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Artículos originales de investigación
081202 - Utilización de la técnica de Real Time PCR aplicada al
estudio de animales intersexuados (bovinos y caninos) - Real
Time PCR technique applied to the study of intersexed animals
(bovines and canines)
Las alteraciones reproductivas en animales domésticos, muchas veces se encuentran asociadas a anomalías cromosómicas.
En los últimos años, el estudio del complemento cromosómico de los intersexos (ej. presencia de cromosoma sexual Y en
animales con aspecto de hembras) se complementó con el desarrollo de técnicas moleculares, permitiendo la realización de
diagnósticos más precisos. El objetivo de este trabajo, fue la puesta a punto de la técnica de PCR en tiempo real para la
detección de secuencias específicas del cromosoma sexual Y. Para esto, se estudiaron dos bovinos hembras Freemartin y un
caso de intersexo en canino. Se utilizaron muestras de machos y hembras normales como controles positivos y negativos
respectivamente. El ADN fue extraído a partir de sangre periférica por el metodo convencional de Fenol-Cloroformo. Las
muestras de ADN se analizaron para secuencias del gen SRY (canino) y una secuencia específica repetida del cromosoma Y
bovino (BRY4). La amplificación de las secuencias en tiempo real se realizó utilizando termociclador Corbett y Kit Biotools
QuantyMix SYG. Se obtuvo una curva de fluorescencia característica para cada secuencia, consistente con los controles
positivos utilizados pudiéndose identificar secuencias del cromosoma Y en los animales intersexuados (hembras freemartin y
canino). Se presenta una técnica rápida, sencilla y altamente específica para el diagnóstico de secuencias del cromosoma Y en
animales intersexuados.
<o:p> </o:p>
Introducción:<o:p> </o:p>
Las anomalías en el desarrollo sexual de los animales domésticos se conocen desde hace mucho tiempo, siendo el síndrome
de freemartin en bovinos (feto genéticamente hembra masculinizado en presencia de un gemelo no idéntico macho) una de las
alteraciones del sistema reproductor mejor estudiadas (Meinecke et al. 2006).
Los animales intersexuados se caracterizan por presentar desarrollo genital incompleto o ambiguo (Short, 1969). Las
anomalías genitales varían de una especie a otra y dependen de la alteración que dio origen al intersexo.
La base de las anomalías del desarrollo sexual, muchas veces responde a alteraciones a nivel cromosómico, siendo la
presencia de líneas celulares portadoras del cromosoma Y o de secuencias específicas de este (como el gen SRY) una de las
causas.
Varios métodos han sido desarrollados para diagnosticar el origen de estas patologías, siendo el estudio del complemento
cromosómico (ej. Identificación del cromosoma Y) el más frecuente. En los últimos años, el desarrollo de técnicas moleculares
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de secuencias específicas de ADN del cromosoma Y
(Padula, 2005), ha permitido optimizar los diagnósticos, en un enfoque muchas veces complementario al análisis citogenético.
Recientemente, la técnica de PCR en tiempo real constituye un valioso recurso aún poco explorado para el diagnóstico de este
tipo de patologías. Meinecke et al. (2004) utiliza la técnica de real time PCR, en un novedoso protocolo para el diagnóstico en
bovino de un caso 60XX/90XXY, constituyendo hasta la actualidad el primer reporte de esta técnica para el diagnóstico de
intersexos en animales domésticos.
La técnica de PCR en tiempo real se caracteriza por ser altamente sensible y específica, permitiendo identificar fragmentos de
ADN a partir del estudio de curvas de temperatura de fusión. En general, se utilizan fluorocromos como el SYBR Green de
modo que, a medida que en cada ciclo se va amplificando la secuencia de ADN blanco, la cantidad de emisión de fluorescencia
aumenta. El resultado, es graficado en una curva exponencial, con una temperatura de melting específica para el producto
amplificado.
