(Prunus persica (L.) Batsch)

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE PROCESADOS INDUSTRIALES DE
MELOCOTÓN (Prunus persica (L.) Batsch) UTILIZANDO BACTERIAS
Zymomonas mobilis.
______________________________________________________________________
Beatriz Brito Grandes.Ing. Quím. MS., Investigadora Departamento Nutrición y
Calidad, E.E. Santa Catalina-INIAP. Ecuador.
Pedro Lozano Rodríguez. Doctor en Química, PhD, Profesor Titular, Facultad de
Química, Universidad de Murcia. España.
____________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
En este trabajo se presentan los resultados de una investigación realizada en el
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Química de la
Universidad de Murcia en España, con el auspicio de una beca de la UNESCO
Biotechnology Action Council.
A la Biotecnología Alimentaria se la podría definir como el conocimiento y la
utilización de los microorganismos para producir más y mejores alimentos, además de
la manipulación genética en plantas y animales con los mismos fines. Es así, como de
las industrias agro-alimentarias, que son la sucesión de operaciones de separación que
conducen a la purificación de una molécula, o bien, más a menudo, a la de una familia
de moléculas, a través de las industrias químicas se llega rápidamente a la
biotecnología, cuando la extracción va acompañada de bioconversiones. En este
aspecto, la elaboración de bebidas alcohólicas (cerveza, vino, vino de frutas, etc),
constituye un ejemplo típico, ya que supone la extracción de un substrato y el
aislamiento de un producto obtenido por fermentación o por conversión enzimática.
(12), (21)
Las frutas de hueso más frecuentemente transformadas en pulpa y zumos son las
ciruelas, los melocotones, los albaricoques y las cerezas. El melocotón, cuyos
procesados industriales, son objeto de esta investigación, tuvo una producción mundial
en 1990, de 81586.000 TM, siendo considerada una de las mas importantes. (23)
Se producen vinos de frutas a escala industrial en diversos países de Europa y muchas
otras partes del mundo, especialmente en aquellas zonas que no reúnen las condiciones
adecuadas para el cultivo de las cepas de uva para la elaboración de vino. En Europa, la
Asociación de Productores de Sidra y Vinos de Frutas de la Unión Europea han
acordado algunas definiciones, para dos tipos de vinos de frutas: los vinos de frutas con
y sin fortificación alcohólica. La reglamentación se encuentra en la Official Journal of
the European Communities, del European Parlament and Council Directive 94/35/EC y
94/36/EC de Junio 30 de 1994, y 95/2/EC de Marzo 25 de 1995. (2)
La investigación de técnicas nuevas que permitan conservar las frutas después de las
cosechas, así como la búsqueda de nuevas formas de consumo tras el procesamiento
industrial, ha permitido el desarrollo de alternativas biotecnológicas para la obtención
de bebidas derivadas de las frutas, pues existe una diversidad de microorganismos, con
diferentes particularidades fisiológicas y metabólicas, que permiten la producción
biológica de etanol. Entre ellas, hay un tipo de bacterias mesófilas, del género
Zymomonas, que se ha empleado en países tropicales como agente fermentativo natural,
para la producción de bebidas alcohólicas a partir de savia de plantas. Tradicionalmente
se ha aislado del pulque Mejicano (savia fermentada del Agave Americana), aunque
también se encuentra en extractos vegetales ricos en azúcares y en sidra y cerveza
contaminada. (5) (15)
El género Zymomonas es una especie única con dos subespecies: Z. mobilis subespecie
mobilis y Z. mobilis subespecie pomacii, quedando este género incluído en la selección
de Bacilos Gram-negativos Anaerobios Facultativos en la novena edición del Manual
Bergey. (26)
En cuanto a las características fenotípìcas del género Zymomonas se podrían resumir en
los siguientes puntos (5):
•
•
•
•
•
•
•
Bacilos Gram-negativos (2-6 μm por 1-1.5 μm).
Las cepas mótiles poseen de 1 a 4 flagelos en posición lofótrica, aún cuando la
motilidad no es un rasgo esencial de la especie.
Células pleomórficas, en rosetas y filamentos.
No forman esporas ni cápsulas, no acumulan lípidos, glucógeno o poli-βhidroxibutirato.
Catalasa positivo, oxidasa negativo.
Anaerobia facultativa .
