TP 3 2016 - Campus Virtual - Universidad Nacional de Tucumán

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Universidad Nacional de Tucumán
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº2
Hemograma. Recuento diferencial
leucocitario. Trastornos leucocitarios.
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RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO
La fórmula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario (RDL) actual es lo que
antes se denominaba “Hemograma de Schilling”. Existen dos tipos: la porcentual o
relativa y la absoluta. La primera expresa la cantidad de cada tipo leucocitario por
100 leucocitos; y la segunda la cantidad de cada uno por litro de sangre. Para el
cálculo de la segunda es indispensable el conocimiento de la cifra de leucocitos
por litro. Debe tenerse en cuenta que la relativa es sólo el paso indispensable para
el cálculo de la absoluta, que es la que tiene valor clínico real. Cualquier aumento
de la concentración absoluta es un incremento absoluto, mientras que una
elevación sólo del porcentaje representa un aumento relativo. El RDL en
condiciones de normalidad está constituido por 5 poblaciones de leucocitos:
neutrófilos (segmentados y en cayado o en banda), linfocitos, monocitos,
eosinófilos y basófilos.
MÉTODO VISUAL O MANUAL: técnica para el examen del frotis sanguíneo
Una vez confeccionado el extendido, éste se deja secar, se fija, colorea y examina
sistemáticamente. Se cubre toda la superficie con una película fina de aceite de
inmersión y se observa primero con poco aumento (con el objetivo de 40x), hasta
encontrar un área donde los glóbulos rojos estén bien distribuidos y no
distorsionados, la morfología de los leucocitos sea clara y los tamaños de ambos
sean proporcionales (generalmente se encuentra en la zona intermedia entre el
cuerpo y cola del extendido) (Figura N°1).
FIGURA N°1: Elección de la zona para realizar el recuento diferencial leucocitario
Varios sistemas se han propuesto para realizar el recuento diferencial. Existe el
problema de la diferente distribución de las células en la extensión, que debe ser
tenido en cuenta al realizar el recuento. El mismo se realiza con el aumento de
40x o 100x de acuerdo a la experiencia del operador o a la complejidad de las
células del extendido. La técnica consiste en seguir una guarda griega y contar
entre 100 o 200 elementos (Figura N°2). De esta manera el trayecto en la zona
elegida incluirá un 50% de células de las zonas periféricas o bordes y el 50%
restante de células pertenecientes a la zona central propiamente dicha.
La distribución irregular de los leucocitos obedece al diferente tamaño de las
células, de forma que las más pequeñas (linfocitos) tienen tendencia a situarse
hacia el centro de la extensión y las de mayor tamaño (monocitos) en las regiones
más periféricas.
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FIGURA N°2: Técnica de recuento diferencial leucocitario
50 o 100 elementos en c/u
Cálculo del número absoluto de cada leucocito
Ejemplo: para el cálculo del valor absoluto de neutrófilos se utiliza una regla de
tres simple
Neutrófilos x 109/L = Número total de leucocitos x 109/L X % de neutrófilos
100
Se procede de igual manera para cada uno de los otros leucocitos.
Causas de error en el RDL
1. Distribución irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensión
2. Realización del recuento en un lugar inadecuado de la extensión
3. Variaciones de la calidad y las características de la tinción
4. Observación de un número insuficiente de células
5. Pericia del observador en la identificación de determinados leucocitos:
neutrófilos segmentados versus no segmentados (en bandas), monocitos versus
linfocitos estimulados, formas inmaduras de granulocitos neutrófilos.
Pese a todo ello y de momento, el RDL visual continúa siendo el método de
referencia para la realización de la fórmula leucocitaria tanto para el NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards) como para el ICSH
(International Comité for Standardization in Haematology).
MÉTODO AUTOMÁTICO
En la actualidad existen autoanalizadores hematológicos que realizan un RDL con
gran precisión, exactitud y sobre todo rapidez. Un autoanalizador de fórmula
leucocitaria debe cumplir siempre dos requisitos fundamentales:
1. Reconocer y cuantificar las poblaciones leucocitarias.
2. Identificar la presencia de anomalías morfológicas mediante alarmas con el
objetivo de detectar la posible presencia de células atípicas o patológicas.
