Utilización de la técnica de Real Time PCR aplicada al estudio de animales intersexuados (bovinos y caninos)

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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504
Utilización de la técnica de Real Time PCR aplicada al estudio
de animales intersexuados (bovinos y caninos) - Real Time
PCR technique applied to the study of intersexed animals (bovines
and canines)
Artigas, Rody1; Gagliardi, Rosa1; Llambí, Silvia1. 1UdelaR
Facultad de Veterinaria, Departamento de Genética y Mejora Animal. A.
Lasplaces 1550. CP11600. Montevideo-Uruguay.
[email protected]
Resumen:
Las alteraciones reproductivas en animales domésticos, muchas veces se
encuentran asociadas a anomalías cromosómicas. En los últimos años, el
estudio del complemento cromosómico de los intersexos (ej. presencia de
cromosoma sexual Y en animales con aspecto de hembras) se complementó
con el desarrollo de técnicas moleculares, permitiendo la realización de
diagnósticos más precisos. El objetivo de este trabajo, fue la puesta a punto de
la técnica de PCR en tiempo real para la detección de secuencias específicas del
cromosoma sexual Y. Para esto, se estudiaron dos bovinos hembras Freemartin
y un caso de intersexo en canino. Se utilizaron muestras de machos y hembras
normales como controles positivos y negativos respectivamente. El ADN fue
extraído a partir de sangre periférica por el metodo convencional de FenolCloroformo. Las muestras de ADN se analizaron para secuencias del gen SRY
(canino) y una secuencia específica repetida del cromosoma Y bovino (BRY4).
La amplificación de las secuencias en tiempo real se realizó utilizando
termociclador Corbett y Kit Biotools QuantyMix SYG. Se obtuvo una curva de
fluorescencia característica para cada secuencia, consistente con los controles
positivos utilizados pudiéndose identificar secuencias del cromosoma Y en los
animales intersexuados (hembras freemartin y canino). Se presenta una
técnica rápida, sencilla y altamente específica para el diagnóstico de secuencias
del cromosoma Y en animales intersexuados.
Palabras Clave: mamíferos, Intersexos, ADN
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Abstract:
The reproductive disorders in domestic animals often are associated with
chromosomal abnormalities. In recent years, the study of chromosomal
complement of intersexed animals (ie. presence of Y sex chromosome in
female-like animals) was supplemented with the development of molecular
techniques, allowing the realization of more precise analysis. The objective of
this work was the development of the technique of real-time PCR to detect
specific sequences of the Y sex chromosome. For this, we studied two bovine
freemartin females and one case of intersex in canine. Some specimens of
normal males and females as negative and positive controls respectively were
used. The DNA was extracted from peripheral blood by conventional phenolchloroform technique. DNA samples were analyzed for the SRY gene sequences
(canine) and a repeated specific sequence of the Y chromosome bovine
(BRY4). The amplification of the sequences in real time thermocycler was
performed using Biotools QuantyMix Corbett and SYG Kit. A characteristic
fluorescence curve was obtained for each sequence, consistent with the
positive controls used, Y chromosome sequences were identified in intersexed
animals (female freemartin and canine). It is shown a fast, simple and highly
specific for the diagnosis of Y chromosome sequences in intersexed animals.
Key Words: mammals, intersex, DNA
Introducción:
Las anomalías en el desarrollo sexual de los animales domésticos se conocen
desde hace mucho tiempo, siendo el síndrome de freemartin en bovinos (feto
genéticamente hembra masculinizado en presencia de un gemelo no idéntico
macho) una de las alteraciones del sistema reproductor mejor estudiadas
(Meinecke et al. 2006).
Los animales intersexuados se caracterizan por presentar desarrollo genital
incompleto o ambiguo (Short, 1969). Las anomalías genitales varían de una
especie a otra y dependen de la alteración que dio origen al intersexo.
La base de las anomalías del desarrollo sexual, muchas veces responde a
alteraciones a nivel cromosómico, siendo la presencia de líneas celulares
portadoras del cromosoma Y o de secuencias específicas de este (como el gen
SRY) una de las causas.
Varios métodos han sido desarrollados para diagnosticar el origen de estas
patologías, siendo el estudio del complemento cromosómico (ej. Identificación
del cromosoma Y) el más frecuente. En los últimos años, el desarrollo de
técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
la detección de secuencias específicas de ADN del cromosoma Y (Padula,
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2005), ha permitido optimizar los diagnósticos, en un enfoque muchas veces
complementario al análisis citogenético.
Recientemente, la técnica de PCR en tiempo real constituye un valioso recurso
aún poco explorado para el diagnóstico de este tipo de patologías. Meinecke et
al. (2004) utiliza la técnica de real time PCR, en un novedoso protocolo para el
diagnóstico en bovino de un caso 60XX/90XXY, constituyendo hasta la
actualidad el primer reporte de esta técnica para el diagnóstico de intersexos
en animales domésticos.
