PRACTICAS hematologia

PRÁCTICA N.º 22: SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTÓNICAS
FUNDAMENTO
Los glóbulos rojos en soluciones isotónicas presentan una morfología muy
característica de disco bicóncavo, que es capaz de doblarse sobre si mismo
debido al material viscoelástico que compone su membrana celular. Esto permite
un grado de deformabilidad esencial para poder atravesar la microcirculación y
en especial el filtro esplénico.
Por ello si suspendemos los eritrocitos en una solución hipertónica, tenderá
a salir agua de la célula para equilibrar las diferencias de concentración,
produciendo un plegamiento de la membrana que da lugar a un aspecto de célula
arrugada o crenada.
Por el contrario, si usamos soluciones hipotónicas se producirá una entrada
de agua en la célula que se hinchará pudiendo salir la hemoglobina de la célula
a través de los poros de la membrana. Observamos entonces unos hematíes
grandes, incoloros, con poco contraste, que se conocen como hematíes
fantasmas. Posteriormente se produce la rotura de la membrana o hemólisis.
Por tanto, el fundamento de esta práctica es suspender los hematíes en
distintas soluciones hipo e hipertónicas para observar los cambios morfológicos
que se produzcan al microscopio óptico.
MATERIAL NECESARIO

Microscopio óptico.

Tubos de hemólisis.

Tubos de ensayo.

Pipetas pasteur.

Pipetas graduadas o pipetas automáticas.

Matraces aforados de 100 ml.

Balanza.

Porta y cubreobjetos.

Vidrio de reloj.

Embudo.
REACTIVOS

Cloruro sódico puro.

Agua destilada.

Aceite de inmersión.

Laca de uñas o sellador histológico.
MUESTRA
Sangre venosa fresca anticoagulada con EDTA K3, que se deja reposar
verticalmente para permitir la sedimentación de los eritrocitos.
TÉCNICA
1.
Preparación de las soluciones hipotónicas: a partir de la solución
isotónica al 0,9% se prepara la siguiente batería de tubos:
2.
1
2
3
4
5
Solución al 0,9 % en ml
4,4
5,5
6,6
7,7
8,8
Agua destilada en ml
5,6
4,5
3,4
2,3
1,2
Concentración final en %
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Preparación de la solución isotónica que es cloruro sódico al 0,9 %.
(Tubo 6)
3.
Preparación de las soluciones hipertónicas: pesamos 1,5 g de cloruro
sódico y lo echamos en un matraz de 100 ml. Enrasamos con agua destilada
hasta los 100 ml. Con ello obtenemos una solución al 1,5 %, y a partir de ella
realizamos la siguiente batería de tubos:
4.
7
8
9
10
11
Solución al 1,5 % en ml
6,6
7,3
8
8,6
9,33
Agua destilada en ml
3,4
2,7
2
1,4
0,7
Concentración final en %
1
1,1
1,2
1,3
1,4
Preparación de la suspensión de eritrocitos: rotulamos 11 tubos de
hemólisis indicando la concentración de la solución salina que contienen.
Dispensamos 5 gotas de la solución salina correspondiente en cada uno de
los tubos. En los tubos 1 a 5 añadimos cinco gotas de las soluciones
hipotónicas; en el tubo 6 añadimos cinco gotas de la solución isotónica; en
los tubos 7 a 11 añadimos cinco gotas de las soluciones hipertónicas.
Añadimos a cada tubo una gota de los hematíes sedimentados en el tubo de
sangre y mezclamos por inversión.
Dejamos reposar los tubos 10 minutos a temperatura ambiente.
Rotulamos 11 portas con la concentración correspondiente de solución
salina que figura en los tubos de hemólisis.
En cada porta depositamos 1 gota de la suspensión de eritrocitos
correspondiente y cubrimos con un cubreobjetos. Sellamos con laca de uñas
o sellador histológico.
LECTURA DE LOS RESULTADOS
Observamos con el objetivo de 40 x cada uno de los portas. Posteriormente
aplicamos una gota de aceite de inmersión en el cubre y observamos con el
objetivo de 100 x.
En el tubo correspondiente a la solución salina de concentración 0,9 % los
hematíes no deben presentar variaciones morfológicas y se apreciará su forma
bicóncava característica.
En los tubos correspondientes a las soluciones hipotónicas observaremos
un hinchamiento celular con pérdida de hemoglobina, hasta llegar a una
hemólisis total o parcial en el tubo correspondiente a la concentración 0,4 %.
Por el contrario, en los tubos correspondientes a las soluciones hipertónicas,
los hematíes se observarán arrugados o crenados.
ACTIVIDADES
1. Contestar a las siguientes cuestiones:
a)
¿Qué son los eritrocitos crenados?
b)
¿En qué tipo de soluciones aparecen los hematíes fantasmas?
c)
¿Qué les ocurre a los hematíes cuando están en una solución
isotónica?
2. Resultados obtenidos: observe al microscopio óptico los eritrocitos
suspendidos en las distintas soluciones y dibuje su aspecto.
PRÁCTICA
N.º23:
DETERMINACIÓN
MANUAL
DEL
TIEMPO
DE
PROTROMBINA
FUNDAMENTO
El tiempo de protrombina (TP) o tiempo de Quick es el tiempo que tarda en
coagular un plasma, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de
tromboplastina hística.
El reactivo utilizado para la realización de esta prueba es una mezcla de
tromboplastina hística (TH) y de calcio, por lo que recibe el nombre de
tromboplastina cálcica. Esta TH procede de extractos de cerebro o de pulmón,
de hombre o de animales (generalmente de conejo o de vaca).
MATERIAL NECESARIO