Los métodos que utilizan los distintos contadores para la realización del RDL son
los siguientes:
 VCS (Volumen, Conductivity, Scatter): Medición de volumen de cada célula
por impedancia; conductividad que informa sobre la estructura interna de las
células incluyendo el tamaño nuclear, densidad y razón núcleo/citoplasma; y
dispersión, que informa sobre la granularidad y superficie celular. Empleado por
Coulter STKS.
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
M.A.P.S.S.: Separación por dispersión polarizada con ángulos múltiples (0º,
90º, 10º, 90º despolarizado). Empleado por Abbott CELL-DYN 3500.
 CC y RF: Detección por CC (corriente continua), que mide volumen total
celular y RF (radiofrecuencia), que informa sobre la relación núcleo/citoplasma, la
complejidad y el volumen del núcleo celular y la granulación citoplasmática.
Empleado por Sysmex SE-9000.
 Tinción con peroxidasa, dispersión óptica y absorción para neutrófilos,
linfocitos, monocitos y eosinófilos; y lisis diferencial, contracción y dispersión con
láser para basófilos. (Bayer ADVIA 120)
El informe del autoanalizador incluye el recuento porcentual y absoluto de los
distintos tipos leucocitarios. Lamentablemente, aunque se trata de instrumentos
muy útiles para detectar la presencia de patología, carecen de garantía para la
interpretación de muchas alteraciones, que generalmente son suministradas bajo
la forma de alarmas. Por lo tanto siempre es obligada la observación
microscópica de la extensión para poder determinar de qué anomalía se trata.
VALORES DE REFERENCIA DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA (adultos)
Fórmula absoluta [x109/L]
Célula
Fórmula relativa [%]
Rango
Promedio
Rango
Promedio
0,1-0,5
0,22
2-5
3,0
1,7-6,5
3,78
38-65
52,0
0,04-0,4
0,20
1-4
2,7
Basófilos
0-0,10
0,04
0-1
0,5
Linfocitos
1,0-4,0
2,50
22-40
34,0
Monocitos
0,1-0,8
0,30
2-10
4,0
Neutrófilos
Cayados
Neutrófilos
segmentados
Eosinófilos
VARIACIONES DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA




Las células hematopoyéticas se distribuyen en cuatro compartimientos:
Compartimiento mitótico medular
Compartimiento de maduración-depósito medular
Compartimiento vascular, el cual en el caso de los neutrófilos se subdivide en:
1. un pool circulante
2. un pool marginal
Compartimiento tisular
Durante las infecciones las células centinelas tales como los macrófagos tisulares
combaten los microbios invasores y liberan citoquinas tales como IL-1, IL-6 y TNF,
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que activan las células estromales y los linfocitos T para producir factores de
crecimiento adicionales. Como resultado, las células progenitoras tempranas en
médula ósea son estimuladas para dividirse y diferenciarse, los precursores
mieloides se mueven más rápidamente a través del pool de maduración; un
número aumentado de células se libera a partir del compartimiento de depósito
medular y los fagocitos circulantes se vuelven capaces de sufrir y aumentar el
estallido respiratorio.
Arneth clasifica a los neutrófilos en dos grupos fundamentales: neutrófilos no
lobulados o incompletamente lobulados y neutrófilos completamente lobulados (2
o más lóbulos). Los primeros son los mielocitos, metamielocitos y cayados.
Se habla de desviación a la izquierda del hemograma cuando aumentan las
formas no segmentadas y/o inmaduras. Se dice que hay desviación a la
derecha, cuando aumentan las células maduras o adultas de mayor lobularidad.
Para valorar la intensidad de la desviación, se recurre al “Indice de desviación
nuclear” (IDN), que consiste en establecer la relación entre las células neutrófilas
no segmentadas y las segmentadas.