El objetivo del presente trabajo, es la puesta a punto de la técnica de real time PCR, para el diagnóstico de secuencias de ADN
específicas del cromosoma Y en animales domésticos intersexuados.<o:p> </o:p>
Materiales y Métodos:<o:p> </o:p>
Se estudiaron dos hembras bovinas raza Holando sospechosas de freemartinismo y un caso de intersexo canino en una
hembra raza Cimarrón uruguayo. Animales normales para cada especie (machos y hembras) testeados citogenéticamente,
fueron incluidos en este estudio como controles positivos y negativos respectivamente. El ADN fue extraído a partir de sangre
periférica por el método convencional de fenol cloroformo. La secuencia repetida BRY4 fue analizada en los individuos
freemartin. La elección de primers y las condiciones de amplificación fueron las descriptas por Peura et al. (1990). El gen SRY
fue analizado para el caso de intersexo en canino, siendo la elección de los primers y las condiciones de amplificación las
descriptas por (Meyers 1999). Las muestras de ADN fueron amplificadas en tiempo real utilizando termociclador Corbett y Kit
Biotools QuantyMix SYG.<o:p> </o:p>
Resultados:<o:p> </o:p>
Las curvas de amplificación de las secuencias se muestran en la figura <st1:metricconverter productid='1' a' w:st='on'> 1 A
</st1:metricconverter> y B. Se obtuvo una única señal de amplificación para los controles positivos, no así para los controles
negativos donde no se detecto señal. Las muestras pertenecientes a los intersexos mostraron amplificación para los
marcadores considerados. La temperatura de melting fue de <st1:metricconverter productid='86?C' w:st='on'>
86ºC </st1:metricconverter> para el gen SRY canino y de <st1:metricconverter productid='84?C' w:st='on'>
84ºC </st1:metricconverter> para la secuencia repetida BRY4 (Fig. <st1:metricconverter productid='1' c' w:st='on'> 1
C</st1:metricconverter> y D).
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Fig. 1: A) Curvas de amplificación para el marcador BRY4; B) Curvas de amplificación para el gen SRY canino; D) Curvas de
melting para BRY4; D) Curvas de melting para el gen SRY.
Discusión:
El análisis de las curvas de temperatura de fusión, reveló la presencia de un único producto de amplificación para las dos
secuencias analizadas. Los individuos freemartin, así como el intersexo canino, mostraron señales de amplificación
consistentes con los controles positivos (machos normales). Ninguna de las hembras (controles negativos) mostraron señales
de amplificación.
El marcador molecular BRY4, amplificó en todas las muestras en torno al ciclo número 10, en tanto que el gen SRY canino lo
hizo en torno al número 20. Esta diferencia se debe a la naturaleza de los marcadores analizados, puesto que el BRY4 se trata
de una secuencia repetida en tanto que el gen SRY es de copia única.
Para ambos marcadores se observa heterogeneidad entre las curvas. Esta diferencia se debe a distintas eficiencias de
amplificación entre las muestras, puesto que no fueron estandarizadas a una misma concentración.
La presencia de un solo producto de amplificación, la temperatura de melting consistente con la temperatura teórica calculada y
la ausencia de amplificación de los controles negativos, muestran especificidad en la reacción de amplificación para cada
marcador.
Conclusiones:
La detección de secuencias específicas del cromosoma Y mediante la técnica de real time PCR, representa una alternativa
novedosa, rápida, sencilla y eficiente, de realizar un diagnóstico específico y sensible de casos de intersexos en animales
domésticos que involucren al cromosoma Y o parte de él.
Se trata de una técnica plástica fácilmente adaptable a otros propósitos, tales como el sexado de embriones o la confirmación
del semen sexado en bovinos.
Agradecimientos:
Los autores quieren agradecer a <st1:personname productid='la' lic. paula' w:st='on' style='font-family:' verdana; text-align:
justify; '>la Lic. Paula</st1:personname> Nicolini por el asesoramiento permanente, y a <st1:personname productid='la' dra.
ana' w:st='on' style='font-family:' verdana; text-align: justify; '>la Dra. Ana</st1:personname> Meikle por la utilización de todos
los equipos disponibles en el Laboratorio de técnicas nucleares.
Bibliografía:
Malentacchi, F.; Forni, G.; Vinci, S.; Orlando, C. (2008). Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a
differential-high resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Research. Vol. 37. Nº12 e86.