Una gradilla.

Un rotulador de vidrio de punta fina.

Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 μl.

Dos puntas de pipeta automática adecuadas para contener 100 y 200 μl
(color amarillo y azul).

Tubos de hemólisis.

Un baño de agua ajustable a 37 ºC.

Dos tubos de ensayo de plástico.
REACTIVOS
Una tromboplastina cálcica comercial.
TÉCNICA
1. Homogeneizar la tromboplastina cálcica, sin agitarla bruscamente.
2. Depositar el volumen total de tromboplastina cálcica que se va a necesitar,
en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que
contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC, entre 5 y 15
minutos.
4. Pipetear 100 μl de plasma en un tubo de hemólisis limpio e incubar durante 2
a 5 minutos a 37ºC.
5. Añadir 200 μl de tromboplastina cálcica, preincubada a 37 ºC, y poner en
marcha el cronómetro simultáneamente.
6. Observar la formación del coágulo y parar el reloj cuando aparezca la primera
red de fibrina. Es conveniente realizar cada determinación por duplicado.
LECTURA DE LOS RESULTADOS
El TP es el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica
hasta la formación del coágulo de fibrina. Los valores del TP están comprendidos,
normalmente, entre los 11 y los 15 segundos.
Lo más correcto es determinar 2 veces el TP de la muestra y dar, como
resultado final, la cifra media calculada a partir de cada par de valores.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
El tiempo de protrombina está alargado en pacientes con déficits de factores
de la vía extrínseca, en enfermos sometidos a terapias con dicumarinas y en
pacientes que sufren algunos trastornos hepáticos.
ACTIVIDADES
1. Contestar a las siguientes cuestiones:
a) ¿Cual es el % normal de actividad de la protrombina?
b) ¿En qué circunstancias se altera el TP?
2. Resultados obtenidos:
 TP de la muestra, en segundos:

% de actividad de la protrombina contenida en la muestra, obtenido
mediante interpolación en la curva de actividad preparada previamente:
3. Valoración de los resultados
La muestra ensayada tiene un TP:
 Acortado.
 Normal.
 Alargado.
PRÁCTICA N.º 24: PREPARACIÓN DE UN POOL DE PLASMAS
FUNDAMENTO
Un pool de plasmas es una mezcla de varios plasmas, que puede ser utilizada
como líquido de referencia, ya que las sustancias que contiene están presentes
en ella a una concentración comprendida dentro de los límites de la normalidad.
MATERIAL NECESARIO

Tubos de recogida de sangre.