Metaboliza glucosa y fructosa a etanol y CO2 con rendimientos cuantitativos, a
través de una modificación de la ruta de Entner-Doudoroff, siendo el único
microorganismo, reportados hasta 1988, que emplea esta vía anaeróbicamente.
El balance neto de la ruta es la formación de un mol de Adenosín trifosfato (ATP) y dos
de etanol y dióxido de carbono por mol de glucosa o fructosa metabolizada, de ahí que
la formación de biomasa sea menor que en el caso de levaduras (dos moles de ATP por
mol de glucosa por la vía glicolítica), debido a una limitación en la disponibilidad de
energía para los procesos de biosíntesis. Este hecho es de fundamental importancia para
la potencial aplicación industrial de Zymomonas, puesto que, como consecuencia del
bajo rendimiento en biomasa, el rendimiento en el producto deseado, etanol, es próximo
al teórico. (6)
Las principales limitaciones de Zymomonas son tres: (6)
•
•
•
En condiciones de operación no estériles, el riesgo de contaminación empleando
Zymomonas es superior al de levaduras, debido al mayor pH de operación en el caso
de la bacteria, que permite el desarrollo de un amplio número de microorganismos.
Solamente puede utilizar como substratos glucosa, fructosa y sacarosa.
La tolerancia a etanol es inferior a la de las cepas de levaduras más tolerantes, es
decir menor de 76 – 100 g/l para el crecimiento celular y 114 – 200 g/l para la
producción de etanol.
El objetivo del presente trabajo se centró en la realización de fermentaciones
anaeróbicas en discontinuo, utilizando bacterias Zymomonas mobilis a condiciones
naturales de anaerobiosis, temperatura y pH, en dos procesados de melocotón: un
concentrado clarificado y un cremogenado despectinizado, para la obtención de un licor
con alto grado alcohólico.
2
MATERIALES Y MÉTODOS
Substratos.
1) Concentrado Clarificado de melocotón, estéril, suministrado por una industria
local (España), diluido a diferentes concentraciones, además se realizaron los
experimentos sin y con adición de glucosa.
2) Cremogenado de melocotón, con tamaño de partícula menor de 0.2 mm., no estéril,
suministrado por una industria local (España).
La preparación enzimática empleada para despectinizar el cremogenado fue de
naturaleza comercial, compuesta de una enzima péctica de origen fúngico (A. niger),
denominada Pectinol D, usada en procesos de clarificación a nivel industrial, y una
enzima especial para la descomposición del material vegetal, denominada Rohament
Cw, las cuales fueron suministrados por la casa Röhm GmbH. (19)
A un litro de cremogenado se anadió 20 ml. de una mezcla de estas dos enzimas (1:1) en
una concentración de 100 mg/ml, manteniéndose una hora con agitación muy lenta,
llegando a disminuir su viscosidad en base el tiempo de caída, en un 99%. Se utilizó
este cremogenado despectinizado, sin y con adición de glucosa en los experimentos.
Microorganismo y Medio de Cultivo.
Zymomonas mobilis ZM4, conservada en glicerol al 20% a -20°C, se reprodujo en el
siguiente medio de fermentación (g/l): glucosa, 100; extracto de levadura, 10; KH2PO4,
2; (NH4)2SO4, 1; MgSO4.7H2O, 0.5. Teniendo en cuenta que la esterilización de la
glucosa y de las sales y extracto de levaduras debe realizarse por separado.
Posteriormente ambas disoluciones se mezclaron en condiciones estériles, dando lugar
al medio de cultivo, el cual se deja aproximadamente 15 horas a 35°C, para que
desarrollen las células.
Reactores anaeróbicos discontinuos.
Para la fermentación se utilizaron erlenmeyers de 250 ml y 2000 ml, los cuales se
adaptaron con tapones de caucho con dos orificios, a través de los cuales se introdujo
tubo de vidrio acoplado a mangueras, los cuales sirvieron para la toma de muestra, y el
escape de gases producto de la fermentación.
La toma de muestra se realizó con una jeringuilla, esta manguera debe llegar hasta el
fondo del matraz. Antes de ser utilizados los reactores se esterilizaron en autoclave, el
substrato y el inóculo se añadieron en condiciones estériles en una cabina de flujo. Los
substratos se utilizaron sin esterilizar, para evitar pérdidas en sus cualidades
organolépticas.
