Henry El laboratorio en el diagnóstico clínico 2

Henry
Laboratorio
en el
Diagnostico
Clinico
Homenaje a
Todd-Sanford & Davidsohn
John Bernard Henry, M.D.
Distinguised Service Professor
Director. Pathology 200 College of Medicine
Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program
Attending Pathologist, University Hospital
Siale University of New York
Upstate Medical University
Syracuse, New York
Frederick R. Davey, M.D.
Prolessor and Chair. Department ot Pathology.
Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D.
Prolessor ol Pathology. State University of New
State University ot New York Upstate Medical
York Downstate Medical Center; Chair.
University. Syracuse. New York
Department ot Pathology and Laboratory
Chester J. Herman, M . D , Ph.D.
Professor ot Pathology, Emory University
School ol Medicine: Director. Pathology. Grady
Health System, Atlanta. Georgia
Richard A. McPherson, M.D.
Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot
Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical
Center. Brooklyn. New York
Gregory A.Threatte, M.D.
Professor ot Pathology; Director ot Core
Laboratories and Outreach. Upstate Medical
University. Syracuse, New York
Clinical Pathology. Department ot Pathology.
Medical College ot Virginia. Virginia
Gail L. Woods, M.D.
Commonwealth University; Director. Clinical
Prolessor ot Pathology; Director. Clinical
Pathology. Medical College ot Virginia
Microbiology. University of Texas Medical
Hospitals, Richmond. Virginia
Branch. Galveston. Texas
Contenido
Sección I. Patología clínica / Medicina de laboratorio
Gregory A.
Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.
1. L a b o r a t o r i o clínico: o r g a n i z a c i ó n , objetivos y p r á c t i c a
3
John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec, M S . H I A S C P I DiM.WiUam K Dcnwyler.M.7
2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m é d i c a
...
50
Gregory A. Threatte, M o
3. Principios de i n s t r u m e n t a c i ó n
. .
60
Andy N.D. Nguyen. MSMÍ. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.
4. A u t o m a t i z a c i ó n d e l l a b o r a t o r i o clínico
79
Rodney S. Markin, /no, cft.O.
5. I n t e r p r e t a c i ó n de los resultados de l a b o r a t o r i o
92
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. «i o.
6. I n f o r m á t i c a , t r a t a m i e n t o de i m á g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d
108
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD
7. Estadística e x p e r i m e n t a l
138
Gregory A. Tetrault. M.D.
8. G a r a n t í a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clínico
148
Gregory A. Tetrault, M.D.
Sección II. Química clínica
Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.
9. Evaluación de la función r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r ó l i t o s ,
e q u i l i b r i o ácido-base y gases sanguíneos
159
D. Roben Dufour, M D
10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b ó l i c o s , ionesinorgánicos y m a r c a d o r e s b i o q u í m i c o s
del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o
180
Elena Níkolova Hrístova, M D, John Bernard Henry. M D
21 I
11. H i d r a t o s de c a r b o n o
Paul £. Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD
224
12. Lípidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a
Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . ¿van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP
249
13. P r o t e í n a s específicas
Richard A. McPherson. M o
14. E v a l u a c i ó n de la f u n c i ó n y el d a ñ o h e p á t i c o
264
D. Roben Dufour. M D
281
/5. E n z i m o l o g í a clínica
D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD
16. Evaluación de la f u n c i ó n e n d o c r i n a
304
Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o
17. Toxicología y m o n i t o r i z a c i ó n t e r a p é u t i c a de f á r m a c o s
Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.
•••
III
335
Sección III. Orina y otros fluidos
Gregory A.
Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.
18. E x a m e n básico de la o r i n a
367
Christine £ Füller, Mí), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D
19. L í q u i d o c e f a l o r r a q u í d e o , sinovial y líquidos serosos del o r g a n i s m o
403
Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D
20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g í a y la e v a l u a c i ó n de la f e r t i l i d a d
425
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D
21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologías de r e p r o d u c c i ó n asistida
432
AndréVan Steirteghem.MD.PhD.
22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestación
446
Robert £ Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi.ü.
23. D i a g n ó s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s
gastrointestinales y pancreáticas
462
David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.
Frederick R. Davey, MD.,
John Bernard Henry, M.D.
24. E x a m e n básico de la sangre
479
Michael W. Morris. M S , DLMIASCPISH., Frederick R. Davey. M D
25. H e m a t o p o y e s i s
520
Frederick R. Davey. Mo, Robert £. Hutchison. MD
26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s
542
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D
27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos
586
Robert £. Hutchíson, M D, Frederick R. Davey, M.D
28. P l a q u e t a s en sangre
623
Jonathan L Miller, MO.Ph.D.
29. C o a g u l a c i ó n , fibrinólisis e h i p e r c o a g u l a c i ó n
.
.
642
Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .
30. I n m u n o h e m a t o l o g í a
660
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,¡ohn Bernard Henry, Mo
31. M e d i c i n a transfusional
718
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO
32. H e m a f é r e s i s
. .
776
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D
33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y células m a d r e
806
Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISBÍ. John Bernard Henry, M D
Sección V. Inmunología e inmunopatología
Richard A. McPherson, M.D.,
John Bernard Henry, M.D.
34. V i s i ó n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunológicos
817
Richard A. McPherson, M.D.
35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u í m i c a
821
Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M D
36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r
850
He/ene MA Paxton. M.S„MTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, гьв. Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc.РЛ.О.D/ABMUI
¡V
Contenido
37. E v a l u a c i ó n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s
y la i n m u n i d a d h u m o r a l
878
Richard A. McPherson, MD
38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i ó n
892
Ene Wagner, pt¡o. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD
39. C i t o c i n a s y m o l é c u l a s de a d h e s i ó n
914
H Dons Massey, MD. FI¡ D. DO S . Richard A. McPherson, M D
40. A n t í g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r
de histocompatibilidad del h o m b r e
927
Armead H. Johnson. «iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,¡udnh A.Wade. 8 k
41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d
949
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD
42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s
963
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.
43. Evaluación clínica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s
r e u m á t i c a s sistémicas
974
Carlos Alberto Yon Múhlen, MO.F*D.. Roben M. Nakamura. M O
44. Vasculitis
990
Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.
45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecíficas
1000
David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D
46. E n f e r m e d a d e s alérgicas
1016
Henry A. Homburger.MD.
47. D i a g n ó s t i c o y m a n e j o d e l c á n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s
t u m o r a l e s serológicos
1028
Jomes T.Wu. rto
Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD
48. Infecciones víricas
1045
Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD
49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsías y m i c o p l a s m a s
1072
Gail L Woods, « D . David H. Walker, MD
50. B a c t e r i o l o g í a m é d i c a
1088
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O
51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s
1119
Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo
52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s
1131
Michael 8. Sm;(íi, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D
53. M i c o b a c t e r i a s
1144
Gail L Woods. MD
54. E n f e r m e d a d e s m i c ó t i c a s
1158
Washington C.Wmn.jr, MD.MRA, Fred W.Westenfeld. MIIASCPISM
55. P a r a s i t o l o g í a m é d i c a
1196
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,¡ames W. Smith, MD.
56. P a t o l o g í a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas
1241
Martín G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D
57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnóstico
de las e n f e r m e d a d e s infecciosas
Gail L. Woods, MD
V
1254
Contenido
Chester, J. Hermán. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.
58. I n t r o d u c c i ó n a la p a t o l o g í a m o l e c u l a r
1273
Chester / Hermán. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D
59. Diagnósticos m o l e c u l a r e s : técnicas y principios básicos
1275
Ehzabelli R. Unger. P I o . MD, Margaret A. Piper. PhD.MP.H.
60. R e a c c i ó n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologías de amplificación
1287
james C. Zimring, MD. PI¡D. Frederick S. No/te, n¡o.
61. Tecnologías de la h i b r i d a c i ó n en serie
1296
jacques Scnrenzet. Mo Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.
62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n é t i c a en la p a t o l o g í a m o d e r n a
1304
Constance K. Stein, PhD.
63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnóstico m o l e c u l a r
1333
Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coríeton T. Garren, MD..PÍI.D.
64. O n c o p r o t e í n a s y d e t e c c i ó n t u m o r a l p r e c o z
.
1344
Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.
65. T é c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnóstico de neoplasias h e m a t o p o y é t i c a s
1355
David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD
66. D i a g n ó s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genéticas
1372
Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.
67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o
y o t r o s m a r c a d o r e s genéticos
1390
Herbert F. Polesky, M D.
68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e análisis d e l A D N
1402
Víctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H
1. Soluciones fisiológicas, t a m p o n e s , indicadores ácido-base,
m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t á n d a r y t a b l a de conversión de t e m p e r a t u r a s
1417
2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e índice de m a s a c o r p o r a l ( I M C )
1420
3 . C á l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguíneo t o t a l ( V S T )
1424
4. Tabla p e r i ó d i c a de los e l e m e n t o s
..
1425
...
1426
5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I )
H. Peter Lehmann. Pít 0, jolin Bernard Henry, MD
VI
Autores
M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D.
Professor of Bacteriology (Medical Microbiology).
Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit,
National University of Ireland, Galway; Consultant
Microbiologist. University College Hospital Galway.
Galway. Ireland
Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D.
Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center;
Assistant Professor. State University of New York
Upstate Medical University, Syracuse. New York
R a y m o n d D. Aller, M.D.
Clinical Professor. Department of Pathology and
Laboratory Medicine. Emory University School of
Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical
Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services
(United States). Nashville. Tennessee
M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D.
Technical Director. Advocate Shared Services
Laboratory. Park Ridge, Illinois
C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D.
Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and
Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine.
New York. New York
W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D.
Staff Member and Clinical Assistant Professor.
Department of Environmental Sciences. Columbia
College of Physicians and Surgeons.
New York. New York
Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D.
General Manager. Research Laboratories.
Incorporated. Tokyo. Japan
S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D.
Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic
Affairs, Department of Pediatrics; Director. The
Immunology Research Laboratory, Weill Medical
College of Cornell University, New York. New York
Fujirebio
Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D.
Professor (retired). The Johns Hopkins University
School of Medicine. Baltimore. Maryland
F r e d e r i c k R. Davey, M.D.
Professor and Chair, Department of Pathology. State
University of New York Upstate Medical University.
Syracuse. New York
Ulysses J . Balis, M O
Instructor in Pathology. Harvard Medical School and
Massachusetts General Hospital.
Boston. Massachusetts
J u l i o C. D e l g a d o , M.D.
Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical
School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory.
Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts
W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B
Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory
Science, State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
M a r g o A . D e n k e , M.D.
Associate Professor. University of Texas Southwestern
Medical Center. Dallas. Texas
M i r i a m Blitzer, Ph.D.
Professor and Chief, Division of Human Genetics.
Department of Pediatrics. University of Maryland,
Baltimore. Maryland
W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T.
Senior Consultant. Health Systems Concepts.
Incorporated. Longwood. Florida
D. R o b e r t D u f o u r , M.D.
Professor of Pathology. George Washington University
Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of
Pathology. Uniformed Services University of the Health
Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and
Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical
Center. Washington. DC.
L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A.
Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine
and Pathology, University of Medicine and Dentistry of
New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore
Medical Center, Neptune. New Jersey
Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H.
Professor. Department of Environmental Sciences.
Columbia College of Physicians and Surgeons,
M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D
Associate Professor and Vice Chairman. Department of
Pathology. University of Texas Medical Branch,
Galveston. Texas
New York, New York
D a v i d J . B y l u n d , M.D.
Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory.
San Diego. California
A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D.
Associate Professor. Medical College of Virginia.
Virginia Commonwealth University; Technical Director
of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia
Hospitals, Virginia Commonwealth. University.
Richmond. Virginia
Laura C o o l i n g , M . D . M.SC.
Assistant Professor. Department of Pathology.
University of Michigan Medical School; Assistant
Director, Blood Bank and Transfusion Medicine,
University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan
vii
M i c h a e l M. F r a n k , M.D.
Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics,
and Professor of Immunology and Medicine, Duke
University Medical Center, Durham. North Carolina
J o n a t h a n R. H i b b s , M.D.
Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center.
New York State Department of Health. David Axelrod
Institute, Albany, New York
T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D.
Associate Professor, Department of Laboratory
Medicine, University of Washington; Head, Clinical
Microbiology Division. University of Washington
Medical Center. Seattle. Washington
H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D.
Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical
School and Mayo Graduate School of Medicine.
Rochester, Minnesota
J o a n H . H o w a n i t z , M.D.
Vice Chair, Department of Pathology. State University
of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings
County Hospital Center, Brooklyn. New York
C h r i s t i n e E. Fuller, M D .
Fellow, Department of Pathology, Washington
University School of Medicine; Fellow. Department of
Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri
E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D.
Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State
University of New York Upstate Medical University,
Syracuse. New York
C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D., Ph.D.
Professor of Pathology, Medical College of Virginia,
Virginia Commonwealth University; Medical Director,
Molecular Diagnostics Laboratory, Department of
Pathology, Medical College of Virginia Hospitals,
Richmond. Virginia
C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S„ MT<ASCP)SBB
Adjunct Assistant Professor, Clinical Laboratory
Science, College of Health Professions; Supervisor,
Histocompatibility, Immunogenetics and Progenitor Cell
Bank, State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
W a y n e W . G r o d y , M.D., P h . D
Professor. Divisions of Molecular Pathology and
Medical Genetics, Departments of Pathology and
Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of
Medicine: Director, Diagnostic
Molecular Pathology
Laboratory, UCLA Medical Center,
Los Angeles, California
C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D.
Professor. Department of Microbiology.
University Medical Center. Washington.
R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D.
Professor of Pathology. Director of Clinical Pathology,
and Director of Hematopathology, State University of
New York Upstate Medical University.
Syracuse, New York
R o b e r t J . H a r t z m a n , C A P T , M C , U S N , M.D.
Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment
Program and Research Program, Naval Medical and
Research Insitute, Bethesda. Maryland
R a n d a l l T. H a y d e n , M.D.
Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's
Research Hospital. Memphis, Tennessee
H a i x i a n g J i a n g , M . D , Ph.D.
Assistant Research Professor. Department of
Pediatrics. Duke University Medical Center, Durham,
North Carolina
D a v i d G. H e i s i g , M.D.
Associate Professor of Medicine. Department of
Medicine, State Universit of New York Upstate Medical
University Syracuse. New York
J o h n B e r n a r d H e n r y , M.D.
Director, Pathology 200, College of Medicine;
Distinguished Service Professor; Director, Transfusion
Medicine & Transfusion Medicine Fellowship;
Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage
Testing Laboratories; Attending Pathologist, University
Hospital. State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse, New York
C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D.
Professor of Pathology, Emory University School of
Medicine; Director. Pathology, Grady Health System,
Atlanta. Georgia
Georgetown
DC
A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D.
Professor, Department of Pediatrics, Georgetown
University Medical School, Washington. DC
Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC
Visiting Professor. Kyorin University School of Public
Health: Research Fellow. Keio University of Medicine.
Tokyo, Japan
C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D.
Professor and Chair. Department of Pathology,
University of Utah: University Hospital (Laboratory
Services) Chairman and Pediatric Pathology
(Laboratory Services) Chairman. University of Utah
Hospital and Primary Children s Medical Center.
Salt Lake City, Utah
viii
Autores
R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D.
Paul E. K n u d s o n , M.D.
Associate Professor of Medicine, Division of
Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin
Diabetes Center. State University of New York Upstate
Medical University. Syracuse, New York
Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical
Pathology,
Department of Pathology.
of Virginia.
Virginia Commonwealth University; Director.
Medical College
Clinical Pathology. Medical College of Virginia
Hospitals. Richmond. Virginia
W i l l i a m K o s l o s k y , M.D.
Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center.
Brooklyn. New York
J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D.
Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs.
Department of Pathology: Director of Special
A n t h o n y S. K u r e c , M.S., H ( A S C P ) D L M
Hematology Laboratory.
Clinical Associate Professor. Department of Clinical
Laboratory Science, College of Health Professions:
Administrator for Pathology Marketing and University
Pathologists Laboratories, State University of New York
Upstate Medical University. Syracuse. New York
University Hospital,
State
University of New York Upstate Medical University.
Syracuse, New York
M i c h a e l W. M o r r i s , M.S.. D L M I A S C P I S H
Professor.
M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D.
Professor. Department of Pathology: Director of Clinical
Laboratories. Harvard Medical School.
Boston,
Massachusetts
Department of Clinical Laboratory Science;
Manager. Department of Pathology. University Hospital.
State University of New York Upstate Medical
University, Syracuse. New York
R o b e r t M . N a k a m u r a , M.D.
R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D.
Assistant Professor, Department of Pathology,
University of New Mexico School of Medicine;
Laboratory Director, University Hospital Rapid
Response Laboratories. University Hospital.
Albuquerque. New Mexico
Professor.
Departments of Immunology and
Experimental and Molecular Medicine.
The Scripps
Research Institute: Senior Consultant and Chairman
Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and
Research Foundation. La Jolla. California
A n d y N.D. N g u y e n , M S M E , M.D.
H. Peter L e h m a n n , Ph.D.
Professor Emeritus. Department of Pathology.
Louisiana State University Medical Center.
New Orleans. Louisiana
Associate Professor.
Department of Pathology.
University of Texas Medical School at Houston;
Director.
Hematology Laboratory and Chemistry
Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director.
J o h n A. Lott, Ph.D.
Professor. Department of Pathology, The Ohio State
University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio
State University Hospitals, Columbus. Ohio
Coagulation Laboratory.
Memorial Hermann Hospital.
Houston, Texas
W a l t e r W . N o l l , M.D
Professor of Pathology.
R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D.
Professor and Vice Chair, Department of Pathology
and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs.
College of Medicine, University of Nebraska Medical
Center. Omaha. Nebraska
Dartmouth Medical School.
Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry
and Molecular Genetics
Dartmouth-Hitchcock
Lebanon.
Diagnostic Laboratories,
Medical
Center,
New Hampshire
F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D.
H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S.
Chief Resident in Pathology. Medical College of
Virginia, Virginia Commonwealth University,
Richmond, Virginia
Associate Professor.
Medicine,
Pathology and Laboratory
Emory University School of Medicine;
Laboratory Director,
Clinical Microbiology and
Molecular Diagnostic Laboratories.
Rex M. M c C a l l u m , M.D.
Associate Clinical Professor of Medicine. Division of
Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke
University School of Medicine; Vice Chair for Clinical
Services. Department of Medicine. Duke University
School of Medicine and Hospital. Durham.
North Carolina
Laboratories, Atlanta.
Emory Medical
Georgia
M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi)
Associate
Professor-Pediatrics.
Northwestern
University Medical School; Director.
Diagnostic
Immunology and Flow Cytometry Laboratories.
Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois
ix
The
Autores
S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D.
Clinical Professor, Department of Pathology: Director.
Andrology Service. University Hospital, State University
of New York Upstate Medical University.
Syracuse, New York
H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P )
Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs
and Research and Development, PanBio InDx,
Incorporated. Baltimore. Maryland
D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D.
Medical Director. Infectious Disease Research Institute;
Vice President, Diagnostics Research. Corixa
Corporation, Seattle. Washington
J a c q u e s S c h r e n z e l , M.D
Assistant Professor. Geneva University Medical School:
Consultant. Division of Infectious Diseases, Geneva
University Hospital. Geneva, Switzerland
M i c h a e l A. Pfaller, M.D.
Professor. Department of Pathology; Director,
Molecular Epidemiology and Fungus Testing
Laboratory, University of Iowa College of Medicine.
Iowa City, Iowa
G r e g o r y P. S m i t h , M.D.
Assistant Clinical Professor. Department of Pathology.
University of Utah; Staff Pathologist, Department of
Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah
J a m e s W . S m i t h , M.D.
Professor Emeritus. Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Indiana University School of
Medicine, Indianapolis, Indiana
M a t t h e w R. P i n c u s , M . D , Ph.D.
Professor of Pathology. State University of New York
Downstate Medical Center; Chair. Department of
Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans
Affairs Medical Center. Brooklyn. New York
M i c h a e l B. S m i t h , M.D.
Assistant Professor; Associate Director, Clinical
Microbiology and Laboratory Information System.
University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas
A l v a r o A . P i n e d a , M.D.
Professor of Laboratory Medicine and Director of
Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo
Medical School and Mayo Graduate School of
Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo
Clinic. Rochester. Minnesota
C o n s t a n c e K. S t e i n , Ph.D.
Associate Professor of Pathology and Pediatrics;
Director of Cytogenetics and Associate Director of
Molecular Diagnostics. University Hospital. State
University of New York Upstate Medical University,
Syracuse, New York
M a r g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H .
Senior Consultant. Technology Evaluation Center.
BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois
E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P
Voluntary Professor. Pathology and Laboratory
Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio:
President and Chief Executive Officer, Medical
Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky
H e r b e r t F. Polesky, M.D.
Professor (retired), Department of Laboratory Medicine
and Pathology, University of Minnesota School of
Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director,
Memorial Blood Centers of Minnesota,
Minneapolis, Minnesota
R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C
Associate Professor in Clinical Laboratory Science.
State University of New York Upsate Medical University,
Syracuse, New York
G r e g o r y A. Tetrault, M.D.
Medical Director, Shared Laboratory Services.
Chesapeake, Virginia
B a r b a r a S. R e i s n e r , Ph.D.
Assistant Professor, Department of Pathology:
Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory,
University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas
Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P.
Special Assistant for Clinical Studies,
L.C..
G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D.
Professor of Pathology; Director of Core Laboratories
and Outreach, Upstate Medical University,
Syracuse, New York
National Institutes
of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute.
Division of Heart and Vascular Diseases,
Bethesda. Maryland
E l i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D.
Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers
for Disease Control and Prevention; Clinical Associate
Professor, Department of Pathology and Laboratory
Medicine, Emory University School of Medicine.
Atlanta. Georgia
R h o n d a K. Roby, M . R H
Senior Forensic Specialist, Human Identification,
Applied Biosystems. Foster City, California
x
Autores
E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D.
Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts
General Hospital, Harvard Medical School.
Boston. Massachusetts
A n d r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D.
Full Professor, Medical School; Scientific and
Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine,
Medical School and University Hospital, DutchSpeaking Brussels Free University.
Brussels. Belgium
D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D
Assistant Professor. Department of Pathology,
University of New Mexico School of Medicine; Staff
Hematopathologist. University of New Mexico Health
Sciences Center. Albuquerque. New Mexico
C a r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D.
Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine,
Pontifical Catholic University School of Medicine,
Porto Alegre, RS, Brazil
J u d i t h A. W a d e , B Sc.
Professor, Department of Surgery, and Faculty of
Medicine, University of Toronto; Formerly Head,
Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital
University Health Network, Toronto.
Ontario. Canada
Eric W a g n e r , Ph.D.
Immunologist, Ste-Justine Hospital,
Quebec, Canada
Montreal.
D a v i d H. W a l k e r , M.D.
Professor and Chairman. Department of Pathology;
Director, World Health Organization Center for Tropical
Diseases. University of Texas Medical Branch.
Galveston, Texas
Victor W . W e e d n , M . D , J.D.
Principal Research Scientist and Director of
Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon
University, Pittsburgh. Pennsylvania
R u t h S. W e i n s t o c k , M . D , Ph.D.
Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes
and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes
Center. State University of New York Upstate Medical
University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs
Medical Center, Syracuse, New York
E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D.
Attending Pathologist and Director, Transfusion Service,
Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey
R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S.
Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State
University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate
Professor of Human Genetics, University of Maryland;
Attending Pathologist, Division Head of Clinical
Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland
F r e d W. W e s t e n f e l d , M T ( A S C P > S M
Clinical Faculty. University oí Vermont: Microbiology
Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health
Care. Burlington. Vermont
D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D.
Professor and Chairman, Department of Pathology;
Professor of Health Administration. Medical College of
Virginia Campus. Virginia Commonwealth University.
Richmond, Virginia
W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A.
Professor of Pathology. University of Vermont College
of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory,
Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont
J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D.
Assistant Professor. Department of Pathology and
Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood
Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center:
Associate Medical Director. Central Kentucky Blood
Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive
Division of the Veterans Affairs Medical Center,
Lexington, Kentucky Hemapheresis
Gail L. W o o d s , M.D.
Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology,
University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas
J a m e s T . W u , PhD
Professor of Pathology, University of Utah Health
Science Center; Director of Special Chemistry
Laboratory. Associate Regional University Pathologists
(ARUP). Salt Lake City. Utah
M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D.
Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern
University Medical School. Chicago: Staff Pathologist,
St. Francis Hospital. Evanston, Illinois
E d m o n d J . Y u n i s , M.D.
Professor, Department of Pathology. Harvard Medical
School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer
Institute. Boston. Massachusetts
J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D.
Pathology Resident, Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Emory University.
Atlanta. Georgia
CAPÍTULO 33
•
811
A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E
de la sangre periférica tanto de pacientes como de donantes normales e
incluso de placenta o sangre de cordón.
Células madre de sangre periférica
El impulso para el desarrollo de tecnologías que permitieran la recogida
de CMH de sangre pentérica fue su uso potencial para trasplante autólogo,
en que el riesgo de contaminación de la médula con células tumorales es
alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de médula ósea por hemaféresis, las células madre obtenidas de sangre periférica se usan de forma
creciente en el entorno alogénico. Un área de gran importancia puede ser
la donación de no familiares o voluntarios, en la que más individuos pueden
prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donación
de médula cuando la hemaféresis se ofrece como opción frente a la recogida tradicional de médula ósea. El procedimiento e instrumentación utilizados para la recogida de células madre de sangre periférica se describen el
Capitulo 32.
De forma clara, la mayor ventaja de las células madre obtenidas de sangre
periférica frente a la médula ósea es el tiempo de injerto de neutrófilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 días para las células madre de sangre periférica frente a las dos a cuatro semanas de la médula ósea (Gianm, 1989).
Esta rápida recuperación claramente reduce la morbimortalidad asociada por
neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia
hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y demás.
Se sabía que las CMH estaban presentes en sangre periférica tras la recuperación de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el
desarrollo de sistemas de hemaféresis que permitieran una recogida segura
de un adecuado número de estas células para proporcionar el injerto al
receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de
pacientes para trasplante autólogo. se ha establecido actualmente la recogida de un gran volumen de aféresis I14-201/ procedimiento) como un procedimiento eficaz para recoger un número adecuado de CMH en un razonable
número de procedimientos para proporcionar una recuperación hematopoyética adecuada.
Las CMH son morfológicamente indistinguibles de otras células mononucleares de la médula ósea o sangre periférica, por lo que resulta esencial la
recogida de un número adecuado de células para asegurar el injerto medular
en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de
médula ósea perseguía obtener un número suficiente de células nucleadas
que permitiera asegurar un número mínimo de células madre. Los injertos de
médula ósea pueden también ser evaluados para la actividad de células
madre mediante el uso de técnicas de unidades formadoras de colonias
(UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de células mononucleares del injerto se
cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimiento hematopoyéticos y aminoácidos esenciales durante 10 a 14 días. Al final
de este periodo, se examinan las placas buscando el número y características de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblásticas
(BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Unidades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y
megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen más de 50
células se valoran como una colonia. Las muestras con más de 1 x 10 UFC
por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la recogida de células madre evolucionó hacia el uso de procedimientos de hemaféresis de sangre periférica, se hizo necesario desarrollar un método que se
:
pudiera realizar en el mismo día y que determinara el número de muestras de
hemaféresis necesarias. El método más aceptado para valorar las muestras
de células madre de sangre periférica es la cuantificación del número de células con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las células primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemaféresis utilizando el recuento de células CD34como índice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hematopoyético (Berenson. 1991). La estandarización de la valoración de las células
CD34 y la disponibilidad de los análisis de citometria de flujo han ocasionado
que la medida de las células CD34+ se utilice por la mayor parte de los programas para determinar el número y adecuación de las muestras de células
madre de sangre periférica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras
de células madre de sangre periférica con mas de 3 x 10 células CD34+ por
kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir
el injerto de neutrófilos entre 8 y 10 días.
f
La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requeriría
múltiples procedimientos de recogida y aféresis, dado que el número de
CMH en sangre periférica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del número de
células en la médula. En consecuencia, se requieren terapias de "movilización" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficiencia de la recogida por hemaféresis. Richman (1976) descubrió que mientras hay una caída en el número de células CD34+ circulantes después de
la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el
porcentaje de células CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrófilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 14 y 21 días después
de la terapia. Este aumento en células CD34+ circulantes es mayor con
agentes quimioterápicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por
hemaféresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes números de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso
aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el
periodo de aumento de células CD34+ circulante es breve (dos a tres
días), son críticos un estrecho control del recuento de leucocitos y células
CD34+ circulantes del paciente, así como el control de los tiempos de recogida por hemaféresis. Además, algunos investigadores han señalado que
la recogida de CMH en la fase de recuperación tras quimioterapia reduce
la probabilidad de contaminación por células tumorales en el producto de
aféresis. El uso de factores de crecimiento hematopoyético como el Factor
Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrófago (GM-CSF) y el Factor
Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un
aumento significativo en el número de células CD34+ en sangre periférica
(Siena, 1989). Dosis de 5 a 10 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 días
causan un aumento de 5 a 10 veces en el número de CMH en sangre periférica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser más eficiente que el cebado con quimioterapia para la recogida de células CD34*. La combinación
de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la máxima movilización de células madre pluripotenciales en sangre periférica, así como la necesidad de menor número de
procedimientos de hemaféresis para recoger una dosis de CMH para trasplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de
trasplante autogénico.
Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alogénico sano para
movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor óseo y cefalea, resulta bien
tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes
Tabla 33-6 Comparación de las tuentes y productos de células madre hematopoyéticas. Lugar de recogida y complicaciones
Sangre de cordón (CMSC)
Tipo de donante
Producto
Lugar de recogida
Complicación principal
Sangre de cordón umbilical
Célula madre de sangre de cordón
Cordón umbilical de placenta
en el nacimiento
Insuficiencia de células madre
Autólogas
(CMMO + CMSP)
Paciente
Médula ósea o CMSP
Médula intraoperatona o
hemaféresis
Recurrencia de la enfermedad
original
Alogénicas
(CMMO + CMSP)
Donante compatible familiar o no
Médula ósea o CMSP
Médula intraoperatona o hemaféresis
Enfermedad injerto contra huésped
CMSP= células madre en sangre periférica; CMMO= células madre en medula Osea; CMSC= c é l u l a s madre en sangre d e c o f d o n
812
S E C C I Ó N IV
•
H E M A T O L O G Í A , C O A G U L A C I Ó N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL
están utilizando sangre periférica como fuente de CMH en lugar de médula
ósea, tanto para trasplantes alogénicos como autogénicos.
Sangre de cordón umbilical
Durante muchos años, se sabía que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o células madre estaban presentes en la sangre del cordón
umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos
para utilizar células recuperadas de cordón umbilical de placenta para el
trasplante hematopoyético (Gluckman. 1989). El éxito aparente de muchos
de estos trasplantes precoces de sangre de cordón ha dado lugar a la organización de diferentes bancos de células de cordón en EE.UU. y en Europa
en un intento por proporcionar otra fuente de células madre para los pacientes que necesitan un trasplante alogénico. Además, como las células madre
se obtienen de sangre del cordón, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin
que aparezcan los grados 3 ó 4 de la GVH. Como consecuencia, el trasplante podría estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no
tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las células madre de cordón
umbilical se obtienen por canulación de los vasos placentarios, con la placenta todavía in útero o más frecuentemente, después del parto o por expresión directa de la sangre del cordón de la placenta después del mismo. El
número de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de
sangre de cordón recogido, lo que depende del tamaño del niño/placenta y
también de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992).
Volúmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto
permitirá obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 células
nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen descartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordón umbilical no se procesan para reducir el volumen, congelándose directamente en DMSO y
almacenándose en nitrógeno líquido. Los trabajadores de banco con entrenamiento específico no sufren distracción por el cuidado de la madre y/o el
niño en la sala de partos, y reducen el riesgo de contaminación bacteriana
de la sangre del cordón.
6
Una cuidadosa selección de la historia médica y pruebas a la madre son
esenciales para asegurar la calidad del producto de sangre de cordón, asi
como la ausencia de enfermedad genética. Además de las pruebas de laboratorio habituales para enfermedades de transmisión serológica, se realizan
más pruebas para enfermedades bacterianas y víricas.
Mientras el almacenamiento de la sangre de cordón umbilical resulta una
alternativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia,
una oferta real para un mayor número de pacientes, presenta como limitación
la necesidad de aumentar el número de CMH adecuadas para receptores de
mayor tamaño, asi como la de optimizar los costes de inicio y mantenimiento
de bancos de células de cordón.
Depuración
Una vez recogidas las células madre hematopoyéticas. bien de médula
o de sangre periférica, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado
ulterior de las CMH recogidas con el objeto de reducir una posible contaminación por células tumorales o, en los trasplantes alogénicos. reducir el
número de células T CD3+. Se han realizado dos aproximaciones no excluyentes entre sí. La primera desarrolla técnicas que persiguen eliminar las
células tumorales, también llamadas técnicas de depuración o selección
negativa. La segunda utiliza métodos para separar y recoger tan sólo las
células madre hematopoyéticas CD34-. descartando la fracción celular
restante que. presumiblemente, contiene células tumorales contaminantes:
estos métodos se denominan habitualmente técnicas de selección positiva
(Tabla 33-7).
Las técnicas originales de depuración empleaban una variedad de métodos específicos e inespecílicos para eliminar la población celular no deseada En aquella época se utilizaban fármacos citotóxicos como la 4-hidroxiperoxiciclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las células
tumorales contaminantes (Yeager, 1986). Estos métodos son los equivalentes in vitro de altas dosis de quimioterapia, por lo que el mayor efecto negativo es el daño a las CMH. Otras técnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-
mación de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en
especial las células T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos monoclonales dirigidos a un receptor específico de célula junto con complemento o ligadas con inmunotoxmas como el ricino para producir una lisis de la
población de células tumorales contaminantes. Ademas, con la llegada de
la tecnología de esferas inmunomagnéticas (immunomagnetic bead technology). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de estas esteras.
El complejo anticuerpo-esfera-célula tumoral se elimina al pasar la suspensión celular por un campo magnético donde la población de células no
deseadas quedará retenida y las CMH son eluidas y recogidas.