Una centrífuga.

Una pipeta Pasteur de plástico.

Un vaso de precipitados de plástico y de 25 ml de capacidad.

Tubos Eppendorf para congelación de plasma.

Una pipeta automática.

Puntas de pipeta automática.

Un rotulador de vidrio de punta fina.
MUESTRA
Sangre venosa recientemente extraídas, adecuadamente anticoaguladas y
procedentes de 6 a 10 personas que no reciban ninguna medicación y que no
padezcan ninguna enfermedad.
REACTIVOS
Anticoagulante: si el pool de plasmas se destina a estudios de coagulación,
el anticoagulante que deben contener los tubos de recogida de sangre es citrato
trisódico 0,11 M y éste debe mezclarse con la sangre en una proporción de 1 a
9.
TÉCNICA
1. Centrifugar todas las sangres a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos, si se
pretende preparar un pool de plasmas pobres en plaquetas, o a 1.000 r.p.m.
durante 10 minutos, si se pretende preparar un pool de plasmas rico en
plaquetas.
2. Desechar los plasmas hemolizados, hiperlipémicos o hiperbilirrubinémicos.
3. Extraer rápidamente los plasmas considerados válidos y depositarlos en un
solo vaso de precipitados.
4. Mezclar bien todos los plasmas para formar el pool.
5. Repartir un mismo volumen del pool (por ejemplo 300 μl) en tubos Eppendorf,
hasta agotar la mezcla de plasmas preparada.
6. Rotular en los tubos Eppendorf el nombre del producto que se ha preparado
(pool de plasmas) y la fecha de elaboración.
7. Proteger del deterioro al pool, mediante:

Un cierre correcto de los tubos, para evitar la evaporación del agua que
forma parte de la mezcla de plasmas y, por tanto, para eludir la
hiperconcentración de las sustancias que ésta contiene.

Una reducción de su exposición a la luz, para soslayar la
descomposición de alguna de las sustancias que incluye (por ejemplo,
la bilirrubina).

Una conservación a baja temperatura, para impedir la acción bacteriana
que puede conducir a la alteración de alguna de las sustancias que
engloba (consumo de glucosa).
8. Emplear el pool, solamente, dentro de los plazos adecuados de
almacenamiento:

Unas 8 horas, si se mantiene a temperatura ambiente (20-25 ºC).

De 2 a 3 días, si se conserva a unos 4 ºC y se pretende determinar una
sustancia enzimática.

Una semana, si se conserva a 4 ºC y se pretende determinar una
sustancia no enzimática.

Un mes, si se conserva a -20 ºC y se pretende determinar una sustancia
enzimática.

Dos meses, si se conserva a -20 ºC y se pretende determinar una
sustancia no enzimática.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a)
¿Qué es un pool de plasmas?
b)
¿De cuántas personas deben proceder las sangres necesarias para
preparar un pool de plasmas?
c)
¿Cuándo deben desecharse los plasmas?
d)
¿Qué se debe rotular en los tubos Eppendorf?
e)
¿Para qué se conservan los plasmas a baja temperatura?
f)
Cuando se pretende determinar una sustancia enzimática, ¿en qué plazo
puede utilizarse un pool de plasmas que se conserva a -20 ºC?
2. Resultados obtenidos:

Número de tubos de sangre procesados:

Volumen total de pool preparado:

Volumen de pool dispensado en cada tubo Eppendorf:

Número de tubos Eppendorf necesitados:
PRÁCTICA N.º 25: DETERMINACIÓN DEL GRUPO HEMÁTICO ABO POR LA
TÉCNICA EN PORTA
FUNDAMENTO
Consiste en observar la aglutinación que se produce cuando se enfrentan
los hematíes del paciente que contienen sustancias antigénicas (aglutinógenos),
con una serie de antisueros conocidos (aglutininas). Todo ello permite la
determinación del grupo ABO del individuo.
MATERIAL

Un portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco.