Se utilizó un agitador con control de velocidad, oscilando de 120 a 100 rpm. La salida
de los gases se recibieron en una probeta graduada con agua, controlando así la
anaerobiosis.
3
Métodos Analíticos.
Determinación de Sólidos Solubles.
Se utilizó un refractómetro manual, ATAGO N1, con escala de 0 a 32 °Brix.
Medida de la Concentración de Biomasa.
Se determinó espectrofotométricamente a 660 nm. Para lo cual se centrifugó un ml de
muestra a 10000 rpm, el precipitado se redisuelve en un volumen de agua tal que la
absorbancia medida sea inferior a 0.4 unidades, utilizando agua como blanco. El
sobrenadante se guarda para analizar glucosa y etanol.
La concentración de biomasa y la absorbancia están relacionadas mediante la ecuación:
A660 = 0.00317 + 5.3071 x Biomasa (g/l)
Determinación de la Concentración de Glucosa. Azúcares reductores totales.
Se realizó según el método de Nelson-Somogy, descrito en (9) (19), basado en la
propiedad que tienen los azúcares reductores de actuar sobre el sulfato de cobre
transformándolo en óxido cúprico, que se trata con un reactivo de arsenomolibdato,
formándose un complejo coloreado cuya intensidad se puede determinar
espectrofotométricamente a 740 nm.
Determinación de Etanol: Kit de Boehringer Mannheim (4)
El etanol es oxidado en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) con
nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD), dando acetaldehido. El equilibrio de esta
reacción esta dado por la cantidad de etanol y NAD; completándose la reacción en
condiciones alcalinas, dando lugar a la formación de acetaldehído. El acetaldehído es
oxidado en presencia de aldehído deshidrogenasa (Al-DH) cuantitativamente, dando
ácido acético. NADH es determinado midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro
a 340 nm.
La concentración se obtiene en g/l, para lo cual se debe considerar la densidad del
etanol, 0.79 g/ml, para reportar en porcentaje volumen (%V), es decir ml etanol/ 100 ml
muestra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Considerando la información obtenida en las diferentes experimentaciones realizadas, se
obtuvo los mejores resultados con la utilización del concentrado clarificado, dejando el
cremogenado despectinizado para futuras investigaciones.
Substrato a fermentar: Concentrado Clarificado
Sólidos Solubles: 52.8 °Brix
Glucosa: 563.70 g/l
Densidad: 1.251 g/ml
Cultivo de Z. mobilis.
Sólidos Solubles: 3.8 °Brix
Biomasa: 1.5152 g/l
Glucosa: 0.5622 g/l
pH: 4.5
4
Volumen a fermentar: 2000 ml incluyendo 400 ml del inóculo.
Condiciones de la fermentación.
Al ambiente (20 - 22 °C), con agitación de 120 rpm.
Tratamientos.
T1: Muestra con dilución a 10 °Brix.
T2: Muestra con dilución a 10 °Brix, con adición de 75 g glucosa/l.
T3: Muestra con dilución a 10 °Brix, con adición de 100 g. glucosa/l.
T4: Muestra con dilución a 10 °Brix, con adición de 125 g glucosa/l.
Toma de muestras y análisis a realizar.
El experimento se inicio inoculando 400 ml de un cultivo de Z. mobilis ZM4 en fase
exponencial de crecimiento, en los reactores que contenían 1600 ml de las muestras,
para controlar posibles contaminaciones se trabajo en la cámara de flujo; cabe indicar
que el agua destilada utilizada en las diferentes diluciones de las muestras, en los cuatro
experimentos, fue estéril. Se cerraron los reactores y se inicio la toma de muestras, 3 ml
periódicamente.
Se analizaron los sólidos solubles, pH, biomasa, glucosa y etanol a las siguientes horas:
0, 24, 48, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231 y 279.
En las Figs. 4.1, 4.2 , 4.3 y 4.4, se presentan la evolución de las concentraciones de los
parámetros analizados en los cuatro tratamientos. Pudiendo observarse las tres fases
caraterísticas del crecimiento microbiano; una fase de retardo hata las 87 horas en el T1,
y las 48 horas para T2, T3 y T4. Luego un crecimiento de la población bacteriana,
paralelo a un aumento en la concentración de etanol en el medio. A pesar de no haberse
agotado el sustrato (glucosa), se produjo la entrada de la población celular en la fase
estacionaria de crecimiento.
