COPEG
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN
DE CÉLULAS DE RIÑÓN DE CORDEROTÉCNICA DE CULTIVO PRIMARIO
1.0
OBJETIVO:
Describir los procedimientos necesarios para aplicar la Técnica de Cultivo
Primario de Riñón de Cordero.
2.0
ALCANCE:
El cultivo primario de células de riñón ovino ha sido tradicionalmente
considerado el sistema de cultivo de células de elección para aislamiento del
virus de la Fiebre Aftosa de las muestras de campo.
3.0
PROCEDIMIENTO:
Paso
Descripción
3.1
Encender el gabinete de bioseguridad por lo menos media
hora antes de comenzar a trabajar en él.
3.2
Desinfectar el gabinete de bioseguridad
y acomodar
dentro, todo el material estéril que se va a utilizar.
3.3
Añadir 50 ml de PBS conteniendo solución alta de
antibióticos (HAS) a cada uno de los cinco vasos de
precipitado de 100ml (Esta serie de vasos serán usados
para lavar el riñón)
3.4
Sumergir el órgano entero en un vaso de precipitado,
luego transferir al 2do vaso usando pinzas estériles
limpias y finalmente al 3er vaso.
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
3.5
Abrir un paquete de gasa estéril y colocar el riñón en un
plato Petri en forma aséptica. Usando un nuevo juego de
instrumentos. Usando un nuevo juego de instrumentos,
remueva todo tejido, conectivo y graso del riñón y
deposítelos sobre una gasa estéril.
Lavar los riñones hasta que estos estén libres de tejidos
extraños primero en el 4to vaso y luego en el 5to vaso
usando pinza estéril para hacer la transferencia.
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
Utilizando nuevos instrumentos y platos Petri estériles
remover la corteza del riñón.
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
3.6
3.7
Código:
PO-LAD -04
Revisión: 01
Responsable
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
Aprobado por: Directores de Operaciones de Campo
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PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN
DE CÉLULAS DE RIÑÓN DE CORDEROTÉCNICA DE CULTIVO PRIMARIO
Paso
Descripción
Responsable
3.8
Transferir la corteza al vaso de 100 ml o plato Petri
pequeño para fraccionarlos en forma de cubos de uno a
dos milímetros, usando tijeras afiladas con dos puntas.
Transferir la corteza fraccionada al frasco tripsinizador,
añadiendo un poco de PBS para enjuagar.
Personal de la
Sección de
Cultivo Celular
3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
Código:
Dos lavados son aceptables para remover cualquier grasa
o glóbulos rojos de los tejidos. El fluido del lavado es
descartado. Para el primer lavado, añadir 200 ml de PBS
más 1 % de la solución alta de antibiótico al frasco
tripsinizador.
Para el segundo lavado usar 200 ml de tripsina 1X (0.25
%). Para cada tripsinización usar agitador magnético
incubando a 37° C durante 5 minutos. Permitir asentarse
el tejido y luego descartar el fluido sobrenadante. Si es
necesario, fraccionar el tejido con tijeras entre lavados.
Añadir 200 ml de tripsina 1X (0.25 %). Incubar a 37° C
mientras está agitándose. Dejar asentarse el tejido y
luego filtrar la suspensión celular en una coladera de
metal especial y depositar en un tubo de centrífuga cónico
de 125 ml, conteniendo 10 ml de suero fetal bovino.
Refrigerar
los
tubos
de
centrífuga
entre
las
tripsinizaciones.
Fraccionar los tejidos con tijeras entre las tripsinizaciones.
3.14
Completar de 4 a 5 tripsinizaciones hasta que la masa de
tejido esté escasa de células.
3.15
Centrifugar la suspensión celular cerca de 200 xg o una
velocidad de 1.200 a 1.400 r.p.m, por 12 a 15 minutos.
3.16
Tomar el paquete de células producido, descartar el
sobrenadante y sembrar en una relación de 1 ml del
paquete celular en 200 a 400 ml de E-MEM conteniendo
10 % de suero fetal bovino. Resuspender las células en
un volumen apropiado de medio.
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Revisión: 01
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Paso
Descripción
Responsable
3.17
Sembrar la suspensión celular en botellas TC-175 cm2,
depositando 50 ml por botella e incubando a 37° C.
3.18
En 2 a 4 días cambiar el medio de cultivo.
3.19
Congelar cuando la monocapa esté completa.
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4.0 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
5.0 HISTORIAL DE MODIFICACIONES
FECHA
11/06/07
Código:
PO-LAD -04
MODIFICACIONES
Se modificaron los siguientes pasos: 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.8, 3.9,
3.10, 3.11, 3.12, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18. La abreviatura correcta
de mililitro es ml sin punto. Se corrigió la redacción del
procedimiento. Se reemplazó “gx” por “xg” en el 3.15.Se
reemplazó TC-150 por TC-175.(Paso 3.17).
Revisión: 01
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