La técnica de PCR en tiempo real se caracteriza por ser altamente sensible y
específica, permitiendo identificar fragmentos de ADN a partir del estudio de
curvas de temperatura de fusión. En general, se utilizan fluorocromos como el
SYBR Green de modo que, a medida que en cada ciclo se va amplificando la
secuencia de ADN blanco, la cantidad de emisión de fluorescencia aumenta. El
resultado, es graficado en una curva exponencial, con una temperatura de
melting específica para el producto amplificado.
El objetivo del presente trabajo, es la puesta a punto de la técnica de real time
PCR, para el diagnóstico de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en
animales domésticos intersexuados.
Materiales y Métodos:
Se estudiaron dos hembras bovinas raza Holando sospechosas de
freemartinismo y un caso de intersexo canino en una hembra raza Cimarrón
uruguayo. Animales normales para cada especie (machos y hembras)
testeados citogenéticamente, fueron incluidos en este estudio como controles
positivos y negativos respectivamente. El ADN fue extraído a partir de sangre
periférica por el método convencional de fenol cloroformo. La secuencia
repetida BRY4 fue analizada en los individuos freemartin. La elección de
primers y las condiciones de amplificación fueron las descriptas por Peura et al.
(1990). El gen SRY fue analizado para el caso de intersexo en canino, siendo la
elección de los primers y las condiciones de amplificación las descriptas por
(Meyers 1999). Las muestras de ADN fueron amplificadas en tiempo real
utilizando termociclador Corbett y Kit Biotools QuantyMix SYG.
Resultados:
Las curvas de amplificación de las secuencias se muestran en la figura 1 A y B.
Se obtuvo una única señal de amplificación para los controles positivos, no así
para los controles negativos donde no se detecto señal. Las muestras
pertenecientes a los intersexos mostraron amplificación para los marcadores
considerados. La temperatura de melting fue de 86ºC para el gen SRY canino y
de 84ºC para la secuencia repetida BRY4 (Fig. 1 C y D).
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A
C
Freemartin 1
Freemartin 2
Blanco
B
D
Hembra
Macho
Intersexo
Fig. 1: A) Curvas de amplificación para el marcador BRY4; B) Curvas de amplificación
para el gen SRY canino; D) Curvas de melting para BRY4; D) Curvas de melting para el
gen SRY.
Discusión:
El análisis de las curvas de temperatura de fusión, reveló la presencia de un
único producto de amplificación para las dos secuencias analizadas. Los
individuos freemartin, así como el intersexo canino, mostraron señales de
amplificación consistentes con los controles positivos (machos normales).
Ninguna de las hembras (controles negativos) mostraron señales de
amplificación.
El marcador molecular BRY4, amplificó en todas las muestras en torno al ciclo
número 10, en tanto que el gen SRY canino lo hizo en torno al número 20.
Esta diferencia se debe a la naturaleza de los marcadores analizados, puesto
que el BRY4 se trata de una secuencia repetida en tanto que el gen SRY es de
copia única.
Para ambos marcadores se observa heterogeneidad entre las curvas. Esta
diferencia se debe a distintas eficiencias de amplificación entre las muestras,
puesto que no fueron estandarizadas a una misma concentración.
La presencia de un solo producto de amplificación, la temperatura de melting
consistente con la temperatura teórica calculada y la ausencia de amplificación
de los controles negativos, muestran especificidad en la reacción de
amplificación para cada marcador.
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Conclusiones:
La detección de secuencias específicas del cromosoma Y mediante la técnica de
real time PCR, representa una alternativa novedosa, rápida, sencilla y
eficiente, de realizar un diagnóstico específico y sensible de casos de
intersexos en animales domésticos que involucren al cromosoma Y o parte de
él.
Se trata de una técnica plástica fácilmente adaptable a otros propósitos, tales
como el sexado de embriones o la confirmación del semen sexado en bovinos.
Agradecimientos:
Los autores quieren agradecer a la Lic. Paula Nicolini por el asesoramiento
permanente, y a la Dra. Ana Meikle por la utilización de todos los equipos
disponibles en el Laboratorio de técnicas nucleares.
Bibliografía:
Malentacchi, F.; Forni, G.; Vinci, S.; Orlando, C. (2008). Quantitative
evaluation of DNA methylation by optimization of a differential-high
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Meinecke, B.; Drogemuler, C.; Kuiper, H.; Brustel, D.; Wohlsein, P.; Ebeling,
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Purebred Dogs. Molec Reprod Dev 1999; 53:266-273.
Padula, A.M.; (2005). The freemartin sindrome: an update. Animal
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Peura, T.; hyttinen, J.; Turunen, M.; Janne, J. (1991). A realiable sex
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Short, R.V. (1969) An introduction to some of the problems of intersexuality. J
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REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 8
Recibido 20.11.2011 / Ref. prov. DIC1104_REDVET / Aceptado 28.06.2012
Ref. def. 081202_REDVET / Publicado: 01.08.2012
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