sospechosas tanto típicas como atípicas y
registrar el resultado multiplicando el número de colonias por la dilución correspondiente
en el registro código RG-712.00-072.
Colonias típicas:
lactosa positivo, de color rojo intenso, con zona de precipitado de
ácidos biliares, diámetro de 0,5 mm o mayor.
Colonias atípicas:
precipitado.
pueden ser de color rosado, amarillento o café claro, con o sin
7.7.2 En caso de haber utilizado agar VRBA-MUG observar la fluorescencia de las colonias
bajo luz UV. Registrar en RG-712.00-072. Para reralizar el recuento de E. coli
considerar positivas aquellas colonias que presentan fluorescencia bajo la luz UV.
Anotar los resultados de los cultivos control y de esterilidad de los medios en el
registro RG-712.00-072.
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7.7.3 Por cada lote de muestras procesadas o si el lote de muestras es mayor a 10, realizar
una muestra en duplicado. Ingresar los resultados en la carpeta compartida para el
cálculo de precisión y evaluar si se ajusta al criterio de precisión calculado por el
laboratorio.
7.7.4 Cuando todas las colonias sometidas a confirmación dan un resultado positivo, significa
que el recuento presuntivo fue confirmado totalmente, si solo algunas colonias resultan
positivas, es necesario calcular el recuento de coliformes totales, de la siguiente forma:
Rcto de coliformes = Rcto. Estimado x
Nº de colonias inoculadas
Nº de colonias confirmadas
Ejemplo cálculo de recuento.
Rcto. de coliformes =
150000 x 3= 90000
5
7.8
7.8.1
Aseguramiento de la calidad del ensayo
Participación periódica en ensayos de intercomparación.
7.9
Expresión de los resultados
7.9.1
Los resultados del Recuento de coliformes se expresan cuantitativamente en Nº
ufc/g o mL de muestra.
7.9.2
Los resultados del Recuento de E. coli se expresan cuantitativamente en Nº ufc/g o
mL. de muestra.
8.
CONTROL DE REGISTROS
IDENTIFICACION
RESPONSABLE
TIEMPO
RG-712.00-072
Registro
de
resultados
análisis
de Encargado de
coliformes, E. coli laboratorio
y Salmonella en
muestras
de
alimentos.
5 años
ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
RESPONSABLE/
SOPORTE
RECUPERACION
Papel
Lab. 348.
Jefe de Sección.
Carpeta Alimentos.
DISPOSICION
Eliminar
picado en
trozos
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CONTROL DE CAMBIOS
VERSION
FECHA
6
02-04-2014
PRINCIPALES
PUNTOS
MODIFICADOS
Todo
Todo
1, 2 y 3
6
7
10.
CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Ejecuta el método
(Cargo)
Técnico de laboratorio
(Preparación y siembra)
Encargado de Laboratorio
(Preparación, siembra, lectura
e informe)
11.
RESUMEN DE MODIFICACIONES
Se modifica formato de PRT a ME.
Se fusionan PRT-712.02-008 y PRT-712.02-037
Se complementa objetivo, campo de aplicación y
alcance, fundamento,
Se incorporan medios de cultivo y reactivos
Se incorporan insumos y equipos
Se incorporan los puntos 7.6.5 , 7.6.6, 7.7.3 , 7.9.2
Se complementa pto. 7.6.10, 7.7.2
Se eliminan los controles ambientales
ANEXOS
No Aplica.
Elabora el informe de
resultados
(Cargo)
Jefe de Laboratorio
Aprueba el informe de
resultados
(Cargo)
Jefe de Subdepartamento