IDN = Mielocitos + Metamielocitos + Cayados = 1 = 0,06
Segmentados
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Se considera desviación a la izquierda cuando el IDN es superior a 1/10=0,1.
Dentro de la desviación a la izquierda hay dos tipos:
1. De tipo regenerativo
2. De tipo degenerativo
La primera está determinada por el aumento proporcional (y en general también
absoluto) de las formas menos lobuladas de cromatina juvenil, más laxa y con
funcionalismo perfecto. Reflejan por lo tanto una hiperactividad medular de
carácter normal. En cambio, la desviación izquierda de tipo degenerativo consiste
en el aumento del IDN pero sobre la base de elementos que aún cuando ostentan
escasa lobulación presentan cromatina picnótica y desde el punto de vista
citoplasmático, micropolivacuolización y granulación tóxica. Son verdaderos
“piocitos circulantes”, con escasa funcionalidad.
VARIACIONES DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA CON EL ESTRÉS
Consta de las fases de:
a)
Alarma. Caracterizada por leucocitosis con neutrofília con desviación a la
izquierda de tipo regenerativo; linfopenia y eosinopenia.
b)
Reacción o lucha: caracterizada por el incremento de la cifra de monocitos
y descenso proporcional de la neutrofilia.
c)
Agotamiento o curación alternativamente.
Fase de agotamiento: el organismo sucumbe ante la agresión. Se caracteriza por
retrogradación a neutrofilia con desviación a la izquierda de tipo degenerativo.
Fase de curación: caracterizada por linfocitosis y eosinofilia con regularización de
los demás valores y desaparición de la desviación a la izquierda.
En la mayoría de los procesos infecciosos y en muchos metabólicos y
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necrotizantes se cumple estrictamente la regla del estrés. No obstante, hay
infecciones que soslayan alguna etapa y otras que prolongan bastante algunas de
ellas.
TRASTORNOS LEUCOCITARIOS
Las variaciones de la concentración de cada tipo leucocitario en la sangre resulta
de:
 El flujo de células hacia la sangre
 La salida de células desde la sangre
 La distribución de las células dentro del sistema vascular
 Combinaciones de ellas
Los trastornos de los leucocitos pueden ser clasificados en fisiológicos y
patológicos.
VARIACIÓN FISIOLÓGICA DE LOS LEUCOCITOS
Se define como leucocitosis un aumento del número absoluto de leucocitos por
encima del rango de referencia (mayor de 10,0 x 10 9/L). Se define leucopenia
como una disminución del número absoluto de leucocitos por debajo de 4,5 X
109/L. Estos términos están definidos para la población adulta.
La leucocitosis fisiológica consiste en un aumento de los leucocitos producido por
factores o situaciones que no implican lesión hística y se observa en los siguientes
casos:
 Edad: el recuento total al nacer y durante las primeras 24 horas de vida varía
dentro de amplios márgenes: 9,0-30,0 x 109/L, siendo los neutrófilos las células
predominantes (neutrofilia), con hasta un 15% de cayados. Los linfocitos se
convierten en la célula predominante después de la segunda semana; esa
linfocitosis alcanza su máximo al año y se mantiene hasta los cinco años cuando
es superada por los neutrófilos. No es raro encontrar en los primeros meses
linfocitos estimulados por contacto con los primeros antígenos.
 Actividad física: aumento de los leucocitos a expensas de los neutrófilos
proporcional a la intensidad y persistencia del esfuerzo muscular. El aumento
rápido y la falta de formas inmaduras sugiere un desplazamiento de los leucocitos
de la reserva marginal a la circulatoria.
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 Embarazo: leucocitosis de hasta 15,0 x 10 /L. Ocurre casi completamente en
el último trimestre. Hay aumento de los neutrófilos y algunos granulocitos
inmaduros a veces, especialmente en hiperemesis y toxemia gravídica. En el
parto hay neutrofilia progresiva y al iniciar el puerperio los leucocitos fluctúan entre
10,0-40,0 x 109/L, especialmente en las primíparas. Se normaliza en el séptimo
día del puerperio.
 Tabaco: los fumadores de cigarrillos muestran un recuento leucocitario mayor
que los no fumadores.
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VARIACIONES PATOLÓGICAS DE LOS LEUCOCITOS
Comprenden variaciones cuantitativas y cualitativas.
VARIACIONES CUANTITATIVAS
Un aumento en el número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, basófilos,
monocitos y linfocitos por encima del valor de referencia para la edad, se designa
respectivamente como: neutrofilia, eosinofilia, basofilia, monocitosis y
linfocitosis.
Una disminución en el número absoluto por debajo del valor de referencia para la
edad de neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos se denomina: neutropenia,
eosinopenia, monocitopenia y linfopenia respectivamente.
Neutrofilia: indica aumento del número de neutrófilos por encima del valor de
referencia absoluto para la edad. En un adulto se habla de neutrofilia cuando el
valor de neutrófilos es mayor a 7 x 109/L.
Reacción leucemoide: significa leucemio: leucemia y eidos: aspecto, tiene
aspecto de leucemia, por lo tanto son aquellos cuadros donde aparecen células
inmaduras (metamielocitos, mielocitos, promielocitos y algunos blastos). Puede ir
acompañada de leucocitosis tan altas como de 50,0 x 10 9/L, como así también
hay raros casos de leucopenia. Las siguientes características de la reacción
leucemoide ayudan a distinguirla de la leucemia mieloide crónica:
1. Los neutrófilos podrían mostrar granulación tóxica
2. Los recuentos de eosinófilos y de basófilos no están aumentados
3. El score de la fosfatasa alcalina leucocitaria está aumentado.
Reacción leucoeritroblástica: el hallazgo característico es la presencia de
glóbulos rojos nucleados (eritroblastos) y de glóbulos blancos inmaduros
(principalmente mielocitos) en sangre periférica. El recuento de leucocitos puede o
no estar elevado. Este cuadro se encuentra cuando la médula ósea está infiltrada
con células malignas (carcinoma, linfoma, mieloma, leucemia), con tejido fibroso
(mielofibrosis primaria o secundaria) o células de depósito (enfermedad de
Gaucher). La aspiración o biopsia de medula ósea ayudan a establecer el
diagnóstico.
Neutropenia: indica disminución del número de neutrófilos por debajo del valor de
referencia absoluto para la edad. La neutropenia se puede clasificar como:
1. Leve, si el recuento de neutrófilos es de 1,0-1,5 x109/L
2. Moderada, si el recuento es de 0,5-1,0 x109/L
3. Severa, si el recuento es menor a 0,5 x109/L
4. Agranulocitosis, si el recuento es menor de 0,2 x109/L
Esta estratificación es útil para predecir el riesgo de infecciones piógenas, ya que
sólo los pacientes con neutropenia severa tienen susceptibilidad aumentada a
infecciones con riesgo de muerte, especialmente si la neutropenia persiste por
más de unos pocos días. Las bacterias endógenas son los invasores más
frecuentes, pero la colonización con una variedad de organismos de origen
nosocomial también es común. La neutropenia se acompaña de monocitosis, pero
los monocitos son más lentos para ejecutar las funciones del neutrófilo.
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La neutropenia también forma parte de la pancitopenia cuyas principales causas
son:
1. Falla en la producción de las células
2. Destrucción periférica de las células aumentada
Eosinofilia: Causas: enfermedades alérgicas, infecciones parasitarias, síndrome
de Loëffler, leucemia mieloide crónica.
Basofilia: Causas: síndromes mieloproliferativos crónicos, reacciones de
hipersensibilidad.
Monocitosis: Causas: infecciones bacterianas, síndromes mielodisplásicos,
leucemias mielomonocíticas
Linfocitosis: Se considera linfocitosis cuando el número absoluto de linfocitos se
encuentra por encima del valor de referencia con respecto a la edad:
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 En la infancia: el número de linfocitos es > 9,0 x10 /L
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 En adultos: el número de linfocitos > 4,0 x10 /L
Más importante que la cifra absoluta o relativa de linfocitos, es el análisis
cuidadoso de sus características morfológicas, en busca de.
A) linfocitos estimulados, reactivos o inmunocitos: suelen presentarse en
mayor o menor grado en las distintas linfocitosis de origen infeccioso
(mononucleosis, citomegalovirus, rubéola, varicela y otras). En general son más
grandes que los normales, con núcleos situados a veces excéntricamente y puede
haber nucleolo. Citoplasma hiperbasófilo, siendo más marcada la basofilia en la
periferia de la célula. Los inmunocitos se agrupan bajo tres aspectos:
 Plasmocitoides: semejantes a células plasmáticas.
 Monocitoides: semejantes a un monocito.
 Pseudoblásticos: semejantes a blastos.
Los linfocitos reactivos se informan en porcentaje incluyéndolos dentro de la
fórmula leucocitaria relativa.
La mononucleosis infecciosa es una enfermedad aguda y generalmente benigna
producida en adolescentes y adultos jóvenes causada por la infección con el virus
de Epstein-Barr. Se presenta en la primera semana con una linfocitosis relativa y
absoluta de más de un 50%, con más de un 10 % de inmunocitos. Estos
inmunocitos son linfocitos T citotóxicos y supresores, que reaccionan contra los
linfocitos B, que son los infectados por el virus. Los síntomas principales son la
fiebre, dolor de garganta y las adenopatías. La prueba diferencial para MNI
detecta anticuerpos heterófilos (Reacción de Paul-Bunell-Davidsohn) adsorbibles
por eritrocitos de buey. También se podrían detectar anticuerpos contra el virus de
Epstein-Barr
B) linfocitos atípicos: se presentan en patologías oncohematológicas.
Linfopenia: Se presenta cuando el recuento absoluto de linfocitos está por debajo
del valor de referencia para la edad. Ejemplos: SIDA, tratamiento con corticoides y
quimioterápicos
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VARIACIONES CUALITATIVAS
ALTERACIONES CITOPLASMÁTICAS ADQUIRIDAS
 Granulaciones gruesas, granulaciones tóxicas o exceso de granulación
primaria: se trata de una abundante granulación primaria, inespecífica y azurófila,
la cual es densa y más voluminosa que la específica. Tiene como enzima
marcadora la peroxidasa y corresponde a lisosomas. Aparecen en cuadros
infecciosos o inflamatorios, intoxicaciones, en tratamientos con drogas
antineoplásicas, corticoides o factores estimulantes de colonias.
 Vacuolización: las vacuolas fagocíticas se encuentran en los neutrófilos en
diversas situaciones (quemaduras, infecciones severas y drogas antineoplásicas)
y pueden ser únicas o múltiples, en cuyo caso se habla de micropolivacuolización.
 Cuerpos de Dhöle: son inclusiones ovaladas que se sitúan hacia la periferia
del citoplasma del neutrófilo. Están compuestos fundamentalmente por ARN y
adquieren un color azul pálido con la tinción panóptica. Aparecen en el curso de
infecciones graves (por ejemplo la escarlatina) y en quemados.
 Desgranulación de los polimorfonucleares neutrófilos: puede deberse a
una disminución del número de gránulos específicos o a un defecto en su tinción.
Es un fenómeno que se observa con relativa frecuencia en las enfermedades
hematológicas con afectación de la célula madre pluripotente o de la serie
mieloide (leucemia agudas, mielodisplasias y síndromes mieloproliferativos
crónicos).
 Bastones de Aüer: estructuras citoplasmáticas presentes en la progenie
granulocítica en forma de barras gruesas o palillos que resulta de la fusión de
lisosomas. Se tienen de color fucsia con la tinción de May Grünwld Giemsa. Son
peroxidasa positiva. Se presentan en las leucemias mieloides agudas y en los
síndromes mielodisplásicos.