Las técnicas de selección positiva se dirigen a la presencia selectiva del
marcador CD34 en las células madre hematopoyéticas y la disponibilidad de
anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientras la tecnología original
utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos monoclonales. en el
momento actual se utilizan técnicas de esferas inmunomagnéticas. La fracción de células mononucleares obtenidas bien de la médula ósea, bien por
hemaféresis de células madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u
otros monoclonales de interés. Se añade una suspensión de esferas inmunomagnéticas marcadas con un segundo anticuerpo. Este último se liga al
monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-célula diana marcado.
Cuando la suspensión celular se somete a un campo magnético, el complejo célula CD34»-esfera magnética quedará retenido y la suspensión de
células mononucleares que contiene tanto células tumorales no deseadas
como células T CD3+ será desechada. Las células madre CD34+ son
entonces liberadas de las esferas magnéticas mediante un agente liberador
y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magnético, dejando una
suspensión celular que contiene aproximadamente un 90% de células
CD34-. La reducción del numero total de células T CD3+ llega hasta una
reducción de 3.5 log,,. La mediana de recuperación para las células CD34+
es de aproximadamente el 50% de la cantidad inicial de células CD34+ presentes en el producto obtenido por hemaféresis. Aunque todavia está permitido el uso para la selección positiva de células CD34+. esta tecnología
también se encuentra bajo activa investigación para aplicaciones de selección negativa.
Depleción de células T
Las técnicas para reducir el número de linfocitos CD3+ en los injertos
hematopoyéticos alogénicos, generalmente de médula, se han dirigido a
reducir la incidencia y severidad de la reacción del injerto contra el huésped
(GVH). Muchas de las técnicas descritas para depurar células tumorales,
como la selección positiva de células CD34+, han sido también aplicadas
para la reducción de células T en el injerto (Tabla 33-8). Otras técnicas específicamente dirigidas a las células T han incluido aglutinación con lectma de
soja, formación de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a contracorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al
receptor CD2 del linfocito. Añadiendo un paso de formación de rosetas con
eritrocitos de oveja, se consiguen eliminar las células T restantes no aglutinadas por la lectina de soja Este método produce una depleción de células
T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982).
Tabla 33-7 Métodos de depuración de células madre
Selección positiva
Selección de células CD34.
Columnas en fase sólida
Esteras magnéticas
Selección negativa
Farmacológicos
4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC)
Etopósido (VP-16)
Inmunológicos
Células tumorales + AcMo + toxina"
Células tumorales + AcMo + lase sólida"
• Toxina = complemento ricino, oíros
'" Fase sólida = esleras magnéticas.
CAPÍTULO 33
•
A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CÉLULAS M A D R E
Tabla 33-8 Métodos de depleción de linfocitos
Leclinas
Lectina de soja con formación de rosetas E
Centrifugado a contracorriente
Inmunológicos
Anticuerpos + complemento
Anticuerpos + lase sólida
Selección positiva
813
dios más recientes también han demostrado un papel de las células asesinas
naturales (NK) en la reacción "injerto contra leucemia". Otros han empleado
combinaciones de técnicas como la selección de CD34+ y dilución a contracorriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en células CD34+ y
otra rica células NK con depleción de células T, aprovechando el hecho de
que las células NK parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la
GVH (Skiera, 1999).
Criopreservación de injertos hematopoyéticos
La dilución a contracorriente es un método utilizado para la depleción de
células T que utiliza la separación característica de células en un campo de
centrifugado, de acuerdo con el tamaño y densidad de las diversas poblaciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se añaden
agentes quimioterápicos o anticuerpos a la población de células madre
hematopoyéticas, por lo que no se deteriora su función celular. Los concentrados de capa leucocítica a partir de médula ósea se introducen en la centrífuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fracciones celulares de diferentes tamaños y densidades. El sistema posee una
alta eficiencia en la separación de la fracción rica en CFU-GM de la fracción
de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las células, la fracción CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente añadida de nuevo a la
facción CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de células CD3+.
si se desea clínicamente (Noga, 1990). La recuperación celular es alta y.
como los medios de dilución son biocompatibles. los productos se pueden
redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del procedimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal experimentado.
La introducción de técnicas con esferas inmunomagnéticas para la selección positiva de células CD34+ ha llevado al uso de estas técnicas en el trasplante alogénico para la depleción resultante de células T CD3+, en especial
de muestras obtenidas de células madre de sangre periférica. La tecnología
con esferas inmunomagnéticas se aplica con facilidad a las células madre
obtenidas por hemaféresis así como a los productos de médula ósea de gran
volumen. Muchos centros han comunicado éxitos con estos nuevos métodos
en la reducción de células T CD3+ en trasplantes alogénicos. en especial
cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (HensleeDowney, 1997).
Otra ventaja adicional tanto de las técnicas de depuración como de selección positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior
de células madre para congelación, recuperación y reinfusión al paciente.
Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusión de productos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la
congelación y almacenamiento para el laboratorio de células madre. En el
momento actual, las técnicas autorizadas para la depuración y/o selección
positiva para reducir la contaminación por células tumorales son costosas, y
se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clínica de estos procedimientos en la reducción de células tumorales. Algunos centros han comunicado un mejor pronóstico mediante el empleo de una combinación de ambas,
depuración y técnicas de selección positiva (Clarke, 1998).
Las técnicas de selección tanto positiva como negativa producen una pérdida concomitante de hasta un 50% en el número original de células CD34+, tanto por toxicidad de diversos agentes (quimioterápicos, complemento), atrapamiento de complejos en esferas magnéticas, o pérdida durante etapas
necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el número de células
CD34+ recogidas en la hemaféresis inicial y en la extracción de médula ósea
debe aumentarse para contrarrestar la pérdida posterior durante el procesado.
Esto puede ser difícil de cumplir en pacientes que son difíciles de "movilizar".
La principal desventaja de la depleción de células T es el aumento resultante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH
parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que
no muestran GVH. La presencia de la población de células T del donante
parece ser crítica en la reacción "injerto contra leucemia", en el reconocimiento de los antigenos del huésped por las células del donante que genera
una respuesta inmune que elimina las células tumorales de huésped. Estu-
Los injertos de CMH de origen autogénico y muchas muestras alogénicas
se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo más frecuente utiliza DMSO al 10% como agente protector, congelación a ritmo controlado y
almacenamiento en nitrógeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso
de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descongelación frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad asociada con la infusión de productos de células madre con DMSO, otros investigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adición de
hidroxietilalmidón u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayoría de los programas. Al intentar lavar los productos después de la descongelación para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una pérdida
significativa de células madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a
reducir el volumen del producto antes de su congelación, reduciendo de esta
forma la cantidad necesaria de DMSO.
Reinfusión de productos de células madre
Independientemente de la fuente del injerto de células madre, las CMH se
infunden al paciente de forma similar a la transfusión de cualquier producto
sanguíneo. Las células madre pluripotenciales. dotadas de un receptor de
membrana único, se dirigirán al espacio medular, reinjertándose y replicándose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor
parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH
recogidas por hemaféresis sin procesado ulterior pueden contener gran cantidad de eritrocitos. La criopreservación con DMSO no conserva la integridad
de la membrana del glóbulo rojo, por lo que estos productos contienen una
gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en
el receptor oscilan desde leves caracterizadas por náusea, escalofríos o cefalea, hasta reacciones más graves, que pueden incluir hipotensión, sepsis,
insuficiencia renal o incluso parada cardíaca (Stroncek, 1991). Estas reacciones se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de células madre criopreservadas generalmente reciben premedicación con antihistaminicos y/o
antieméticos. También la hidratación y el uso de diuréticos están indicados
para reducir los efectos secundarios producidos por la administración de
hemoglobina libre y el volumen de líquido infundido.
Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes
transfundidos con productos de células madre
criopreservadas
Frecuentes
Escalofríos
Náuseas
Vómitos
Fiebre
Cefalea
Disnea
Inlrecucntes
Insuficiencia renal
Parada cardiaca
Hipotensión
Sepsis
Factores asociados
Volumen de tejido reinfundido
Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido
Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alogénicos)
Contaminación bacteriana
814
SECCIÓN IV
•
HEMATOLOGÍA, COAGULACIÓN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL
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BIBLIOGRAFÍA
S E C C I Ó N
V
Inmunología e inmunopatología
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C A P Í T U L O
34
" Visión general del sistema inmune
y de los trastornos ¡nmunológicos
• RICHARD A. MCPHERSON, M.D.
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
820
Linfocitos T
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO
820
Linfocitos B
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS
CÉLULAS LINFOIDES
817
INMUNOLÓGICO
Células presentadoras de antígeno
BIBLIOGRAFÍA
Células NK
CÉLULAS NO LINFOIDES
820
820
819
Neutrófilos y eosinófilos
Basófilos y mastocitos
FACTORES HUMORALES
819
Inmunoglobulinas
Complemento
Citocmas
El sistema inmunológico está estructurado para reconocer, responder y
destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias,
virus, hongos y parásitos, que de otro modo, serían capaces de promover
infecciones dañinas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes
del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y
de las reacciones específicas que emplea el cuerpo para combatir los organismos patógenos. En general, esta función inmunológica se puede resumir
como la búsqueda de antigenos extraños que no pertenecen al cuerpo y su
destrucción. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de
la aparición de antígenos nuevos extraños en células tumorales y trata de
destruirlas dejando ilesos los antígenos normales presentes en células sanas.
Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de
la función inmunológica se vean afectados. Éstos incluyen reacciones de
hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alogénicos de órganos o tejidos, la enfermedad de injerto contra huésped: la búsqueda de la tolerancia en los trasplantes continúa. Este capitulo resalta los componentes del
sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clínicas de la
inmunidad mas significativas.
CÉLULAS LINFOIDES
Las células linfoides del cuerpo incluyen las células de los ganglios linfáticos, bazo, células de las superficies mucosas y células circulantes de la sangre. Derivan de células madre hematopoyéticas multipotentes. que se producen progresivamente desde el saco vitelino en el embrión, al hígado en el feto,
y la médula ósea en el niño y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las
diferentes células linfoides se identifican por la presencia de marcadores proteicos únicos presentes en su superficie y que permiten a esas células desempeñar determinadas funciones.
Linfocitos T
Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la médula ósea,
pasan de la corteza a la médula timica y durante este proceso sufren la maduración. Este proceso implica una selección, de modo que las células que reaccionan con antígenos propios se eliminarán, mientras que se retienen otras
células capaces de reconocer antígenos mediante interacciones con moléculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal.
1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfocitos en la sangre, y se encuentran también en zonas paracorticales de ganglios linfáticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su
maduración, sufren una programación genética, en la cual el gen para el
receptor de antígeno de la célula T (TCR) se reordena para dar receptores
proteicos que son invariantes en su especificidad antigénica, durante toda la
vida de ese linfocito y de sus células descendientes.
La mayoría (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antígeno compuestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un
heterodímero que se encuentra en la membrana exterior asociado al complejo molecular CD3 (CD3 es un marcador para células T). Las subunidades proteicas </. y \i del TCR poseen regiones variables, de unión y constantes (la
cadena a también contiene una región de diversidad), con sus correspondientes secuencias en el gen del TCR, el cual sufre un reordenamiento que
produce una elevada especificidad en la unión de un determinado antígeno.
Las proteínas CD3 asisten en la Iransducción de la señal al interior de la célula cuando un antígeno se une al TCR en la superficie linfocitana (Janeway.
1994; Weiss. 1994). Un pequeño porcentaje de linfocitos T presentan un TCR
compuesto por subunidades y y ó que interaccionan de forma similar con
CD3: estas células se encuentran generalmente en la superficie de mucosas
de los tractos grastrointestinal y respiratorio. Las proliferaciones de células T
se pueden dividir en neoplásicas (clónales) o benignas (policlonales). según
su ADN muestre de forma predominante una sola forma de reordenamiento
818
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
génico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y
como ocurre normalmente en una población linfocitaria heterogénea.
El análisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad
de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de células
CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la función
de otras células del sistema inmune secretando citocinas que estimulan
varias funciones. Existen dos subpoblaciones de células CD4+: T 1, que
secreta interleucma 2 (IL-2) e interferón-y (IFN-y); y T„2. que secreta IL-4 e IL-5.
Las células T„1 facilitan las actividades de los macrófagos como la hipersensibilidad y la producción de anticuerpos con acción opsonizante; las células
T,,2 dirigen la síntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en
un 30% délas células T (asi, la relación de células CD4 y CD8 en sangre es
típicamente 2:1). Estas células T CD8+ presentan actividad citotóxica y supresora en la respuesta inmune.
células B se produce tanto en la médula ósea, donde tiene lugar una selección negativa y positiva, como en localizaciones periféricas. La estimulación
antigénica de las células B desencadena la formación de células plasmáticas
que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmunidad humoral. El complejo receptor de antigeno de la célula B utiliza la inmunoglobulina M (IgM) como componente de unión al antígeno. La especificidad
antigénica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en
el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena
pesada se divide en región variable, de diversidad, de unión y constante,
mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unión y
constantes. La maduración de la respuesta mediada por anticuerpos implica
el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reordenamiento génico, aunque el tipo de cadena ligera de una célula B permanece fijado.
El mecanismo de reconocimiento antigénico es diferente entre los dos subtipos de linfocitos T. Las moléculas CD4 se unen a las moléculas de MHC de
clase II presentes en las células presentadoras de antigeno, mientras que las
moléculas de CD8 interaccionan con moléculas de MHC de clase I. De acuerdo con esto, las células CD4+ reconocen antigenos sólo en el contexto de
MHC de clase II, y las células CD8+ los reconocen sólo a través de MHC de
clase I.
Las células B también presentan en su superficie receptores para el complemento (CD21. que es también el receptor para el virus de Epstein-Barr
[EBV] y hace que estas células sean susceptibles de una infección por EBV)
y para la región Fe de las inmunoglobulinas: también presentan COI9 y
CD20. que se usan a menudo para la identificación inmunológica de las células B.
H
Células presentadoras de antígeno
Linfocitos B
Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de
los linfocitos periféricos en sangre, y además se pueden encontrar en la
médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros tejidos linfáticos. En el bazo y
ganglios se agregan para formar los folículos Imfoides. La diferenciación de
Los macrófagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de
inflamación, y también procesan los antígenos ingeridos y los presentan asociados a moléculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las células T no se
activan con antígenos solubles y. por tanto, la presentación de antígenos de
este modo es necesaria para la estimulación de células T y la inducción de la
Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las células presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o
miemos y presentan los fragmentos peptídicos del antígeno, asociados a una molécula de MHC, a las células T. En la célula T, un TCR específico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activación celular tiene lugar a través del complejo CD3
y la activación de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la célula B está compuesto por una molécula de Ig unida a la membrana que se encuentra formando un complejo con otras proteínas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antigénico. las
TK celulares también se activan. La activación coeslimuladora de células T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligandos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulación de la célula T a través de las moléculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molécula CD40 de la célula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. Littman D:
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CAPÍTULO 34
•
VISIÓN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L Ó G I C O S
inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrófagos también secretan citocinas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar
directamente células tumorales en su papel de inmunovigilancia. y además,
son también células efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej.
la hipersensibilidad retardada).
Las células dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones
intersticiales de otros órganos) y las células de Langerhans (presentes en la
epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmáticas enriquecidas en
moléculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presentación antigénica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran
muy importantes para esta función en todo el sistema inmune.
Células NK
Las células NK (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los
linfocitos en sangre periférica. No son células T ni B y anteriormente se las llamaba células nulas. Las células NK tienen la función de lisar otras células sin
necesidad de una previa sensibilización. Pueden atacar células tumorales. infectas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a células aberrantes. Las células NK se caracterizan por los marcadores de superficie CD16
y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificación. CD16 es el
receptor para la región Fe de la IgG y por tanto las células NK son capaces de
lisar selectivamente aquellas células que se encuentran recubiertas de anticuerpos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensibilidad). Las células NK también secretan cilocinas como el IFN-y.
Curiosamente, las células NK se pueden reconocer en una preparación de un
frotis de sangre tenido, como linfocitos grandes y granulosos.
CÉLULAS NO LINFOIDES
Estas células no están programadas genéticamente para reconocer antígenos específicos o interaccionar con células linfoides en la inducción de una
respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desencadenadas por diversos factores.
819
linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la
exposición continuada a multitud de antígenos extraños y pueden permanecer durante años mediante una secreción continuada para sustituir a
aquellas moléculas que se pierden mediante la limpieza normal de proteínas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo
es la IgA en una forma dimérica especial que resulta de su secreción a ese
lugar (véase Capítulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que reside en la superficie de células B donde puede estar involucrada en la transducción de la señal inmunológica. pero no adquiere concentraciones
importantes como moléculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a
través de su unión a la superficie de basófilos y estimula la secreción de
sustancias vasoactivas de esas células en presencia de alérgenos específicos).
Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan uniéndose a los antigenos
invasores en la superficie de células extrañas, bacterias, virus, etc. y facilitando su destrucción mediante efectores inespecíficos como el complemento y las células NK. La monitonzación de enfermedades mediante el análisis de inmunoglobulinas incluye un análisis cualitativo para la detección clonal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnóstico de mieloma múltiple) y
análisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA
(para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobreproducción de tipos de inmunoglobulinas) y para títulos de anticuerpos específicos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumococos, Haemophilus. tétano, difteria u otros microorganismos)
Complemento
Este conjunto de proteínas que interaccionan entre si tiene el papel de destruir enzimáticamente las dianas (p. ej.. células, bacterias) a las que les dirigen los anticuerpos u otros medios (véase Capítulo 38). La medida de los
componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diagnóstico clínico: detectar deficiencias congénitas (que son relativamente infrecuentes) que pueden suponer una predisposición a ciertas enfermedades
como infecciones o la progresión hacia enfermedades autoinmunes) y para
detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de
análisis de una enfermedad autoinmune sistémica como puede ser el lupus
eritematoso sistémico.
Neutrófilos y eosinófilos
Los neutrófilos llegan a las regiones de inflamación por la acción de quimioatrayentes; entonces vierten sustancias tóxicas y enzimas de sus granulos que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrófilos
también ingieren restos celulares al igual que los eosinófilos. retirándolos de
los tejidos.
Basófilos y mastocitos
Los basófilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en
su superficie receptores que se unen a IgE. La unión de IgE en la membrana
de los basófilos no es específica del antígeno que reconoce la IgE. sino que
es el resultado de la suma de la acción de la cantidad total de IgE y los basófilos disponibles. Cuando el antígeno (o alérgeno) entra en contacto con su
IgE especifica presente en la superficie del basófilo. la célula se activa y
secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilidades. Asi, la especificidad de un basófilo está dirigida por la IgE que tiene unida
a su superficie desde la sangre; teóricamente, un basófilo podría tener múltiples moléculas de IgE diferentes en su superficie y podría, por tanto, reaccionar con muchos alérgenos diferentes.
FACTORES HUMORALES
Inmunoglobulinas
Las moléculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de células B para estimular la secreción de más inmunoglobulinas: también pueden circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los
tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en
contacto con microorganismos patogénicos. Las principales inmunoglobu-
Citocinas
Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las respuestas inmunes celulares; son mediadores que actúan a corto plazo y que
son elaborados por algunas células y difunden a otras células donde actúan (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrópicas en el sentido de que
pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de
forma endocrina estimulando células a una cierta distancia; pueden actuar
sobre células que se encuentran en el espacio inmediato (estimulación
paracrina); también pueden estimular a las propias células que las han
secretado (autocrina). Las acciones específicas de las citocinas incluyen la
hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que
inducen la producción de granulocitos y macrófagos. respuestas de inmunidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], interferones e IL-8), estimulación de la multiplicación y activación de linfocitos
(mediante IL-2 y otros), y la activación inespecifica de células inflamatorias
(véase Capítulo 39). Todavía se están descubriendo nuevas citocinas a
medida que van apareciendo más detalles sobre la comunicación célulacélula.
El uso clínico de las citocinas incluye tanto la supresión de la respuesta
inmune en el trasplante de órganos alogénico mediante fármacos como la
ciclosponna que inhibe la producción de IL-2, y la estimulación de la respuesta inmune en terapias frente al cáncer o a infecciones. Estos últimos tratamientos son en su mayoría experimentales, aunque trabajos recientes han
demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con
antibióticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996).
Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias mediante las cuales las respuestas inmunes se estimularán o inhibirán selectivamente de acuerdo con las necesidades clínicas concretas.
820
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El MHC (también denominado complejo antigénico leucocitario humano.
HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye moléculas de la
Clase I (HLA A, B y C). moléculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las
moléculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del
complemento y el TNF-u y TNF-|i (véase Capítulo 40). Las funciones de los
antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su
participación en la presentación antigénica a células T. Estos antígenos fueron descubiertos y su naturaleza altamente polimórfica fue descrita en esludios de tolerancia inmunológica y en el rechazo de trasplantes de órganos
alogénicos. En consecuencia, una de las utilidades clínicas más importantes
del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de órganos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicación
clínica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus
familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que
se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis
anquilosante con HLA B27) (véase Capítulo 41). Otra aplicación más del tipo
HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho
refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formación de anticuerpos anti-HLA tras ser expuestos a múltiples donantes (p. ej., tras las
transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplantes de células progenituras hematopoyéticas (HPC) (véase Capítulo 31).
MECANISMOS DE DAÑO INMUNOLÓGICO
te a virus, hongos, protozoos, parásitos y también microbios intracelulares
como mycobacterias. Los pacientes con el síndrome de la mmunodeficiencia
adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes
oportunistas cuando pierden sus células T CD4+.
APLICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS
INMUNOLÓGICO
Las principales áreas de aplicación clínica de los ensayos inmunológicos
son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de órganos/tejidos y su
rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias
La enfermedad autoinmune puede ser sistémica (véase Capitulo 43), estar
restringida a órganos específicos (véase Capítulo 45) o puede implicar vasculitis (véase Capítulo 44). Muchos de los ensayos se basan en técnicas que
emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con
autoantigenos específicos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros
autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta que emplean secciones de órganos para identificar autoanticuerpos específicos como aquellos que se dirigen frente al músculo liso, mitocondnas. células parietales y demás. Los avances tecnológicos han proporcionado fuentes purificadas de muchos autoantígenos importantes que formarán parte de ensayos futuros para autoanticuerpos más específicos y que
permitan una automatización más eficaz.
La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alogénicos y las
mmunodeficiencias se basan en la búsqueda de subpoblaciones linfocitarias
con una particular importancia de las células T y de las CD4+. Ademas, los
estados de inmunodeficiencia congénita requieren un análisis más detallado
de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando
generalmente con una batería de ensayos convencionales para analizar la
presencia y (unción de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasando, cuando es necesario, a ensayos muy esotéricos en la búsqueda de desórdenes menos frecuentes (véanse Capítulos 36 y 42).
Las respuestas inmunologías pueden dañar tejidos normales además de
los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas respuestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de naturaleza anafiláctica o alérgica: está mediada por la IgE unida a la superficie de
basófilos y mastocitos. Cuando antígenos específicos (o alérgenos) se unen
a la IgE de superficie, los basófilos se estimulan y liberan la histamina y otras
Los trastornos alérgicos se evalúan típicamente a través de ensayos en la
sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones
piel, medida de la concentración total de IgE en suero, y la cuantificaaon de
alérgicas. Estrategias clínicas para el tratamiento de asma y alergias han
la reactividad específica de la IgE en suero con alérgenos comunes de la
empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar
comida, el polen y otros factores ambientales (véase Capitulo 46).
los efectos de la histamina hasta la desensibilización. Un estudio reciente
A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmunoempleó con éxito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para
lógicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnóstico clínico
el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podría, en el
probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas
futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentración de IgE en
factores y actividades, para establecer diagnósticos correctos y monitorizar y
suero.
ajustar los tratamientos.
El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antígenos presentes
en la superficie celular; el daño puede ocurrir mediante la unión y activación del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicídad
BIBLIOGRAFÍA
celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de células tumorales o de
parásitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los antiFekade D. Knox K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy
treatment with antibodies against tumor necrosis lactor c«. N Engl J Med 1996:
cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la
335:311.
miastenia gravis).
Germain R: MHC-dependent antigen processing and peptide presentation ProviEl tipo III resulta de la formación de inmunocomplejos, entre antígenos exóding ligands for T lymphocyte activation. Cell 1994. 76:287.
Janeway C. Bottomly K: Signáis and signs for lymphocytic responses. Cell 1994:
genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantígenos endóge76:275.
nos y autoanticuerpos. El daño tisular típico ocurre en órganos que contienen
Milgrom H. Fick RB. Su JO, et al. Treatment of allergic asthma with monoclonal antinumerosos vasos sanguíneos pequeños donde los inmunocomplejos circuIgE antibody N Engl J Med 1999. 341:1966
lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229
Paul W, Seder R. Lymphocyte responses and cytokines. Cell 1994; 76:241
genos endógenos.
von Boehmer H: Positive selection of lymphocytes Cell 1994: 76:219.
El tipo IV está mediado por células, también se denomina hipersensibilidad
Weiss A. Littman D: Signal Iransduction by lymphocyte anligen receptors. Cell 1994;
retardada, y depende del funcionamiento de las células T CD4+ o de la cito76:263.
toxicidad de células T CD8+. El tipo IV es la base de la reacción inmune frenWeissman I: Developmental switches in the immune system Cell 1994; 76:207.
CAPÍTULO
35
Inmunoensayos e inmunoquímica
• Yoshihiro Ashihara, Ph.D.
• Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc.
• Robert M. Nakamura, M.D.
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
821
Ensayo inmunofluorométrico por partición radial
Fluoroinmunoensayo en tiempo real
Características generales de la reacción
Inmunoensayo fluorescente homogéneo
antígeno-anticuerpo
Características de los antígenos
Ensayo de polarización de la fluorescencia
Características de los anticuerpos
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia
de excitación
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo
Inmunoensayo de fluorescencia protegida
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES
DE LOS INMUNOENSAYOS
823
INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE
Tipos de inmunoensayos
Origen
Química de conjugación
Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres
Características de la fase sólida
de acridinio como marcadores
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA
Y NEFELOMÉTRICOS
Inmunoensayo electroquimioluminiscente
824
Origen y principios de la reacción de precipitina
INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS
825
AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN
DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO
Sistemas de inmunoensayo heterogéneos
Resumen
Secuencia práctica del inmunoensayo
830
Origen
en el sistema analítico
Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo
heterogéneo
Principios y métodos del ensayo
Nuevos sistemas para la próxima generación
Resumen
INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
(sistemas modulares)
833
Origen y clasificación
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA
SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE 845
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos
Origen
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de
Resumen
INMUNOENSAYO FLUORESCENTE
842
Sistemas de ensayo homogéneos
Principio de aglutinación de partículas
RADIOINMUNOENSAYO
841
ensayo por inmunofiltración)
839
Origen y clasificación
Inmunoensayo fluorescente heterogéneo
Método fluoroinmunométhco
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Características generales de la reacción
antígeno-anticuerpo
Los ligandos inmunológicos se basan en la afinidad entre moléculas, como la
enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antígeno y el anticuerpo, y juegan un papel importante en los seres vivos. Las características de reconocimiento específico de los inmunoensayos (reacciones antígeno-anticuerpo) han
pasado a ser ampliamente utilizadas como herramientas analíticas, a pesar de
la amplia gama de métodos disponibles para el análisis clinico en un laboratorio.
Tiras reactivas
Instrumentos inmunocromatográficos
Resumen
BIBLIOGRAFÍA
848
Los inmunoensayos se pueden utilizar para la detección tanto de antigeno como de anticuerpos. Para la delección de antigenos, el anticuerpo específico correspondiente debe prepararse como uno de los reactivos. Lo contrario se aplica para la detección de anticuerpos. La sensibilidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de
nuevos tipos de sistemas para la detección de la señal y la tecnología
de fase sólida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar
menos de 0,1 pg.'ml de antígeno presente en la sangre. Se pueden aplicar a la detección de haptenos como moléculas pequeñas: proteínas y
complejos proteicos como las macromoléculas: y también para cualquiera de los anticuerpos frente a alérgenos, agentes infecciosos y antigenos autólogos.
822
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
Características de los antigenos
Los antígenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede
representar sitios antigénicos (epítopos) para producir los correspondientes
anticuerpos, desde moléculas pequeñas como los haptenos y hormonas,
hasta macromoléculas como proteínas, glícoproteínas, glicolipidos y otros
productos naturales. Algunos compuestos químicos artificiales también pueden ser antígenos actuando como haptenos. Los antígenos deben tener al
menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos
incluyen secuencias de aminoácidos de peptidos presentes en proteínas y
estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.
Características de los anticuerpos
La inmunoglobulma. una proteína plasmática importante, se refiere a anticuerpos en el contexto de funciones biológicas de inmunoglobulmas específicas de antígeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a
estimulaciones antigénicas. Los anticuerpos se componen de moléculas funcionales y heterogéneas que unen antígenos mediante un dominio de unión
al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD
e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM
presentan dos subgrupos. Todas las moléculas de anticuerpo conocidas presentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura molecular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones
variables. El dominio hipervaríable (sitio de unión al epitopo) puede ensamblarse para interaccionar con una amplia variedad de epítopos (determinantes antigénicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos categorías de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como analitos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos
IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de antisueros obtenidos a través de la inmunización con un antígeno purificado.
Anticuerpos
2. La producción de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad
ilimitada de reactivo homogéneo con una afinidad y especificidad muy
constante.
3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmunización con un antígeno sin purificar.
Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso.
que son las siguientes:
1. Reactividad insuficiente para la precipitación o aglutinación debido a que
la formación del entramado del inmunocomplejo es débil o no ocurre cuando se emplean anticuerpos monoclonales.
2. Los antigenos con múltiples epítopos heterogéneos son más difíciles de
caracterizar inmunoquímicamente con un solo anticuerpo monoclonal.
Producción de anticuerpos mediante tecnología
recombinante
Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresión para el fragmento F de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosforilcolina empleando tecnología recombinante en Escherichia colí. Esta técnica
hace posible producir un anticuerpo quimérico fusionado con una enzima.
Ha aparecido una técnica lamada phage display (una traducción podría ser
muestra de fagos) para la producción de anticuerpos (Wmter. 1994). En este
método fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unión previamente
determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, eliminando asi la necesidad de inmunización y generación de hibridomas. Los
genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por
unión al antígeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias
infectadas Además, la afinidad de la unión de los anticuerpos se mejora
mediante mutación. En un futuro próximo esta técnica permitirá el uso de anticuerpos específicos de alia avidez.
v
policlonales
Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunización con un
antígeno, que presenta varios epítopos. En otras palabras, se generan anticuerpos específicos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo policlonal por un antígeno complejo generalmente es mayor que la de un simple
anticuerpo monoclonal. Para la inmunización con moléculas relativamente
pequeñas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias proteínas transportadoras o carner.
Cinética de la reacción antigeno-anticuerpo
Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de acción de masas de la
química se pueden aplicar a la reacción antígeno-anticuerpo. La cinética de
una reacción Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986):
K
Ag + Ab AgAb
K
2
Anticuerpos
monoclonales
Los anticuerpos monoclonales (Kóehler. 1975) se han desarrollado empleando las siguientes biotecnologías: fusión somática de células, selección del
hibridoma resultante y dilución límite para obtener monoclonales. Se definen
como anticuerpos homogéneos uniformes dirigidos a epitopos específicos.
Una linea celular establecida permite la secreción de todas las inmunoglobulinas especificas que reaccionan frente a un solo antígeno. Los anticuerpos
monoclonales han permitido el análisis de moléculas, epitopo por epitopo. gracias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales
no tienen la habilidad de reconocer la molécula completa, en comparación con
los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos antígenos con un epitopo común parecen el mismo antígeno. El anticuerpo CA199 (Magnaní, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas
y tamaños moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohidratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificación de isoenzimas.
subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las moléculas,
puesto que pueden distinguir la mínima diferencia entre moléculas.
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anticuerpo libres. AgAb representa la concentración del complejo antigeno-anticuerpo, y K' y K son las constantes de asociación y disociación, respectivamente. El ritmo de formación del complejo antigeno-anlicuerpo se representa
de la siguiente forma:
K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|
y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi.
*' _ [AgAb]
?
K ~[Ag][Ab]~
11
(constante de asociación en el equilibrio o constante de afinidad).
K es el parámetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de
que los antígenos y los anticuerpos a menudo poseen múltiples dominios de
unión en la molécula. La constante de asociación para múltiples reacciones
antígeno-antícuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El
valor de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos experimentales:
a
Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distintos antígenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable
existencia de la misma secuencia de aminoácidos, hidratos de carbono o lípidos en distintas moléculas. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha
permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo muy útiles y prácticamente ideales para un laboratorio de diagnóstico clínico.
Los métodos de producción y las aplicaciones de los anticuerpos monoclonales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las
ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes:
1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo muy bien definido.
a
[Ab] = [Ab],-[AgAb]
donde [Ab] es la concentración del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. representa la concentración total de anticuerpo inicial.
CAPÍTULO 35
a
•
823
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
puestos cromóforos, fluoróforos. y más tarde, compuestos quimioluminiscentes. Dependiendo del sustrato elegido, el método de ensayo se puede definir
como un inmunoensayo enzimático fluorescente o quimioluminiscente
(Thorpe. 1984).
Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluoróforos como sondas.
Los fluoróforos requieren de una longitud de onda óptima para que su excitación produzca una emisión de luz detectable. La sensibilidad del FIA normalmente desciende debido al fondo inespecífico presente en las muestras biológicas. Existen fluoróforos que poseen un retraso en la emisión de fluorescencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un FIA en
tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha
resultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminación del ruido de
fondo. Se han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden
detectar concentraciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
"([Ab],-B)F
donde F es el anlígeno libre o analito, y B es el antígeno unido o analito.
Una representación de Scatchard se produce cuando la cantidad de antígeno unido (B) se representa en eje el X y la relación de los analitos B/F se
representa en el eje Y. Dos parámetros que se pueden determinar de una
representación de Scatchard son la constante de disociación o afinidad, de la
pendiente de la línea, y la concentración de los sitios de unión al anticuerpo
por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).