Meinecke, B.; Drogemuler, C.; Kuiper, H.; Brustel, D.; Wohlsein, P.; Ebeling, S.; Wehrend, A.; Meinecke-Tillmann, S.(2007).
A diploid-triploid (60,XX/90XXY) intersex in a Holstein Heifer. Sex. Dev; 1:59-65.
Meyers-Wallen VN, Schlafer D, Barr I, et al. Sry-negative XX Sex Reversal in Purebred Dogs. Molec Reprod Dev 1999;
53:266-273.
Padula, A.M.; (2005). The freemartin sindrome: an update. Animal reproduction science.
87:93-109.
Peura, T.; hyttinen, J.; Turunen, M.; Janne, J. (1991). A realiable sex determination assay for bovine preimplantation embryos
using the polymerase chaín reaction. Theriogenology. Vol.35. Nº. 3: 547-555.
Short, R.V. (1969) An introduction to some of the problems of intersexuality. J Reprod Fertil Suppl. May;7:Suppl 7:1-8.
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REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 8
<o:p> </o:p>Recibido 20.11.2011 /Ref. prov. DIC1104_REDVET / Aceptado 28.06.2012 / Ref. def. 081202_REDVET /
Publicado: 01.08.2012
<o:p> </o:p>Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080812.html concretamente en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080812/081202.pdf
<o:p> </o:p>REDVET® Revista Electrónica de Veterinaria está editada por Veterinaria Organización®.
Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org®http://www.veterinaria.org y con REDVET®http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
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Autor
Artigas, Rody1; Gagliardi, Rosa1; Llambí, Silvia1. 1UdelaR
Facultad de Veterinaria, Departamento de Genética y Mejora Animal. A. Lasplaces 1550. CP11600.
Montevideo-Uruguay.
[email protected]
Resumen
Las alteraciones reproductivas en animales domésticos, muchas veces se encuentran asociadas a anomalías cromosómicas.
En los últimos años, el estudio del complemento cromosómico de los intersexos (ej. presencia de cromosoma sexual Y en
animales con aspecto de hembras) se complementó con el desarrollo de técnicas moleculares, permitiendo la realización de
diagnósticos más precisos. El objetivo de este trabajo, fue la puesta a punto de la técnica de PCR en tiempo real para la
detección de secuencias específicas del cromosoma sexual Y. Para esto, se estudiaron dos bovinos hembras Freemartin y un
caso de intersexo en canino. Se utilizaron muestras de machos y hembras normales como controles positivos y negativos
respectivamente. El ADN fue extraído a partir de sangre periférica por el metodo convencional de Fenol-Cloroformo. Las
muestras de ADN se analizaron para secuencias del gen SRY (canino) y una secuencia específica repetida del cromosoma Y
bovino (BRY4). La amplificación de las secuencias en tiempo real se realizó utilizando termociclador Corbett y Kit Biotools
QuantyMix SYG. Se obtuvo una curva de fluorescencia característica para cada secuencia, consistente con los controles
positivos utilizados pudiéndose identificar secuencias del cromosoma Y en los animales intersexuados (hembras freemartin y
canino). Se presenta una técnica rápida, sencilla y altamente específica para el diagnóstico de secuencias del cromosoma Y en
animales intersexuados.
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Sumario
The reproductive disorders in domestic animals often are associated with chromosomal abnormalities. In recent years, the study
of chromosomal complement of intersexed animals (ie. presence of Y sex chromosome in female-like animals) was
supplemented with the development of molecular techniques, allowing the realization of more precise analysis. The objective of
this work was the development of the technique of real-time PCR to detect specific sequences of the Y sex chromosome. For
this, we studied two bovine freemartin females and one case of intersex in canine. Some specimens of normal males and
females as negative and positive controls respectively were used. The DNA was extracted from peripheral blood by
conventional phenol-chloroform technique. DNA samples were analyzed for the SRY gene sequences (canine) and a repeated
specific sequence of the Y chromosome bovine ( BRY4). The amplification of the sequences in real time thermocycler
was performed using Biotools QuantyMix Corbett and SYG Kit . A characteristic fluorescence curve was obtained for
each sequence, consistent with the positive controls used, Y chromosome sequences were identified in intersexed animals
(female freemartin and canine). It is shown a fast, simple and highly specific for the diagnosis of Y chromosome sequences in
intersexed animals.