ALTERACIONES CITOPLASMÁTICAS HEREDITARIAS
 Anomalía de Alder-Reilly: de transmisión autosómica recesiva, consiste en la
aparición de gruesas granulaciones azurófilas, muy visibles y que suelen
ocasionar algunas enfermedades tesaurismóticas como la mucopolisacaridosis.
Son coloreables metacromáticamente por el azul Alcián, peroxidasa negativa y
PAS positiva.
 Anomalía de Chediak-Higashi: de transmisión autosómica recesiva, se
asocia a un síndrome clínico peculiar (albinismo óculo-cutáneo) y consiste en la
aparición de inclusiones citoplasmáticas azurófilas gigantes, peroxidasa positiva y
PAS negativo. La granulación no se limita al neutrófilo, sino que se extiende a
toda la progenie leucocitaria. Los neutrófilos son no funcionantes o
hipofuncionantes, por lo que son frecuentes las infecciones.
 Anomalía de May-Hegglin-Rebuck: de transmisión autosómica dominante,
consiste en la presencia de inclusiones color celeste, Feulgen y PAS negativas.
Son residuos ribosómicos de ARN. El defecto comprende a los leucocitos y las
plaquetas, siendo característica la aparición de macroplaquetas, cuya función no
es normal; también se acompaña de trastornos de la coagulación.
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ALTERACIONES NUCLEARES ADQUIRIDAS
 Hipersegmentación nuclear: son neutrófilos de cinco o más lóbulos, que
aparecen en la anemia megaloblástica y en síndromes mielodisplásicos.
 Seudomaduración
degenerativa:
consiste
en
un
asincronismo
morfoestructural de maduración demostrado por: a) lobulación del núcleo; b)
cromatina inmadura para ese grado de lobulación; y c) masa nuclear total
francamente aumentada respecto de la citoplasmática. El hallazgo de estos
elementos coincidente con la presencia de blastos permite clasificar la leucemia
como mieloide.
 Neutrófilos pelgeroides: es un leucocito de núcleo bilobulado que acompaña
a los elementos inmaduros de las leucemias mieloides sobre todo las agudas e
infecciones graves
ALTERACIONES NUCLEARES HEREDADAS
 Anomalía de Pelger-Huet: se transmite con carácter autosómico dominante,
y consiste en la disminución o ausencia de segmentación nuclear en los
neutrófilos. Las claves para identificarla son: a) núcleos esféricos, ovalados o
bilobulados, b) heterocromatina muy densa, y c) la mayoría de las células tiene
una apariencia similar. La cromatina de los núcleos Pelger-Huet se caracteriza por
su concentración grosera formando masas que han determinado su designación
de “núcleo en escarapela”. Los leucocitos de la malformación de Pelger-Huet
conservan intacto su funcionalismo. Presenta una falsa desviación a la izquierda,
pues los elementos no son inmaduros.
 Hipersegmentación de los neutrófilos de Undritz: de carácter autosómico
dominante, no entraña patología. El 80% o más de los neutrófilos tiene 4 o 5
lóbulos.
EJEMPLOS DE HISTOGRAMAS
NEUTROFILIA
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LINFOCITOSIS
EOSINOFILIA
BIBLIOGRAFIA
 Diagnóstico citológico de las hemopatías. Grignaschi. Ed. Panamericana. 1991.
 Dacie and Lewis Practical Haematology. Tenth edition. Churchill y Livingstone.
2006.
 Hematología Clínica de Wintrobe. R. Lee y colaboradores. Ed. Lea and Febiger.
London. 1.993.
 Manual de técnicas de laboratorio en hematología. Vives J y Aguilar J. 2ª
edición. Ed. Masson. 2006.
 Hematología. Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Rodak. 2ª edición. 2004.
 Informe automatización del hemograma: entre la ayuda, la confusión y la
controversia. Carbia C, Fink N, Lazarowski A. XIX Congreso Argentino de
Hematología. 2009.
 Manual de histogramas Sysmex. Autoanalizador hematológico KX-21/KX21N.
Edición 2002.