15
VISIÓN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES
DE LOS INMUNOENSAYOS
Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimioluminiscentes como sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen moléculas sintetizadas químicamente y productos naturales como la aequorina. A
diferencia de los fluoróforos. la mayoría de los compuestos quimioluminiscentes requieren una estimulación química, en lugar de energía lumínica,
para generar la emisión de luz. La reacción de reducción-oxidación es un proceso común a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificación de la
señal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las moléculas
quimioluminiscentes generan un solo fotón por descomposición molecular.
Han aparecido una serie de compuestos innovadores para la quimioluminiscencia que han resultado útiles para su aplicación en inmunoensayos. Un
metal quelado con grupos tri-bifenilo emite luz a través de una reacción continua de reducción-oxidación en la superficie de los electrodos (Blackburn,
1991).
Tipos de inmunoensayos
Una breve clasificación y una lista de las características de vanos inmunoensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitación proporcionan el método más sencillo por el que los antígenos y anticuerpos reaccionan entre ellos sin necesidad de una señal de detección. El complejo antigeno-anticuerpo en un gel o en fase líquida puede observarse cualitativamente
como un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector.
El inmunoensayo de aglutinación de partículas (Kasahara, 1992b) emplea
partículas inertes como sonda, en lugar de la precipitación directa de los complejos antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antígenos unidos a partículas
como eritrocitos, látex o un sol metálico reaccionan con el analito de la muestra. Como resultado de esta reacción inmune, las partículas grandes presentan un patrón de aglutinación significativo que puede verse a simple vista.
Yalow (1959) describió el desarrollo de un RÍA empleando isótopos radiactivos como sonda. Este avance permitió la detección cuantitativa de niveles
residuales de analitos y contribuyó al avance de la investigación básica y la
medicina clínica. La insulina, por ejemplo, se cuantificó mediante un RÍA, y
sustituyó al inmunoensayo de la insulina. El RÍA se puede preparar como un
procedimiento en fase sólida para una separación fácil de la sonda libre de la
unida. Desde el desarrollo de los RÍA, la búsqueda de sondas alternativas a
los isótopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar
inmunoensayos no isotópicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y
otros grupos de respuesta.
En los diversos tipos de ensayos mencionados anteriormente, los principales factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son la constante de
asociación (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la señal de las
sondas y la relación señal/fondo de la señal de detección reducida por el
fondo de la propia reacción o por una reacción inespecifica.
Los isótopos de yodo 125 ( l) requieren unos 7 millones de moléculas
para generar 1 fotón/segundo, basado en el cálculo de la vida media de isótopos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos quimioluminiscentes de
enzimas pueden incrementar el número de eventos en una orden de magnitud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplificación
catalítica que poseen las enzimas.
,25
l2S
El inmunoensayo enzimático (EIA), que emplea enzimas como sondas, se
desarrolló al principio de la década 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y
rápidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las
señales dependiendo de la actividad catalítica de la enzima. En un intento de
mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-
Química de conjugación
En función del ensayo elegido, el método de conjugación que une una molécula con otras, como enzimas (o cofactores) a antígenos (o anticuerpos) o antígenos (anticuerpos) a una fase sólida puede variar. La reacción de acopla-
Tabla 35-1 Clasificación de los inmunoensayos y sus características
Señal de detección
Separación B/F*
Detección de la señal
Inmunoensayos de precipitación
No necesarias
No necesaria
Inmunoensayos de partículas
Células sanguíneas.
partículas artificiales (gelatina.
partículas de látex, etc.)
Radioisótopos ('»1, H)
Enzimas
No necesaria
Fluoróforos
Necesaria
A simple vista, turbidez.
nefelometría
A simple vista, analizador de
patrones, espectrofotometría.
cómputo de de partículas
Cómputo de fotones
Espectrofotometría. fluorimetria.
cómputo de fotones
Cómputo de fotones
Compuestos quimioluminiscentes
Necesaria
Cómputo de fotones
Radiommunoensayos
Inmunoensayos enzimáticos
Inmunoensayos fluorescentes
Inmunoensayos
quimioluminiscentes
3
Necesaria
Necesaria
Sensibilidad
~10|jg/m|t
-5 ng/mM
-5 pg/ml
-0,1 pg/m|6(CL-EIA)
11
-5 pg/ml
1
-5 pg/ml
libre Los ensayos homogéneos que se incluyen no requieren la
'Paso de lavado para la separación do la sonda unida en el inmunocomple¡o de la sonda que queda
separación B/F.
Dalos de Ritchie (1978)
Datos de Aux (1988).
'Oatos de Isomura (1994)
'Datos de Sgoulas (1989)
:
824
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pueden causar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distintas cinéticas de la reacción inmune o la actividad enzimática con las vanado
nes de la temperatura. Puede existir una diferencia en la temperatura entre
los pocilios que se encuentran en el borde de la placa y los que se encuentran en el centro. Una diferencia de unos 2 C puede observarse con un termómetro infrarrojo entre los pocilios del borde y los centrales a temperatura
ambiente. La forma y tamaño de la fase sólida son factores críticos que afectan a la cinética de la inmunorreacción y a la capacidad de unión del anticuerpo o antígeno de la fase sólida. Partículas esféricas magnéticas o de
látex de 3.000 A de diámetro, poseen una superficie total mayor para la inmunoabsorción de lo que se obtiene normalmente con otras lases sólidas. La
mayor superficie total ayuda a reducir la duración de la reacción inmunológica (Nishizono. 1991).
miento aplicada se debería llevar a cabo en condiciones que eviten la reducción
de las propiedades biológicas de la proteína. En el método del glutarakJehido
(Avrameas, 1978). el glutaraldehido, con dos (o posiblemente más) grupos
aldehido como agente de acoplamiento, se ha empleado para la conjugación de
grupos amino proteicos. Este método se basa en reacciones mixtas, incluida la
condensación aldólica a elevado pH (la pKa del residuo NH es de 8.6 a 10.8).
En este método, mostrado en la Figura 35-1. el conjugado resultante presenta
formas diferentes por la existencia de múltiples dianas de unión. El método de
la oxidación con periodato (Nakane. 1966) para la conjugación de anticuerpos,
emplea la peroxidasa de rábano, que contiene grupos de hidratos de carbono
en su molécula. Los métodos mencionados anteriormente no son apropiados
para la regulación de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se
requiere la estereoespecificidad configuracional del conjugado.
Como se muestra en la Figura 35-2, se han desarrollado métodos de conjugación nuevos (Kato. 1975; Kitagawa. 1978) empleando un reactivo de
conjugación sofisticado, el éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimída (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en un éster activo
y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo SH,
respectivamente. El grupo carboxilo también puede ser utilizado como una
diana específica para la conjugación con un residuo a- o i-NH presentes
en una proteina empleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de
conjugación. El reactivo NHS también conjuga proteínas o el grupo carboxilo introducido en una fase sólida.
Características de la fase sólida
Todos los inmunoensayos heterogéneos que emplean conjugados con sondas, incluidos los radioisótopos, requieren al menos un paso para diferenciar
el anligeno que ha reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del
que permanece sin reaccionar (libre). La inmovilización de antigenos o anticuerpos en una fase sólida se realiza mediante uniones covalentes o mediante adsorción tísica a través de interacciones no covalentes. Se han empleado
como lase sólida, partículas de gel hechas de agarosa. poliacrilamida. cuentas de plástico o placas de poliestireno. y también partículas recubiertas de
oxido de hierro que pueden separarse en un campo magnético.
A menudo se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter.
como fase sólida. Con estas fases sólidas relativamente grandes, puede ser
necesaria la agitación de la mezcla de reacción para acortar el tiempo necesario para que tenga lugar la reacción inmune. El fenómeno prozonal o efecto de gancho, se debe a una elevada concentración de analito, y es probable
que se observe en un inmunoensayo de un solo paso cuando se emplean
cantidades limitadas de anticuerpo en fase sólida, o cuando se usan anti-
Las partículas que se emplean en los ensayos de aglutinación de partículas se enumeran en la Tabla 35-2 El fenómeno de la aglutinación de partículas (aglutinación directa) causado por una reacción inmune, se observó por
primera vez en un ensayo para detectar la presencia de antigeno tras la incubación con el suero de un paciente infectado. La aglutinación de eritrocitos
tras la incubación con el suero dio lugar al descubrimiento de los grupos sanguíneos ABO. Los inmunoensayos de partícula se basan en el principio de
aglutinación y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a
una partícula inerte, en lugar de la precipitación directa de un complejo antigeno-anticuerpo. Como sonda, la partícula puede aumentar significativamente la sensibilidad del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinación
resultante se detecta a simple vista o mediante instrumentos espectrofotométricos para su cuantificación.
Los entreoíos, partículas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos
de partículas de látex, incluyendo el látex modificado con óxido de nierro o tintes, funcionan como fases sólidas útiles en estos ensayos. El diámetro de las
partículas empleadas en reacciones de aglutinación varía entre 7 pm y 0,01 pm.
No existe una única teoría que explique las reacciones de aglutinación
(Kasahara, 1992a) debido a la gran variedad de lamaño de las partículas empleadas. Para partículas mayores de 3 pm a 5 pm de diámetro, no se observa a
temperatura ambiente el movimiento browniano de partículas dispersas actuando de acuerdo con el coeficiente de difusión. Sin embargo, la teoría de la energía potencial de la interacción entre partículas, o la teoria de la reacción de coagulación de coloides, se pueden aplicar a partículas pequeñas como pueden ser
las micropartículas de látex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es unas
750 veces más eficiente en una reacción de aglutinación que una molécula bivalente de IgG. La distancia entre partículas en una floculación debe ser menor o
igual a 120 Adebido a la longitud de la molécula de anticuerpo. En resumen, los
factores importantes a tener en cuenta en una inmunorreacción de fase sólida
son las propiedades de la superficie de las partículas, como su carga e hidrofobicídad, y la estabilidad de la dispersión.
INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMÉTRICOS
Origen y principios de la reacción de precipitina
El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se
combinan con anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utilizado ampliamente en la identificación y cuantificación de las reacciones de precipitina. La aplicación de las técnicas de precipitina posee las ventajas de la
sensibilidad, especificidad y sencillez. La limitación que supone la sensibilidao
de estos ensayos requiere de una importante consideración. Incluso en las
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
825
Tabla 35-2 Partículas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinación de partículas
Método de ensayo
Eritrocitos humanos
humana (VIH)
Eritrocitos de ave
Mezcla de eritrocitos animales
(HBV)
Látex
Látex (color)
Microcápsulas
Parliculas de gelatina
Parliculas pohpeptídicas
Partículas de silicato
Partículas de oro
Soles de metal
Suministro
Hemaglutinación directa (Landsteiner)
I lemaglutinación eritrocito-anticuerpo:
Grupo sanguíneo ABO
Anticuerpo para el virus de la
placa de microtiter/portaobietos
Hemaglutinación directa
Hemaglutinación pasiva: placa de microtitor
Hemaglutinación pasiva indirecta: placa de microtiter
Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano
Anticuerpos de T allldum
Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I
Aglutinación pasiva indirecta: portaobjetos
Aglutinación pasiva indirecta: turbidimetría
Aglutinación pasiva indirecta
Inmunocromatografía
Aglutinación pasiva: placa de microtiter
Aglutinación pasiva: placa de microtiter
Aglutinación pasiva indirecta: cámara CCD
Aglutinación pasiva e indirecta
Aglutinación pasiva: placa de microtiter/cámara CCD
Fotometria mejorada con aglutinación indirecta
Aglutinación indirecta
Gonadotropma coriónica
Ferriti na
Gonadotropma coriónica humana (hCG)
Anticuerpo para T pallidum
Anticuerpos para HIV. T. pallidum
Hemoglobina humana (hHb)
Anticuerpo para T pallidum, y para HBs
Anticuerpo para T pallidum
Estrògeno total
hCG. hHb
De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu
Technology lor the 1990s Washington DC American Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso
mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas técnicas de difusión de luz. el límite inferior de sensibilidad de ensayos de inmunoprecipitina se mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sensibilidad es suficiente para la cuantificación de las principales proteínas séricas. La reacción de precipitma forma la base de muchas técnicas inmunoquimicas cuantitativas y cualitativas que se emplean en los laboratorios clínicos
(Kabat. 1961).
Los factores que afectan a la reacción de precipitina fueron investigados
detalladamente por Heidelberg en 1935, quien encontró que las proporciones relativas entre reactivos, condiciones de temperatura, pH y fuerza iónica
del medio, y las características de avidez y afinidad del anticuerpo, son todas
de igual importancia para la formación del precipitado inmune. En cuanto al
patrón de formación de precipitma cabe notar que existe un punto en que la
precipitación es máxima u óptima, denominado punto de equivalencia. La
adición continuada de antígeno una vez que se ha alcanzado el punto de
equivalencia produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apropiado para la determinación de analitos debería de llegar hasta la zona de
equivalencia. La optimización de la concentración del anticuerpo que se va a
emplear como reactivo es necesaria, al igual que la optimización de las soluciones tamponadas. Los métodos de precipitación más típicos son los
siguientes:
Métodos cualitativos del ensayo de precipitación
Inmunodifusión sencilla (Williams. 1970)
Inmunodifusión doble (Garvey, 1977)
Inmunodifusión doble en dos dimensiones (Williams, 1970)
Reacción de electroinmunodifusión (Ritzmann, 1975)
Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)
Métodos semicuantitativos del ensayo de precipitación
Inmunodifusión radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965)
Electroinmunodifusión en una sola dimensión (Axelsen. 1975) (electroforesis 'cohete")
Inmunoensayos
nefelométricos
Se han desarrollado vanas técnicas de análisis por inmunoprecipitina que
emplean sistemas de dispersión de la luz (Ritchie. 1978). La formación de los
complejos inmunológicos se ha asociado a la cantidad de dispersión de luz y
se ha empleado como la base para la cuantificaoón del antígeno Se han
diseñado instrumentos sofisticados que rápidamente miden la dispersión de
la luz. Las medidas de dispersión de la luz generalmente se denominan turbidimetrias o nefelometrías.
id Biosensor
INMUNOENSAYOS DE PARTÍCULAS
Principio de aglutinación de partículas
La reacción de aglutinación se puede emplear para detectar anticuerpos
presentes en individuos que han sido sensibilizados con antigenos específicos (aglutinación directa o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinación inversa
emplea un anticuerpo específico que se emplea para detectar antígenos
solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un dominio de unión a haptenos
(para drogas, hormonas o partículas pequeñas) no forma una estructura
entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice en una
fase sólida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuando se emplea una partícula o un transportador inmovilizado con un hapteno
como reactivos, puede darse una inhibición de la reacción de aglutinación
que permite la detección del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de
competitividad, en el que la aglutinación de partículas de hapteno con una
cantidad limitada de anticuerpo, libre o unido a partículas, se inhibe debido a
la presencia de hapteno libre presente en la muestra. Además, partículas
marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados a una fase sólida de la
membrana. Este tipo de ensayo ha sido muy popular como un método sencillo para la detección cualitativa de gonadotropma coriónica humana (hCG)
y otros analitos.
Hemaglutinación
Las pruebas de hemaglutinación (Boyden, 1951) son sencillas en su realización y no requieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los
países desarrollados como los que se encuentran en vías de desarrollo, han
adoptado una variedad de ensayos de hemaglutinación. Una de las pruebas
de hemaglutinación más extendidas es la que se emplea para la detección de
anticuerpos contra Treponema pallidum. comercializado como Serodia-TP por
Fujirebio, Inc (Tokio. Japón). En Estados Unidos, el ensayo de hemaglutinación para Treponema pallidum se aprobó en 1981 por el Center for Disease
Control (CDC). También fue recomendado por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuanto a su especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b).
En el ensayo de aglutinación de Treponema pallidum. el reactivo consiste
en eritrocitos sensibilizados y desensibihzados de oveja, y una solución diluyeme del suero para la reconstitución de células sensibilizadas liofilizadas
como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos y semicuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dilución del suero,
empleando una placa de titer como recipiente de la reacción: empleando una
826
SECCIÓN V
В
A n t í g e n o o haptcno
conjugado en una p a r t í c u l a
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Anticuerpo en la muestra
Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinación pasiva de partículas para la detección de antígenos de múltiples epítopos [A) o de
anticuerpos (B). (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for 1990s.
Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.)
pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el poci- conjugan químicamente para que un anticuerpo reaccione específicamente
lio 1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los poci- con los epítopos de superficie del eritrocito, y el otro es específico para el antigeno diana o analito. El ensayo se aplica para la detección de anticuerpos
lios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de
frente a VIH, además de para la detección de varios antigenos. A diferencia
aglutinación resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos,
de otras formas de aglutinación convencionales, no requiere la separación de
que indican que la reacción inmune no ha tenido lugar, muestran partículas en
plasma o suero. Este ensayo es simple y ahorra tiempo, y además, presenta
floculación condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del
ventajas en cuanto a la seguridad, porque elimina la necesidad de la separapocilio. Por el otro lado, los patrones positivos indican que la reacción inmución del suero en el caso de muestras peligrosas positivas para VIH o HBV.
ne ha tenido lugar, y muestran un patrón de aglutinación de partículas extendido. Las partículas aglutinadas no se pueden sedimentar más para obtener
una condensación como en los patrones negativos, porque se pierde su forma Aglutinación de partículas de gelatina
global en la aglutinación. En las filas primera y segunda, se emplearon el
suero y las células no sensibilizadas (control negativo), respectivamente. Los
El desarrollo de una partícula especial de gelatina con una superficie muy
individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuos 3 a 8 muestran hidrofílica que es capaz de evitar la unión inespecífica de materiales presenresultados negativos o positivos, dependiendo de la dilución de la muestra. Se
tes en la muestra ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984).
obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una dilución de
La partícula se prepara por separación de fases y entrecruzamiento tridimen1:2.560 (filas 3 a 8).
sional a 40'C y pH óptimo. La partícula resultante se tija con formaldehído o
f
Existen tote de hemaglutinación para la detección de anticuerpos frente al
virus de la hepatitis В (HBV), hepatitis tipo С (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroideos y otras sus­
tancias. Ensayos de hemaglutinación inversa se emplean para la detección
del antígeno de superficie de HBV. la a-fetoproteína (AFP), hemoglobina
humana, etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinación es de aproximadamente 50 ng/ml para la detección de antígeno (analito). Kemp (1988)
desarrolló un nuevo ensayo de hemaglutinación que emplea un anticuerpo
monoclonal específico para el antígeno de superficie de los eritrocitos humanos. Este anticuerpo puede reconocer un epítopo común a diferentes tipos de
eritrocitos y a células anormales, como las que se encuentran en casos de
anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los eritrocitos de
las muestras se emplean como partículas de fase sólida, y la aglutinación
resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se
glutaraldehido, y su diámetro es de unas 3 um. Las propiedades físicas de las
partículas de gelatina en comparación con las de los eritrocitos se muestran
en la Figura 35-8. Una partícula de gelatina carece de antigenicidad y está,
por tanto, libre de los problemas asociados con el empleo de anticuerpos
heterofílicos cuando se emplean eritrocitos como partículas. Este tipo de partícula artificial requiere una menor dilución del suero para evitar las uniones
inespecificas y garantiza una detección más sensible que en el caso de los
glóbulos rojos. Otras partículas sintéticas (Hirayama, 1991) compuestas de
ácido L-glutámico y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama
(1991) como alternativa a las partículas de gelatina. Estas partículas sintéticas se pueden teñir de cualquier color porque las partículas son incoloras, al
igual que las de gelatina. El ensayo de aglutinación de partículas de gelatina
se empleó inicialmente para la detección de anticuerpos frente al virus linfotrópico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubrió inicialmente como un
CAPÍTULO 35
•
827
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Menos agregados
y de menor tamaño
Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibición de partículas para la detección de antígenos con un solo epitopo (haptenos), empleando partículas de antigeno con anticuerpos libres (A) o fijados (8). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA |eds): Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
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SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. pallidum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos semicuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington. DC. American Society for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)
retrovirus humano. Este ensayo de aglutinación (Ikeda, 1984) rápidamente se
hizo muy popular para la detección de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sensibilidad y especificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control muy
estricto de la temperatura. La aglutinación de partículas de gelatina puede
sustituir cualquier ensayo basado en la hemaglulmación, con la excepción de
ensayos que emplean los eritrocitos de la muestra como partículas.
Aglutinación con látex
La aglutinación con látex (Galvin. 1984). utilizando partículas de látex,
se ha utilizado para la detección de vanos analitos. como la hCG para las
pruebas de embarazo, y la detección cuantitativa de otras proteínas plasmáticas con o sin instrumentación. El procedimiento de este ensayo cualitativo es sencillo. Por ejemplo, es posible que uno solo tenga que mezclar
unas gotas del látex sensibilizado con el reactivo y la muestra empleando
un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos más larde, se puede
detectar a simple vista la aglutinación de fase invertida, como resultado de
la inmunoreacción. La aglutinación con látex se adaptó para ensayos cuantitativos empleando métodos de detección lumínica basados en la turbidimetria (absorción de la luz) o nefelometría (dispersión de la luz). Con eslas
técnicas, la aglutinación de látex adquiere una mayor sensibilidad de subnanogramos por mililitro, mientras que la sensibilidad del ensayo midiendo
la precipitación intacta del complejo antígeno-anticuerpo es menor de 0.5
ug'ml.
Ensayo de turbidimetha con látex
La absorción de luz (pérdida de luz mediante su dispersion en la superficie
de una partícula) es proporcional al diámetro de la partícula y depende de la
longitud de onda empleada. La mayoría de los reactivos de látex disponibles
de forma comercial con un diámetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores
químicos automáticos empleando principios de medida fotométncos. Para
mejorar todavía más la sensibilidad, se trató de mejorar los reactivos y la instrumentación, así como optimizar el tamaño de la partícula, seleccionar la
longitud de onda apropiada, y mejorar el software del sistema informático que
integra los datos. Ahora existen sistemas automatizados que emplean partículas de látex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora con una sensibilidad de subnanogramos por mililitro.
Inmunoensayo por contaje de partículas
El inmunoensayo por cómputo de partículas (PACÍA: paríde-counting
immunoassay) (Masson. 1986) emplea el contaje celular óptico para obtener
el descenso en partículas libres después de la inmunoreacción. En el formato PACÍA, se puede medir tanto el ritmo del ensayo, es decir, el ritmo en el
que decrece el número de partículas libres, o el valor final cuando ha finalizado la reacción. La medida del ensayo al final de la reacción puede emplearse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por mililitro; sin
embargo, se requiere un mayor tiempo de incubación.
Inmunoensayos con otras partículas
Se han desarrollado inmunoensayos de dispersión cuasi-elástica empleando la medida del cambio en la respuesta a la distribución del tamaño de la partícula (Yarmush. 1987). Esla técnica utiliza un haz de láser para medir la reducción en la media del coeficiente de difusión de las partículas como resultado
de la reacción inmune. Otros métodos miden la variación de anisotropía angular de la luz dispersada con el incremento del tamaño medio de la partícula.
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Figura 35-6. Patrones de hemaglutinación para detectar anticuerpos anti-I pallidum (A) e interpretación como positivo o negativo a la dilución linal del suero (6). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s.
Washington, DC. American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.]
Glóbulos rojos
del dolíanle
Reactivos
bivalentes
Unión pero
un aglutinación
Figura 35-7. Representación esquemática de un ensayo basado en la aglutinación autóloga de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes
en la muestra como partículas. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for
the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
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SECCIÓN V
Panículas ,ic y c i i i i i i K i
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
inirocitosdco\cia
Las partículas con diámetros parecidos a la longitud de onda consiguen una
variación angular de la dispersión de la luz dependiente del tamaño.
Figura 35-8. Microgratía electrónica (x25.000) y propiedades
tísicas de las partículas de gelatina en comparación con los
eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz
GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology
lor the 1990s. Washington. DC. American Society (or Microbiology. ASM Press. 1992. pág. 139, con permiso. |
se ha descrito en el apartado Cinética de la reacción de antigeno-anticuerpo, de la siguiente ecuación.
Resumen
La hemaglutinación indirecta y la aglutinación de partículas de gelatina son
ensayos que, realizados en placas de microtiter, han sido muy populares en
procesos de determinación cuantitativa y cualitativa de diversos analitos.
Estos ensayos no requieren instrumentos adicionales ni un control estricto de
la temperatura. Lo más importante es que estos ensayos garantizan una sensibilidad igual o mayor que la del inmunoensayo enzimático convencional en
lo que se reliere a la detección de anticuerpos frente a agentes infecciosos.
El látex como fase sólida proporciona unas importantes ventajas cinéticas,
como un menor tiempo de ¡nmunorreacción. Por este motivo, ha sido posible
adaptar el látex para su uso en instrumentos sofisticados, aplicando principios
diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad de unos 3
órdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitación convencionales. El látex es susceptible de presentar interferencias de factores
desconocidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado
varios absorbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubación. La
gran ventaja del inmunoensayo de partículas es su simplicidad, ya que no
requiere la separación de los reactivos libres de los unidos.
B/F = K([Ab].-B)
a
el eje Y es la relación B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libre
[Abj de [Ab],-B, igual al antígeno libre [Ag). Así. la K, representa la pendiente
de la representación. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10
L'M para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiactivas, como los rayos gamma del l, se pueden medir en términos de cuentas
por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioisótopos más frecuentes y sus propiedades se muestran en la Tabla 35-3. La elección de la sonda afecta considerablemente al protocolo del ensayo. Por ejemplo, una de las sondas más utilizadas, el l , necesita un tiempo relativamente corto para el conteo. pero no puede almacenarse mucho tiempo debido a
que tiene una vida media corta. Sin embargo, el tritio ( H) requiere un tiempo
mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duración del ensayo. La mayo9
;:
Ia
1
RADIOINMUNOENSAYO
Origen
Desde que apareció la técnica del RÍA. el uso de radioisótopos como
sonda, que se desarrolló en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha
mejorado de una forma espectacular en cuanto a sensibilidad y precisión. Se
han introducido diversas variaciones del método en el laboratorio clínico. Hay
dos tipos principales de RIAs, competitivos y no-competitivos, que requieren
pasos de lavado para separar la sonda unida de la que permanece libre (conjugados). El ensayo competitivo sigue la ley de acción de masas, que especifica la reacción entre analitos y proteínas de unión, receptores y anticuerpo. El tactor clave en la optimización del ensayo es la afinidad de unión del
anticuerpo. La representación de Scatchard de la relación entre anticuerpo
unido y libre, frente a la concentración del analito, se emplea frecuentemente para evaluar la función del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la representación de Scatchard para la determinación de la ciclosponna. Tal y como
Ciclosponna (pg/ml)
Figura 35-9. Representación de Scatchard de las características de unión de anticuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M).
a
9
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Tabla 35-3 Propiedades de los radioisótopos empleados como
sonda en los radioinmunoensayos
Actividad especifica
l25
da de los RÍA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjugación y mantener la actividad biológica de los reactivos. Un método muy utilizado de conjugación de proteínas con l es el método de la cloramma-T (Hunter.
1962). La lirosina. en particular, posee una mayor reactividad con el yodato
debido a la presencia de un grupo hidroxi en la posición para del anillo aromático. La señal puede medirse en términos de CPM como emisiones de
radiación gamma. A diferencia de las enzimas, el empleo de isótopos como
sonda, con un radio de Stokes pequeño, no suele afectar a la actividad antigénica, debido a la falta de alteraciones alostéricas cuando se conjugan isótopos con antígenos pequeños (haptenos).
l?5
Principios y métodos del ensayo
Se han desarrollado varios métodos (exceso de antigeno) basados en la
unión competitiva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antígenos con y sin sonda
(analitos presentes en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un
método competitivo convencional se muestra en la Figura 35-10. En un principio, una cantidad conocida de antigeno acoplado a una sonda y el antígeno de
la muestra se mezclan y reaccionan con una cantidad constante de anticuerpo
unido a una fase sólida, como puede ser partículas de sefarosa o la cara interna de tubos de plástico. Después de que la reacción inmune alcance el equilibrio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que no han reaccionado y
se separan los antígenos del complejo inmunológico que permanece atrapado
en la fase sólida. El paso de lavado aparece como separación B/F {bound:
unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representación
del porcentaje de antigeno unido frente a la concentración logarítmica del analito produce la curva estándar que muestra la Figura 35-10. La representación
de CPM sobre la curva estándar nos da la concentración del analito.
Otro método que emplea anticuerpos se muestra en la Figura 35-11. El primer anticuerpo es específico para un determinado antígeno (analito) y reaccio-
831
na competitivamente tanto con el conjugado como con el antigeno. Entonces,
el complejo inmunológico es capturado por un segundo anticuerpo específico
para el primer anticuerpo, asociado a una fase sólida. Cuando el segundo anticuerpo se asocia a una fase sólida fina, el complejo inmunológico de la segunda reacción puede separarse como un precipitado, del resto de las moléculas
que no han reaccionado. Para la determinación de un anticuerpo, el anticuerpo
unido a una sonda y el anticuerpo de la muestra reaccionan competitivamente
con el antígeno (analito) fijado a la fase sólida. Cuanto mayor sea la pendiente
de la curva estándar, más precisos son los datos que aporta. Los métodos competitivos requieren cantidades menores de anticuerpo o antígeno (analito) que
los ensayos de tipo sandwich descritos más adelante. Los ensayos no competitivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado mayor popularidad en los últimos tiempos.
Los ensayos radioinmunométricos (IRMA) o ensayos de sandwich (Fig. 35-12),
tienen una relación alternativa entre el analito y el anticuerpo. El ensayo competitivo clásico consigue una respuesta inmunológica con una mínima cantidad de
anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran cantidad de anticuerpo en
la fase sólida. La tecnología de los anticuerpos monoclonales ha hecho posible la
elaboración de grandes cantidades de anticuerpos específicos a un coste
moderado, permitiendo la explotación del ensayo de sandwich. El ensayo de
sandwich emplea un exceso estequiométrico de anticuerpo y es más sensible
que un ensayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sensibilidad teórica última del ensayo de sandwich es de una molécula de analito,
lo cual es posible cuando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se
acerca al infinito. Como se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase
sólida primero se une al antígeno (analito) de la muestra. Después de la separación B'F, el conjugado reacciona con el antígeno (analito) fijado a la fase sólida, y la señal se puede medir después de la eliminación de los conjugados
libres mediante un paso de lavado. Este ensayo requiere antígenos con más
de dos determinantes antigénicos. Cuando se emplean dos anticuerpos diferentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase sólida específico para un
determinante antigéníco, y un anticuerpo conjugado específico para otro determinante antigénico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el
sandwich en un solo paso. Así, la fase sólida puede mezclarse con el antígeno de la muestra y con el conjugado simultáneamente. No se produce interferencia porque ambos anticuerpos, tanto el de la fase sólida como el conjugado, son capaces de reconocer distintos determinantes antigénicos. En este
ensayo la señal generada es proporcional a la concentración del analito presente en la muestra, al igual que en el ensayo de sandwich en dos pasos.
Este método de ensayo se puede aplicar a la detección de anticuerpos con
un formato de ensayo que emplea antígeno en la fase sólida y antígeno aco-
832
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
->Conccnir;icit>ii de analto
Figura 35-11. Principio de un ensayo de RÍA competitivo empleando un segundo anticuerpo para la separación B'F (unido/libre).
piado a una sonda. Para un formato en dos pasos, se puede emplear el antígeno en la fase sólida y un anticuerpo específico para el anticuerpo diana
acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich, la sensibilidad del
ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar IRMA para la
determinación de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel de sensibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparación con
unas 0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antígeno asociado a una sonda.
Resumen
Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos por
varios motivos: 1) precisión y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjugación del isótopo, 3) detección de la señal sin optimización y 4) estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del
RÍA son la corta vida en almacén de los reactivos y la necesidad de protección frente a la radiactividad nociva. Además, como se discute más adelante,
Figura 35-12. Principio de un ensayo de RÍA de tipo sandwich empleando la fase sólida, también conocido como ensayo inmunorradiométrico (IRMA).
CAPÍTULO 35
Tabla 35-4
•
833
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Comparación del radioinmunoensayo. el ¡nmunoensayo enzimàtico heterogéneo y el inmunoensayo enzimàtico homogéneo
Ensayo
Pasos de la reacción
enzimàtica
Pasos de la reacción inmune
Pasos para la detección
de la señal
Radioinmunoensayo
Muestra*
Analito o Ab
marcado
Inmunoensayo enzimàtico
heterogéneo
Muestra+
Analito o Ab -Enzima
marcado
Inmunoensayo enzimatico
homogéneo
Muestra*
Analito o Ab
—Enzima o coladores
marcado
Reacción inmune con pasos de
lavado para la separación
No necesarios
Emisión radiactiva (rayos y)
Reacción inmune con pasos de
lavado para la separación
Reacción enzimàtica con
reactivos adiciónalos
Densidad óptica
Fluorescencia
Luminiscencia
La reacción inmune y/o sistèmica
se desarrolla en una sola solución,
que incluye el reactivo para el
revelado de la serial enzimàtica
La reacción inmune y/o
sistémica se desarrolla en
una única solución que
incluye el reactivo para el
revelado de la señal
enzimática
Densidad óptica
Fluorescencia
Luminiscencia
los RÍA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogéneos, debido a que las
señales de los isótopos no pueden modular las reacciones antígeno-anticuerpo.
INMUNOENSAYO ENZIMÀTICO
Origen y clasificación
Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se
desarrollaron como una alternativa a los radioisótopos (Engvall. 1971: Van
Weeman. 1971; Avrameas. 1971). Los más utilizados son el ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), el
EIA y la técnica del inmunoensayo de multiplicación enzimática (EMIT: enzyme-multiplied immunoassay technique), que es una marca registrada de
SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Esencialmente, los EIA heterogéneos son similares a los RÍA, excepto que emplean enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogéneos, eliminando los pasos de lavado para la separación B/F que de otro
modo son necesarios. La Tabla 35-4 compara las características de los EIA
homo y heterogéneos con los RÍA. Mejoras en los EIA han aportado muchos
formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplicidad y precisión. Las ventajas y desventajas de los EIA se listan en la Tabla
35-5 (Nakamura, 1992).
Inmunoensayos enzimáticos heterogéneos
El principio de los ensayos de EIA heterogéneos es similar al de los RÍA.
excepto que es la actividad enzimática, no la radiactividad, la que se mide.