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Key Words: mammals, intersex, DNA
Artículo
Introducción:<o:p> </o:p>
Las anomalías en el desarrollo sexual de los animales domésticos se conocen desde hace mucho tiempo, siendo el síndrome
de freemartin en bovinos (feto genéticamente hembra masculinizado en presencia de un gemelo no idéntico macho) una de las
alteraciones del sistema reproductor mejor estudiadas (Meinecke et al. 2006).
Los animales intersexuados se caracterizan por presentar desarrollo genital incompleto o ambiguo (Short, 1969). Las
anomalías genitales varían de una especie a otra y dependen de la alteración que dio origen al intersexo.
La base de las anomalías del desarrollo sexual, muchas veces responde a alteraciones a nivel cromosómico, siendo la
presencia de líneas celulares portadoras del cromosoma Y o de secuencias específicas de este (como el gen SRY) una de las
causas.
Varios métodos han sido desarrollados para diagnosticar el origen de estas patologías, siendo el estudio del complemento
cromosómico (ej. Identificación del cromosoma Y) el más frecuente. En los últimos años, el desarrollo de técnicas moleculares
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de secuencias específicas de ADN del cromosoma Y
(Padula, 2005), ha permitido optimizar los diagnósticos, en un enfoque muchas veces complementario al análisis citogenético.
Recientemente, la técnica de PCR en tiempo real constituye un valioso recurso aún poco explorado para el diagnóstico de este
tipo de patologías. Meinecke et al. (2004) utiliza la técnica de real time PCR, en un novedoso protocolo para el diagnóstico en
bovino de un caso 60XX/90XXY, constituyendo hasta la actualidad el primer reporte de esta técnica para el diagnóstico de
intersexos en animales domésticos.
La técnica de PCR en tiempo real se caracteriza por ser altamente sensible y específica, permitiendo identificar fragmentos de
ADN a partir del estudio de curvas de temperatura de fusión. En general, se utilizan fluorocromos como el SYBR Green de
modo que, a medida que en cada ciclo se va amplificando la secuencia de ADN blanco, la cantidad de emisión de fluorescencia
aumenta. El resultado, es graficado en una curva exponencial, con una temperatura de melting específica para el producto
amplificado.
El objetivo del presente trabajo, es la puesta a punto de la técnica de real time PCR, para el diagnóstico de secuencias de ADN
específicas del cromosoma Y en animales domésticos intersexuados.<o:p> </o:p>
Materiales y Métodos:<o:p> </o:p>
Se estudiaron dos hembras bovinas raza Holando sospechosas de freemartinismo y un caso de intersexo canino en una
hembra raza Cimarrón uruguayo. Animales normales para cada especie (machos y hembras) testeados citogenéticamente,
fueron incluidos en este estudio como controles positivos y negativos respectivamente. El ADN fue extraído a partir de sangre
periférica por el método convencional de fenol cloroformo. La secuencia repetida BRY4 fue analizada en los individuos
freemartin. La elección de primers y las condiciones de amplificación fueron las descriptas por Peura et al. (1990). El gen SRY
fue analizado para el caso de intersexo en canino, siendo la elección de los primers y las condiciones de amplificación las
descriptas por (Meyers 1999). Las muestras de ADN fueron amplificadas en tiempo real utilizando termociclador Corbett y Kit
Biotools QuantyMix SYG.<o:p> </o:p>
Resultados:<o:p> </o:p>
Las curvas de amplificación de las secuencias se muestran en la figura <st1:metricconverter productid='1' a' w:st='on'> 1 A
</st1:metricconverter> y B. Se obtuvo una única señal de amplificación para los controles positivos, no así para los controles
negativos donde no se detecto señal. Las muestras pertenecientes a los intersexos mostraron amplificación para los
marcadores considerados. La temperatura de melting fue de <st1:metricconverter productid='86?C' w:st='on'>
86ºC </st1:metricconverter> para el gen SRY canino y de <st1:metricconverter productid='84?C' w:st='on'>
84ºC </st1:metricconverter> para la secuencia repetida BRY4 (Fig. <st1:metricconverter productid='1' c' w:st='on'> 1
C</st1:metricconverter> y D).