3.0
110
15
2.5
300
2.0
250
200
1.5
150
1.0
100
10
0.5
5
50
0.0
0
0
100
90
Glucosa (g/l)
20
Biomasa (g/l)
Sólidos Solubles (°Brix)
350
80
70
60
50
40
30
20
10
0
30 60 90 120 150 180 210 240 270
Horas
FIG. 4.1
Tratamiento 1: Concentrado Clarificado a
10 °Brix.
Etanol final: 54.67 g/l = 6.92 % v/v
5
Etanol (g/l)
25
25
3.0
60
40
300
2.0
250
200
1.5
150
20
Glucosa (g/l)
Biomasa (g/l)
Etanol (g/l)
80
2.5
15
10
1.0
100
20
0.5
0
0.0
5
50
0
0
50
100
150
Horas
200
0
250
FIG. 4.2
Tratamiento 2: Concentrado Clarificado a
10 °Brix más 75 g glucosa/l.
Etanol final: 92.48 g/l = 11.71 % v/v
25
3.0
300
2.0
250
200
1.5
150
10
100
80
60
Etanol (g/l)
15
2.5
Glucosa (g/l)
20
Biomasa (g/l)
Sólidos Solubles (°Brix)
350
40
1.0
100
5
0
0.5
20
50
0.0
0
0
50
100
150
Horas
200
0
250
FIG. 4.3
Tratamiento 3: Concentrado Clarificado a 10
°Brix más 100 g glucosa/l.
Etanol final: 96.55 g/l = 12.22 % v/v
25
3.0
10
300
2.0
250
200
1.5
150
1.0
100
80
60
40
100
5
0
0.5
0.0
0
50
0
50
100
150
Horas
200
20
0
250
FIG. 4.4
Tratamiento 4: Concentrado Clarificado a
10 °Brix más 100 g glucosa/l.
Etanol final: 104.11 g/l = 13.18 % v/v
6
Etanol (g/l)
15
2.5
Glucosa (g/l)
20
Biomasa (g/l)
Sólidos Solubles (°Brix)
350
Sólidos Solubles (°Brix)
350
100
El crecimiento celular en Zymomonas mobilis es inhibido más fuertemente por etanol
que el catabolismo, debido a los elevados requerimientos de energía para el
mantenimiento de las funciones celulares, que además aumentan al incrementarse la
concentración de etanol en el medio (6). Trabajos relacionados respecto al mecanismo
de inhibición por etanol ya se reportan en 1995 (16), donde se indica que la
concentración de etanol no tiene efecto significativo sobre la capacidad fermentativa de
Z.mobilis, pero que esos cambios si afectan totalmente su efecto inhibitorio.
En el Cuadro 1, se presenta los rendimientos en etanol (Yp/s) y biomasa (Yx/s), los
cuales se determinaron teniendo en cuenta en cada caso las concentraciones finales en la
máxima producción de etanol y biomasa y glucosa consumida. La productividad
volumétrica (PE) se calculo de forma global teniendo en cuenta el etanol producido y el
tiempo total de fermentación en cada tratamiento.
Según (6), en cultivos discontinuos, el cálculo de las velocidades específicas de
consumo de substrato (qs) y de producción de etanol (qp) es difícil, debido a que la
concentración de biomasa cambia exponencialmente con el tiempo, Sin embargo, se
puede realizar una estimación de dichos valores considerando un intervalo de tiempo en
la fase exponencial de crecimiento, y haciendo una aproximación a la linealidad.
Teniendo en cuenta este hecho, se puede emplear las siguientes relaciones de
Stevnsborg y Lawford.
qp =
ΔP
(g etanol/g biomasa. h)
med
X . Δt
(g glucosa/g biomasa.h)
qs = ΔS
X med.. Δt
Donde:
ΔS: substrato consumido en el intervalo de tiempo, Δt.
ΔP: producto formado en el intervalo de tiempo, Δt.
Δt = t2 - t1
X med = concentración de biomasa a t = t1 + Δt/2
CUADRO 1
PARÁMETROS CINÉTICOS DE Zymomonas mobilis A DIFERENTES
CONCENTRACIONES INICIALES DE GLUCOSA EN REACTORES
DISCONTINUOS, UTILIZANDO CONCENTRADOS CLARIFICADOS DE
MELOCOTÓN (Prunus persica (L.) Batsch).