Los EIA requieren un proceso secundario para obtener señales mediante la
reacción catalítica de las enzimas. Como fase sólida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microliter, partículas
de plástico, tubos de plástico, partículas magnéticas y látex con filtros, entre
otros. El uso de pequeñas partículas magnéticas y de látex permite acortar el
tiempo de mmunorreacción, reduciendo asi el tiempo total que requiere el
ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introducción de sustratos colorimétricos y fluorométncos, y más
tarde de suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la
señal. Algunas de las enzimas más utilizadas en vanos EIA heterogéneos son
la peroxidasa de rábano, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa
oxidasa. la ureasa y la catalasa. Las enzimas más utilizadas junto con sus
características aparecen en la Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando
se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzi-
ma y por la selección de la medida de la señal, entre los que la quimioluminiscencia es el método más sensible.
El lormato del ensayo de los EIA heterogéneos, al igual que los RÍA. se
puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (véase Fig. 35-14).
Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigenoenzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de
reactivo) incluyen los ensayos inmunométricos de sandwich de dos dianas y
los ensayos indirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos
inmunométricos de sandwich han aumentado su popularidad para la determinación de antigenos como hormonas, marcadores tumorales. proteínas plasmáticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para la medida de anticuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la detección de anticuerpos frente a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y autoanticuerpos
Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo
enzimático
A. Ventajas
t Se pueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de
amplificación de las enzimas.
2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una
larga vida de almacenaje
3. Se pueden desarrollar múltiples ensayos simultáneamente.
4 Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones
del ensayo
5. El equipamiento no es necesariamente caro y está
ampliamente disponible.
6 No existen riesgos radiactivos durante el mareaje ni el
desecho de los residuos.
B. Desventajas
1. La medida de la actividad enzimática puede ser más compleja
que la medida de la actividad de algunos tipos de
radioisótopos
2. La actividad enzimática se puede ver afectada por algunos
componentes del plasma
3. Los ensayos homogéneos, actualmente, poseen una
sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los
radiommunoensayos.
4. Los EIA homogéneos para moléculas proteicas grandes se
han desarrollado, pero requieren reaclivos inmunoquímicos
compiojos
J
EIA = inmunoensayo enzimático
De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immunoassays En
Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and
Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor
Microbiology. 199?. pags 149-167, con permiso
834
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 35-6 Características de las enzimas típicas empleadas como sonda en los inmunoensayos enzimáticos
Características
Peroxidasa (EC 1.11.1.7)
Enzima f5-galactosidasa
(EC 3.2.1.23)
Fuente
Tamaño molecular (daltons)
Actividad específica
Tasa de renovación"
Medida de la enzima
Rábano
ca. 40.000
250 U/mg
10 000
Colorimetria, fluorimetria.
luminometria
Luminometría
Oxidación del periodato
(método de Nakane)
E. coli
ca. 530.000
600 U/mg
318000
Colorimetria, fluorimetria,
luminometría
Fluorimetria
Método de la dimaleimida, reactivo
de entrecruzamiento'
Medida de alta sensibilidad
Método de mareaje de la enzima
Fosfatasa alcalina
(EC 3.1.3.1)
Intestino bovino
140 000
1.000 U/mg
250 000
Colorimetria, fluorimetria,
luminomelria
Luminometria
Método del glutaraldohído,
reactivo de enlrecruzamiento
' Número de moléculas del sustrato producidas por una molécula de enzima en una reacción de un minuto; número de moléculas/MUÍ
El reactivo contiene grupos químicamente reactivos como el maleimida y el succinimida.
1
¿
>
Un EIA heterogéneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos:
1. La fase sólida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo.
2. Después de la adición del conjugado y la incubación, hay unos pasos de
lavado con una solución tamponada que contiene un detergente, uno o
dos pasos después de la inmunorreacción. La reacción inmunológica debe
alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.
3. La fase sólida, con el complejo inmune que contiene el antígeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con
la solución de sustrato enzimático.
4. La reacción enzimática se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas)
y el producto de la reacción se mide con varios detectores dependiendo
del sustrato empleado.
Ensayo
enzimático
colorimétrico
En este ensayo, la reacción enzimática se realiza utilizando sustratos cromogénicos para desarrollar un color mediante la reacción catalítica principal. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar
un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato
para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos más utilizados en
los inmunoensayos enzimáticos colorimétricos. Un espectrofotómetro se utiliza para medir la densidad óptima del cromógeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad óptica en tubos
o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresión de los
resultados, hasta instrumentos manuales más sencillos. Cuando la reacción
EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (método de transferencia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes
insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina
que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El
precipitado de color que se acumula en la fase sólida por la acción de la
enzima puede detectarse a simple vista. Teóricamente, la medida de la densidad óptima está limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinación de la densidad óptica de analitos que requieren un amplio rango puede
resultar problemática, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado
y fase sólida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo
sandwich.
2
2
Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los
inmunoensayos no isotópicos, han sacado a la luz diversas desventajas de
los RIAs, como son los residuos radiactivos, radiólisis de los analitos marcados, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarrolló un EIA ultrasensible que puede detectar 3 fmoles de una IgG específica. Para alcanzar este
nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, como la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase sólida a otra distinta para reducir las señales de fondo.
l25
Inmunoensayo
L-
ENSAYO de anticuerpo
Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimático (EIA) empleando la fase
sólida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.
enzimático
fluorescente
Los EIA fluorescentes son idénticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluoróforo se genera por la
reacción enzimática. Después de la excitación del fluoróforo a su longitud de
onda de excitación óptima, se emite luz a una longitud de onda característica.
Instrumentos como un fluorímetro requieren una fuente de suministro de la luz
de excitación y un fotomultiplicador como detector de la emisión de flúores-
CAPÍTULO
AMI'I'I)
35
AMIM)
835
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Interim diario ( I
ESTADIO SI
Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la detección de la fosfatasa alcalina (ALP).
La eliminación hidrolítica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrónico iniciada químicamente (CIEFL:
chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposición del AMPPD mediante la liberación de dioxetano fenolato (AMPD) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formación del intermediario de transferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del peróxido cíclico. Tiene lugar una liberación de energía con emisión de luz.
cencía. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en
la muestra. Estas sustancias aumentarían la señal de fondo, lo cual puede
interferir en la sensibilidad del ensayo. Así. se debe prestar atención a la elección de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los
EIA colorimétricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de
señal que es al menos de un orden de magnitud mayor.
intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically ¡nitiated
electrón exchange luminiscence). mediante la liberación del grupo dioxetano
rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda máxima de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la concentración de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de
10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991).
El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se
usa como sonda enzimática. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partículas férricas de 0.3 pm de diámetro como tase sólida
para acortar el tiempo de mmunorreacción a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsorcíon. La relación entre la señal
quimioluminiscente y la concentración de analitos es lineal hasta unos siete
órdenes de rango dinámico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era
10 veces mayor que la de un RÍA convencional cuando se ensayó la AFP; se
detectó un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos.
Así. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre los RÍA en términos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza
del proceso y están ganando en popularidad en el mercado.
2
Inmunoensayo
enzimático
quimioluminiscente
Los inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean
sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se
emplean como sonda La reacción enzimática quimioluminiscente genera luz.
similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la
luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los últimos 20 años, se ha prestado mucha atención a la aplicación de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan
enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol
con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos muy sensibles. Estos ensayos son
efectivos como herramientas en el diagnóstico práctico. La reacción de oxidación enzimática de análogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho
en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un método frecuente que
se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe
(1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la
sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y
compuestos aromáticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol
como potenciador consigue un incremento de la emisión de luz de unas 2.800
veces en una mezcla de reacción optimizada. Este ensayo puede detectar la
TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reacciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por múltiples factores que causan un aumento de las señales inespecíficas de fondo
(ruido).
Bronstein (1989a) desarrolló un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo
sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de
adamantilo. No requiere moléculas adicionales para la emisión de luz quimioluminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos
externos a las moléculas de luminol. AMPPD es una molécula nueva que
constituye un sustrato completo porque está compuesta por un grupo adamantilo como estabilizador de toda la molécula, la unión de dioxetano como
fuente de energía, el éster de fosfonlo como diana de escisión para la enzima, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola
molécula. La estructura de la molécula y el proceso de reacción para la generación de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisión del enlace fosfoestérico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por
Inmunoensayos enzimáticos homogéneos
Origen
Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es
diseñar instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogéneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no
requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA heterogéneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los EIA
homogéneos porque la actividad enzimática se puede modular fácilmente
cambiando los factores presentes en el microambiente de la reacción Ag-Ab.
Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioisótopo como
señal. Actualmente, los EIA homogéneos son menos sensibles que sus equivalentes heterogéneos. Los EIA heterogéneos convencionales tienen una
sensibilidad equivalente a la de los RÍA en muchas aplicaciones, mientras que
los EIA homogéneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o
dos órdenes de magnitud inferior. Los EIA homogéneos pueden necesitar
reactivos inmunoquímicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rápidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. Hay
varios tipos de EIA homogéneos En cada uno de estos ensayos, la interacción antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulación de la actividad
enzimática refleja el grado de reacción inmunoquímica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de las características de los EIA homogéneos típicos. Los EIA
homogéneos se pueden clasificar en ensayos de unión competitivos o no
836
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Tabla 35-7 Clasificación y características de un inmunoensayo enzimàtico homogéneo típico
Nombre y tipo de ensayo
Competitivo'
EMIT
SLFIA
ARIS
Inmunoensayo de canalización enzimàtica
Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina
CEDÍA
No competitivo'
Inmunoensayo de anticuerpo híbrido
s
Conjugado
Antigeno con hsozima. G6PD
Antigeno con sustrato
Aniígeno con grupo prostético
Antigeno con G6PD y hexocinasa
Antigeno con avidina
Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa
Tipo de modulación
Inhibición alosténca
Inhibición alosténca
Inhibición alosténca
Facilitación mediante proximidad
Inhibición alostérica
Inhibición aloslérica
Anticuerpos híbridos específicos para el
Inhibición alostérica
antígeno y el inhibidor
Inmunoensayo de unión proximal
Anticuerpo con G6PD y hexocinasa
Cascada de suslratos por proximidad
Anticuerpo con amilasa
Inhibición alostérica
EIHIA
Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo
Electo de cargas
Inmunoensayo enzimàtico mejorado
frente al succinil
Anticuerpo con peroxidasa
Estabilización
AEST
• La negrita indica que el nombre de la enzima está escrito y la enzima descrita en detalle en el texto
G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the
1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.
competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos
sin embargo, la unión de anticuerpos específicos para haptenos a su ligando
acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibición de la actividad enzimática. Los haptenos libres presentes
matos de ensayo, el antígeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un
en la muestra o en el estándar liberan esta inhibición compitiendo por la unión
grupo prostético de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unión no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimática es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una
ción de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima
enzima. De entre los distintos tipos de métodos mencionados, se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activicial atención a cinco EIA homogéneos.
dad enzimática (Rowley, 1975). La excepción al mecanismo de inhibición es
el ensayo EMIT para la tíroxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En
este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enziInmunoensayo de multiplicación enzimática
máticamente, pero pasa a una conformación activa cuando se une al anticuerpo
anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe
EMIT, el primer EIA homogéneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972).
la enzima mediante su unión al dominio catalítico, aumentando asi la K„ "apaEl sistema de EMIT está esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la
rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del
conjugación de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimática;
Forma inactiva del
compi ej o enzimàtico
Enzima
Forma activa del con jugado
enzima-analito
Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicación enzimática (EMIT) La actividad de una enzima que actúa como
sonda está inhibida por la unión del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno.
Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimática es proporcional a la concentración de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for
the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
CAPÍTULO 35
•
837
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUÍMICA
Haz de
excitación
Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El
sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona con
un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisión del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentración del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De Nakamura RM. Kasahara Y.
Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology
ASM Press, 1992. con permiso.)
dominio catalítico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las más útiles porque tienen
menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos
ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por
litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad
muy inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.
Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado
El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un
sustrato fluorogénico característico, el umbeliferil (i-galactósido, unido a un
antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la acción de
la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede
actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite
con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunología) (Fig. 35-16). La concentración del antigeno en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se
puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y también para proteínas como la IgG y la IgM. Una desventaja de este método es que no se utilizan las propiedades de amplificación de la enzima, y por tanto, el sistema de
ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentración molar de
analito de 10"' a 10 .
,c
Inmunoensayo de reactivación de la apoenzima
El inmunoensayo de reactivación de la apoenzima (ARIS) es un ensayo
homogéneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prostético, que
consiste en un dinucleótido de flavm adenína (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17,
el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-
piten por una cantidad limitada del anticuerpo específico. En el equilibrio, el nivel
de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente
en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero
no con la que está unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa
oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La
enzima activa se genera en este proceso, y además, se ha incluido un mecanismo de amplificación dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que
emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rápidamente a la medida de proteínas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985).
y para otros haptenos como la fenitoma o diversas hormonas.
Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática
El inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). desarrollado
por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un
sustrato insoluole. Este ensayo es el más apropiado para la determinación de
antígenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogéneo porque el complejo inmunológico del conjugado con un antígeno grande bloquea la reacción enzimática con el sustrato sólido (Fig. 35-18). La u-amilasa se ha utilizado como
sonda enzimática para la detección de ferritína y AFP. La reacción inmune del
analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su máximo en
unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unión no competitiva
requiere un tiempo de incubación menor para alcanzar un nivel de detección
sensible. Empleando este método, el rango de medida de la femtina en suero es
de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). También se ha aplicado el
EIHIA en un formato sobre película seca (Ashihara. 1991). La película seca consiste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para
la reacción inmunológica y enzimática. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa humana presente
838
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Forma activa
Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivación apoenzimática (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucleótido de tlavin adenina (FAD). La
apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD como cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentración de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimática generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and
Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)
en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la detección de la proteína C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental químico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada
para su aplicación en analitos como pueden ser los marcadores tumorales.
Inmunoensayo mediante clonación de donadores
de enzimas
El inmunoensayo mediante clonación de donadores de enzimas (CEDÍA:
cloned enzyme donor immunoassay) se consiguió por primera vez mediante la
aplicación de la tecnología de ADN recombinante a los inmunoensayos homogéneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de
sintetizar una proteína de p-galactosidasa dentro de un polipéptido de gran
tamaño (una enzima aceptora [EA]) y de un polipéptido pequeño (una enzima
donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrámeros con
actividad enzimática. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antígeno (analito)
está unido a la ED. y el anticuerpo específico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontáneo de la enzima activa. Los antígenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de
analito-ED por la unión al anticuerpo, modulando la cantidad de |í-galactosidasa activa que se forma. La señal generada por los sustratos de la enzima es
Forma activa
Forma inactiva
Figura 35-18. Inmunoensayo homogéneo de inhibición enzimática (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de
Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo específico para un antígeno de alto peso molecular. El antígeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado con el
antígeno especifico. La forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentración de antigeno es directamente proporcional a la actividad enzimática de la reacción del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press. 1992, con permiso.)
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
839
Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimáticos clonados (CEDÍA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrámero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociación del aceptor enzimático con el conjugado de antigeno-donador enzimático. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the
1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)
directamente proporcional a la concentración de analito presente en el suero
del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimétrico que no
requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es
apropiado para su uso en analizadores químicos automatizados.
Resumen
Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antígeno-anticuerpo,
incluyendo aquellos que implican a proteínas séricas, hormonas, drogas,
otros antígenos y anticuerpos dirigidos frente a patógenos. Los EIA heterogéneos que emplean sustratos cromogénicos pueden tener una sensibilidad
comparable a la de los RÍA, y han ganado en aceptación para su aplicación
en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogéneos emplean sustratos
sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeñas partículas
como fase sólida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos
de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los
RÍA. Además, la manipulación del ensayo se encuentra muy simplificada en
los instrumentos totalmente automatizados. En comparación con los EIA
heterogéneos, los EIA homogéneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a
sensibilidad, rango de aplicación y su aplicación en analitos de gran tamaño. Además, la elevada señal de fondo (ruido) y la relativamente baja señal
del ensayo son inevitables debido a la eliminación de los pasos de lavado
para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogéneos son
ventajosos porque están basados en un formato sencillo de ensayo y se
pueden adaptar a la instrumentación automática preexistente. En este
momento, los EIA heterogéneos con instrumentos totalmente automatizados, siguen siendo la mejor elección en cuanto a sensibilidad y simplicidad,
y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de
radioisótopos.
tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se
encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatomía patológica. Durante los últimos años, se han desarrollados muchos procedimientos
de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia
variedad de proteínas y polipéptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su
desarrollo, los FIAs analíticos se vieron dificultados por el descenso de la
sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras biológicas. Gradualmente, la sensibilidad de los métodos fluorimétricos fue
mejorando, y se hizo posible la detección de analitos a concentraciones de
10 M. También se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentación y la introducción de sustratos únicos con unas reacciones inmunoquímicas y enzimáticas más óptimas.
15
La selección del fluorocromo que se va a emplear como sonda es importante. La sonda debería ser estable y debería poseer un coeficiente de extinción molar y rendimiento cuántico elevados. También debería emitir en longitudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su
anticuerpo. Cuando se irradian la mayoría de los fluoróforos o moléculas fluorescentes con una longitud de onda apropiada, un electrón de la molécula
sulre una transición al estado excitado. A medida que el electrón vuelve a su
situación inicial, se libera energía física en forma de un fotón de menor energía (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de máxima emisión, característica de
un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas típicas, el isotiocianato de fluoresceína (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns
entre excitación y emisión, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio)
presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de
nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogéneos y
homogéneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase sólida o no sólida. Se discutirán los métodos más
empleados.
INMUNOENSAYO FLUORESCENTE
Inmunoensayo fluorescente heterogéneo
Origen y clasificación
Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes como sondas inmunoquímicas para detectar antigenos en secciones
Los protocolos de FIA heterogéneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este
ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimáticos heterogéneos y los
840
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
radioinmunoensayos. La mayoría de los ensayos comerciales disponibles
emplean un sistema con el antígeno unido a una lase sólida o un anticuerpo.
El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los
RIAylosEIA.
Método fluoroinmunométrico
El analito reacciona en solución con un exceso de anticuerpos marcados.
Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antígeno unido a
una tase sólida. La matriz de tase sólida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentración de analito. Este método es adaptable para el ensayo de haptenos y proteínas complejas. El FIA en
fase sólida se desarrolló para el análisis serológico de anticuerpos trente a la
rubéola, toxoplasmosis, antígenos víricos y anticuerpos antinucleares. Los
métodos de FIA heterogéneos para la determinación de antigeno se desarrollaron para proteínas séricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortisol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogéneos es
la reducción significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminación
física de los tactores de interferencia en el paso de separación.
Ensayo inmunofluorimétrico por partición radial
En los mmunoensayos por partición radial, se emplea una cromatografía
radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982).
El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos
analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).
de excitación de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en
solución emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarización de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada
que se transmite a través de la muestra puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unión al anticuerpo. Sin embargo, como
se muestra en la Figura 35-20. el movimiento térmico aleatorio da lugar a
que pequeñas moléculas que contienen un hapteno se muevan libremente
en la solución perdiendo su orientación polarizada. Cuando el antígeno
sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los
160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para
aumentar la señal polarizada.
Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en la polarización al mezclar antígeno y anticuerpo marcado, aunque la reacción inmune hubiese tenido lugar. Este método es el más útil para la medida de antigenos pequeños y haptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de
muchas drogas y fármacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL).
Desarrollaron un analizador de nueva generación, el IMx. para medir moléculas de gran tamaño molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antígenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988).
Combinaron dos principios en el ensayo, la polarización de la fluorescencia
y el inmunoensayo enzimálico con microparticulas (MEIA). La demanda de
capacidades de acceso directo impulsó a Abbott a desarrollar un analizador
de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clínicos (Smith, 1993).
Fluoroinmunoensayo en tiempo real
Esta metodología hace uso de una instrumentación especial y de sondas
fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el
uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con
un período de tiempo de unos 100 ns o más entre la excitación y la emisión.
Debido a que la mayoría de las sustancias responsables de la fluorescencia
de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de
fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento
especial que produce pulsos rápidos de luz que excitan al fluoróforo. La fluorescencia se mide un poco después de la excitación. Así, el efecto del fondo
inespecífico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluoróforos que presentan fluorescencia
retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los
siguientes:
1. Derivados pirénicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns.
2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento
muy largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario
(Sm ') y terbio (Tb ).
3
1
3
Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir
muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.
Inmunoensayo fluorescente homogéneo
Por definición, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogéneas.
No requieren la separación de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA
homogéneos también poseen la ventaja de ser rápidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogéneos, presentan ciertas desventajas. Los FIA homogéneos tienen una sensibilidad limitada de aproximadamente 10 molar con una instrumentación estándar. Pueden existir impurezas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos
requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros,
y una instrumentación especial para alcanzar una mayor sensibilidad.
10
Ensayo de polarización de la fluorescencia
Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un
solo plano. Cuando se observa desde un ángulo recto con respecto al haz
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia
de excitación
El método de transferencia de la fluorescencia de excitación (FETI)
(UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluoresceína como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor. El ¡sotiocianato de fluoresceína
(FITC) tiene un máximo de emisión de 525 nm y la tetraetilrodamma
posee un fuerte pico de absorción a 525 nm. Asi. cuando el antigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce un apagamiento (quenching) de la lluorescencía del FITC. Este fenómeno implica una transferencia de energía de una sonda electrónicamente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la
energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia
entre las moléculas donadora y aceptora. Para que se produzca una
reducción apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia
entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este método resulta útil para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan
con fluoresceína y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con
fluoresceína y rodamina reduce la intensidad de señal de la fluoresceína
ajustando la proporción y la cantidad de donador y aceptor para que puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energía.
Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han conseguido mejoras en el método FETI usando un
marcador fluorescente como el criptato trisbipiridínico de europio (III)
[Eu ] como donador y un fluoróforo como la aloficocianina como aceptor
(Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un
elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm
transfiere energía a través de una molécula aceptora a una excitación de
620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en
tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energía
mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal
quelante de criptatos y lo ha aplicado a la detección de AFP y del antígeno carcinoembriónico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox.
Francia) desarrolló un inmunoensayo homogéneo automatizado,
KRYPTOR. para la detección de marcadores tumorales como el CEA. CA
19-9. CA 125 y AFP empleando la emisión del criptato amplificada en
tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con
nueve minutos de incubación
3
CAPÍTULO 35
•
841
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Baja p o l a r i z a c i ó n
Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlígeno, el conjugado marcado con una
molécula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamaño molecular de más de 160 kDa. la rotación molecular del F unido se
ve reducida y se mantiene la polarización 8. en la presencia de antígeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de modo que puede
rotar libremente en la solución, dando lugar a una disminución de la señal polarizada.
Inmunoensayo de fluorescencia protegida
En este ensayo (Nargessi. 1979). el antígeno proteico se marca con fluoresceína y a continuación se hace reaccionar con un anticuerpo específico
para el antígeno. El anticuerpo especifico inhibirá estéricamente la reacción
de un segundo anticuerpo específico para la fluoresceína. que funciona
absorbiendo la fluorescencia de la fluoresceína cuando se une al fluoróforo.
La habilidad del anticuerpo específico para la fluoresceína de interaccionar
con la fluoresceina cuando está unida a la superficie del antigeno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentración
de anticuerpos o de antígenos (analtos) en un sistema homogéneo.
INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE
Origen
Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda moléculas
que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol.
esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio
[Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscencía.
Básicamente, el método del ensayo no difiere del de los inmunoensayos heterogéneos. RÍA y FIA. La generación de luz por derivados del luminol requiere
OH iHfi. como iniciador químico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores
de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados
químicamente con OH H O muestran un rendimiento cuántico quimioluminiscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras moléculas
quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998).
Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicamente en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogéneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec;
;
tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnóstico práctico, y sus
características se describen a continuación
Ensayo quimioluminiscente usando esteres de
acridinio como marcadores
En este método (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan directamente con moléculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden
reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios muy energéticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisión de luz por parte de los esteres de acridinio
es muy rápida, en unos 5 a 10 segundos después del inicio de la reacción de
oxidación. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proceso, posee una relación entre el espectro de emisión y el tiempo de reacción
con una pendiente mucho más acusada que la quimioluminiscencia de tipo
resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es
mayor que la de un RÍA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres
de acridinio y la estabilidad de los conjugados con proteínas durante periodos
de almacenaje se han mejorado mediante la modificación de la molécula y la
química de la conjugación. Esta tecnología probablemente aporte mejoras
para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas.
¿
Inmunoensayo electroquimioluminiscente
El ECLIA emplea compuestos electroquímicos como sondas que generan
luz electroquímicamente, asociada al ciclo reactivo de la reacción de oxidación-reducción. Con la optimización de las soluciones de reacción, la selección del método de conjugación apropiado y el desarrollo de compuestos
como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnología quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991).
2-
842
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Proteína
Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un éster de acridinio basado en la descomposición oxidativa.
2
El Ru(bpy), * tiene un sitio de reacción para la conjugación de analitos
usando un reactivo de activación como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado
con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para
moléculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos
de oro. El Ru(bpy), - en una fase sólida y el TPA se oxidan en la superficie
de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-'
pierde electrones de forma espontánea. El Ru(bpy) - puede generar una
emisión de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal
a través de una reducción con TPA'. La eficacia de generación de la luz
(rendimiento cuántico) depende de la proximidad entre el electrodo y el
conjugado, y por tanto, de la difusión del conjugado. Los conjugados libres
pueden generar más luz que los conjugados fijados a una fase sólida como
resultado de una reacción inmune. Esto permite un acceso fácil al formato
de ensayo homogéneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogéneos. El protocolo de ensayo para la determinación de analitos es el
siguiente: microparticulas magnéticas cubiertas de anticuerpo como fase
sólida se mezclan con la muestra para permitir la reacción inmune.
Después de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una
solución con la fase sólida se introduce en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de detección de un
ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml
para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la detección de la señal
que los FIA y otros CLIA.
2
3
1
3
3
2
AUTOMATIZACIÓN INSTRUMENTAL Y MODULACIÓN
DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO
Sistemas de ensayo homogéneos
A pesar de que muchos inmunoensayos homogéneos se han desarrollado
para protocolos manuales descritos en este capítulo, la mayoría de ellos no
han sido automatizados todavía. Para el método EMIT, se pueden adaptar
analizadores químicos genéricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos están disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogéneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre sí. El sistema CIS Bio
KRYPTOR se ha desarrollado con características especiales, incluyendo el
uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un método de dos
longitudes de onda para la corrección interna del estándar de intensidad de
fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del límite de detección.
Sistemas de inmunoensayo heterogéneos
Hasta el principio de los años 80, la mayoría de los inmunoensayos heterogéneos se hacian de forma manual. Entonces Boehñnger-Mannheim (que
se fusionó con Roche Diagnostics en 1998) desarrolló un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos
enzimáticos colorimétricos que empleaban la peroxídasa de rábano como
enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compañías trataron de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimático totalmente automatizados, que
eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antígenos asociados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento como la calcitonina, existen en concentraciones muy bajas en el
suero, necesitando así un sistema de detección muy sensible para poder
medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los
muchos métodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo más sensibles capaces de detectar analitos presentes en
concentraciones muy bajas.
Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora
son también capaces de utilizar inmunoensayos enzimáticos fluorescentes.
Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basándose en la
generación y detección de las señales y el tipo de fase sólida. Con respecto a la detección de la señal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japón) y el
AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un método de fluorescencia del
inmunoensayo enzimático que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato
especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayos enzimáticos de quimioluminiscencia.
Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japón). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur.
Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han
utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994:
Babson, 1991). El éster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha
aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS
2010 (Roche Diagnostics. Indianapolís. IN), se usa el Rufbpy)/' como
sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).
Secuencia práctica del inmunoensayo
en el sistema analítico
La demanda de mercado esperaba una instrumentación capaz de realizar un gran número de ensayos con capacidad de acceso directo. Para
cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el
tedio que implican los inmunoensayos heterogéneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicación en un sistema de ensayo totalmente automatizado, se diseñaron cartuchos individuales de reactivos previamente
empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reacción. Un sistema genérico para los inmunoensayos con sondas heterogéneas está
esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes
del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de
reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reacción se introducen de forma automática en el instrumento. Las muestras se transportan a la posición apropiada para la dispensación. El ensayo está diseñado para emplear bandejas de reacción o
rotores que automatizan los pasos de mezclado y separación, que dependen del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreacción, y la reacción de generación de la señal. Todos los pasos de la reacción tienen lugar
de forma secuencial en la línea de reacción y las señales generadas se
miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los
siguientes 20 a 40 minutos y se envían automáticamente a través de la red
al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por
hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de
acceso directo.
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
Instrumentación y puntos clave para un inmunoensayo
heterogéneo
Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al
formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separación BF,
el arrastre, flujo de los desechos y demás. Asi. debemos prestar atención a lo
bien que funciona el instrumento después de su puesta en marcha.
Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de
inmunoensayo totalmente automatizado en un laboratorio clinico de automatización.
843
Cubeta de reacción
En un sistema de inmunoensayo. es muy importante diseñar las características de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducíbles. Los fabricantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rápido de los reactivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso
que contiene los reactivos y la unidad de reacción en el sistema Lumipulse.
El sistema Immulite emplea una unidad de reacción para la separación B.'F. El
844
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 35-8 Nueva generación de sistemas de inmunoensayo heterogéneos
ACS:CENTAUR
ARCHITECT (ABBOTT)
(BAYER DIAGNOSTIC)
ADVIA IMS (BAYER
DIAGNOSTICS)
Sustancia marcada
Sustrato enzimático
Detector de la señal
Formato del ensayo
Pretratamiento
Flujo de la reacción
Duración del ciclo (seg)
Duración de la reacción (min)
Temperatura de la reacción
Numero máximo de analitos
Capacidad (ensayos/hora)
Fase sóhda
Tiempo del primer resultado (min)
Separación B/F
Método de muestreo
Liotilizado y empaquetado
en porciones
Recipiente de reacción
Inmunoensayo enzimático
fluorescente
Fosfatasa alcalina
4-metilumbeliter¡l tosíalo
Fluorescencia
S-1. S-2, competitivo
Si
Rotatoria
30
10 o 40 min
37°C
20
120
Partícula magnética (bcad>
50
Campo magnético
Pipeteando la sonda
Paquete de reactivos
(en solución)
Cubeta desechable
Inmunoensayo
quimioluminiscente
Ester de acndinio
Ninguno
Quimioluminiscencia
S-1, S-2, competitivo
Sí
Rotalona
15
7 5-36
37"C
30
240
Partícula magnética
8-40
Campo magnético
Chip desechable
Cubeta desechable
Inmunoensayo
quimoluminiscente
Ester de acndinio
Ninguno
Quimioluminiscencia
S-1, S-2, competitivo
Sí
Rotalona
18
29
37"C
25
200
Partícula magnética
30?
Campo magnético
Sonda fija
Particulas secas en la
cubeta de reacción
Recipiente de reacción
Inmunoensayo
quimioluminiscente
Fosfatasa alcalina?
Foslato de dioxelano?
Quimioluminiscencia
S-1, S-2, competitivo
?
Rotatoria
36
20
37"C
36
100
Partícula magnética
Aulodilución de la muestra
Sí
Si
Si
AIA-21 (TOSOH)
Paquele de reactivos
Cubeta de reacción
Principio de la reacción
AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reacción única que consiste en pocilios para el reactivo, la incubación y para la muestra dentro de
una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una
unidad rnatricial. Esta última puede emplearse para captar la fase sólida de
látex, seguida de una separación B'F y de una segunda reacción inmune de
anticuerpo marcado con la fase sólida.
Tipo de toma de muestra y dispensación de fluido
En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos
tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminación entrecruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el
chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En
el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en
varias alícuotas pequeñas, la contaminación entrecruzada sigue ocurriendo.
Así, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contaminación y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de
emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija.
También deben tomarse en consideración las consecuencias medioambientales de los chips desechables.
Arrastre
El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentración
extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnósticos clínicos erróneos. Un tubo de plástico desechable para la muestra es la forma más sencilla
de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias
ventajas económicas como se ha mencionado antes. Asi, la mayoría de las
técnicas que conciernen a la ingeniería de las muestras se han concentrado en
minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a
menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras
todavía crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un
antígeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra
negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para comprobar dicho resultado, mediante un reanálisis automático de los valores positivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.
Separación B/F y sistemas de lavado
En un inmunoensayo heterogéneo, el conjugado unido debe separarse
de la sonda libre. Esta separación B'F depende de las características de la
Solución en una botella
?
Campo magnético
Pipeteando la sonda
(técnica del aceite)
Si
fase sólida. Los sistemas IMx y AxSYM emplean micropartículas de látex
como fase sólida y emplean una membrana porosa para atrapar el látex
para la separación de particulas de la fase sólida de la líquida. Diagnostics
Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los sistemas de separación B/F, en la que la solución de reacción sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida permanece en un lecho de fase sólida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos,
es que evitan la contaminación entrecruzada y el arrastre de una mezcla
de reacción a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado.
Todos los demás sistemas emplean particulas magnéticas (magnette partióles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separación rápida y fácil, mediante la aplicación de un campo magnético.
Nuevos sistemas para la próxima generación
(sistemas modulares)
La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comercial que se han introducido en los últimos años. Muestra las
especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubación y de reacción, se puede obtener un resultado rápido en
unos 10 a 25 minutos. Así, es posible una máquina de alto rendimiento
que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Además, varios fabricantes
han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos
sistemas analíticos que se necesitan en un laboratorio clínico. Muchos
laboratorios clínicos han introducido un sistema de transporte de muestras
que se conecta con distintos instrumentos analíticos controlados de forma
independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a
este sistema porque la velocidad del instrumento o la duración de su ciclo
no se puede armonizar fácilmente con el resto de software y hardware.
Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es
un ejemplo de una máquina de nuevo concepto, en el que un sistema de
ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo
conectados a un analizador químico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY),
que puede realizar química clínica e inmunoensayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todavía en
desarrollo, que harán posible la simplificación del laboratorio clínico a un
coste final inferior.
CAPÍTULO 35
•
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U Í M I C A
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RÁPIDOS PARA SU
USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIÓN AL PACIENTE
Origen
Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej.,
hCG para el diagnóstico del embarazo) ha simplificado el formato de los
inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rápido y reproducible. Teniendo
en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto
ha dado como resultado una primera generación de formato de ensayo de
inmunoensayo enzimático de flujo.
