IA-MBA-PT-020 Detección y enumeración de Escherichia
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LANASEVE Rige a partir de: 04/10/10 Código: IA-MBA-PT- 020 Detección y enumeración de Escherichia coli y coliformes en agua Versión 04 Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 1. Objetivo Disponer de un método para realizar la detección de Escherichia coli y coliformes en agua. 2. Alcance Para aplicar en muestras de agua potable. 3. Responsabilidad y autoridad Jefe de Sección: debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Analista: deben realizar las actividades descritas en este procedimiento. 4. Definiciones Bacteria lactosa positiva: bacteria aerobia capaz de crecer a 36 °C en 24 horas y formar colonias en un agar selectivo y diferencial que contiene lactosa y producir ácido. Bacteria coliforme: bacteria lactosa positiva, oxidasa negativa Escherichia coli: bacteria coliforme que produce indol a partir del triptofano a una temperatura de 44 °C en 24 horas. 5. Abreviaturas y/o Siglas No aplica 6. Referencias y/o Bibliografía IA-MBA-PE-009-RE- 008 Hoja de trabajo SEG-PE-005 Control de medios IA-MBA-PO-004 Control de Equipo. ISO 9308-1 Calidad del agua: detección y enumeración de Escherichia coli y bacterias coliformes (Edición 2000) Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 04/10/10 Código: IA-MBA-PT- 020 Detección y enumeración de Escherichia coli y coliformes en agua Versión 04 Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7. Descripción del procedimiento 7.1 Fundamento Teórico Filtración de un volumen específico de agua a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 μm que permite retener las bacterias. La membrana es colocada en un agar selectivo y diferencial que contiene Tergitol 7, esta sustancia impide el crecimiento de bacterias Gram positivas. El medio contiene también lactosa, TTC y azul de bromotimol como indicador de pH. Los coliformes fermentan la lactosa y esto se evidencia por un cambio de color del indicador de pH; además el TTC es reducido a un complejo insoluble rojo formazán por la mayoría de coliformes excepto E.coli 7.2 Equipo, Materiales, Medios de cultivo y reactivos 7.2.1 Equipo Incubador 36 ºC ± 2 °C Incubador 44 ºC ± 0,5 °C Sistema para filtración de agua (Embudos, bomba para vacío, soporte para embudos) 7.2.2 Materiales Pinzas estériles Membranas Millipore 0,45 µm estériles Aplicadores de madera Papel filtro 7.2.3 Medios de cultivo y reactivos Agar Tergitol 7 (agar lactosa TTC con heptadecisulfato de sodio ) Caldo Triptofano Agar Triptona de soya Reactivo de Kovacs Reactivo de oxidasa Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 04/10/10 Código: IA-MBA-PT- 020 Detección y enumeración de Escherichia coli y coliformes en agua Versión 04 Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.2.4 Cepas control Escherichia coli 7.3 Procedimiento 7.3.1 Colocar la membrana Millipore en el embudo de filtración, utilizar pinzas estériles. 7.3.2 Sellar el embudo 7.3.3 Depositar 100 ml de agua en el embudo y filtrar por vacío. 7.3.4 Remover la membrana con pinzas estériles y colocarla en placa de agar Tergitol 7 7.3.5 Incubar la placa a 36 °C ± 2 °C por 21 h ± 3 horas 7.3.6 Después del período de incubación examinar la placa y considerar las colonias amarillas, como colonias típicas 7.3.7 Si se observan colonias típicas, inocular una placa de agar triptona de soya y un tubo de 3 ml de caldo triptófano , incubar a 36 °C ± 2 °C por 21 h ± 2 horas y 44 °C ± 0,5 °C por 21 h ± 3 horas respectivamente. Prueba Oxidasa 7.3.8 Colocar de 2 a 3 gotas o disco reactivo de oxidasa en un papel filtro , con un aplicador de madera transferir una colonia del agar triptona de soya al papel filtro. 7.3.9 Esperar 30 segundos y observar la aparición de un color azul-morado, esto se considera como reacción positiva. Prueba de indol 7.3.10 Agregar de 0,2 ml a 0,3 ml de reactivo de Kovacs al tubo de caldo triptófano. 7.3.11 Si se observa el desarrollo de un color rojo en la superficie del caldo indica la presencia de indol. 7.4 Reporte de resultados 7.4.1 Contar todas las colonias que dan una reacción oxidasa negativa como bacterias coliformes 7.4.2 Contar todas las colonias que dan una reacción oxidasa negativa y producción de indol como Escherichia coli. 7.4.3 Registrar los resultados en el formulario IA-MBA-PE-009-RE-008 Hoja de trabajo 7.4.4 Reportar el n° colonias confirmadas como E.coli en 100 ml Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada Elaborado por: Jefe de Sección LANASEVE Rige a partir de: 04/10/10 Código: IA-MBA-PT- 020 Detección y enumeración de Escherichia coli y coliformes en agua Versión 04 Página 4 de 4 Revisado por: Encargada de Calidad de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 7.5 Control de Calidad 7.5.1 Se deben como control positivo una cepa de E.coli. 7.5.2 La concentración del inóculo del control positivo debe estar aproximadamente entre 30 a 100 ufc para 100 ml. 7.5.3 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al procedimiento SEG-PE-005 Control de medios. 7.6 Puntos Críticos de Control Control de temperaturas de los incubadores, se debe mantener el registro de la temperatura óptima de cada equipo, así como las medidas correctivas en caso de alguna variable según IA-MBA-PO-004 Control de Equipo. 8. Anexos No aplica Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada