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Fig. 1: A) Curvas de amplificación para el marcador BRY4; B) Curvas de amplificación para el gen SRY canino; D) Curvas de
melting para BRY4; D) Curvas de melting para el gen SRY.
Discusión:
El análisis de las curvas de temperatura de fusión, reveló la presencia de un único producto de amplificación para las dos
secuencias analizadas. Los individuos freemartin, así como el intersexo canino, mostraron señales de amplificación
consistentes con los controles positivos (machos normales). Ninguna de las hembras (controles negativos) mostraron señales
de amplificación.
El marcador molecular BRY4, amplificó en todas las muestras en torno al ciclo número 10, en tanto que el gen SRY canino lo
hizo en torno al número 20. Esta diferencia se debe a la naturaleza de los marcadores analizados, puesto que el BRY4 se trata
de una secuencia repetida en tanto que el gen SRY es de copia única.
Para ambos marcadores se observa heterogeneidad entre las curvas. Esta diferencia se debe a distintas eficiencias de
amplificación entre las muestras, puesto que no fueron estandarizadas a una misma concentración.
La presencia de un solo producto de amplificación, la temperatura de melting consistente con la temperatura teórica calculada y
la ausencia de amplificación de los controles negativos, muestran especificidad en la reacción de amplificación para cada
marcador.
Conclusiones:
La detección de secuencias específicas del cromosoma Y mediante la técnica de real time PCR, representa una alternativa
novedosa, rápida, sencilla y eficiente, de realizar un diagnóstico específico y sensible de casos de intersexos en animales
domésticos que involucren al cromosoma Y o parte de él.
Se trata de una técnica plástica fácilmente adaptable a otros propósitos, tales como el sexado de embriones o la confirmación
del semen sexado en bovinos.
Agradecimientos:
Los autores quieren agradecer a <st1:personname productid='la' lic. paula' w:st='on' style='font-family:' verdana; text-align:
justify; '>la Lic. Paula</st1:personname> Nicolini por el asesoramiento permanente, y a <st1:personname productid='la' dra.
ana' w:st='on' style='font-family:' verdana; text-align: justify; '>la Dra. Ana</st1:personname> Meikle por la utilización de todos
los equipos disponibles en el Laboratorio de técnicas nucleares.
Bibliografía:
Malentacchi, F.; Forni, G.; Vinci, S.; Orlando, C. (2008). Quantitative evaluation of DNA methylation by optimization of a
differential-high resolution melt analysis protocol. Nucleic Acids Research. Vol. 37. Nº12 e86.
Meinecke, B.; Drogemuler, C.; Kuiper, H.; Brustel, D.; Wohlsein, P.; Ebeling, S.; Wehrend, A.; Meinecke-Tillmann, S.(2007).
A diploid-triploid (60,XX/90XXY) intersex in a Holstein Heifer. Sex. Dev; 1:59-65.
Meyers-Wallen VN, Schlafer D, Barr I, et al. Sry-negative XX Sex Reversal in Purebred Dogs. Molec Reprod Dev 1999;
53:266-273.
Padula, A.M.; (2005). The freemartin sindrome: an update. Animal reproduction science.
87:93-109.
Peura, T.; hyttinen, J.; Turunen, M.; Janne, J. (1991). A realiable sex determination assay for bovine preimplantation embryos
using the polymerase chaín reaction. Theriogenology. Vol.35. Nº. 3: 547-555.
Short, R.V. (1969) An introduction to some of the problems of intersexuality. J Reprod Fertil Suppl. May;7:Suppl 7:1-8.
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REDVET: 2012, Vol. 13 Nº 8
<o:p> </o:p>Recibido 20.11.2011 /Ref. prov. DIC1104_REDVET / Aceptado 28.06.2012 / Ref. def. 081202_REDVET /
Publicado: 01.08.2012
<o:p> </o:p>Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080812.html concretamente en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n080812/081202.pdf
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Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org®http://www.veterinaria.org y con REDVET®http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
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Palabras clave
mamíferos, Intersexos, ADN, mammals, intersex