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos
de ensayo por inmunofiltración)
La Figura 35-23 ilustra esquemáticamente un instrumento típico de inmunoensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que
consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un
parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo
y el procedimiento se describen a continuación. Varias gotas de la muestra de
orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y
entonces se añade el tampón de lavado por goteo y a continuación una solución con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.
Tiras reactivas
También se ha desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el
coste de los materiales en comparación con el formato del ensayo de flujo En
este formato, la tira del ensayo contiene un área con un punteado de anticuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente
manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se
introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuación se introduce la
tira en una solución de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un
revelador de color si es necesario.
Instrumentos inmunocromatográficos
Con el fin de eliminar pasos de adición de reactivos en estos dos formatos, se han conseguido importantes mejoras empleando técnicas inmunocromatográficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rápido.
Membrana de nylon
c
845
La inmunocromatografía consiste en la separación B. F y generación de la
señal simultáneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso,
como una membrana de nitrocelulosa o una lámina de libra de vidrio. A través de la acción capilar de la membrana, el analito de la muestra puede
migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente
para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga
de muestra, la de mareaje y la de detección se encuentran entre los dos
extremos. El método inmunocromatográfico se clasifica en varios formatos.
La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatográficos típicos El
extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y está
conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado,
debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de detección. El extremo distal de la
membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como
una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye
el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o látex coloreado, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este
complejo migra a la zona de detección. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de detección puede captar el complejo y formar una linea
roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase móvil en una migración es la propia muestra.
Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentración de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resultados a simple vista. En este formato, la señal que debe detectarse se produce en la zona de detección con una zona donde se concentran partículas coloreadas.
Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automática, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma
esquemática en la Figura 35-25. En este formato, la posición de cada una
de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocromalografías mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una
solución de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de
lavado espontáneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica
sobre un parche que está en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se añaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con
el conjugado después de su reconstitución. La mezcla de reacción que
contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que
contiene la solución de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye
y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de detección. En
este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes
del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarán
hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo
inmovilizado captura el complejo en la zona de detección para formar una
linea coloreada. Este método presenta algunas ventajas que difieren de
otros instrumentos inmunocromatográficos que se revelan con la muestra.
En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipémico puede interferir en
la evaluación del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado
color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este instrumento ha sido útil en la detección de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayoría de los componentes, como la membrana, el parche
absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un
molde de plástico.
Resumen
Los instrumentos de inmunoensayo rápidos y sencillos se resumen en la Tabla
35-9.
Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo,
Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Sección transversal de un Hybritech ICÓN
de impregnación o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones
y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captación se encuentran inmovilizados en el centro de una membrana de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayoría de los instrumentos inmunocromatográficos
te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o látex coloreado. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migración del inmunocado y el tampón de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial.
complejo, junto con la migración de la solución de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimático en dos pasos.
846
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatográfico típico mediante adición de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona como porción de carga de la muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antígeno marcado con látex coloreado o coloides de oro. El analíto de la muestra forma un complejo con el
conjugado y migra a la zona de detección, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado
y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.
chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil
a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA
permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra,
25 ul. La corriente actual de ensayos rápidos para POCT se orienta hacia ensa-
yos que emplean instrumentos de inmunocromatografía porque una persona con
práctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede
realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).
Figura 35-25. Instrumento inmunocromatográfico que emplea EIA. Se aplica un método de amplificación sensible a la inmunocromatografía
empleando una enzima. La muestra se añade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este método, se emplea una solución de revelado como fase móvil, que puede servir como tampón de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plástico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.
Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rápidas para los instrumentos de inmunoensayo
Principio
del ensayo
Nombre del kit
... .
(analito)
Formato inmunocromatográfico
Un paso
Helisal One Step
(Helicobacter pylori)
(todo en uno)
Biocard Troponin I test
Clearview hCG II
QuickVue One-Step
hCG
CARD-I-KIT
Troponin I
TROPT Troponin T
Determine HBsAg
BioSign Tumor
_.
Tipo de muestra
Volumen de
muestra (ul)
Fase móvil
Tiempo de
reacción (min)
Sensiblilidad
Alojamiento
Fabricante
Sangre
5C
Plasma
5
Igual que ELISA
MP"'
Suero
Orina
Orina
150-200
3 gotas (75?)
Suero
Orina
Orina
15
5
3
0.1 ng/ml
25 mlU/ml
25 mlU/ml
MP
MP
MP
Cortecs Diagnostics
Ltd.
ANI Biotech oy
Unipath Limited
QU1DEL
Suero
4 gotas (100?)
Suero
5-10
0,1 ng/ml
MP
AboaTech Ltd.
?
Sangre
Sangre/suero
Sangre/suero
150
50
50
Plasma
Plasma/suero
Revelador
5-15
15
5-10
0.1 ng/ml
1 ng/ml?
MP
TS'
'••IF
Roche Diagnostics'
Abbott
Princeton BioMeditech
Corp.
Morningstar
Diagnostics
West Wind Plus, Inc.
HBs Insta test
Sangre/suero
200
Plasma/suero
15-20
0.5 ng/ml
MF
EASY-SURE HBsAg
Suero
100-150
Suero
5-20
1 ng/ml
TC'
PSA RapidScreen Test
Sangre
1 gota colgante
Revelador
-15
>4 ng/ml
MP
Triage Cardiac
(Myoglobin CK-MB
Troponin-I)
AMRAD ICT
Hepatitis B
Espline HBs-Ag
TestPack PLUS hcG
EASY-SURE HIV 1/2
Sangre
?
Plasma
15
?
MP
Sangre/suero
?
Sangre/suero
5-15
2 ng/ml
cc-
Plasma/suero
Suero/orina
Plasma/suero
25
25
40
Revelador
Suero/orina
Revelador
15
5
10
0.5 ng/ml
50 mlU/ml
—
MP
MP
CC
Orina
3
20 mlU/ml
22
Plasma/suero +
solución del conjugado
15
3,1 ng/ml
rs
Distribution
Dainabot
50
Tampón, etc.
2
10 ug/'ml
TC
Hybritech, Inc.
Nyco Diagnostic
1 gota
Tampón, etc.
10
1
MP
Morningstar
Diagnostic
?
Tampón. etc.
15
2 ng/ml
MP
Orgenics
?
1
Toot
Dos pasos
Método inmunocromatográfico de tiras reactivas
AimStick PBD
Orina
Dainascreen HBsAg
Plasma/suero
ICON-II hCG
NycoCard CRP
Suero
Plasma de sangre
completa
Suero/plasma
Volumen de
la inmersión
Formato de flujo
Chagas dobule-spot
test
Combinación de inmunocromatografia y flujo
DoubleCheck HBsAg
Suero/plasma
Craig Medical
Distribution. Inc.
Biosite Diagnosticst
j
Amrad Corporation
Ltd.
Fujirebio Inc.
Abbott
West Wind Plus. Inc.
Craig Medical
MP = représense moldes de plástico (molóing plástic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reacción ((esí cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case)
•Datos de Towt (1995)
t Datos de Bruni (1999)
j
848
SECCIÔN V
•
INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA
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CAPÍTULO 35
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C A P Í T U L O
36
Examen de laboratorio
del sistema inmune celular
• Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP)
• Susana Cunningham-Rundles, Ph.D.
• Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI)
CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN DE
LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA
LA INTERPRETACIÓN
851
Decisión de analizar
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
FUNCIÓN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD
MEDIADA POR CÉLULAS
859
METODOLOGÍA: CITOMETRIA DE FLUJO
Y DE IMAGEN
859
Hardware y otras herramientas
Significado clínico de las pruebas de inmunodeficiencia
RECEPCIÓN Y ANÁLISIS
Efecto de la edad en la respuesta inmune
865
Inmunofenotipificación: aplicación a las muestras
Malnutrición y respuesta inmune
de rutina y leucémicas
Cáncer
APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS DE
INMUNIDAD CELULAR
853
Fases de estudio: fase de exploración
Fases de estudio: fase de confirmación
Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad
PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO
Análisis del ADN
Citometría de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad
de fluorescencia
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE CALIDAD
EN EL LABORATORIO CELULAR
874
BIBLIOGRAFÍA
874
IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD
CELULAR
855
Inmunología celular
Metodología: determinación de la activación y la
proliferación linfocítica en la evaluación de la
inmunodeficiencia celular
El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a
la detección de determinadas anomalías en pacientes con sospecha de déficit
inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciación y función de las células inmunes normales, de la deleción experimental de genes, y
de análisis detallados de síndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las
bases funcionales de la desregulación inmune en pacientes con mutaciones
genéticas primarias (congénitas) del sistema inmune o de infecciones congénitas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no
se pueden distinguir por la presentación clínica de las infecciones: la información genética está convirtiéndose en un importante componente para las pruebas e interpretación diagnóstica. La misión de la inmunología clínica de laboratorio es transformar las nuevas líneas de investigación en pruebas altamente
estandarizadas y clínicamente relevantes para cada paciente en concreto.
Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado principalmente en tres áreas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el
impacto de los defectos congénitos inmunes sobre la defensa del huésped; 2)
enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad
inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunológicas adquiridas,
en las cuales la infección daña directamente el sistema inmune, como en la
infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además, los
defectos inmunes celulares de enfermedades con características de mala función inmunológica, como las infecciones crónicas, el cáncer, la malnutrición o
las lesiones traumáticas, proporcionan información esencial en la defensa del
huésped mediada por la inmunidad.
El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de
inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una infección natural o
por una inmunización. Debido a que la inmunología, como actualmente se utiliza en un laboratorio clínico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin.
1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real
de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la
inmunidad humoral, la función inmune celular es fundamentalmente compleja
y difícil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral básicas miden la producción de anticuerpos específicos elaborados en cierto momento como respuesta a una infección por un virus o microbio específico; en contraste, los
análisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales.
En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes
primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el síndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tourame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia de la evaluación estandarizada en el laboratorio clínico de las deficiencias
inmunes. El descubrimiento y el estudio de niños con trastornos relativamente
raros pero muy importantes, como el déficit de adhesión leucocitario (LAD)
(Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodológicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cómo se
presentan estos defectos de adhesión (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificación de la enfermedad granulomatosa crónica
(CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades
heterogéneas con alteración en la actividad de la cadena respiratoria fagoci-
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han
sido útiles en la identificación del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997).
Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congénitos pueden ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999)
o, en el futuro, a la terapia génica (Malech, 1999).
Como la mayoría de los linfocitos en sangre periférica son células en
reposo, la reacción inmune celular debe reproducirse o generarse en el sistema de análisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, mantener la reacción proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi
como de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunología clínica cambió radicalmente durante los años 80, debido al impacto de los
importantes esfuerzos de investigación, incluyendo el uso de anticuerpos
monoclonales para identificar células inmunes, el descubrimiento de la regulación de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda
necesidad de comprender y controlar la aparición epidémica del VIH. La aparición del VIH ocurrió casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las
células T CD4+. Los primeros análisis de la inmunodeficiencía funcional celular en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados
inicialmente en el análisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Siegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes
funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo
se presentan las pruebas inmunológicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. La evaluación de la inmunidad celular está cambiando
desde los análisis simples y puntos finales fijos hacia un análisis integrado
de la función celular en varios niveles que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinámico.
CRITERIOS CLÍNICOS PARA LA EVALUACIÓN
DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES
PARA LA INTERPRETACIÓN
Decisión de analizar
Aunque en teoría la interpretación de las pruebas inmunológicas comprende
desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en términos prácticos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presentación clínica. Sin embargo, como las pruebas inmunológicas pueden ser caras
y lentas, la elección de la prueba a menudo depende de la sospecha clínica.
Como hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que
sean total y específicamente diagnósticas, la interpretación debería realizarse
con precaución. La responsabilidad del laboratorio de inmunología clínica es
establecer un número suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para
conocer la naturaleza y la extensión de la alteración inmune y considerar un
rango de posibles causas cuando se realice su interpretación.
Normalmente, la decisión de analizar la respuesta inmune en un paciente
surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la
inexplicable susceptibilidad a la infección, el aumento de la gravedad de
infecciones habituales, o la reacción inusual a la inmunización son motivos
para realizar una valoración inmune. Las infecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden
al tratamiento, y ciertos estados alérgicos o atópicos también pueden requerir un análisis inmunológico. En estos últimos años, la posibilidad de la infección por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria
como principal diagnóstico de presunción. Sin embargo, como se tratará pos-
Tabla 36-1 Presentación de una posible inmunodeficiencia
Infecciones bacterianas frecuentes
Reacción sistèmica a virus inusualmente grave
Desarrollo de la infección debida a un organismo inusual como
hongos o protozoos
Reacción sistèmica después de la vacunación con virus vivos
Historia familiar de infecciones recurrentes
Exposición al virus de la inmunodeficiencia humana
851
teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnóstico de una enfermedad inmune primaria.
Los cambios inmunológicos pueden acompañar a muchas entidades clínicas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, de enfermedades hematológicas como la anemia de Fanconi, la
hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos como la
histiocitosis, y las hemoglobinopatías como la anemia de células falciformes.
la talasemia, además de un amplio grupo de anomalías cromosómicas como
el síndrome de DiGeorge. el síndrome de Down, el síndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermólisis ampollosa, y el síndrome de
Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumáticas, la enfermedad mixta
del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistémico, la
esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple y la miastenia gravis pueden asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan más adelante en los
Capítulos 43 y 45.
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
Las características principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficiencia supuestamente adquirida por infección con VIH. debe distinguirse
de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clínicas descritas.
Incluso a menudo las lesiones traumáticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran pérdida de sangre o un daño visceral producen
un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Además, otras situaciones
como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipicamente idénticos a la inmunodeficiencia primaria.
Mientras que la infección por el VIH puede diagnosticarse rápidamente
mediante una determinación directa, el laboratorio de inmunología clínica se
emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del
paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el análisis del VIH.
Esto se basa en la observación de que entre los adultos VIH-positivos. casi
siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, como resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado
a considerarse como un marcador de la infección por el VIH.
Sin embargo, hay un cierto número de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un
número de células CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. Éstas incluyen, aunque no sólo están limitadas a estos, al síndrome de DiGeorge, el
timoma benigno, el comienzo de la infección por el virus de la hepatitis C
(VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutrición calórico-proteica y las
neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversión del
cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un número bajo de CD4.
El lactante del caso n." 3 presentaba múltiples abscesos sépticos del tracto
gastrointestinal (Gl) y se creía que tenía un trastorno de la inmunodeficiencia
primaria. Sin embargo, esta evaluación se hizo después de un episodio de
casi ahogamiento en una bañera en la que se encontraron indicios de un destapacaños. Las lesiones del tracto Gl por cáusticos produjeron lesiones múltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos. El
desequilibrio del conjunto de linfocitos T periféricos, pero no el daño del tracto
Gl. se resolvió rápidamente. Esle caso también muestra la necesidad de llevar a cabo una prueba de confirmación tan pronto como sea posible cuando
el paciente esté estable.
Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el
contexto de una infección o de cambios hematológicos. Los trastornos por
inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Capítulo 42. La evaluación de
laboratorio a menudo requiere de una valoración por etapas, no solo para
minimizar la extracción de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las
pruebas disponibles con vistas a un diagnóstico diferencial. Puede parecer
que determinados diagnósticos de presunción se sospechan con demasiada
frecuencia, por ejemplo, el síndrome de Wiskott-Aldrich, aunque éste necesita
descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un síndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si sólo se valora la respuesta a mitógenos en lugar de la respuesta frente a antígenos. y con el
tiempo el defecto inmune puede llegar a ser más importante, de forma que
sean necesarias pruebas de seguimiento.
852
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH
Conjunto de linfocitos
Caso estudio
Edad
%CD3
%CD4
%CD8
1. Inicial
2. Inicial
3. Inicial
1 semana
4. Inicial
3 anos
5. Inicial
a los 5 meses
6. Inicial
al año
7. Inicial
8. Inicial
9. Inicial
10. Inicial
al día
3 años
6 años
3 meses
56
73
29
43
89
93
83
76
36
51
0
64
65
26
18
15
25
62
36
51
18
25
42
0
20
26
18
45
29
—
6 años
3 meses
4 meses
1 semana
12 años
8 años
50 años
—
72
L'-
IO
15
32
57
31
48
7
12
24
33
47
51
35
ABS #
209
330
762
2.846
B74
272
2.734
96
304
2.794
0
No hay dalos
No hay datos
No hay datos
No hay datos
Diagnóstico
Deficiencia idiopatica de CD4
Disqueratosis
Inmunodeficiencia congènita R/0
Lesión caustica gastrointestinal
Aplasia de glóbulos rojos
Síndrome de Noonan
Sindrome de Williams
Sindrome de DiGeorge
Talasemia
Neutropenia inmune
Melanoma uveal
Posthipertermia
ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.
Significado clínico de las pruebas
de inmunodeficiencia
Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clínico es
cómo evaluar el significado clínico potencial de la respuesta inmune alterada
in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clínico. Sin
embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificación de los pacientes según el nivel y extensión del defecto.
Por ejemplo, los estudios del síndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clásicamente una tríada de aplasia tímica y paratiroidea y defectos conotruncales.
mostraban que existían diferencias importantes en la gravedad de las infecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reducción del
número de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitógenos originada por
la hipoplasia tímica. Inicialmente. se observó un alto grado de muertes asociadas a este síndrome, pero con las nuevas técnicas quirúrgicas y métodos anestésicos, se ha visto que un número significativo de niños parecen desarrollarse
normalmente sin infecciones graves (Bastían, 1989). Sin embargo, algunos niños
desarrollaron infecciones que no respondían al tratamiento y, finalmente, mortales y no hubo ningún modo de predecir la evolución. Recientemente, ha sido
posible utilizar análisis del fenotipo linfocítico más exacto y analizar los niveles de
los defectos inmunes en el síndrome de DiGeorge. Utilizando análisis longitudinales durante muchos meses y una aproximación paramétrica múltiple, parece
que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente número de
células T CD4, por la inversión del cociente CD4/CD8, y por la producción disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La
investigación del significado de las deleciones monosómicas del cromosoma
22q11.2, que son la principal causa del síndrome de DiGeorge, del síndrome
velocardiofacial y del síndrome de la anomalía conotruncal de la cara, ilustran la
importancia de la nueva información genética. Sólo el síndrome de DiGeorge fue
descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros síndromes
clínicos asociados con la microdeleción del cromosoma 22q 11.2 han mostrado
que en más del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune
(Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con
ninguna caracteristica fenotípica particular.
La función de las células T puede ser tan importante o más importante en
la infección por el VIH que la pérdida de las células CD4^ o la tasa de pérdida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable
incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociación entre el délicit inmune
detectado ex vivo y la función inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992).
Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortostática alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del síndrome de fatiga crónica o que un aumento de las concentraciones plasmáticas del factor de
necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss.
1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.
Efecto de la edad en la respuesta inmune
Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia
durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan.
1994). Aunque hay una considerable variación en esto y muchas veces es
una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clínico proporcione resultados considerando distintos
grupos de edad.
El estudio de pacientes pediátricos presenta hallazgos particulares para el
diagnóstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema
inmune en el niño no está completo al nacer y, además, los niños no han
estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales
y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposición congénita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalías
inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune pediátrica incluyen una
marcada linfocitosis al nacimiento, una elevación de las células B, un
aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas células asesinas
naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993).
Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la
hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). También, hay una importante
diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La
respuesta neonatal de los niños prematuros a ciertos activadores microbianos
puede ser más potente que la de los adultos o que la de los niños nacidos a
término debido a los rápidos cambios en la regulación inmune (Veber, 1991:
Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la programación perinatal (Prescott, 1998).
Malnutrición y respuesta inmune
Aunque generalmente se cree que la malnutrición es relativamente rara en
los países desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutrición es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad
(Pennington. 1996). La malnutrición se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el déficit de zinc puede presentarse
como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el déficit
primario de la captación de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis enteropática o con un déficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963).
Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorción asociada que
alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cunningham-Rundles, 1981). Esto está asociado con el hecho de que el zinc es
necesario para la actividad biológica de la hormona tímica, necesaria en la
producción de las células T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para
la activación de las células T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la
respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos específicos en la respuesta inmune. La malnutrición puede ser un factor que aumente
la complejidad de muchos casos clínicos. La interacción de las infecciones
con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda
puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la
supresión transitoria de la respuesta inmune. El estrés físico puede tener
efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones
en el contexto de la inmunosupresión (Cunningham-Rundles, 1999). Ésle es
un proceso bidireccional. La alteración del crecimienlo puede ser el primer
signo de la infección por el VIH en un niño VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como
por otras razones, la evaluación inmune debe ser un proceso continuo en el
contexto del tratamiento o de otros análisis.
853
un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferación
reducida capaz de ayudar a la célula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto
los linfocitos T de la lámina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma
diferente a las células T de sangre periférica en el uso de la vía de transducción del CD2 en lugar de la vía del receptor de células T/CD3.
Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitualmente en los laboratorios de inmunología clínica y. con raras excepciones, las
células inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre periférica. Por esta razón, el uso de pruebas cutáneas in vivo y el examen de la respuesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es útil para el
inmunólogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluación. En cualquier caso, la utilización de aproximaciones sucesivas y la repetición de análisis son muy informativas.
Cáncer
La inmunodeficiencia primaria está asociada con el aumento de la incidencia de cáncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez está más claro que
hay tumores que se desarrollan asociados a la infección por VIH (Davis. 1984;
Chintu, 1995; Krown. 1996).
En el paciente con cáncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reducción en la respuesta ante un estímulo antigéníco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metástasis o estar causada
por los efectos secundarios del tratamiento. La reducción en la respuesta
inmune frente a los activadores no específicos estudiados ex vivo en ensayos
de proliferación se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un significado pronóstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se
observa en los pacientes con cáncer no tratado un cociente CD4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los
estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse
inmunológicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta
no protectora (Lee. 1997).
El desarrollo de nuevos métodos ¡nmunoterapeúticos está aumentando,
sugiriendo que la respuesta a antígenos específicos del tumor será más utilizada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune
también pueden utilizarse en el seguimiento y evaluación de la respuesta a
los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cáncer
(Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producirá una supresión transitoria de la respuesta inmune que se resolverá en un corto periodo de tiempo,
mientras que la radiación puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La
evaluación de la respuesta inmune en el paciente con cáncer requiere de la
utilización de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas
y activadores, que refleje los procesos relevantes, así como especificidad en
la respuesta.
APROXIMACIÓN METODOLÓGICA A LAS PRUEBAS
DE INMUNIDAD CELULAR
Los estudios en humanos se han basado en la observación de las células
inmunes de sangre periférica ya que el compartimento periférico es más
accesible y más fácil de medir, pero esta aproximación puede no reflejar los
sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre
las diferencias entre la respuesta inmune sistémica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la
respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del huésped in vivo
(Xu-Amano, 1993). La función de la inmunidad sistémica celular parece estar
regulada a través de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas
tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interferón-y (IFN-y). se favorece la defensa
inmune celular del huésped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991).
En contraste con la inmunidad sistémica, la actividad primaria de la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de
microorganismos, toxinas y antigenos a través de la secreción y el transporte
de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por
Fases de estudio: fase de exploración
La evaluación de la función inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una
exploración de las posibles áreas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3.
Estos estudios de exploración deben acompañarse de un análisis de citometria
de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en niños, debe incluir
del uso de marcadores de células B para evaluar posibles cambios en estas,
que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja
población de células T. También se recomienda el empleo de un marcador de
células NK en niños de más de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta
población pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983).
Como existe frecuentemente una limitación en la sangre que va a ser
extraída para estos estudios es esencial que la primera evaluación incluya
paralelamente un recuento sanguíneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial.
La etapa de exploración incluirá un panel de pruebas para evaluar la respuesta mitogénica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores continúa siendo una de las
herramientas más sensibles para evaluar la función normal, y cuando esta
incluye un activador apropiado de células T y B puede ser utilizado específicamente para definir las áreas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre,
se recomienda la utilización de distintas concenlraciones de cada activador.
Además, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El
uso de tubos que contienen heparina de litio o ácido etilenediamintetraacético
(EDTA) no se recomienda para ningún estudio de funcionalidad de linfocitos.
Deben utilizarse tubos con heparina sódica (sin conservante) o con citrato
dextrosa (ACD). La sangre extraída en tubos heparinizados también puede
emplearse para el análisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la
preparación de la muestra y su análisis es critico (Nicholson, 1993).
La pregunta sobre cuándo debe extraerse la sangre es importante. En general, la mayoría de los datos se han obtenido con sangre extraída por la mañana
y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no
puede hacerse, es muy útil continuar manteniendo la uniformidad del tiempo
de extracción para cada paciente individual. Este hecho es más crítico cuando
se mide el número absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzación de
la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clínico (Malone. 1990).
Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura
ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las células
Tabla 36-3 Exploración básica en los estudios inmunológicos
Recuento sanguíneo completo y análisis dilerencial
Análisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de
células B y T) por citometria de flujo
Activación de linfocitos in vitro frente a mitógenos y activadores microbianos
Inmunoglobulinas séricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas
si hay evidencia de infecciones clínicas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogéneos,
por tanto, se necesitan estudios adicionales
854
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se envía por avión u otro
transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir
un control paralelo de la muestra extraída de una persona sana que sirva
como un estándar interno en el proceso de evaluación.
Fases de estudio: fase de confirmación
Aspectos
generales
Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas sobre aspectos específicos de las primeras series. Como
poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango
anormal). Pueden añadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de
partida de estudios analíticos.
Es importante organizar apropiadamente la extracción de sangre cuando el
paciente se encuentre en el estado más estable clínicamente. Se recomienda
realizar por duplicado los estudios básales antes de llevar a cabo una intervención, o incluso en la fase de confirmación. En algunos casos de posible
inmunodeficiencia puede haber un secuestro de células inmunes, que se
refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento periférico,
como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmación también debe incluir una cuidadosa reevaluación de la historia médica de los
pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta
etapa de confirmación se muestran en la tabla 36-4.
Persistencia
timica
El roentgenograma de la silueta tírmca puede no ser suficiente, ya que el
timo tiende a la depleción por estrés (Haynes, 1998). Aunque es difícil
determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamaño real del timo evaluado por resonancia magnética nuclear (MRI) se correlaciona con el
número de linfocitos CD4+ en la infección por VIH (Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un
órgano compuesto por tejido linfoide central y periférico. Haynes (1998) ha
postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las atocinas o de otros tactores producidos por las células inmunes periféricas del
espacio tímico penvascular. Como se describe en la sección específica
sobre la evaluación por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresión de antígenos de maduración normales adquiridos
durante el desarrollo tímico será suficiente para identificar la presencia de
un timo funcionante.
Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutánea
Falta de historia antigénica apropiada cuando el panel no incluye
activadores ubicuos
Inmunodeficiencia primaria
inlecciones víricas
Malnutrición
Enfermedades granulomatosas
Neoplasias
».
neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlación global entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia
(Mass. 1998) pero no ha sido útil como herramienta analítica para determinar la razón de la falta de respuesta. La prueba cutánea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutánea con derivados proteicos purificados
(PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es
una excepción, aunque los individuos anérgicos no responden y. además,
hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo
de Calmette-Guérin (BCG).
Las causas de falta de respuesta en la prueba cutánea se muestran en la
Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutánea con
inmunización de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se llegó a
utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigüedad del mecanismo de respuesta subyacente. La introducción del prueba de
la ventana cutánea" proporciona una medida más cuantitativa e informativa
de la respuesta inmune in vivo debido a que la reacción puede emplearse
para determinar una respuesta tumoral autóloga (Black. 1998). Sin embargo,
aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutáneas como
demostración convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro
pueden tener un significado pronóstico in vivo, no debe ser infravalorada.
Fases de estudio: estudios analíticos de la inmunidad
Los estudios analíticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6.
Aunque la descripción completa de estos abordajes no se encuentra entre los
objetivos de este análisis, en general estos estudios son válidos para definir
el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen método es
evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la
presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la
vista de las áreas de función general disminuida y entonces poner en marcha
los estudios de la función efectora.
Pruebas cutáneas
En este momento puede ser importante la utilización de un panel de
pruebas cutáneas. Este abordaje en la evaluación de la inmunidad celular
sirvió en un principio como punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cutá-
Tabla 36-4 Estudios analíticos de confirmación y de primera etapa
Roentgenograma de la sombra timica
Prueba cutánea
Actividad de las células asesinas naturales (si el niño tiene 6 meses
0 más)
Producción de citocinas en respuesta a la activación con T-coadyuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interferón-y, IL-4 y otros)
Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el
paciente como respondedor
Respuesta a la inmunización
Prueba para la presencia de anticuerpos específicos según la
edad
Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas
(sustancias de grupo sanguíneo anti-A y anti-B) si el paciente es
del grupo sanguíneo A, B o O
Prueba para el déficit de actividad de las enzimas adenosín deaminasa y purma nucleótico fosforilasa
Función inmune diferencial
Hay dos tipos principales de células implicados en la inmunidad (Haynes,
1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (células T) y 2) linfocitos B (células B). Los
linfocitos T se definen por la expresión del receptor del linfocito T el cual se
une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de células T que es esencial para su activación
Tabla 36-6 Estudios analíticos e inmunorreguladores
Desarrollo de los antígenos de la activación durante la respuesta a la
estimulación, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina,
regulación del MHC de clase II sobre las células T, receptores
solubles y otros
Respuesta do activación precoz (p. ej, canales de calcio)
Inmunorregulación
Respuesta a IL-1, IL-2, interferones
Desarrollo de funciones efectoras
Síntesis de inmunoglobulinas in vitro
Actividad citotoxica de las células T
Análisis de células supresoras/factores de supresión
Activación de genes, análisis del ciclo celular
Respuesta a la inmunización: inmunización de novo
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Tabla 36-7 Fenotipificación inmunológica de las subpoblaciones
de linlocilos
Panel básico de sangre periférica (sangre, glóbulos rojos Usados*)
CD45/CD14
Inmunoglobulinas control de isofipo de ratón
CD3/CD19
CD3/CD4
CD3/CD8
CD3-/CD56 y 16
Células mononucleares aisladas, panel de activación'
CD45/CD14
Inmunoglobulinas control de isotipo de ratón
CD3/CD25 (IL-2R)
CD3/HLA-DR
' Si el CD3 está bajo, entonces repetir y añadir CD2. Posteriormente, pueden
añadirse monoclonales trente al receptor de las células T acoplado con CD3.
También pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto también puede
realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como
iniciador
' Después de 2 días de cultivo, extraer las células y lavarlas antes de teñirlas
con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las células control que
no contienen activador, después analizar las células activadas. Los activadores pueden incluir mitógenos. IL-2 y/o mleilerón-y.
Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un
amplio grupo de antígenos, requieren la maduración tímica para su función
normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las
inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD20) y tras una activación adecuada se diferencian en
células plasmáticas que secretan anticuerpos específicos, mediando, de este
modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometerá la función de los linfocitos T y afectará a la activación de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la médula ósea puede afectar tanto a
la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque
pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con más
detalle posteriormente en la Proliferación linfocítica como método In Vitro de
evaluación de la inmunidad celular.
La distinción entre respuesta inmune específica y no especifica es una
necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser
capaz de distinguir entre lo propio y lo extraño. En general, esto se logra
medíanle la incorporación del sistema de autoantigenos del complejo molecular MHC en la fase de reconocimiento antigénico. El antigeno debe ser procesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al desarrollo de la memoria inmune. La función del procesamiento
antigénico se lleva a cabo por las células presentadoras de antígeno (APCs),
siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activación y
la proliferación de los linfocitos. y puede incluir la producción de células electoras y la activación de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de
inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como
"memoria" y se desencadena típicamente después de inmunizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresión del antígeno MHC de
clase II puede detectarse en los linfocitos por citometría de flujo utilizando
anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcador de déficit de MHC de clase II (Tabla 36-7).
Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la
inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repetidos. Esta inmunidad está mediada por las células fagociticas. algunas de las
cuales, como el monocito. también pueden procesar y presentar antígenos, y
las células NK. A diferencia de las células fagociticas. las células NK no están
desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduración de
este sistema, está también disminuida al nacer.
Esta tercera rama está representada por las células NK. que no son ni
célula B ni exactamente células T por no tener ni inmunoglobulinas de superficie ni el receptor de células T. Estas células, antes llamadas células "K", células "nulas" o "tercera población", ha eludido la clasificación convencional por
análisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador
más definitivo de la célula NK (Trinchieri. 1998). Las células NK han sido más
855
conocidas como células que pueden matar inespecíficamente (naturalmente)
a las células infectadas por virus y bacterias y que evitan las metástasis de
las células tumorales. Sin embargo, las células NK también regulan funciones
de las células T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las células NK
son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas,
particularmente IFN-y. Las células NK son importantes para la activación de
las células fagociticas independientes de antígeno durante las fases precoces
de la infección y para favorecer el desarrollo de las células Th1 específicas de
antígeno. El sistema NK está por naturaleza activado y no tiene que ser inducido por antígenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anticuerpos específicos, estas células pueden matar específicamente. La evaluación funcional de esta población celular puede llevarse a cabo de forma
adecuada utilizando un análisis rápido de liberación de cromo ¡conocido como
un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante
citometría de flujo. Los estudios futuros estarán encaminados a detectar cómo
las células NK ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).
Desarrollo de la respuesta inmune
Si se ha determinado que la población de células está esencialmente
intacta en ausencia de activación, la cuestión de un fallo intrínseco puede
estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el análisis
expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antigénico de las células T (TCR) y los antígenos de activación como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de
regulación del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque
las poblaciones celulares pueden expresar un antígeno de diferenciación normal de referencia, también pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo
cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las células
T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las células
CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresión de ciertas moléculas, como el CD28. también es un indicador importante. En algunos síndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulación del receptor de IL-2 en
respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematuramente (Cunningham-Rundles. 1990).