Parámetro
q s (g/g.h)
q p (g/g.h)
P E (g/l.h)
Y p/s (g/g)
Y x/s (g/g)
t (h) *
pH final
*
Concentración Inicial de Glucosa (g/l)
144.65
279.66
299.81
0.756
0.481
0.508
0.322
0.244
0.294
0.264
0.505
0.466
0.408
0.347
0.393
0.011
0.008
0.008
111 - 183
159 - 183
111 - 207
3.9
3.8
3.8
Intervalos de tiempo para realizar los cálculos de qs y qp.
7
364.38
0.542
0.327
0.569
0.351
0.008
87 - 187
3.8
Las muestras se centrifugaron a 10000 rpm, por 15 minutos, y se procedió a realizar una
encuesta con cuatro panelistas no adiestrados, para ver la aceptabilidad del producto
obtenido, a nivel de aroma, color y sabor. Encontrandose que no existía variación de
color entre los cuatro tratamientos; el sabor tenia mucha aceptabilidad, habiendo
diferencia de criterios con el sabor a sidra de cada producto obtenido, a pesar de la
diferencia en la composición respecto al contenido de etanol y glucosa.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1. Las fermentaciones alcohólicas con el uso de cremogenados deben realizarse,
utilizando este substrato pasteurizado, con las debidas pérdidas que afecten sus
cualidades organolépticas. El pardeamiento en el producto final puede evitarse
mediante un escaldado previo, la adición de disoluciones de ácido ascórbico, etc.; a
la vez que puede ser utilizado en fermentaciones secundarias o adicionarse al final
de las fermentaciones, para obtener el color y/o aroma característico de la fruta.
Existe la posibilidad de adición de aromas y etanol en el refinado, para dar el
acabado final de los productos obtenidos, así como, para la obtención de elaborados
de mayor grado alcohólico.
2. Debe compararse los resultados de la fermentación con la bacteria Zymomonas
mobilis, con los que se obtuvieran utilizando levaduras, para, entonces decidir cuál
es la mejor alternativa biotecnológica; además de su uso en frutas tropicales, que ya
tienen su significación comercial en los mercados internacionales.
3. Una aplicación práctica en nuestro país sería la obtención de cremogenados de
frutas, en vista de que la obtención de este procesado está más al alcance de los
productores de fruta y es una transformación inmediata, que ayuda a disminuir las
pérdidas post cosecha ocasionadas en el almacenamiento. Como ejemplo, tenemos
que en la Región de Murcia en España, seis cooperativas que representan a más de
1800 socios y una facturación superior a 2000 millones de pesetas, invertieron 500
millones de pesetas para construir la primer factoría industrial de los agricultores
"Cremofruit" (Periódico La Verdad, sección "El Campo", noviembre 20 de 1997).
4. En esta fase de experimentos, los mejores resultados de las fermentaciones con la
bacteria Zymomonas mobilis, se obtuvo utilizando concentrados clarificados,
diluídos a 10° Brix, obteniendo contenidos alcohólicos de 7% v/v y un máximo de
13% v/v cuando se adicionó 125 g glucosa/l. Que bien podrían comercializarse
como vino de fruta, pues cumplen con la reglamentación de la Asociación de
Productores de Sidra y Vinos de Fruta de la Unión Europea.
5. Los parámetros cinéticos reportados, son comparables con los obtenidos en otras
condiciones de trabajo con esta bacteria. Los valores que corresponden al
rendimiento de etanol que caracteriza el comportamiento de Z. mobilis, son más o
menos similares. El rendimiento de biomasa es ligeramente menor, lo cual es
razonable, cuando se observa que el pH final de la fermentación es 3.8 en
comparación con rangos de 4.5 a 5.0, obtenidos en otras condiciones de
experimentación.
6. Los procesos fermentativos típicos en la elaboración de sidra duran de 2 a 12
semanas, sin control de temperatura, pH u otros parámetros, hasta que el azúcar
8
fermentable se halla metabolizado y transformado en etanol; en base a esto los
valores correspondientes a las productividades volumétricas de etanol, son menores
con relación a los obtenidos bajo condiciones controladas donde se obtienen
perfiles de fermentación y productos más constantes.
7. Se ha obtenido información sobre el comportamiento de la bacteria Zymomonas
mobilis, cuando se utiliza como substratos dos procesados industriales de
melocotón. Hay pocas investigaciones de este tipo reportadas en la bibliografía
especializada.
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