Un rotulador de vidrio.

Una pipeta Pasteur desechable.

Palillos mezcladores.

Un reloj.
REACTIVOS

Suero anti-A.

Suero anti-B.

Suero anti-AB
MUESTRA
Sangre capilar o sangre total anticoagulada con EDTA, citratada u oxalatada.
TÉCNICA
1. Dividir el portaobjetos o tarjeta visualizadora en dos secciones con el rotulador
de vidrio. Marcar una con la letra A y otra con la letra B.
2. Depositar una gota de suero anti-A (azul) en la sección A del portaobjetos, y
una gota del suero anti-B (amarillo) en la sección B.
3. Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del volumen
usado de antisuero) junto a la gota de antisuero.
4. Mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto en cada
una de ellas y formando un círculo de 2 a 2,5 cm de diámetro.
5. Hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás,
durante dos minutos.
6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
LECTURA DE RESULTADOS
La aglutinación se pone de manifiesto por la aparición de una serie de grumos
rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario, los hematíes
permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo.
La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante examen
microscópico de las mezclas. En general estas pruebas son muy eficaces, ya que
la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el
tamaño de los grumos. El resultado puede observarse en unos segundos, aunque
conviene reexaminar la reacción al cabo de 2 minutos para comprobar que no se
ha pasado por alto ninguna reacción débil. Estas suelen ocurrir en menos de un
1% de las muestras analizadas.
Hematíes y suero
anti-A
Hematíes y suero
anti-B
Grupo eritrocitario
aglutinación
no aglutinación
A
no aglutinación
aglutinación
B
aglutinación
aglutinación
AB
no aglutinación
no aglutinación
O
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Atendiendo a los resultados obtenidos se asignarán los correspondientes
grupos eritrocitarios. En el caso de que el grupo obtenido sea el A, los hematíes
problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina anti-A1, de forma que si
se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al subgrupo A1.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) ¿Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis?
b) ¿Qué muestra utilizamos?
c) ¿Cómo se ve la aglutinación positiva?
d) ¿Qué debemos hacer si el grupo obtenido es el A?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Aglutinación
No aglutinación
Mezcla de hematíes y suero anti-A
Mezcla de hematíes y suero anti-B
3. A la vista de los resultados, la sangre analizada es del grupo:
A
B
AB
O
PRÁCTICA N.º 26: DETERMINACIÓN DEL GRUPO HEMÁTICO ABO POR LA
TÉCNICA EN TUBO
FUNDAMENTO
Consiste en observar la aglutinación que se produce cuando se enfrentan los
hematíes del paciente que contienen sustancias antigénicas (aglutinógenos), con
una serie de antisueros conocidos (aglutininas). Todo ello permite la determinación
del grupo ABO del individuo.
MATERIAL

Tubos de hemólisis.

Un rotulador de vidrio.

Pipetas Pasteur desechable.

Centrífuga.

Gradillas.
REACTIVOS

Suero anti-A.

Suero anti-B.

Suero anti-AB.

Solución salina fisiológica.
MUESTRA
Sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una
suspensión de hematíes problema.
TÉCNICA
1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello
rotulamos convenientemente un tubo de centrífuga y añadimos 0,5 ml de la
muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para
suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2.000 r.p.m. y
decantamos el sobrenadante; repetimos esta operación tres veces hasta que
el sobrenadante esté totalmente transparente.
2. A continuación, preparamos una suspensión al 5% de los hematíes. Para
ello cogemos 0,1 ml de hematíes lavados y añadimos 1,9 ml de salino.
3. Se rotulan tres tubos de hemólisis bien limpios con las letras A, B y AB.
4. Se añade a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 5%.
5. Se añaden dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el
tubo B, y dos gotas de anti- AB en el tubo AB.
6. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 30
segundos a 3.400 r.p.m.
LECTURA DE RESULTADOS
Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para
desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia
de aglutinación.
Si la reacción es negativa, los hematíes se resuspenden homogéneamente.
Si la reacción es positiva se observa un botón de hematíes que permanecen
unidos una vez desprendido el sedimento.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Se realiza igual que en la técnica en porta.
Es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en
los tubos puede ocasionar falsos negativos.
También pueden darse falsos positivos por dos motivos:

Aglutinación no específica: se debe a la presencia de ácido hialurónico en la
sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, y se
elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes.

Fenómeno de Rouleaux: consiste en una agrupación no específica de
hematíes que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que
más frecuentemente originan este tipo de fenómeno son el fibrinógeno, las
gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona.
Estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes
problema.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) Qué tipo de técnica inmunológica se emplea en este análisis?
b) A qué concentración se prepara la suspensión de hematíes problema?
c) Cómo se ve la aglutinación positiva?
d) A qué se debe el fenómeno de Rouleaux?
e) Cómo se pueden evitar los falsos positivos?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Aglutinación
No aglutinación
Mezcla de hematíes y suero anti-A
Mezcla de hematíes y suero anti-B
3. A la vista de los resultados, la sangre analizada es del grupo:
A
B
AB
O
PRÁCTICA N.º 27: DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh POR LA TÉCNICA EN
PORTA
FUNDAMENTO
Esta técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie
de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal
humano que contiene anticuerpos anti-D. En el caso de que los hematíes
contengan el antígeno D se producirá una aglutinación que puede observarse a
simple vista.
En la determinación del grupo Rh por la técnica en porta conviene mencionar
que la aglutinación se favorece por el calor, de manera que es necesario disponer
de un visualizador que permita tanto calentar el porta, como observar mejor el
resultado de la reacción.
MATERIAL

Un portaobjetos.

Un rotulador de vidrio.

Una pipeta Pasteur desechable.

Palillos mezcladores.

Un visualizador luminoso.
REACTIVOS

Suero anti-D.

Albumina bovina al 30%.
MUESTRA
Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.
TÉCNICA
1. Dividir el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar una
con la letra S (sangre) y otra con la letra A (albumina).
2. En la sección S colocamos dos gotas de suero anti-D, y en la sección A
ponemos dos gotas de albúmina bovina al 30%.
3. Depositamos una gota de sangre en cada una de las secciones y mezclamos
con palillos distintos.
4. Colocamos el porta sobre el visualizador previamente calentado, y lo
balanceamos para favorecer la mezcla de sangre y reactivos.
LECTURA DE RESULTADOS
Esperamos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba.
La presencia de aglutinación positiva se manifiesta por la aparición de grumos
rojos sobre un fondo claro. No deben confundirse con pequeños coágulos de
fibrina presentes en la muestra.
La presencia de una aglutinación negativa se manifiesta porque la mezcla
da lugar a una suspensión homogénea de los hematíes.
La mezcla de sangre con albumina bovina debe dar siempre aglutinación
negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro
Sección S
Sección A
Interpretación
aglutinación
no aglutinación
Rh postivo
no aglutinación
no aglutinación
Rh negativo
aglutinación
aglutinación
No tiene
Para confirmar un Rh negativo es necesario realizar la prueba en tubo.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica?
b) ¿Para qué se utiliza el visualizador?
c) ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones?
d) ¿Qué ocurre si aglutina la sección A?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Aglutinación
Sección S
Sección A
3. A la vista de los resultados, la sangre analizada es del grupo:
□ Rh positivo
□ Rh negativo
PRÁCTICA N.º 28: DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh POR LA TÉCNICA EN
TUBO
FUNDAMENTO
Esta técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie
de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal
humano que contiene anticuerpos anti-D. En el caso de que los hematíes
contengan el antígeno D se producirá una aglutinación que puede observarse a
simple vista.
La determinación del grupo Rh por la técnica en tubo se hace para confirmar
resultados, siempre que en la técnica en porta salga Rh negativo.
La razón de utilizar albúmina bovina, tanto en esta técnica como en la de en
porta, reside en el hecho de que los hematíes pueden revestirse in vivo de
anticuerpos o proteínas plasmáticas anormales, y en presencia de albúmina
producir una agregación que daría la idea de una glutinación positiva. Por ello
empleamos un control de albúmina, de manera que si aparece aglutinación en
ese tubo debemos repetir la prueba, pero usando un suero anti-D en medio
salino.
MATERIAL