El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinéticamente, debido al
retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificación. Esto
debe ser comprobado mediante estudios periódicos. En algunos casos, no
pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las
funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluación puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta añadiendo citocinas pueden ser útiles, aunque pueden no mostrar la
lesión al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias
de análisis pueden utilizar sangre en lugar de células mononucleares aisladas
(Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualización, ex
vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las células no
se alteran. Además, este sistema puede utilizarse para medir la producción de
citocinas (Petrovsky, 1995; De Groóte, 1998; Suni, 1998).
Se aconseja al laboratorio de inmunología clínica elegir estudios analíticos
básicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base
para la comparación. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de estas pruebas.
PROLIFERACIÓN LINFOCÍTICA COMO MÉTODO
IN VITRO DE EVALUACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR
Inmunología celular
Activación
y proliferación
linfocítica
Aunque el sistema inmune se divide clásicamente en componentes humoral y celular, esta separación no es absoluta, ya que hay una considerable
interdependencia entre las células B y las células T.
856
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA Í INMUNOPATOIOGÍA
El parámetro funcional de la inmunidad celular más frecuentemente medido
es la proliferación linfocitaria. La medida de la activación/proliferación de los
linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los años 50 e inicio de los 60. cuando la división celular se determinaba por el recuento del
número de linfocitos que se habían transformado en blastos. Estos métodos
fueron reemplazados por la cuantificación de la incorporación de precursores
marcados de los ácidos nucleicos (timidma tritiada) en el ácido desoxirribonucleico (ADN) recién sintetizado. Aunque este "análisis en masa' permanece
como el procedimiento de laboratorio más frecuentemente utilizado para
medir la proliferación celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos
y nuevos procedimientos para evaluar la activación y proliferación linfocitaria.
Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferación de
la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de células en fases
especificas del ciclo celular, la cuantificación de citocinas y de receptores de
citocínas asociados a células y la posibilidad de evaluar el número de divisiones celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta
sección se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activación y en la proliferación de los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos métodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema
inmune celular.
Determinación de las vías bioquímicas
de la activación linfocitaria
Tras la interacción específica del mitógeno o el antigeno/MHC con los
receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribución del
sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activación
de múltiples vías de señalización. Estos cambios conducen finalmente a la
diferenciación de la célula T. a la secreción de citocinas. a la proliferación, a
la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales están desvelando las
complejas rutas moleculares y bioquímicas que conducen a la célula T activada por estas rutas. Constantemente se están descubriendo alteraciones
especificas en estas vías y subyacen en muchas de las enfermedades de la
inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los análisis de proliferación en masa indican solo que no hay división celular o que
esta es limitada y no proporcionan información sobre las alteraciones subyacentes de la activación del linfocito. Se requieren ensayos más sofisticados
para investigar las alteraciones subyacentes de las células T.
Activación de los linfocitos T inducida por antigenos
La activación de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una
serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre
la activación de una célula T nativa frente a la activación de una célula T de
memoria. El antigeno es procesado por las células B o por los monocilos provocando el ensamblaje de péptidos inmunogénicos en los productos de los
genes del MHC de clase I o II El complejo péptidoMHC es presentado a las
células T que portan el receptor apropiado de esa célula T. Además, la APC
expresa una serie de moléculas de adhesión y coestimulación que interactúan
con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la célula
T. La unión aislada del receptor de la célula T no es suficiente para la activación de la célula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 señales" para la
activación de la célula T (Brestcher, 1992). La primera señal que ocurre por la
vía TCR/CD4/CD8 modula la transición de la célula T en las primeras etapas
de la activación (p ej.. de G a G.). La 2- señal se produce por la via de los
coestimuladores. más concretamente por el CD28 y en menor medida por
LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la inducción de la IL-2 y de otros genes de
citocinas requeridos para la proliferación y diferenciación de la célula T hacia
células efectoras.
0
Reconocimiento de las células T, activación
y transducción de la señal
El complejo TCR está compuesto por una estructura de reconocimiento
del antígeno heterodimérica (esto es. el TCR) y un complejo de transducción
no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la
superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de señalización por si mismo. La estructura de reconocimiento antigénico está compuesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6) y el complejo de transducción CD3 está
formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dímero
de cadena zeta. Cada una de las proteínas del CD3 contienen un residuo llamado residuo inmune de activación de la tirosina (ITAM). que se une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f¡ (que existe como un
homodímero f¿ una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y)
contiene 3 ITAM y es el componente más significativo del complejo TCR.
estando implicado en la transducción de la señal desde el TCR (Weiss
1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un
papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activación de
las células Tflrving. 1991). Las moléculas CD4y CD8 de la superficie de las
células T también están unidas de forma no covalente al complejo TCR Se
unen a las moléculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y
también están implicadas en la transducción de las señales de activación
Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las células T en el contexto de los antigenos del MHC. En general, las células T CD4+ responden
a antígenos exógenos procesados y presentados en el contexto de MHC de
Clase II y las células T CD8+ responden a antigenos endógenos procesados
y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 también están asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos
precoces tras la activación de las células T. Además de estas interacciones
y las interacciones de las moléculas «estimuladoras, otro grupo de moléculas (moléculas de adhesión), presentes tanto en la APC como en las células
T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de
la unión.
Las moléculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7
(CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor
(HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las células T.
la CD28 es la principal molécula «estimuladora y se une al B7: la CTLA-4.
por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y está implicada en la disminución de modulación de la activación de las células T (Linsley, 1991b). El
receptor en las células T para el HSA no ha sido identilicado. La presentación del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las moléculas
coestimuladoras lleva a una respuesta anérgica (tolerancia) en posteriores
exposiciones a ese antígeno especifico pero no afecta a las respuestas a
otros antígenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunogénicos a
tumores inmunogénicos transplantados transfiriéndoles el gen 87 (Townsend.
1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las moléculas
coestimuladoras juegan un papel importante en la activación de las células T
in vivo.
Transducción de señales después de la estimulación
antigeno-específica
La presentación del antigeno a las células T conduce a la agregación del
complejo del TCR-CD3 y a la activación de la proteína tirosina cinasa (PTK),
El TCR por si mismo tiene un pequeño dominio ciloplasmático sin actividad
de transducción conocida. Es la cadena asociada ¡¡ del complejo CD3, que
contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad
de la proteína tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplasmáticas de PTK están implicadas en las etapas mas precoces que siguen a
la agregación del receptor de células T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de
señalización que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la vía de la
coestimulación por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activación de
las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activación de tres vías. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La
activación del p21"» activa las proleína cinasas activadas por mitógenos
(MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripción regulando de este
modo la expresión genética. La activación de la tirosina cinasa también activa
a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generación de
los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El
DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rápido y sustancial
aumento del calcio ciloplasmático. El aumento del calcio libre activa la fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma.
1-
b
CAPÍTULO 36
•
857
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
Estos procesos también conducen a la inducción de proteínas de unión al
ADN y a la transcripción de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor
de IL-2 requeridos para la proliferación de la célula T. Para más información
sobre las vías de transducción molecular tras la activación del TCP. y el CD28,
consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999).
La comprensión de las vías que conducen a la activación de la célula T ha
llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar
estrategias terapéuticas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han
publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y están asociadas
con la forma autosómica del síndrome de la inmunodeficiencia combinada
severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena común
y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalías de la transducción y están asociadas con la forma ligada al cromosoma
X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de
SCI adquiridas autosómicamente están asociadas con las mutaciones en la
proteína tirosina Jak3 de la familia de proteínas Jano. la única molécula de
señalización asociada con la cadena común y (Russell. 1995). A medida que
se van descubriendo más anomalías subyacentes que conducen a la inmunodeficiencia de células T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse
empleando un extenso sistema que identificará los trastornos de acuerdo con
las alteraciones en la diferenciación, la maduración y la función (Gelfand.
1993). Estas designaciones podrían comenzar a enfocarse en los defectos
fisiológicos o bioquímicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones terapéuticas. Para una revisión de las alteraciones moleculares específicas que originan alteraciones en la activación y proliferación de
la célula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).
Respuestas de la célula T
Recientemente, se ha preterido la designación de la respuesta de la célula
T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de
la célula T que originan unos patrones de secreción de citocinas que se sabe
que están implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secreción de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las
respuestas tipo I se caracterizan por la secreción de citocinas que se sabe
que aumentan la inflamación (promflamatorias) e inducen la activación y la
proliferación de las células T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las
respuestas tipo II se caracterizan por la secreción de citocinas que suprimen
la inflamación (antiinflamatorias) y estimulan a las células B a dividirse y diferenciarse en células secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10
e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secreción de las citocinas del
tipo I regulan la secreción de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por
ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Châtelain, 1992) como ih vitro
(Seder, 1992:1993). las células T no se diferencian en células secretoras de
IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune
humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 presentes durante la estimulación de las células T nativas dirigirán la respuesta
hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994).
Muchos factores están implicados en la regulación del tipo de respuesta de
la célula T que sigue a la estimulación antigénica. Además del ambiente de
citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antígeno influye en el
tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreñas, 1995). La respuesta predominante que se desarrolla Iras la activación de la célula T tiene implicaciones clínicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de
tipo I a la infección por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora
(Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la
mayoría de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen
por intensa inmunodepresión. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que
la exposición repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre
el 39% y el 75% de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC)
de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga vía
intravenosa y niños nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para
VIH-1 y negativos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secretan IL-2 en respuesta a la proteína env in vitro. Estos científicos proponen que
estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad
protectora mediada por células como resultado de una baja dosis de inmunización o de infección.
Metodología: determinación de la activación y
la proliferación linfocitica en la evaluación
de la inmunodeficiencia celular
Los defectos del desarrollo, las alteraciones genéticas congénitas y las
infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Además, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones terapéuticas también originan mmunodeficiencias. Los análisis en masa pueden
emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminución de la
respuesta proliferativa de las células T y han estado disponible durante algún
tiempo pero están limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada
información que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologías ha permitido
la producción de una variedad de reactivos que pueden emplearse para evaluar múltiples actividades a lo largo de la via de activación de la célula T. Estos
reactantes incluyen anticuerpos monoclonales específicos como marcadores
de la activación de la célula T. reactivos y sistemas para la detección de citocinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferación linfocitica.
Procedimientos empleados para evaluar la activación
y la proliferación de la célula T
El procedimiento más frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celular es una simple prueba cutánea. Una prueba cutánea positiva
para la delección de una respuesta de hípersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las
pruebas cutáneas se llevan a cabo fácilmente, los resultados negativos son
difíciles de interpretar, especialmente en niños pequeños, y las pruebas cutáneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulación de linfocitos in
vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por células son la sensibilidad por contacto, la formación de granulomas y el rechazo
alogénico.
Los linfocitos son los únicos en los que se expresan receptores de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molécula o sustancia extraña
(antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el
reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la célula T. En general, solo hay un número limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extraño, las
células proliferan rápidamente de forma clonal para generar un gran número
de células tanto efectoras como de memoria.
Los primeros métodos empleados para evaluar la proliferación linfocitica
incluían el recuento manual del número de células antes y después de la estimulación. Desgraciadamente, estas técnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos problemas técnicos. En los últimos años se han desarrollado
nuevos métodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la división celular. Hay que subrayar que los métodos que
miden los sucesos iniciales en la activación del linfocito T pueden o no correlacionarse con la división celular.
3
Ensayo de incorporación de timidina tritiada H
(ensayo TdR)
Muchos laboratorios evalúan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculando el grado de incorporación de nucleósidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubación prolongada
de cultivos celulares de mononucleares de sangre periférica con mítógenos
(tres a cuatro días) o con antígenos (5 a 10 días). En general, solo un número
limitado de células T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las células deben cultivarse durante 5 a 10 días para detectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirán la rápida proliferación de hasta el 100% de las
células T. Por esta razón, la proliferación puede detectarse en tres o cualro
dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La transformación linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtógeno fue descrita por pri-
858
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
mera vez por Nowell (1960). Los mitógenos son, en general, los estimuladores más potentes, ya que activan una gran proporción de linfocitos en relación
con los aloantigenos y los antigenos.
Citometria de flujo en la evaluación de la activación
y la proliferación linfocitaria
Los análisis en masa, además de sus inherentes problemas técnicos, no
proporcionan información sobre las subpoblaciones celulares específicas
que están respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multiparamétrico inherente se ha convertido en el instrumento de elección para el
análisis de la inmunología celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activación/proliferación de la célula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una
revisión extensa de la citometria de llujo y de los métodos empleados para
evaluar la activación y la proliferación linfocítica. véase Bauer (1993) y Shapiro (1995).
Otro método basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso
importante en los laboratorios clínicos es la medida de los linfocitos en varías
fases del ciclo celular. En general, los análisis del ciclo celular se llevan a
cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de
ADN. El marcador empleado más frecuentemente es el yoduro de propidio.
que interacciona estequiométricamente con el ADN (esto es. la cantidad o
intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la
célula). Utilizando complejos modelos matemáticos, es posible medir el porcentaje de células con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona
con el porcentaje de células en fase "S" del ciclo celular. En general, los linfocitos de sangre periférica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celular, con menos del 5% de las células en la fase "S"
C
Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporación de
timidina tritíada por análisis de inducción de marcadores de superficie celular
combinados con una medida del porcentaje de células en vanas fases del
ciclo celular tras la activación (Cost. 1993).
Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma
estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de
marcador, se estimula la división de los linfocitos. Con cada división sucesiva
la cantidad de marcador por célula se reduce a la mitad. La fluorescencia
emitida por las células tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimación del número de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodología se
ha estandarizado recientemente en un equipo analítico que incluye el soft-
Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activación de
los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397
Copyright <g Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley 8 Sous, Inc.)
FLUORESCENCIA
I.OÍÍ
l»KH26
Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos periféricos estimulados y no estimulados por mitógenos tras cinco dias en cultivo. La proliferación celular se indica por la dilución de la intensidad fluorescente en cada
generación sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Citometry. 3* ed.
Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pág. 3 1 3 . Copyright í Wiley-Liss. 1995. Reimpreso
con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)
ware necesario para el análisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma
Immunochemicals. St. Louis. MO). Una evaluación de 14 de los marcadores
utilizados más frecuentemente informó que dos de los marcadores. PKH26 y
el ester succinimidilíco del diacetato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los
más adecuados por su capacidad para cuantificar la proliferación de los linfocitos (Parish, 1999). Este ensayo puede proporcionar la evaluación más
fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas de cultivo in vitro con
ventajas importantes sobre los análisis en masa habituales, permitiendo la
medición de subpoblaciones específicas de linfocitos. Los indices de CSFE
parecen correlacionarse más estrechamente con los análisis con TdR que la
medida de las células CD69* (Ángulo. 1998). La medida de la proliferación
linfocitaria empleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido desarrollada, optimizada y analizada para su empleo en aplicaciones clínicas
(Allsopp, 1998; Ángulo. 1998).
La posibilidad recientemente desarrollada de medir la producción de atocinas asociadas a las células a nivel de una sola célula tiene un importante
potencial como herramienta clínica en la evaluación de la respuesta celular
inmune. Básicamente, las células son estimuladas, ya sea como PBMC o
como sangre completa, durante cuatro a seis horas en presencia de reactivos que bloquean el transporte de membrana (breleldina A o monensma)
para evitar la secreción de atocinas. Entonces, se marcan las células con
anticuerpos monoclonales específicos de cada subpoblación, se fijan, se
permeabilízan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes
específicos para el estudio de la citocina de interés (Jung, 1993; Prussia
1995). El ensayo se ha desarrollado en presencia de anticuerpos «estimuladores para la detección sensible de respuestas antigénicas en cultivos de
sangre tras periodos relativamente cortos de incubación (Suni, 1998). Se ha
prestado especial atención al desarrollo de anticuerpos que reconozcan las
formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato de Golgí) y la optimización del tiempo de cultivo para detectar la máxima respuesta de las atocinas (Mascher, 1999). Los estudios clínicos han comenzado a demostrar la
utilidad potencial de esta técnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren quemaduras muy graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de citocinas Th2 pueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multíorgánico
(Zedler. 1999). Esto puede ser muy ventajoso, ya que no hay pruebas actuales que indiquen qué pacientes sufrirán esta complicación potencialmente
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
mortal. Se están realizando actualmente muchos estudios que evalúan la
utilidad clínica de esta prometedora nueva tecnología. Se ha informado la
expansión de esta técnica para incorporar la capacidad de medir simultáneamente la proliferación y la síntesis específica de citocinas a nivel de una
sola célula pero todavía no ha sido evaluada en un marco clínico (Mehta,
1997).
Ciertamente, se están desarrollando nuevas técnicas que miden los diferentes acontecimientos implicados en la activación de la célula T. Hay métodos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fosforilación/desfosforilación hasta la transducción de señales, la transcripción
de los genes y la división celular. Según se adapten estos métodos a la actividad clínica diaria, podremos disponer de un arsenal de estos para evaluar
muchos de los procesos implicados en la activación y proliferación de los linfocitos. Aunque un elevado número de estas nuevas tecnologías todavía
están en manos de los laboratorios de investigación, los métodos se están
simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluación en los
laboratorios clínicos.
FUNCIÓN GRANULOCÍTICA EN LA INMUNIDAD
MEDIADA POR CÉLULAS
Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor común. Los granulocitos son extremadamente importantes en la respuesta
inflamatoria precoz, y las alteraciones en sus funciones conducen a deficiencias importantes en la inmunidad celular. Estas suceden en cualquier
punto de una serie de procesos necesarios para la función de los granulocitos, incluyendo la dificultad en abandonar la vasculatura (diapédesis), el
movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimioquinesia). la opsonización del agente agresor (fagocitosis) y la destrucción por la vía de la generación de radicales tóxicos del oxígeno.
METODOLOGÍA: CITOMETRÍA
DE FLUJO Y DE IMAGEN
El empleo de la citometria de flujo (análisis celular basado en el láser) se
ha convertido en el estándar de la práctica del laboratorio clínico en el estudio de respuesta inmune celular, como se indicó previamente (Kamientsky.
1969; Hertzenber, 1976). Las determinaciones de la inmunocompetencia e
¡nmunomodulacíón de los marcadores y receptores de superficie específicos, la caracterización de la línea por medio de la fenotipificación inmune
de los linfomas y de las leucemias, la definición de malignidad empleando
sondas específicas de cromosomas, así como el estudio de la heterogeneidad tumoral por las mediciones multiparamétricas del ADN son estudios
frecuentemente realizados en muchos laboratorios, como se estableció previamente, y se detallan en Keren (1989a. 1989b), así como en muchas
otras referencias mencionadas a lo largo de este texto. La clasificación de
los tipos celulares por estos medios significa la posibilidad de definir las
funciones biológicas y efectoras en las bases moleculares y permite establecer las relaciones de estas mediciones con procesos y definiciones de
enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son posibles
empleando las tecnologías basadas en el láser. Se utilizan dos tecnologías
principales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabilizan las partículas y se determinan las características físicas y químicas de
las partículas que pasan a través de un flujo de líquido en una suspensión
de células aisladas. En la segunda, conocida como análisis estático, las
partículas son estacionarias y la plataforma o el láser se mueven como en
un análisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnología del análisis de
imagen se está haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la
evaluación de citospines preparaciones de contacto {louch preparations).
en preparaciones cromosómicas. y en secciones titulares para ciertas aplicaciones, como la hibridación ¡n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los
avances en la disponibilidad de las sondas fluorescentes para la FISH y la
representación cromosómica en los años recientes hará que estos análisis
859
sean más relevantes y útiles en el laboratorio clínico (Weinberg. 1993). Recientemente, la FDA aprobó el anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniería genética trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de pacientes
con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan el gen
HER2meu y al mismo tiempo aprobó una prueba diagnóstica en la que se
usan métodos de inmunohístoquímica (IHC) para la detección de la proteina HER2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la
FISH para detectar la amplificación de la expresión génica de la proteina
HER2/neu se está utilizando en laboratorios especialmente entrenados.
Cada prueba complementa a la otra, poseyendo cada una distintas dificultades técnicas y sensibilidad. El IHC suele producir falsos negativos debido
a la existencia de artefactos y necesita ser revisado por otro método. Con
el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la expresión génica no
tiene por qué equipararse necesariamente con la amplificación génica).
Como sucede en muchas técnicas, incluyendo el análisis del ciclo celular
en el ADN. cada uno de los nuevos marcadores y de las nuevas técnicas
deben ser definidos, evaluados y correlacionados con los resultados del
paciente antes de otorgarle o no una utilidad clínica absoluta. Se ha introducido el desarrollo de instrumentación que combina la fuerza de la citometria de flujo y las ventajas estáticas del análisis de imagen. Esos instrumentos, conocidos como citómetros de exploración por láser, realizan las
mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia adelante, dispersiones laterales y fluorescencia en las células en suspensión o
fijadas en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinará
si este abordaje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria
de flujo actual y con las configuraciones de sistemas de imagen (MartinReay, 1994) (Fig. 36-3). Los citómetros de exploración por láser y los análisis de imagen no se desarrollan en este capítulo.
Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrónicos, ópticos y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnología
de los ordenadores y del software han permitido que la tecnología de la citometria de flujo llegue a ser una rutina en el laboratorio. Además, la amplia
posibilidad de anticuerpos monoclonales agrupados, que incluyen más de 150
(Kishimoto, 1998), marcados con muchos colores, directamente conjugados y
en formato preformado ha permitido la detección simultánea de múltiples antigenos de superficie así como de constituyentes citopiasmáticos y nucleares.
La posibilidad de desarrollar análisis multiparamétricos es la mayor fuerza de
la citometria de tiujo. Actualmente, la determinación tanto de los marcadores
fenotípicos como de los intracelulares es una rutina en muchos laboratorios.
Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citometria de flujo
convirtiéndolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia de "caja
negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenómeno es
el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificación de las poblaciones de las células T para la monitorización de los pacientes con VIH (Shapiro, 1993: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de
la aparición de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el
laboratorio lúe principalmente para la caracterización de las leucemias y de
otras enfermedades hematológicas malignas y para el análisis del ADN de
tumores en la fase de síntesis (fase S) y el índice de ADN (DI). Aunque la tecnología de la citometria de flujo puede ser más "caja negra", la epidemia de
VIH ha aportado la citometria de flujo a un número mucho mayor de instituciones y laboratorios [College of American Pathology [CAP]. 1990-2000). Esto
ha permitido a esta tecnología ser una parte integral de muchos diagnósticos
y un importante complemento en el tratamiento de los pacientes. A pesar de
su simplificación, persisten muchas cuestiones relacionadas con la regulación
de la FDA, la competencia de los análisis y la gestión y reproducibilidad de los
datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al análisis del ADN (CAP,
1990-2000). No es el propósito de este capítulo describir todos los matices de
la citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometrías de
flujo actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipificación y análisis del ADN. La mayoría de los problemas de los laboratorios
son la imposibilidad de estandarizar los reactivos de control de calidad y los
calibradores y la pérdida de métodos rápidos y fiables para la transferencia y
almacenaje de datos, compatibles con los sistemas de información del laboratorio. Se insta a los lectores a que consulten las numerosas referencias para
una selección apropiada del citómetro de flujo o de imagen referente en
cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (Shapiro, 1993, 1995).
860
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 36-3. El empleo de citómetro de exploración por láser (LSC) produce dalos que son comparables a los datos de la citomelría de flujo:
sin embargo, debido a que la máquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la citomelría de flujo, en la que toda
la información de cada célula se encuentra en un solo pulso electrónico para cada parámetro, la LSC emplea cientos de mediciones para calcular y extraer los parámetros para cada célula. También es posible obtener parámetros derivados. El valor celular es la cantidad total de fluorescencia por célula, pero los parámetros derivados, como el área celular y el valor pico, son también importantes. La figura muestra los datos
de una preparación con cytospin de células HL-60 que fueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo
parámetro del valor rojo, así como las tres posibles combinaciones de los parámetros rojos derivados. De particular interés es la agrupación
de células localizada debajo de la letra c. La muestra tue teñida con hematoxilina y eosina. y las células de las áreas marcadas (videsupca)
fueron trasladadas. Se muestran las lotos digitales de las primeras 20 células trasladadas a cada región. Las células en la región c están en
mitosis. mientras que las células en la región d, b. y a se corresponden a células a través de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular.
(Cortesía de CompuCyte. Cambridge, MA.)
Más importante para los médicos es la comprensión de la tecnología, las fortalezas y las debilidades en el control y garantía de la calidad, en la preparación de la muestra y en la interpretación de los datos.
Hardware y otras herramientas
Fuente luminosa y procesamiento de la señal
La citomelría de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasificación, y esta propiedad persiste con los elementos de investigación en los
laboratorios altamente especializados. La citometría de flujo clínica emplea
ahora helio-neón o diodos láser y láser de ion de argón refrigerados por aire
o un único ion de argón refrigerado por aire con emisión a 488 nm (Bogh.
1993). El láser actual tiene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW,
y dura más de 6.000 horas. Esos láseres, comparados con los previos refrigerados por agua, son fáciles de mantener, no requieren precauciones especiales de seguridad y son más baratos de sustituir. Si un laboratorio está interesado en desarrollar cinco o más colores de análisis empleando sondas de
Hoescht estimuladas con radiación ultravioleta, entonces es necesario
emplear grandes láseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los
láseres refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos
láser están eliminando la necesidad de los láseres relrigerados por agua. La
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR
mayoría de los citómetros de ílujo multifacéticos clínicos utilizan un láser simple de ion argón refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomultíplicadores. Las configuraciones instrumentales más Irecuentes incluyen el
Becton-Dickmson FACScan que está siendo reemplazado por el FACS-Calibur (tiene un módulo de clasificación con capacidades limitadas) y el FACS
Vantage para ocho o más parámetros y categonzación de alta velocidad. El
Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laboratorio habituales,
ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulter XLs o el
FACSCalibur. Beckman Coulter continúa con el Coulter XL y software mejorado para el tratamiento de datos. Además, el ASTRA de Beckman Coulter
añade a la categonzación de alta velocidad, ocho parámetros adicionales
para el laboratorio de investigación. La introducción del XL como última tecnología en citometría de flujo con el empleo de señales de procesamiento de
pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995). con convertidores de analogía
digital de alta resolución (ADCs). invalida el uso de los amplificadores logarítmicos (log amps). Este es un importante avance ya que elimina cuestiones
de alineación y baja sensibilidad en los límites bajos (umbral) en la medición
de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicional, las
mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero tienen
que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para
colocar todos los puntos de interés). Este proceso en los instrumentos no
digitales se lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logarítmicos. Desgraciadamente, esta conversión de la señal lineal por medio del
ADC a los amplificadores logarítmicos ocasiona un ruido que origina un
aumento de los coeficientes de variación de procesamiento de la señal (CV)
al aumentar la señal fluorescente Esto hace que cada medición tenga diferente sensibilidad ya que el CV de la señal de conversión aumenta con un
mayor número de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos técnicos que
utilizan una citometria de flujo clínica realmente no entienden la causa de la
sensibilidad variable de los amplificadores logarítmicos en sus instrumentos,
se enfrentan a los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de
su escala logarítmica. La linealidad es particularmente importante en la
medición del contenido del ADN (como las mediciones del ADN se hacen en
una escala lineal, los problemas de la amplificación logarítmica se eliminan
pero entran en juego otros factores electrónicos similares) ya que el valor DI
depende de su exactitud. Ademas, la alineación se está haciendo cada vez
más importante en la medida cuantitativa de la fluorescencia de la proliferación y la activación (Auer. 1994; Shapiro, 1995) así como está afectando al
valor pronóstico de los valores de la fase S en ciertos cánceres. El laboratorio debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolución, y controles
de calidad antes de desarrollar trabajos clínicos. Los controles de calidad
diarios se definen posteriormente en este capítulo. Se remite de nuevo a los
lectores a revisar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer.
1993: Shapiro, 1995).
Flujo celular
En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la
mayoría de los instrumentos clínicos se utilizan en la medición de las células
CD4 en la monitonzación de la enfermedad por VIH, la mayoría de los sistemas clínicos utilizan un sistema cerrado como precaución de riesgo biológico. El primero, conocido como un flujo celular de corriente en aire o de flujo
en aire, permite que el punto de medida óptico se encuentre directamente
sobre la corriente de muestra. Este tipo de flujo celular minimiza la distancia
entre la cámara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto
minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra necesario entre las mismas. Esta cámara permite una mayor variabilidad del
grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 1993:
Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son importantes en la clasificación celular y no se consideran aquí. En el sistema
cerrado, a menudo referido como punta de cuarzo o célula de flujo, el punto
focal está dentro de la cámara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo
son la fineza del cuarzo y por ello la difracción del haz del láser o la dispersión de la señal. Adicionalmente. la sección cuadrada tan relativamente
amplia (200/ pm) hace que sea más difícil controlar el flujo. El éxito de estas
células de flujo de cuarzo en el sistema clínico depende de la iluminación y
de las ópticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avanzado mucho
861
en estos sistemas para proporcionar seguridad y una máxima sensibilidad
con el uso de sistemas basados en láser de baja potencia iBogh. "993).
Todos los términos empleados en la definición de estos sistemas son confusos, incluyendo la tasa del flujo, la cubierta de presión, el tamaño de la parte
central, la velocidad resultante de la partícula, el CV resultante, etc El factor
más importante que ha de comprender un trabajador de laboratorio es que
en el análisis del ADN, las células son analizadas con un flujo bajo para
aumentar el tiempo que permanece la partícula en el haz, lo que permite una
mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificación. la sensibilidad no
es un problema especial, y el flujo de la partícula puede aumentarse. Muchos
sistemas clínicos están comprometidos en acomodar las dos aplicaciones
más frecuentes: la inmunotipificación y el análisis del ADN (Shapiro, 1993,
1995a: Goetzman. 1993). Los citómetros de flujo de investigación tienen mucha mayor flexibilidad y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la
presión diferencial y el tiempo
Colores y más colores:
aplicaciones de los fluorocromos
Muchos laboratorios todavía emplean los fluorocromos más frecuentes, el
isotiocianato de fluoresceína (FITC: 530 nm de emisión) y el ficoeritrin (PE;
575 nm de emisión) en la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC
se conjugan directamente por el anticuerpo de interés y simultáneamente se
añaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo
secundario como una IgG de carnero antirratón (GAM) marcada con fluoresceína para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluorescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados en la clínica en el
estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo con sangre
completa. El Pl puede utilizarse simultáneamente con el análisis de superficie
realizado en el análisis multiparamétrico del ADN, aunque esto requiere la
conservación de la membrana celular (Clevenger, 1993).
Existen más tinciones disponibles en el laboratorio clínico que permiten
mediciones simultáneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales
marcados directamente y excitados en un láser a 488 nm. Esta disponibilidad está revolucionando el desarrollo actual de la citometria de flujo en la
práctica de laboratorio Estas tinciones con una emisión roja o roja lejana
incluyen el tándem PE Texas Red (625 nm de emisión), el tándem PE-Cy-5
(675 nm de emisión) y la alolicocianina (675 nm de emisión), por nombrar
unos pocos (Fig. 36-4). Los primeros tándem eran problemáticos ya que el
exceso de PE libre en la solución conducía a un exceso de fluorescencia de
fondo. Están surgiendo nuevas tecnologías para la síntesis de estas tinciones, resolviendo muchos de los problemas técnicos, y constantemente se
están añadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clínico
(Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas,
se puede desarrollar un análisis de la población de VIH en un único tubo con
gran seguridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se liñe simultáneamente con CD45, PE-Cy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con
el nuevo procesamiento de señal digitalizado. la compensación (wde inlral
se lleva a cabo fácilmente, y se realiza el análisis empleando el CD45 como
un agente iniciador mediante dispersión lateral (SSC) y el análisis simultáneo
de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenómeno interesante es que estas
nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia como un iniciador en lugar de los parámetros habituales de dispersión de luz. Esto es
posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes
de la mayoría de las células o no tienen competición autofluoresceme en
estado natural como se encuentra con el FITC. Además, pueden excitarse a
una longitud de onda que minimiza la autofluorescencia de los constituyentes celulares como la riboflavina. Por tanto, cuando ocurre un suceso raro
(presencia celular <0.1% de la población total) empleando un iniciador fluorescente, se pueden analizar muchas células rápidamente Este método
también se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando
fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el núcleo o el
citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los métodos de evaluación de sucesos raros son cada vez más frecuentes y más fiables para el
laboratorio clínico. Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En
la evaluación de la enfermedad residual mínima (MRD) incluyen la PCR. la
citometria de flujo combinada con sondas nucleares, la citometria de flujo
862
SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometría de flujo multicolor multiparamétrica (De Shapiro HM: Practical Flow
Cytometry. 3- ed. Nueva Cork, Wiley-Liss, 1995. pág. 245. Copyright © Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)
con la utilización de múltiples marcadores que delinen el fenotipo leucémico
y varias aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisión real de la
médula ósea en la leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha
demostrado en el análisis de citometría de flujo; simplemente es un tema de
nivel de sensibilidad y de detección del suceso (Campana. 1995.1999). Esto
obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resultados de la citometría de flujo frente a los criterios morfológicos de remisión
y predicción de recidivas. Sigue evaluándose cómo afectará esto a las estrategias de tratamiento en varias enfermedades hematológicas malignas. Además, el empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es más habi-
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tual. La detección de las señales de RT-PCR en pacientes que se encuentran en remisión clínica todavía no está clara, mientras que la detección del
MRD por amplificación de la PCR de los genes del receptor antigénico se ha
correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento (Campana, 1999).
El empleo de fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del
análisis mulliparamétrico llegue a ser una realidad en muchos laboratorios.
Los parámetros pueden evaluar 1) diferentes poblaciones funcionales de una
población celular particular empleando unas sondas fluorescentes mtracelulares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeños grupos de
863
otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el estatus de activación celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el
empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificación del
VIH empleando un abordaje en ancla): (4) asi como observar la expresión
de la superficie celular y el DI o fase S de una población particular de células al igual que definir la fase S CD19 en la leucemia aguda. Obviamente,
las posibles combinaciones son casi infinitas y su sofisticación está aumentada por la disponibilidad de marcadores específicos y sondas de ADNARN
(Fig. 36-6). A continuación se expone un análisis sobre algunas de esas
investigaciones y técnicas.
