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Obtención de Nuevas Enzimas para la Producción de Biodiesel y Bioetanol mediante Técnicas Metagenómicas Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Francisco Noya Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable” ¿Cuánto bioetanol necesita Uruguay? 700 Etanol (millones de litros) 600 500 400 630 531 300 200 100 3 69 0 4,5% 5% Vehículos a nafta comunes 15% 85% 100% Vehículos Flex Fuel Lignocelulosa a Etanol 20-40% del costo 2 empresas productoras Mediante hidrólisis que pueden ser enzimática se liberan fermentados en etanol azúcares sencillos La biomasa vegetal es renovable y abundante Objetivo Desarrollar enzimas nacionales que permitan hacer económicamente viable la conversión de biomasa en etanol. Estrategia • Aprovechar toda la diversidad genética de una comunidad bacteriana especializada mediante la metagenómica funcional. • Analizar todos los organismos, sean cultivables in vitro o no. • Seleccionar las mejores enzimas y expresarlas en cepas industriales especializadas en convertir azúcares sencillos en etanol. Construcción de bibliotecas metagenómicas Extraer el ADN Seleccionar por tamaño Clonarlo en fósmidos pCC1FOS Empaquetarlos in vitro e infectar E.coli EPI300 Seleccionar aquellas colonias que adquirieron funciones de interés Comunidades Microbianas Departamento de Ingeniería de Reactores Facultad de Ingeniería Universidad de la República Selección Tamaño de las bibliotecas: 30.000 clones cada una, 42 kbp por clon Función Medio Celulasas Avicel o CMC, revelado con Rojo Congo Avicel como única fuente de carbono Hemicelulasas Xilano de Avena, revelado con Rojo Congo Esterasas/Lipasas Tributirina Trioleína/rodamina Lipasas Celulasas Actividad celulolítica Papel de filtro Bagazo de caña de azúcar Cantidad de clones identificados Función Rumen Celulasas 21 Lodos de bioreactores 6 Hemicelulasas 5 4 Esterasas/Lipasas 11 6 Genes identificados por secuenciación masiva ORF Predicted function CAZy Xil3_c1_87 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68 Xil3_c1_45 Xylanase, arabinofuranosidase GH43,62,32,68 Xil3_c1_71 BACON-glucanase GH5 Csd6_c1_40 BACON-glucanase GH5 Csd9_c1_5 Endoglucanase GH5 Csd8_c5_17 β-xylosidase GH43 Csd18Uruguay_c1_59 Endoglucanase GH5,16 Csd4_endoG Endoglucanase GH5 Csd4_xyl β-xylosidase GH43 Csd4_lac Laccase / Cu-oxydase AA1 Conversión de celulosa en etanol Etanol a partir de celulosa (1% CMC) 2,5 Etanol (g/L) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80 Tiempo (h) C- Csd4 Csd23 Csd18 100 120 Producción de etanol por Csd4 2,50 Ethanol (g/l) 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Glucose CMC Avicel FP Bagasse Sustratos al 1%, 48 horas, 37ºC Xylan Salts Caracterización Enzimática Csd4 CgtA GTPase Phosphoenolpyruvate synthase Putative hemin binding Adenylate kinase Laccase Putative promoter Endoglucanase Csd4 34406 bp Beta-xylosidase EndoG 120 120 100 100 Relative activity (%) Relative Activity (%) pH y temperatura óptimos de EndoG 80 60 40 20 80 60 40 20 0 0 2 3 4 5 6 7 pH 8 9 10 11 10 30 50 T (⁰C) 70 90 Relative Activity % Actividad de EndoG en distintos solventes 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Especificidad de EndoG Sustrato Actividad CMC + Avicel - 4-MUC + Celotetraosa + Xilano + Lichenan - Perspectivas Perspectivas glucanasa xilanasa β-glicosidasa CBP β-xilosidasa MS04 Consolidated Bioprocessing Perspectivas Switchgrass Pasto elefante Caña común Panicum virgatum Pennisetum purpureum Arundo donax Pretratamientos físicos y/o químicos “CBP” Etanol Agradecimientos • BIOGEM • • • • • • • • • • Inés Loaces Cecilia Rodríguez Vanessa Amarelle Daniela Senatore Uriel Koziol Elena Fabiano Andrés Iriarte Federico Battistoni Raúl Platero Federico Rosconi • ANCAP • Nikolai Guchin • FING • Liliana Borzacconi • Frig. Pando • Betiana Bouzas • ANII • Unidad de secuenciación • José Sotelo • Laura Barreiro • UNAM • Alfredo Martínez • University of Florida • Lonnie Ingram • Ismael Nieves