Tubos de centrífuga y de hemólisis.

Un rotulador de vidrio.

Una pipeta Pasteur desechable.

Gradillas para tubos.

Una centrífuga.
REACTIVOS

Suero anti-D.

Albumina bovina al 30%.

Solución salina fisiológica al 0,9%.
MUESTRA
Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.
TÉCNICA
1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello
rotulamos convenientemente un tubo de centrífuga y añadimos 0,5 ml de la
muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para
suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2.000 r.p.m. y
decantamos el sobrenadante. Repetimos esta operación tres veces.
2. A continuación, preparamos una suspensión al 5% de los hematíes. Para ello
cogemos 0,1 ml de hematíes lavados y añadimos 1,9 ml de salino.
3. Rotulamos dos tubos de hemólisis limpios con las letras D y A.
4. En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y en el tubo A ponemos una
gota de albúmina bovina al 30%.
5. A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5% y
agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos.
6. Centrifugamos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 30 segundos a 3.500 r.p.m.
LECTURA DE RESULTADOS
Se dan suaves golpes en el fondo de los tubos para despegar el botón
hemático y se observa la presencia de aglutinación.
Se considera aglutinación positiva si se formen grumos de color rojo en un
líquido claro. Por el contrario, si se resuspenden homogéneamente los hematíes,
decimos que la aglutinación es negativa.
El tubo con albúmina es un control negativo, y debe dar siempre ausencia de
aglutinación. En caso de no ser así, el resultado de la prueba no es válido.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es
Rh positivo.
Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos, procederemos a
incubar ambos a 37 1C durante media hora, al cabo de las cuales centrifugamos a
1.000 r.p.m. durante un minuto y observamos la presencia de aglutinación.
En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no
posee un Du (D débil) mediante una prueba de Coombs indirecta.
Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación,
informaremos que el paciente es Rh negativo.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) ¿Por qué utilizamos el control de albúmina?
b) ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D?
c) ¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto?
d) ¿Cómo se prepara la muestra problema?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Aglutinación
Tubo D
Tubo A
3. A la vista de los resultados, la sangre analizada es del grupo:
□ Rh positivo
□ Rh negativo
PRÁCTICA N.º 29: DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO Du (D DÉBIL)
FUNDAMENTO
El Du es un antígeno débil que no se pone de manifiesto en las pruebas
normales de determinación del Rh. Por ello debemos sensibilizar previamente los
hematíes problema con un suero que contiene anticuerpos anti-D, y
posteriormente enfrentarlos al suero de Coombs. Si existe el antígeno Du en la
superficie de los eritrocitos, se producirá en una primera fase la unión de los
anticuerpos anti-D a sus receptores de membrana, y en una segunda fase la
aglutinación de los hematíes en presencia del suero antiglobulina humana.
Esta técnica no es más que un test de Coombs indirecto.
MATERIAL

Tubos de centrífuga y tubos de hemólisis.

Una pipeta Pasteur desechable.

Gradillas para tubos.

Una centrífuga.

Un baño de agua.

Un reloj.
REACTIVOS

Suero anti-D humano.

Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Coombs).

Solución salina fisiológica al 0,9%.
MUESTRA
Hematíes de la sangre problema previamente lavados tres veces en solución
salina fisiológica, y suspendidos al 5% en dicha solución.
TÉCNICA
1. En un tubo de hemólisis colocamos una gota de suero anti-D y una gota de
suspensión de hematíes al 5%.
2. Mezclamos suavemente e incubamos a 37 1C durante 45 minutos.
3. Después de incubar, lavamos los hematíes en solución salina fisiológica tres
veces consecutivas. Decantamos completamente la solución salina después
del último lavado.
4. Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs, y
mezclamos suavemente.
5. Centrifugamos el tubo a 1.000 r.p.m. durante un minuto.
LECTURA DE RESULTADOS
Observamos la aparición o no de aglutinación, mediante golpes suaves en el
fondo del tubo. En caso de duda, observamos al microscopio entre porta y cubre
con el objetivo de 40x.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Si existe aglutinación, el resultado es positivo. Esto indica que en la
membrana de los hematíes hay antígeno Du, y se clasifica la sangre como Rh +
variante Du.
En caso de no existir aglutinación se clasificará la sangre como Rh negativo.
Para evitar falsos positivos debidos a una sensibilización previa de los
hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los
hematíes problema.
Esto nos servirá como control negativo.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) ¿Qué contiene el suero de Coombs?
b) ¿Qué se detecta con la prueba directa?
c) ¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta?
d) ¿Que buscamos en la sangre del paciente?
e) ¿Qué ocurre si el control es positivo?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Aglutinación
Prueba indirecta
Prueba directa
3. A la vista de los resultados, la sangre analizada es del grupo:
□ Rh positivo
□ Rh negativ
PRÁCTICA N. 30: PRUEBA CRUZADA MAYOR
FUNDAMENTO
Se utiliza sobre todo en terapia transfusional, cuando se quiere saber si existen
incompatibilidades entre donante y receptor.
Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante,
primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último
frente al suero antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectaremos los
anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.
Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores
en la técnica.
MATERIAL

Tubos de hemólisis.

Una pipeta Pasteur desechable.

Gradillas para tubos.

Una centrífuga.

Un baño de agua.

Un reloj.
REACTIVOS

Albúmina bovina al 30%.

Suero antiglobulina humana de conejo (suero de Coombs).

Solución salina fisiológica al 0,9%.
MUESTRA

Suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe
ser fresco (menos de 24 horas desde la extracción) y conservado a 4 ºC.

Hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina
fisiológica y resuspendidos en ella al 2-5%.
TÉCNICA
1. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes
del donante y dos gotas del suero del receptor.
2. Mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3
minutos.
3. Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos, y leemos el resultado en
medio salino.
4. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina al 30%.
5. Mezclamos bien e incubamos a 37 C durante 30 minutos.
6. Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos, y leemos el resultado en
medio albuminoso.
7. Lavamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar los
anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Se retira bien todo el
sobrenadante del último lavado.
8. Añadimos al tubo una gota de suero de Coombs y se mezcla bien.
9. Centrifugamos a 1.000 r.p.m. durante 2 minutos y leemos los resultados.
LECTURA DE RESULTADOS
La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático con
suavidad después de cada una de las centrifugaciones. En caso de reacciones
débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con
objetivo de 40 x.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son
compatibles, y por tanto, la transfusión es posible.
La aglutinación en cualquiera de las fases indica incompatibilidad.
Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo de
incompatibilidad.
En ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimático. Dado
que el empleo de enzimas como la bromelina o la papaína refuerza las reacciones
antígeno-anticuerpo, esta prueba se usa para re- examinar a los receptores que
han sufrido reacciones transfusionales.
ACTIVIDADES
1. Responder brevemente a las siguientes cuestiones:
a) ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada mayor?
b) ¿Cuándo se debe realizar la prueba cruzada menor
c) ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoideo?
d) ¿Que pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?
2. Completar la siguiente tabla con los resultados obtenidos:
Resultado
Medio salino
Medio albuminoideo
Suero antiglobulina
3. A la vista de los resultados, las sangres analizadas son:
□ Compatibles
□ Incompatibles