4 C O L O R (1)45/4/3/8
Figura 36-5. A. Empleo de la atometría de flujo de cuatro colores en el desarrollo del panel de moni
tonzación del VIH. El método demuestra el empleo del CD45 como estrategia de comienzo y el
empleo del CD45 y la dispersión de luz en el desarrollo de una diferenciación en tres partes (H-6). El
empleo de la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de células T sean medidas en el mismo tubo y que todas las células sean contadas. El histograma 7 se incorpora en la región
F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SSC). En el histograma 1. el empleo de la región Q
define los desechos. Si estos son mayores del 15% del total de sucesos, normalmente se toma como
una muestra inaceptable. Esta investigación permite analizar todos los parámetros y compararlos
entre si. (Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados fueron de clones Coulter o (SectorDickinson para el FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.)
La ilustración continúa en página siguiente
SECCIÓN V
864
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 36-5. Continuación. B. panel de monilorización del VIH como en A, excepto que en este caso los paneles incorporan el empleo de un
parámetro de recuperación lintocítico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, en H:2 se demuestra el
empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepción permiten calcular y comparar múltiples valores del CD3 trente a otros.
ID Pcnt
11 1.7
12 71.2
13 1.4
14 25.6
Figura 36-6. El empleo de la citometría de
flujo multiparamétrica permite la detección
simultánea de una superficie fluorescente
(CD20 positiva) y por lo tanto la definición de
la linea celular y después la posibilidad
simultánea de medir la intensidad de yoduro
de propidio y así la medición del contenido
total de ADN. para identificar las células leucémicas específicas marcadas como CD20.
Esta técnica evita la necesidad de aislar la
población de interés antes de la tinción del
ADN y puede hacerse simultáneamente con
la tinción de la médula ósea para la evaluación leucémica. Otras poblaciones, como las
citoqueratinas y otros marcadores de estirpe
celular, pueden ser identificadas en tubos
adicionales. La muestra de médula ósea fue
teñida con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y
después fijada empleando metanol, permeabilizada usando Tritón X al 0.1%, y teñida
con solución de yoduro de propidio (Pl) y
ARNasa estándar. Los linfocitos de sangre
periférica fueron utilizados como control normal no ciclico (no se muestran los dalos).
CAPITULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
RECEPCIÓN Y ANÁLISIS
Inmunofenotipificacion: aplicación
a las muestras habituales y leucémicas
El análisis de las poblaciones celulares con la citometría de flujo emplea
una combinación de parámetros que. cuando se aplican, definen una población especifica de células. La citometria de flujo emplea parámetros similares
a aquellos que se han empleado durante muchos años en hematología, incluyendo el tamaño (por dispersión de luz hacia delante), la granulación citoplasmática (dispersión lateral), las afinidades por marcadores específicos y
otros, y las combina con las herramientas inmunológicas ya mencionadas.
Estas incluyen múltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o
sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la detección
simultánea de estos parámetros por los sistemas analíticos actuales. Durante
muchos años, la citometria de flujo del laboratorio clínico sólo podía emplear
tres mediciones simultáneas incluyendo la dispersión de luz hacia adelante
(FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE. La tinción de las poblaciones
celulares estaba limitada por la no disponibilidad de anticuerpos monoclonales conjugados directamente, necesitándose la utilización de un reactante
GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con bíotina. La definición de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo
necesario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo
positivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la población
celular tiene un límite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cursor de modo que no más del 2% de los acontecimientos considerados como
negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos
positivos empleando un control isotípico emparejado. Aunque esta investigación parecía razonable en aquel momento (Lewis, 1993) y funcionó bien con
grupos celulares brillantes, se ha hecho bastante incómoda a la hora de identificar células leucémicas o de desarrollar análisis de marcadores de activación celular. Las células leucémicas eran particularmente problemáticas, porque cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los
controles isotópicos pueden tener poca relevancia. La aplicación de reglas
estrictas y rápidas a los cursores de posición conducía a una infraestimación
de los grupos positivos. El fallo de esta lorma de actuación se hace especialmente dramático en el análisis de la monoclonalidad de la expresión de cadenas ligeras K y A. A menudo se perdían diferencias pequeñas pero significativas. Se ha cuestionado en muchos casos el empleo de isotipos de control en
ciertas situaciones, tanto por las aberraciones técnicas asociadas con su utilización como por los costes añadidos al laboratorio. Los nuevos algoritmos
de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de
definición de grupos basándose en los significados de las intensidades de las
poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como la
cuantilicación del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la
necesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biología de
la población de interés cuando se diseña un protocolo de análisis. Afortunadamente, algunos software sofisticados y los mejores reactantes nos han
permitido utilizar entradas multiparamétncas para identificar las poblaciones, antes que intentar hacer estimaciones de la expresión fluorescente
empleando valores cursor. Muchos investigadores han empleado la investigación mulliparamétrica para definir grupos u otras poblaciones de interés
(Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Porter,
1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se
revisan aquí.
Con la llegada de la florescencia multicolor surgió la necesidad de analizar el número de células que expresaban uno o más colores al mismo tiempo
en una población celular particular identificada por las regiones FALS y SSC.
Cuando se desarrolló este método por primera vez. los científicos estaban
pensando básicamente en cálculos matemáticos y recuento de todas las
células y en el número de estas células que expresaban uno o más colores.
Se desarrolló una investigación binaria para este análisis, conocida como
prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de análisis tenían una entrada
difícil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones
no se podían redefínir posteriormente utilizando listas de análisis de modos,
865
provocando una frustración importante. La técnica fue modificada con posterioridad para permitir más recepciones, y otros fabricantes con el software
realizaron esta aproximación binaria con base postanalílica Loken entonces
identificó las poblaciones de la médula ósea empleando el CD45 frente al
SSC. una investigación única para identificar las poblaciones heterogéneas
presentes en la médula ósea (Fig. 36-7). Estos y otros iBorowitz. 1992) desarrollaron el concepto de patrones que identifican estados leucémicos específicos. Shapiro empleó una vía de estimulación para definir la evolución de
este concepto (Shapiro, 1995c). Después Loken promocionó el empleo del
análisis de entrada dual-paramétrico con CD45 y CD14 en la región linloci
tica del FALS frente al SSC en sangre periférica (Loken, 1990). Muchas
agencias aceptaron y promovieron esta investigación en la mayoria de los
paneles de citometria de flujo para el VIH para minimizar el efecto de los
monocitos contaminantes en la población Imfocítica ya que podrían interferir
con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocitos tienen receptores CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que iniciaron este
tipo de análisis incluían los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alérgicas e
Infecciosas, la División de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de
Nueva Cork, el Comité Nacional para la Estandarización del Laboratorio Clínico (NCCLS. 1992) y el CAP (1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta
investigación solucionó muchos problemas, no asegura que cada tubo en el
panel tenga los mismos contenidos que el tubo que contiene el CD45 y el
CD14, y la corrección purificada corregida puede ser sobreestimada, conduciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisados durante
una conferencia convocada por el CDC. un año después de que se publicaran las líneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer.
1993; CDC. 1993). Otros análisis de esta investigación se han desarrollado
por el ACTG Flow Advisory Comittee en el programa DAIDS Proficiency
CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1993) y por el CAP en su programa de análisis de competencia (Homberger, 1993). Una nueva investigación de recepción fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron a la investigación
original de Loken para identificar los grupos de la médula ósea (Loken.
1990). El empleo del CD45 como parámetro de entrada ha simplificado el
análisis de la médula ósea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revisiones de médula ósea y leucemia, el CD45 normalmente se establece
como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersión luminosa
anterior o la dispersión lateral; esto permite la identificación de una pobla
ción potencial de blastos (malignos) La población de blastos entonces se
identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los tres parámetros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el método de CD45 en tubo,
con cuatro colores, permite la identificación de una región grande de linfocitos iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto
también puede hacerse sin la utilización de los parámetros de dispersión
luminosa, como se describió previamente (también puede hacerse empleando un panel de dos tubos, tres colores). Recientemente, nuevos productos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) añaden gotas precontadas ai
tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto de irfo
citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo que
la fenotipificación. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hematología) cuando se desarrollan las enumeraciones de célula T y elimina los
problemas del deterioro de los glóbulos blancos al empaquetarse y permite
un diferencial exacto para obtener el número de células T exacto. Estos
métodos están siendo incorporados en los ensayos ACTG VIH y en oros
laboratorios.
Otra estrategia de recepción es el empleo de dos o tres identilicadores de
una población particular de interés. Esta investigación, frecuentemente conocida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza las propiedades particulares de algunas células para investigar otro tipo de parámetros. Cuando se
aplican específicamente a linfocitos T, se considera como una puerta-T
(Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de
especial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las
poblaciones de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar
la expresión de CD45Ra y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja
de este método es que es intuitivo y que cada color actúa como un control de
calidad para la otra población (Fig. 36-8). Además, tenemos la posibilidad de
identificar la expresión de marcadores biológicamente relevantes en relación
S66
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
3: P
4:
k
ENTRADA Bl ÁSTIC A
ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45
(1)34 C"D33 (1)45
Figura 36-7. Médula ósea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada de imagen luminosa: (paneles
H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linfática. FTIC frente a PE, identificando la población de blastos
CD34/CD33 doble positiva (61,1% de todos los linfocitos se identifican como blastos). H3: Entrada total. CD34/CD33
doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados como blastos). H4: Blastos identificados por el CD45
frente al FALS son iguales a 46,5% (letra región k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6, H7:
Dispersión lateral identificada por marcador fluorescente de interés (PE-CD33, FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45).
(Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente fueron obtenidos tanto de Coulter como de Becton-Dickmson para los clones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S. San Francisco,
CA] para los clones Cy-5 marcados.)
con las poblaciones funcional o biológicamente relevantes. Esta evaluación
es buena por si misma para cuantificar la fluorescencia (véanse histogramas
2 y 3. respectivamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no
es nuevo, sí lo son las técnicas para medir los equivalentes de fluorescencia
o los umbrales de fluorescencia u otros similares. Las mediciones cuantitativas de la fluorescencia se describirán tras el análisis y entrada del ADN. Otra
investigación para la puerta de entrada se encuentra en la recogida de CD34,
que emplea el CD34 y el CD45 teñidos con o sin ADD como una evaluación
de viabilidad en la identificación y enumeración de los progenitores celulares
CD34. Estos métodos también utilizan gotas para enumerar el número de
células recubiertas. Estos métodos tienen gran utilidad en los protocolos de
trasplante de médula ósea en los que los progenitores celulares se extraen de
la sangre del cordón, de la médula ósea o de sangre periférica y, posteriormente, se reinfunden (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and
Graft Engineering [ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigación se ha convertido en
el patrón para muchos laboratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9
delinea dos métodos estándar, el ISHAGE y el protocolo Milán para desarro-
llar la enumeración de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Becton-Dickinson) utiliza una investigación similar y reactivos para automatizar el
proceso. Adicionalmente. se ha diseñado un método capilar llamado ensayo
Steller, un procedimiento sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (BectonDickinson).
Análisis del ADN
Generalidades
Conceptualmente, la realización del análisis del ADN debería ser más
simple que el análisis de inmunotipificación, pero la revisión de los datos
publicados y sus capacidades pronosticas asi como los progresos por los
laboratorios sobre las pruebas de competencia indican otra cosa (Nicholson,
1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997). Se convocó una conferencia de
consenso de ADN y los resultados se publicaron en Cytometry (Shankey.
1993). Esta publicación fue una revisión histórica de los principales tipos de
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clínico
de la medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parámetros
fueron analizados en términos de efectividad como marcadores pronósticos.
La conferencia CAP #26 de 1994 se basó en los marcadores previos y en
marcadores indirectos de algunos tumores potenciales adicionales. En cada
caso, el DI y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronósticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido a la variabilidad en la realización técnica y al análisis de estos ensayos (tanto en la preparación de instrumentos como de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad
tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realizaron recomendaciones específicas en cada tipo de tumor para las medidas apropiadas de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de «involución apropiada de los histogramas.
Preparación de la muestra
Los métodos de preparación del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar. Existen muchas referencias para los métodos originales, asi
867
como muchas modificaciones. Los métodos más frecuentes, desarrollados
por Krishan. Vmdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vindelov, 1994), son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En
cada caso, ya estén las células enucleadas o conservada la membrana celular, el marcador Pl de ADN es el que más frecuentemente se utiliza en la
mayoría de los laboratorios clínicos y ya se ha descrito. La tinción Pl es
directa a condición de que se sigan el tiempo, la saturación y los parámetros
de extracción del ARN Las medidas de las alteraciones macroscópicas del
cariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captación
de Pl) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta
medición incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor,
el índice GyG, o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el
paquete de software de deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del
tumor presente (muestreado) en la muestra. Es frecuente ver que los laboratorios publican el resultado de un tumor diploide en una muestra que "no"
contiene tumor. Los tumores con valores casi diploides necesitan reglas de
interpretación estrictas, como la definición de tetraploidia. Surgen más pro-
Figura 36-8, La citometría de flujo con cuatro colores para realizar estudios funcionales permite el estudio
recíproco de poblaciones celulares, como sucede con el estudio CD45Ro (definido como memoria) y el
CD45Ra (definido funcionalmente como nave) en un determinado subgrupo de células T. Esta figura
demuestra la definición de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (región E) evaluada en los histogramas 5.
6 y 7 para la expresión de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y las células no CD4. Esto
se puede utilizar como una determinación comparativa de los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo.
La fluorescencia en cinco colores debería permitir el uso simultáneo de CD8. que debería medirse y compararse con los CD4. Obsérvese la ausencia clara de tinción no específica actualmente disponible utilizando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la cuantificación directa
de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la comparación de un punto y otro en el tiempo en
un estudio longitudinal mediante histogramas simples con parámetros, como es el caso de los histogramas
2, 3, 6 y 7. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a través de CD45Ra y CD45Ro se
obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron utilizando los métodos de lisado
de sangre completa estándares).
868
SECCIÓN V
C8228950.02
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
C8228950.02
C8228950.02
Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Milán para la enumeración del CD34. Arriba, la enumeración de las células CD34+ en sangre del cordón
por análisis de citometria de flujo utilizando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Milán (fila de abajo). Se define
la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia utiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la región
celular dim CD45 y para excluir las células muertas empleando 7AAD (no mostrado) (fila superior). La fila del medio muestra el protocolo
ISHAGE con un isotipo control. • El protocolo Milán utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del centro, abajo) para establecer los cuadrantes, el inferior derecho se usa para excluir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, Keeney M, y cois: The ISHAGE
guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996; 3:213, con permiso.)
blemas en la definición de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de
cortes y restos de núcleo y la población en fase S. La sigla, descriptiva y semicuantitativa, de BAD se utiliza en el paquete de software de análisis para moldear los efectos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994)
(Figs. 36-10 y 36-11). El impacto de este parámetro en el análisis es controvertido.
Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de
análisis paramétrico simple (sólo Pl) están sujetas a estos algoritmos de
deconvolución. llevando a una gran variabilidad entre los laboratorios
(Coon, 1994). Los algoritmos de deconvolución para el ADN se han estu
diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilch. 1993. 1994. 1999:
Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos modelos
CAPITULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
empleados para el análisis necesitan un mayor estudio. El documento de
consenso del ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos
tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen análisis en
concordancia, pero incluso con estas pautas existe un nivel de ambigüedad en la interpretación y rendimiento en el laboratorio clinico. Estas
ambigüedades contribuyen a la discordancia de los resultados en estudios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 1988,
1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la
interpretación de los resultados sea más difícil para los laboratorios nuevos y para ios el nicos que están intentando comparar los resultados de
su laboratorio con la bibliografía reciente en el tratamiento de sus pacientes Esto es especialmente cierto en la clasificación de los valores de la
fase S. Las medidas de la (ase S están sujetas a los efectos de los restos y modelación de los agregados como describieron Rabinovitch (1993.
1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (1988), Wheeless, (1991) y otros. El área entre 2C y 4C está sujeta a interferencias
por artefactos. Además, es de importancia clave que la decisión con res-
869
pecto al modelo matemático usado para un tumor determinado se mantenga constante y que los datos del modo de lista se conserven sin cambios por si se necesitan más análisis.
Debido a la dificultad en el análisis del histograma del ADN. algunos han
propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios expertos. La actualización de la FDA no ha aclarado ningún método y todavía se
considera como una prueba en investigación. Desgraciadamente, durante
muchos años la práctica clínica sugería otra cosa. Múltiples artículos proponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente debido al alto grado
de variabilidad y de pérdida de significado pronóstico (ASCO. 1996). Poste
riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para resolver algunos de los temas en el análisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y
36-13). Está en desarrollo un patrón o guía de la NCCLS para su emplee
por los laboratorios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles
de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronósticos y como medidas de la actuación y práctica médica.
Figura 36-10. Empleo de diferentes técnicas de entrada para el análisis del ADN A.
Pico tradicional frente a su integración con la correspondiente excusión de dobletes.
El histograma de un parámetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro de
propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G con el
correspondiente G..M. B. Nuevo método de entrada (K.D. Bauer. comunicaciones
personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la medición integral y al
FL3 (área) Este método está siendo evaluado para mayor consistencia en la eva
luación de los valores de la fase S C. Pico frente a integral demostrando que el
66.8% de los acontecimientos se encuentran en la puerta de la población (pico
frente a integral, puerta b).
SECCIÓN V
870
4(H)
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
80818589.H83 FL3 HP's "A"
DIPLOID CVCLE
Figura 36-11. A y 8, El empleo de técnicas con modelado informático en dos tipos diferentes de muestras. En A. se demuestra una linea
celular fijada. Esta preparación muestra pequeños restos y una buena recuperación de la población aneuploide. Ambas poblaciones demuestran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una linea celular de la muestra. En B. se demuestra una sección de una muestra
en parafina con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno, y los restos son minimos. La muestra demuestra
una fase S del 9%. (Cortesía de Multicycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)
Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un modelo estático o un dibujo en el tiempo de todas las células analizadas.
La integración del área para el número de células entre 2C y 4C en el histovados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y
grama del ADN no es capaz de dar ninguna información respecto a las céluotros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN) para mejorar la calidad de los
las "detenidas" en S (las células en realidad detienen la síntesis de ADN) o
modelos en la estimación de las propiedades proliferativas y cinéticas de un
de medir el número de células normales infiltrantes que pueden estar también
determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la proliferaproliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capacición no son iguales que las medidas de la cuantificación de la fase S, que son
c
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Contenido de A D N / D A P 1
Figura 36-12. Representación mulliparamétrica del contenido de ADN (escala vertical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (escala horizontal) que muestra
una población celular citoqueratina-positiva con menos de 2N de contenido de
ADN El estroma celular citoqueratina negativo se emplea para establecer la referencia 2N. permitiendo esto la identificación de las células hipodiploides. El histograma sin entrada convencional en el panel inferior demuestra la imposibilidad de
asignar un contenido de ADN a la población celular mixta del tumor y de células
estromales (Glogovac, 1999).
dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El histograma de un parámetro proyecta resultados razonables cuando se trata de
una población celular asincrónica, relativamente homogénea. El mareaje por
pulsos se utiliza más frecuentemente en grandes entornos académicos y más
a menudo para medir la efectividad de la irradiación y quimioterapia obteniendo medidas reales de las células G,. G.. así como de los compartimentos
G + M. lo que no es posible empleando medidas paramétricas simples de la
fase S.
Pueden utilizarse otras técnicas con sondas nucleares y citoplasmáticas
asi como marcadores de superficie para separar la población de interés de la
mezcla de tipos celulares. Este tipo de análisis multiparamétrico es muy útil
para medir la lase S en las neoplasias hematológicas malignas (Fig. 36-6).
Puede identificarse la población especifica de blastos por el FITC fluorescente y por el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de
ADN y de la lase S empleando el Pl. Los métodos de tinción están alterados para conservar las propiedades de la superficie nuclear o las propiedades nucleares (Clevenger. 1993: Ramaekers, 1993: Carothers, 1994; Bauer,
1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos métodos normalmente incluyen la tinción del marcador de superficie de interés (p. ej.. KI-67. ciclina B1.
citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijación en alcohol (o
fijación comercial y permeabilización reaclante) y tratamiento con un detergente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los métodos
de tinción se modifican selectivamente para conservar las propiedades de
membrana y núcleo especificas de la sonda de interés (Bauer, 1994).
Esludios de interés del ADN
Se ha publicado mucho en la bibliografía sobre la apoptosis (a menudo
definida como muerte celular programada) y su relevancia en los parámetros
tradicionales del ADN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el propó-
871
sito de este capítulo desarrollar este tema. Aunque se están realizando muchos estudios, las mediciones de la apoptosis todavía no son parte de la rutina del laboratorio clínico.
Como se mencionó anteriormente, el análisis de laboratorio del ADN se ha
controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembolsan. Muchos investigadores de este campo han votado por la exclusión sistemática de esta prueba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos
tumores. Bagwell y otros, están estudiando retrospectivamente la reevaluación de un grupo de casos de cáncer de mama para tratar de desarrollar un
modelo pronóstico unificado para los pacientes con cáncer de mama con ganglios negativos En el análisis se incluyen un total de 350 histogramas de ADN
unívariantes de tres centros de cáncer de Suecia (Bagwell, 2000). El estudio
está tratando de identificar y corregir los factores que pueden haber disminuido la utilidad de la fracción de la fase S como describieron las recomendaciones de la Sociedad Americana de Oncología Clínica (ASCO), para desarrollar un modelo pronóstico para el cáncer de mama ganglio-negativo, para
identificar posibles avances en los métodos de la citometría de ¡lujo y para
demostrar la utilidad de estas técnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comunicación personal. 2000) y col. se ha publicado recientemente sobre 630 muestras de tumores de mama fijadas con formol de mujeres menores de 45 años
empleando un análisis bivariante de citoqueratina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13).
Este análisis se desarrolló para aumentar la capacidad de detectar poolaciones tumorales mezcladas donde los índices de supervivencia pueden disminuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdido en el
análisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan
resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnóstica útil que
previamente quizá fue infravalorada por su complejidad.
Citometría de flujo cuantitativa:
mediciones de intensidad de fluorescencia
La definición de los tipos celulares en términos mmunológicos como las
células efectoras implica la propiedad de estas células de regular, ya sea
aumentado o disminuyendo, las funciones moleculares especificas a través de
receptores de superficie. Conocidas como fenotipos inmunológicos (Poncelet,
1993). estas células necesitan otras propiedades medióles para definir sus
papeles biológicos en la maduración y en los procesos de enfermedad. Uno de
los fenómenos observados es la diferente expresión de antígenos de superficie celular (CD) en términos cuantitativos relativos y absolutos. Antes de la disponibilidad de las medidas absolutas, los términos descriptivos como brillante
u oscuro, bimodal. y demás, eran utilizados en la bibliografía para describir un
fenómeno visual de diferentes densidades antigénicas. Aunque descriptivos,
estos términos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorios y
entre los pacientes. También pueden perder precisión a la hora de definir un
hecho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento
de los pacientes o la definición (tipo celular) mediante la medida de la expresión de CD y el solapamiento de la expresión. La evidencia sugiere que las
diferencias cuantitativas en la expresión antigénica en la leucemia linfocítica
crónica y en otras leucemias puede ser importante para determinar el pronóstico (Poncelet. 1985). Estas medidas también se emplean en la definición del
MRD y en la investigación del efecto o activación viral en la enfermedad por
VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de células específicas presentes a menudo
no aporta una imagen clínica real. Esto es particularmente cierto en los casos
de leucopenia y cuando la población de blastos es un porcentaje relativamente
pequeño del total de células presentes.
La citometría de flujo cuantitativa (QFCM) se define como la cuantificación
de la intensidad fluorescente (Fl) determinada por la capacidad de unión del
anticuerpo de un anticuerpo conjugado con un fluorocromo. y es una medida
indirecta de la cantidad de antígeno celular de superficie por cada célula individual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet. 1985, 1986; Schwartz,
1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos de polieslireno o
líneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticuerpo para
determinar el número de absoluto de receptores o de determinantes amígameos por célula, también denominados densidad antigénica (Poncelet. 1993).
Las unidades ABC se definen como la medida de la capacidad retal/va de
unión del anticuerpo.
Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de células de tumores tijados en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tinción de citoqueratina (FITC).
Al Una población aneuploide de CK+ de cáncer de mama: A2, Un cáncer de
mama mulliploide con una población hipodiploide y casi Iriploide aneuploide.
Véase que el contenido diploide de ADN se identifica por la localización de la
población celular CK. A3. Un ganglio lintático axilar con metástasis de adenocarcinoma de mama. La presencia de la población celular muy pequeña ce células aneuploides (2%) es ambigua en los datos no metidos (véase Fig. 36-128):
sin embargo, en la presentación bivariabte. las células CK+ aneuploides son claramente evidentes. A4, Tinción con citoqueratina de células de tumor prostátíco
extraídas de biopsias fijadas en parafina. La exclusión de las células CK del
estroma en el análisis del ciclo celular del ADN incluye la medición del 2,6% a
3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un ganglio axilar con metástasis de
adenocarcinoma de mama mostrando un dato sin entrada (línea gruesa y línea
de puntos mostrando 10x en la escala vertical) y el dato de la citoqueratina del
ADN introducido (línea de guiones) La presencia de células aneuploides es
ambigua en los datos no metidos: si se reconocen como una población aneuploide, representan solo el 2% de las células, concordando con la abundancia
histológica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. Palanca BJA. Rabinovitch
PS: Cytokeratin Immunofluorescence in DNA analysis of paraffin extracted cells.
Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. con permiso.)
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
Este método no necesita igualar los Índices de fluoresceinaproteína (F P).
ya que las células y el modelo se han teñido con el mismo anticuerpo. El
empleo de mediciones de intensidad fluorescente debería proporcionar al
usuario un medio para evitar esta situación.
El empleo de lineas celulares o microgránulos para construir una curva de
calibración estándar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986):
1. Los anticuerpos en condiciones de saturación deben unirse a la super
ticie celular a través de una interacción monovalente.
2 El número de lugares antigénicos por célula puede inferirse de la cantidad de anticuerpo unido.
3. La intensidad fluorescente puede determinarse utilizando una curva
de calibración con células de diferente expresión antígénica o con gra-
873
nulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de
ratón a las concentraciones de saturación del anticuerpo. Estas medidas están sujetas a la variación de la capacidad de unión de los anticuerpos monoclonales específicos con la inmunoglobulina de ratón,
asi como a las interacciones del poliestireno con los clones específicos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un laboratorio a otro y pueden no ser las mismas para los diferentes monoclonales fabricados de la misma especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon.
1995).
4. Se puede utilizar la intensidad de fluorescencia media del canal de
estas partículas, determinada por citometría de flujo, para estimar la
molécula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de una determinada célula.
Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del análisis multiparamétrico del ADN empleando BrdU como sonda nuclear. Fue realizado empleando una línea celular CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y después con un anticuerpo FITC anti-BrdU
y teñida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl). La figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o
linlocitos de sangre periférica |PBL|) utilizados para validar la unción con BrdU. Los controles negativos son obligados para el éxito de la interpretación de estos análisis Estos estudios proporcionan una mejor comprensión de las células que están en el ciclo y en qué fase del ciclo
celular están.
874
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una
fuente constante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM).
son independientes de las subclases de anticuerpo empleado para
detmir el antigeno.
6. Estas determinaciones pueden realizarse empleando monoclonales
conjugados directamente a saturación utilizando patrones de granulos
apropiados. Debe tenerse más cuidado para evitar problemas espaciales relativos al tamaño de la molécula de tluorocromo y los Índices de
fluoresceína'proteína.
Se puede obtener más información recurriendo al documento consensuado
de 1997 de U.S.-Canadá que revisa los parámetros necesarios para la estandarización (Stelzer. 1997).
Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantitativos nos ayudarán a definir programas de software de análisis de grupos para la cuantificación e identificación celular estableciendo la intensidad fluorescente media de
los canales como medida de separación de células con diferentes fenotipos
tuncionales.
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA
DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR
En este capítulo, se han tratado de resaltar las áreas donde los médicos
asi como los laboratorios deben prestar particular atención a los métodos utilizados y a las interpretaciones realizadas en la evaluación de la respuesta
celular. La garantía de la calidad y el control de calidad de los parámetros no
están bien definidos en esta área del laboratorio, y existen pocos estándares
absolutos cuando se compara con los análisis químicos o las determinaciones de anticuerpos humorales. El éxito del laboratorio celular reside en su
aproximación al problema y en la evaluación longitudinal de la condición que
va a ser diagnosticada. Se señaló claramente que los estudios de base necesitan repetirse si la evaluación original se lleva a cabo en un momento de
estrés inmunológico.
Los parámetros básicos de las variaciones diurnas en las poblaciones de
linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone
(1990) concluyó que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuentos absolutos se debe en un 50% a la biología y en otro 50% se debe a
otros problemas técnicos. Los factores que afectan la evaluación longitudinal de las cantidades absolutas de CD4 en un ensayo clínico han sido revisadas por Fei (1993). Además. Fahey (1990) revisó el valor pronóstico tanto
humoral como celular de los análisis en VIH. En otros ensayos clínicos
celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la falta de formatos y métodos estandarizados asi como a los reactivos. Además, la calibración de los instrumentos y la sensibilidad no están bien monitorizados.
Los ensayos con linfocitos T citotóxicos son particularmente difíciles de
estandarizar. Los ensayos históricos como la proliferación mitogénica son
también difíciles, con variabilidad entre los laboratorios. Por lo tanto, los
laboratorios que ofrecen estas pruebas inmunologías deben tener una
amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpretar el resultado
individual del paciente. Los laboratorios celulares deben establecer rangos
normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normales de
adultos no se apliquen en los ensayos pediátricos. Esto es particularmente
problemático porque los rangos normales pediátricos son difíciles de determinar debido a la falta de niños disponibles en el primer año de vida, y la
correcta interpretación de los resultados del laboratorio depende de ellos.
Deben hacerse cuidadosamente las comparaciones de los datos entre los
laboratorios.
Siempre que esté disponible, un laboratorio de inmunología celular debe
utilizar los estándares adecuados en el desarrollo de la citometría de flujo y
en el análisis del ADN y tener presentes las regulaciones federales y estatales con respecto al laboratorio, incluyendo la Ley de 1988 (Human Health and
Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Además, deben participar en
pruebas de capacidad, cuando estén disponibles, y estar incluidos en programas de formación incluyendo evaluaciones de competencia para todo el personal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labora-
torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante
el proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas
deben ser cuidadosamente controladas en cuanto a la exposición al calor y al
frío y el tiempo desde que se extraen al paciente Debe acompañar a las
muestras una historia clínica para que se puedan realizar estudios particulares de modo que el director del laboratorio pueda realizar la correcta aproximación a la prueba.
Se ha publicado un documento de consenso con recomendaciones sobre
el análisis inmunofenotipico de las neoplasias hematológicas por citometría
de flujo (Braylan, 1997). Este documento fue minuciosamente desarrollado
por los proveedores de la comunidad médica interesados en cubrir los procedimientos de laboratorio, la selección de anticuerpos para la identificación de
neoplasias, el análisis de datos y la interpretación, informes médicos e indicaciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. La FDA
ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF¡. 1998). que elimina
reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigación. Esta
regla no permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cómo
emplear sus reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La
regla ASR proporciona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en
buenas condiciones. Todos los laboratorios que utilizan estos reactivos como
una prueba de fabricación casera" deben desarrollar sus propios ensayos clínicos y estudios de validación y deben emplear una declaración de descargo
de responsabilidad en su informe final. El documento de consenso permite al
laboratorio desarrollar sus análisis de un modo consistente y la definición del
significado clínico a un gran número de laboratorios e instituciones. El documento no es un patrón pero concuerda con otro estándar NCCLS que está
actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor dificultad de trabajo de interpretación ya que los datos no son fácilmente estandarizabas. Además, la garantía de la calidad de la muestra y la evaluación realizada dependen de la cuidadosa documentación de los parámetros biológicos
y logisticos que pueden influir en el resultado. El futuro de las pruebas utilizadas en la evaluación de los componentes celulares de la respuesta inmune
residen en el desarrollo de nuevos métodos que conduzcan a una mejor estandarización.
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518.
CAPÍTULO 36
•
EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR
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7
C A P Í T U L O
#
37
S Evaluación del funcionamiento de las
> inmunoglobulinas y la inmunidad humoral
• Richard A. McPherson, M.D.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE
LOS ANTICUERPOS
Inmunoglobulina D
878
Moléculas de anticuerpo
Resumen
Interacción antígeno-anticuerpo
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
BASE GENÉTICA DE LA DIVERSIDAD
DE ANTICUERPOS
881
Inmunoglobulina M
Inmunoglobulina G
Inmunoglobulina A
Los anticuerpos son las moléculas electoras de la inmunidad humoral
(mediada por células B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen
específicamente a los antigenos que estimularon su producción. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las proteínas plasmáticas de un individuo
sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las proteínas con menor
velocidad de migración en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo
se centra en la discusión de las propiedades estructurales y funcionales de las
inmunoglobulinas, su evaluación en el laboratorio y su importancia clínica.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE
LOS ANTICUERPOS
Moléculas de anticuerpo
Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford,
1991). Una molécula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de
"Y". Presenta dos dominios de unión al antigeno en las puntas de la "Y" (región
Fab) y zonas de unión para componentes del sistema del complemento y/o
varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (región Fe). Cada
molécula de inmunoglobulina está compuesta por 2 cadenas pesadas (H:
heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idénticas entre si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se
encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interacción
con el antigeno están compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de
las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una región variable de unos 110 residuos de aminoácidos en el extremo amino-terminal (las
puntas de la "Y"), que forma el dominio de interacción con el anligeno, unido a
una región constante. La región conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces
más grande que en la cadena L. Cada cadena está compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un dominio de región variable (V ) y un dominio de región constante (CJ. mientras que
la cadena H tiene un dominio de región variable (V,.) y 3 ó 4 dominios de región
constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminoácidos en
H
886
Patogénesis
880
PROPIEDADES GENERALES DE
LAS INMUNOGLOBULINAS
Inmunoglobulina E
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
888
Inmunoelectroforesis
Inmunofijación
Prevención de las enfermedades y terapia
BIBLIOGRAFÍA
891
las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3
pequeñas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de la molécula para formar el sitio de unión al antigeno. Cada dominio de unión al antígeno tiene sólo el tamaño suficiente para unir un determinante antigénico del tamaño de cinco o seis residuos de azúcar.
Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e)
y las cadenas ligeras de dos (•,- y X), donde algunos de los isotipos presentan
subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y„ y , y y y.. Los
isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes
de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la
base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada
por sí sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denominan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una
letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE).
2
3
Los anticuerpos tienen dos dominios idénticos de interacción con el antigeno. El dominio de interacción con el antigeno está compuesto por los aminoácidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molécula
monomérica compuesta por 4 cadenas (véase Fig. 37-1) posee dos sitios
idénticos de asociación con el antígeno, y se dice que son moléculas bivalentes. Estas moléculas son capaces de entrecruzar moléculas de antigeno,
si cada una de ellas presenta 3 o más determinantes antigénicos, formando
un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado tamaño, precipitará (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiológicamente porque facilita ia internalización del antígeno. como
puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. También
interviene en la activación del sistema del complemento. Además, este entrecruzamiento puede ser necesario para desencadenar la producción de anticuerpos (por la acción de linfocitos B) por parte del antígeno. La eficiencia con
la que el anticuerpo se une al antígeno y produce entrecruzamiento se ve
aumentada gracias a una región muy flexible (región de bisagra) que se
encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que varíe
la distancia que separa los dos dominios de unión al antígeno.
La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antígeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un
virus) presenta repeticiones de determinantes antigénicos en su superficie.
CAPÍTULO 37
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
879
(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por
otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque
consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco más grande que un
fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molécula está cortada en
fragmentos más pequeños de varios tamaños (Fig. 37-1). Como los fragmentos
F(ab'),son bivalentes, todavía pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subunídades de anticuerpos) tiene las demás propiedades biológicas de las moléculas intactas de anticuerpos puesto que carecen
de la cola (la región Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea
terapéuticamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles tóxicos
y facilitando la eliminación de la sustancia del cuerpo.
IKKK'
OKIH
Cada clon de células B produce moléculas de anticuerpo con un único dominio de unión al antígeno. Inicialmente, las moléculas se insertan en la membrana plasmática, donde funcionan como receptores de superficie para el antígeno.
Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a
las células B, las cuales se multiplican, diferencian en una célula plasmática, y
sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de
interacción con el antígeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y
diversas células para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante
sus dominios C en la región Fe de la molécula. Las propiedades biológicas de
los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1.
t
Figura 37-1. Representación esquemática de la molécula de inmunoglobulina G.
Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e
intracalenarios que determinan los lazos Cada uno de los lazos determina un
dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones de corte enzimàtico más probables en la región "bisagra" por parte de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la acción de la papaina
se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2
fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestión de Fab con pepsina
en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma
no covalente). La porción de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab
se denomina Fd.
v
H
L
Una molécula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partícula de tal
forma que ambos dominios de interacción antigénica se encuentren unidos a
determinantes antigénicos de esa misma partícula, en lugar de encontrarse
en dos partículas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unión, la energía efectiva de la interacción o avidez, es mucho mayor que la que presenta
una unión monovalente a dos partículas. Se ha demostrado que este mecanismo es muy importante desde un punto de vista fisiológico, en la neutralización de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unión.
El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su
habilidad para unir antígenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biológicas mediadas por la cola de la "Y", la región Fe de la molécula.
Esta parte de la molécula de anticuerpo determina lo que ocurrirá con el antígeno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad
de interacción con el anlígeno pueden presentar una variedad de regiones Fe
distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la
superficie de macrófagos, facilitando asi la fagocitosis de antígenos.
L
Interacción antígeno-anticuerpo
La unión de un antígeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el número de sitios de unión contribuyen a la fuerza de la interacción antígeno-anticuerpo. Esta unión reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente débiles, incluyendo uniones hidrofóbicas y de hidrógeno, fuerzas de
van der Waals e interacciones iónicas. Estas fuerzas débiles son efectivas sólo
cuando la molécula del antigeno está lo suficientemente cerca para permitir que
algunos de sus átomos puedan insertarse en las regiones complementarias de
la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de
cuatro cadenas son sus dos dominios de interacción con el antígeno idénticos
entre sí, mientras que la región correspondiente del antígeno es lo que se denomina el determinante antigénico (epitopo). La mayoría de las macromoleculas
antígénicas presentan vanos determinantes antigénicos distintos; si dos 3 más
de ellos son idénticos, se dice que el antigeno es multivalente.
La afinidad de una molécula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antigénico se inserta en un solo sitio de unión al antigeno, y es independiente del número de determinantes antigénicos. Sin embargo, la avidez
total de un anticuerpo por un antígeno multivalente. como un polímero con
Tabla 37-1
Propiedades biológicas de los dominios de
inmunoglobulina (IgG)
Dominio
Función conocida o probable
C„3
1. Reacciones citotrópicas que implican
(a) Macrófagos y monocitos
(b) Mastocitos heterólogos
(c) Células citotóxicas (K)
(d) Células B
2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras
1. Unión al complemento (C1q)
2. Control del ritmo catabòlico
1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas
2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas.
3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que
conllevan unión del antígeno y funciones electoras
1. Unión al antígeno
2. Formación de enlaces no covalentes entre cadenas
pesadas y ligeras
Debido a que posee una localización expuesta y una estructura flexible, la
región bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre indica, esta región confiere una cierta flexibilidad a la molécula, permitiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a una sola partícula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos
regiones de unión al antígeno o. alternativamente, puede estirarse al máximo
para unir dos partículas. Las propiedades que aporta la región bisagra a las
moléculas de inmunoglobulina están relacionadas con su alto contenido en
prolina y residuos de aminoácidos hidrofílicos. Los puentes disulfuro que se
establecen entre las cadenas H en moléculas de IgG. IgA y en IgD se encuentran en la región bisagra (Fig. 37-1).
VHTV,
Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las moléculas de anticuerpo en diferentes fragmentos característicos que permiten un entendimiento
de la relación estructura-función de la proteina. El corte con papaina produce dos
fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unión al antígeno) idénticos, cada uno de ellos con un dominio de unión al antigeno, y un fragmento Fe
De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of
immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso
C,,2
C..1/C
880
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unión de todos los
sitios de unión juntos. Una molécula de IgG típica se une con al menos 10.000
veces mayor fuerza a un antígeno multivalente si ambos dominios de interacción con el antigeno están implicados, que si sólo interviene uno de ellos.
Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interacción con el antígeno entre moléculas de IgG e IgM es la misma, la molécula de IgM (debido a
que es un pentámero y por tanto posee 10 dominios de interacción con el antígeno) poseerá una avidez mucho mayor por un antígeno mullivalente que una
molécula de IgG (que posee dos dominios de interacción con el antígeno). Esta
diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades
mucho menores que los que se producirán más adelante. El aumento en la afinidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la
inmunización se denomina maduración de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral frente a un antígeno es heterogénea, esto es, se producen anticuerpos con distintos dominios de unión al antígeno por parte de los clones de
linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo
de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso
cuando cada uno de sus dominios de interacción sólo tiene una baja afinidad.
El tamaño del complejo antígeno-anticuerpo se determina por la valencia
del antígeno y las concentraciones relativas del antígeno y el anticuerpo. La
reacción de precipitación de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruzamiento de antígenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si sólo está
presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), moléculas con un
solo determinante antigénico no pueden entrecruzarse. Si un antígeno es
bivalente, puede formar pequeños complejos cíclicos o cadenas lineales con
el anticuerpo, mientras que un antígeno con tres o más determinantes antigénicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad.
Sin embargo, la mayoría de los antisueros producidos frente a un antígeno
contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal)
que reaccionan con diferentes determinantes del antígeno y pueden cooperar
en el entrecruzamiento del antígeno. Por el contrario, anticuerpos homogéneos (monoclonales) sólo pueden precipitar moléculas que presentan repeticiones idénticas de determinantes antigénicos.
Dadas las condiciones de valencia que permiten la formación de grandes
agregados, el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se forman
depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos
reactivos. Si hay un exceso de antígeno o de anticuerpo es poco probable que
se formen grandes complejos (Fig. 37-2).
El tamaño y composición de los complejos antígeno-anticuerpo no sólo son
importantes para las reacciones de precipitación in vilro. también son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los complejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan múltiples
regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los
receptores Fe de los macrófagos, los cuales los ingieren y degradan. Los
complejos pequeños, formados en exceso de antígeno, sólo presentan una
región Fe por complejo. Así, se unen pobremente a los receptores Fe de los
macrófagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos
se pueden depositar en pequeños vasos sanguíneos de la piel, ríñones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, causando inflamación y destrucción del tejido.
Aunque parece que los complejos antígeno-anticuerpo tienen una apariencia
muy rígida, los anticuerpos son entidades dinámicas que sufren fluctuaciones
estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unión. Estos ajustes incluyen desplazamientos
laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromáticos,
cambios conformacionales e incluso pequeñas rotaciones entre dominios V
y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrón, 1991).
H
L
BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD
DE ANTICUERPOS
6
9
Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 moléculas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genéticos
especiales para producir una gran cantidad de moléculas de inmunoglobulina,
que se desarrollan durante la respuesta a un antígeno sin la necesidad de
involucrar un número excesivo de genes (Edward, 1993).
Figura 37-2. Las concentraciones del antígeno y del anticuerpo
influencian el tamaño de los complejos antígeno-anticuerpo que se
forman. Los complejos de mayor tamaño se forman cuando ambas
moléculas están presentes en aproximadamente la misma concentración molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos más
pequeños se forman cuando existe un gran exceso de antigeno.
Nótese que los pequeños complejos formados en exceso de antigeno presentan pocas moléculas de anticuerpo por complejo: por este
motivo, no son eliminados eficientemente por los macrófagos de los
fluidos extracelulares.
CAPÍTULO 37
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
881
Figura 37-3. Organización y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el cromosoma 12 de ratón.
Cada gen V„ tiene también una secuencia líder que no aparece en la representación Los genes de la región constante se identifican mediante
el isolipo de la cadena pesada, y existe más de un gen para los isotipos C, y C„ A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C están compuestos por múltiples exones, tal y como se ilustra para el gen C„ (dominios C„,-C,„...). Los sitios de recombmación se encuentran en el extremo
5' de cada uno de los genes C„ y tampoco se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o segmentos génicos. Cada cadena pesada está codificada por cuatro segmentos génicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de Marcu KB: Immunoglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright © de Cell Press).
M
Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que
codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas
diferentes. En cada grupo, distintos segmentos génicos que codifican para
diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se
pueden poner en contacto mediante procesos de recombinación específicos
que tienen lugar durante la diferenciación de células B. Los grupos de genes
de cadenas ligeras contienen uno o más genes constantes (C) y juegos de
segmentos variables (V) y de genes de unión (J). El grupo de genes de la
cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversidad (D) y segmentos J. Para generar una molécula de anticuerpo, un segmento génico V se recombina con otro segmento génico J , dando lugar a un
gen V para la cadena ligera; y un segmento V„ se recombina con un segmento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3).
Cada uno de los segmentos génicos generados se cotranscribirá con el segmento de la región constante correspondiente para producir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combinación de los diferentes segmentos génicos que codifican para las regiones
V, y V.„ los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y
miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de moléculas de anticuerpo diferentes.
H
Este repertorio inicial de moléculas de anticuerpo se puede expandir incluso más mediante la hipermutación somática, la cual se activa mediante la
exposición al antígeno. Así, el papel que juega el antígeno en presencia de la
mutación somática parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune
y a una diversidad prácticamente ilimitada de moléculas de anticuerpo. Mutaciones somáticas puntuales tienen lugar en células B (no en células germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las
hipermutaciones somáticas se encuentran, en su mayoría, confinadas a los
genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contiguos. Se estima que tendrá lugar, aproximadamente, una mutación en la
región V de la cadena H o L. en cada célula individual con cada división celular. Esto no sólo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que también puede causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas células B resultantes que puedan unir al antígeno con mayor
avidez presentan una ventaja sobre otras células B que no son capaces de
unir al antígeno con tanta avidez. A medida que decae la concentración de
antígeno, aquellas células B que presentan receptores con mayor avidez
dominan la población de células involucradas en la respuesta. Esto origina
una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutación somática puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados
de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho más efectivos.
Todas las células B producen inicialmente anticuerpos IgM. Más adelante
algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el
mismo dominio de unión al antígeno (idiotipo) que la IgM original (exclusión
alélica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinación con la
exclusión alélica permite que los mismos dominios de unión al antígeno (la
misma cadena V„ y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades biológicas (funciones efectoras secundarias).
Así. este mecanismo de organización gémea permite la construcción de
moléculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de múltiples segmentos
génicos, su reagrupación en diferentes secuencias, la combinación de distintas cadenas pesadas y ligeras en la construcción de moléculas de inmunoglobulina, y de mutaciones somáticas.
PROPIEDADES GENERALES DE
LAS INMUNOGLOBULINAS
(Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993)
Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades están
resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina M
Esta glucoproteína es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre
en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la
IgM se secreta en forma de pentámero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimentación de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos
autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistémico
(SLE), la forma monomérica de 7S se puede detectar en cantidades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de
inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.
882
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\
(denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V„ (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminoácidos se enumeran empezando por el
extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una región hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama también se ilustra la región donde pueden encontrarse la mayoría de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los dominios V, y V„. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. Los marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.
Debido a que la forma pentamérica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unión al antigeno, resulla más eficiente que su forma monomérica
7S o la IgG en el entrecruzamiento del antígeno y en la activación del sistema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unión y activación del complemento, unido a su temprana
aparición durante el transcurso de una infección, hace de la IgM un agente especialmente potente para combatir las invasiones microbianas.
Cada pentámero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptídica.
denominada cadena J (del inglés joming). con un tamaño molecular de 15 kDa.
Este polipéptido accesorio se produce por parte de las células secretoras de
CAPÍTULO 37
Tabla 37-4
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
883
P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s
IgM
IgG
IgA
IgD
A Fisiológicas
Concentración mg/ml en suero de un adulto normal
1.2-4.0
8.0-16.0
0.4-2.2
0.03
17-450 ng/ml
Unidades internacionales/ml
69-322
92-207
54-268
<100
•
Porcentaie de la inmunoglobulina total
13
80
6
0.002
Porcentaje de distribución intravascular
41
48
76
75
51
Ritmo de sintesis mg/kg/dia
2,2
35
24
0.4
0,003
Ritmo de catálisis en suero, %/día
10,6
6
24
37
90
(o vida media/dia)
(5-6)
(18-23)
(5-6.5)
(2.8)
(2,3)
Biológicas
•
Capacidad de aglutinación
+4
+2
+
Capacidad de fijación del complemento por la vía clásica
•4
Hipersensibilidad anafiláctica homologa
+4
+
Anafilaxis heleróloga en conejillo de Indias
—
—
±
Fijación a basólilos y mastocitos homólogos
+4
—
+
Unión citolilica a macrófagos
1
+
Transporte Iransplacentario
—
+
Unión al tactor reumatoide
Presencia en secreciones externas
±
+
+4
+2
Otras propiedades características:
IgM - Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva frente a la bacteremia.
IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los fluidos extravasculares
IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo.
IgD -Presente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activación de células B y/o la inmunorregulación
—
—
IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en residuos de cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo
carboxilo-terminal de dos regiones Fe de moléculas monoméricas de IgM
adyacentes. Se cree que la oligomerización se inicia en este punto.
La IgM es además, el primer tipo de anticuerpo secretado por las células B
durante su desarrollo. Los precursores inmediatos de las células B. llamadas
células pre-B. sintetizan cadenas u., pero no cadenas ligeras, que acumulan
en el interior de las células. A continuación las células pre-B empiezan a sintetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para formar moléculas de IgM monoméricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmática, donde
funciona como receptor para el antigeno. En este momento, las células se
han convertido en linfocitos B y pueden responder al antígeno.
Quizás debido a su gran tamaño, el pentámero de IgM secretado no se
encuentra de modo significativo en los espacios intersticiales; se encuentra
confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es un componente
minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies mucosas y en
la leche materna.
Filogenéticamente, la IgM es la inmunoglobulina más primitiva, y la mayoría de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evolucionado
para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas.
Otras propiedades físicas y biológicas de la IgM y de otros tipos de inmunoglobulinas se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina G
La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional
(Burton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglobulina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune
secundaria. La región Fe de las moléculas de IgG se une a receptores específicos de células lagocíficas, como macrófagos y leucocitos polimorfonucleares.
incrementando asi la eficiencia con que las células fagociticas pueden ingerir y
destruir microorganismos infecciosos que se han recubierto con anticuerpos de
IgG en respuesta a la infección. Estos anticuerpos unidos a células diana también pueden guiar a linfocitos NK (Natural Killer) a destruirlos mediante un proceso de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC del inglés antibody-dependenl cell-mediated cytotoxic¡ty¡. La función mejor conocida de la IgG
es la activación del complemento por la vía clásica. La región Fe de la IgG puede unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema del complemento, que desencadena un ataque bioquímico que mata a los micoorganismos Se
—
necesitan al menos dos moléculas de IgG para la activación del complemento,
en comparación con una sola molécula de IgM, que contiene cinco regiones Fe
Las moléculas de IgG son los únicos anticuerpos que pueden pasar de la
madre al feto. Células placentarias que se encuentran en contacto con la sangre materna poseen receptores que se unen a la región Fe de la IgG y median
su paso hasta el feto. Los anticuerpos primero penetran por un proceso de
endocitosis mediada por receptores y después se transportan a través de la
célula para liberarse posteriormente por exocitosis a la sangre fetal. Otros
tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. por tanto, no pueden atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la placenta confiere una linea de defensa fundamental frente a la infección durante las primeras semanas de vida del niño. Normalmente, el embrión humano empieza
a recibir cantidades significativas de IgG materna por vía transplacentaria a
las 12 semanas de gestación. La cantidad aumenta de forma constante hasta que, al nacer, el suero del cordón contiene una concentración de IgG comparable a la del suero materno. Salvo que existan trastornos inmunológicos.
los niveles de IgG de un adulto se alcanzan en el séptimo año de vida y a partir de este momento permanecen constantes.
Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusión que les permite difundir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros
tipos de Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espacios, es la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a
microorganismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG
que se encuentran recubriendo células diana, como pueden ser células tumorales, pueden desencadenar su muerte extracelular mediante ADCC; las células NK responsables de la ADCC presentan receptores para Fe de IgG.
Existen cuatro subtipos de IgG humana, de 1 a 4. Las cuatro subclases reflejan la existencia de cuatro cadenas H distintas no genéticamente (y1 a y4). que
son similares pero no idénticas en cuanto a su secuencia de aminoácidos y propiedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dominante en adultos
humanos. La lgG3 es la más efectiva en su unión al complemento, seguida de
lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al complemento por la vía clásica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atravesar la placenta. Un resumen de las propiedades físicas y biológicas de la IgG
se encuentra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.
Inmunoglobulina A
Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo
presente en las secreciones (leche, saliva, lágrimas y secreciones respiratorias
884
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G
A. Fisiológicas
Porcentaje de IgG total en suero
Ritmo de síntesis, mg/kg/dia en suero
Ritmo de catálisis en suero, %/día
(vida media, día)
Relación K/X
Marcadores alotípicos (tipo de Gm)
B. Biológicas
Capacidad de fijación del complemento por la via clásica
Capacidad de adhesión a piel heteróloga
Transporte transplacentario
Receptor en macrófagos
Capacidad de reacción con proteína A
Actividades dominantes:
Toxoide antitetáníco
Toxoíde antidiftérico
Antitiroglobulma
Anti-ADN
Anti-Fth
Anli-lactor VIII
Anlidextrano
Anlilevano
Anti-ácido teicoico
Número de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la región de bisagra
Posición de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas pesadas
e intestinales). Existe en forma de un monómero de cuatro cadenas (como la
IgG) o formando un dímero de dos unidades monoméricas. Las moléculas de
IgA presentes en las secreciones son dímeros que llevan una sola cadena J.
similar a la asociada con la IgM pentaméríca, con una cadena adicional glicopolipeptídica llamada el componente secretor (SC) de 70 kDa. Los dímeros de
IgA recogen el SC de la superficie de células epiteliales que recubren el intestino, tos bronquios o los conductos galactóforos, salivares o lacrimales. El componente secretor se sintetiza en las células epiteliales e inicialmenle se expone en la superficie extema de estas células, donde actúa con un receptor que
une los dímeros de IgA. El complejo resultante de la unión del dímero a su
receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se transfiere a
través del citoplasma de la célula epitelial en forma de vesícula membranosa,
la cual se fusiona con la membrana plasmática en el lado luminal de la célula
IgGI
igG2
igG3
lgG4
66*8
25
8
(23)
1,4-2,4
a, z, f, x
23 ± 8
?
6,9
(23)
1,0-1,1
n
7,3 ± 3.8
3,4
16.8
(7)
1.1-1,3
bo, bi, bz.
g. st. etc
4.2 ± 2.6
?
6.9
(23)
5,0-7,0
+2
±
+3
+
+
±
+
+
+
+
+
+2
+2
+2
+2
+2
+
+
+
+
+
+
+2
±
+
—
—
—
2
N214
+
+
-
±
±
±
±
±
+
•
-
—
+
4
N131
—
5
N131
—
—
2
N131
epitelial. La porción extramembranal del receptor se escinde por acción enzimática y se secreta como parte de la molécula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.)
al lumen. El extremo amino-terminal del receptor del dímero de IgA que permanece unido a este dímero es el SC (Fig. 37-5). Así, la molécula secretora
completa de IgA es un producto sintético de dos tipos celulares, células plasmáticas y células epiteliales. Además de su papel en el transporte, el SC también puede proteger las moléculas diméricas de IgA de la digestión por parte
de enzimas proteolíticas presentes en las secreciones.
En los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos,
lgA1 e lgA2, en función de la estructura antigénica y la variación en la disposición de los puentes disulfuro intercatenarios. Así como la lgA2 es un componente menor del suero, este subtipo es la forma dominante en las secreciones. Además, la IgA secretada alcanza los niveles de un adulto antes que
?
Figura 37-5. Mecanismo por el cual el componente secretor media el transporte de la molécula
dimérica de IgA a través de una célula epitelial.
Todo el complejo se transporta desde el fluido
extracelular al interior del lumen del tubo epitelial.
El componente secretor se sintetiza en la célula
epitelial como una glucoproteína transmembranal
y funciona como un receptor en su superficie
basolaleral para unir el dímero de IgA. El complejo IgA-receptor penetra en la célula en una vesícula endocíticá que cruza la célula y es exocitada
en la superficie apical La escisión del receptor
libera el dímero de IgA para su secreción a la
superficie exterior (luminal). La porción del receptor que permanece unida al dímero de IgA se
denomina el componente secretor. Este mecanismo de transporte es responsable de la deposición
de IgA en diversas secreciones exocrinas (p. ej.,
saliva, leche, bilis, lágrimas y sudor) y en capas
mucosas que protegen el revestimiento de los
conductos nasofaríngeos, intestinales y del tracto
genitourinario.
CAPÍTULO 37
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo,
puede estar plenamente desarrollado a los dos años de edad, mientras que
los niveles de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto hasta los 12 años de edad.
Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada
constituye una primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente
exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesión de microorganismos a la
superficie de las células mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una
propiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multivalencia. que se asocia a una gran avidez por la unión de antígenos; esto puede
resultar especialmente relevante en la neutralización de virus. La actividad antiviral de anticuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha
suministrado cualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada también
puede combinarse con determinados antígenos de la comida, impidiendo su
absorción al torrente sanguíneo y reduciendo asi la incidencia de reacciones
alérgicas. Por eiemplo. las inmunodeficiencias de IgA pueden desencadenar
incrementos en tos niveles e incidencias de anticuerpos humorales dirigidos contra antígenos derivados de la comida y microorganismos intestinales.
La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija el complemento
mediante la vía alternativa; a través de un receptor específico de Fe presente en macrófagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y
puede inducir la degranulación de eosinófilos mediante un receptor especifico, que ha implicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades
físicas y biológicas de la IgA están enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4.
885
Inmunoglobulina E
De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE está presente en la menor
concentración en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel
humana (anticuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reacción alérgica (anticuerpo reagénico) La actividad biológica de la IgE se basa en su propiedad de unirse mediante su región Fe a basófilos y a su equivalente en los
tejidos, los mastocitos La IgE puede ser importante también en la respuesta
inmune humoral durante enfermedades parasitarias, ya que a menudo se
encuentran elevados los niveles de esta inmunoglobulina en suero de pacientes que presentan una infección por helmintos. La IgE puede jugar un papel en
el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del complemento a los locos
de inflamación desencadenando una reacción de hipersensibilidad inmediala.
Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza biluncional de las moléculas de anticuerpo Su porción Fe se une a las células diana
mientras que su porción Fab se une al alérgeno (véase Capitulo 46 para el
papel de la IgE en enfermedades alérgicas y ensayos relacionados) Los niveles de IgE en suero en determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6.
Al igual que la IgA, la IgE se produce principalmente en el revestimiento de
los tractos respiratorios e intestinales y forma parte del sistema secretor externo de anticuerpos. Una deficiencia de IgE se ha asociado de forma poco consistente con la deficiencia de IgA en individuos inmunodeficienles que presentan una excesiva susceptibilidad frente a infecciones. La IgE no atraviesa
la placenta y los complejos de IgE-antigeno no se unen al complemento por
la vía clásica (Tabla 37-4).
Inmunoglobulina D
A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las
principales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una
proporción elevada de linfocitos B, especialmente en recién nacidos. Durante
el transcurso de la diferenciación de las células B. estas células sintetizan y
presentan en superficie tanto moléculas de IgD como de IgM. Aunque esto
aparentemente contradice la regla de "una célula, una inmunoglobulina", los
dominios de unión al antígeno (idiotipos) de ambas moléculas y de sus cadenas ligeras son idénticos. Sólo difieren en sus regiones C„. La IgD asociada
a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con que las células B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferación clonal. Existen evidencias que sugieren que las células B que presentan IgM pueden responder a ciertos antígenos T-independientes y que la adquisición de IgD se
requiere por parte de las células B para poder responder a la ayuda de células T necesaria para las respuestas a antigenos T-dependientes.
Además, si las moléculas de IgD se eliminan selectivamente de células B
que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que la cadena 8 es mucho
más sensible a la acción de la papaina, estas células pasan a ser susceptibles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una respuesta
inmune sigue sin conocerse, pero la opinión general es que enciende, apaga
o modula la división o la diferenciación de células B.
La IgD generalmente se detecta en suero a los seis meses de edad, y su
concentración a lo largo de toda la vida es muy baja. Sin embargo, en estados de enfermedad la concentración de IgD puede variar enormemente. En
infecciones crónicas, los niveles en suero de IgD se elevan, al igual que los
del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha asociado un incremento específico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes con
alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las concentraciones normales de IgD. Generalmente, la IgD está ausente en individuos con hipogammaglobulinemia.
Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biológico específico como
anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un cierto
número de antigenos. La IgD de superficie, que tiene proteínas semejantes a
las de la IgM de superficie, es un marcador de células B maduras, y su papel
como receptor está aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la
señal que Iransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes.
1993). La IgD no une al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a
células a través de su región Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la
del resto de las inmunoglobulinas. carece del péptido transmembranal en la
región carboxi-terminal que ancla la molécula en la superficie de las células
B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propiedades de la IgD.
Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas
afecciones
Elevado
Dermatitis atópica
Mieloma de IgE
Hiper-lgE e inlecciones recurrentes
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardías)
Aspergilosis broncopulmonar
Pénfigo
Parásitos (como la ascariasis)
Lepra
Sida
De normal a elevado
Rinitis alérgica
Asma alérgica
Alveolitis extrínseca alérgica
Fibrosis quistica
Aspergiloma
Alergias a medicamentos
Enfermedad hepática grave
Urticaria alérgica
Enfermedad de Kawasaki
Periarteritis nodulosa
Normal
Linfangiectasia intestinal
Bronquiolitis
Pénligo
Tiroiditis
Fallo renal crónico
De normal a disminuido
Leucemias
Mieloma múltiple
Deficiencia de IgA
Disminuido
Ataxia-telangiectasia
Hipogammaglobulinemia ligada al sexo
Hipogammaglobulinemia congenita
Hipogammaglobulinemia adquirida
Deficiencia de IgE
Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishizaka K Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E
System. Washington DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman
CA tvi Ishi/aka K. Daylon DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglobulin E System, Washington. DC. U S. Government Printing Ottice, 1975
886
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAKXOGI'A
Hiperinmunoglobulinemia
Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero
Edad
(Años)
Media de IgG (mg/ml)
Media de IgA (mg/ml)
NIVELES DE INMUNOGLOBULINAS EN SUERO
Varón blanco Mujer blanca Varón blanco Mujer blanca
5-9
10-14
15-19
20-24
25-29
30-34
35-39
40-44
45-49
50-54
55-59
60-64
65-69
70-74
75+
10,28
10.41
10,55
10,69
10.83
10.98
11.12
11.27
11,42
11,57
11,72
11.88
12,04
12.20
12.36
11.05
11.13
11 20
11 28
11.35
11.43
11.50
11.58
11,66
11,74
11,81
11.89
11,97
12.05
12.13
1.09
1,16
1,23
1,32
1.40
1,50
1.59
1.70
1.81
1.93
2.06
220
2.34
2.49
2.66
Una interpretación válida de los niveles de inmunoglobulinas en suero requiere un reconocimiento de las variaciones biológicas que existen a lo largo de la
vida de los individuos. Las vanables más importantes son la edad, sexo y raza.
Estudios en un grupo de individuos sanos de raza blanca (3.212) de una
sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que la concentración media de IgG
e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeñas pero significativas entre
sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero de IgG y menores
de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias entre sexos para
la IgG y la IgA son estadísticamente significativas, su significado biológico no
resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron relativamente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenían niveles medios
de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml).
1,10
1.15
1.21
I.28
1.35
1.42
1,49
1.57
1,65
1,74
1,83
1.93
2.03
2.14
2.26
Vanos estudios han descrito que los niveles de inmunoglobulinas son mas
elevados en personas con pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran
los resultados obtenidos en una población birracial de individuos sanos del
condado de Evans. Georgia. Los individuos de color tenían niveles mayores de
las tres inmunoglobulinas principales (IgM. IgG e IgA) que los blancos. La
mayor diferencia se encontró en la IgG. No se detectaron diferencias entre individuos urbanos y rurales en este estudio. Individuos blancos de Rochester,
Nueva York, tenían niveles en suero de IgG e IgM similares a los de individuos
blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durban, Natal, Sudáfrica,
demostró que varones adultos bantúes tenían niveles significativamente mayores de IgM (32% más), IgG (40% más) e IgA (32% más) en suero que individuos blancos de esta comunidad que nacieron en el mismo año y pertenecían
al mismo grupo sanguíneo ABO. Varones asiáticos sanos mostraban aproximadamente un 20% más de IgG. un 23% más de IgA. y un 7% más de IgM
que individuos comparables de raza blanca. Un estudio de individuos del área
metropolitana de Washington, D.C. demostró que individuos de color tenían
niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos pero niveles
similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control empleados en estos
estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y también a diversos factores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '/-globulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de proteínas del
suero, una medida de las proteínas totales o de albúmina y fracciones de
y-globulinas. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas
varían con la edad, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8).
Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de
sujetos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI)
(Cassidy. 1974).
Resumen
En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA,
IgD e IgE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y
dos subtipos de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo
posee una determinada cadena H (n, y, a. 8, e, y„ y¡, y . y¿ y n, a¿. respectivamente). Las cadenas H contienen la región Fe del anticuerpo, que
determina qué otras proteínas se unirán al anticuerpo y por tanto, las propiedades biológicas del tipo y subtipo. Cualquiera de las cadenas L (K- O X) pueden asociarse con cualquiera de las cadenas H.
3
Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas
corresponden a las diferencias funcionales en sus lugares de producción y
acción, sus niveles relativos de síntesis en respuestas inmunes primarias y
secundarias, y sus papeles como efectores fisiológicos. Por ejemplo, la IgG predomina tanto en sangre como en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM
está principalmente confinada a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fundamentalmente en superficies epiteliales. La IgD e IgE se encuentran principalmente unidas a células, la IgD en células B. y la IgE en basófilos y mastocitos.
Los incrementos de inmunoglobulinas pueden ser monoclonales o policlonales. Las inmunoglobulinas monoclonales de un único individuo son idénticas
estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expansión clonal de una
sola célula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto, son específicas
para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un mismo individuo
son estructuralmente diferentes entre ellas en una o más características importantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera; o por su especificidad antigénica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de la expansión clonal de varias células linfoides productoras de distintas inmunoglobulinas.
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patogénesis,
diagnosis, prevención y terapia de las enfermedades.
Patogénesis
La hiperinmunoglobulinemia es una destacada característica del mieloma
múltiple y de la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antígenos nativos pueden aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se
describe en los Capítulos 43 y 45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menudo una de las características más destacadas de algunas inmunodeficiencias
(véase Capítulo 42).
Tabla 37-8
INMUNOGLOBULINAS POLICLONALES
Los aumentos policlonales de inmunoglobulinas se han asociado con
diversos estados patológicos (Tabla 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973).
La electroforesis de proteínas séricas es a menudo suficiente para estable-
Concentración de le G en suero en una población birracial
Media de la raza negra
(± SE) (mg/ml)
Sexo
Edad (Años)
N. de muestras
Media de la raza blanca
(± SE) (mg/ml)
Hombres
15-34
35-54
55-74
17
17
20
11.2(7.3)
10.8 (5.9)
10,9(7.4)
21
20
13.4 (6.5)
13,5 (9,0)
13,3 (5.8)
15-34
35-54
55-74
19
19
20
10,6 (6,3)
12,3(3.4)
10,9 (6.1)
I8
15
16
15,6 (8.0)
15,4 (6,4)
14.2 (9,6)
Mujeres
Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman. 1967)
N. de muestras
•"•
CAPÍTULO 37
Tabla 37-9
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas
enfermedades asociadas
Tipo de
inmunoglobulina
Afección
Inmunodeliaenaas
Hiperinmunoglobulina E e infecciones
recurrentes
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Disgammaglobulinemia tipo 1
Hiperinmunoglobulina A e infecciones
recurrentes
Sida
Infecciones
Infecciones congénitas (sífilis.
toxoplasmosis, rubéola, citomegalovirus)
Mononucleosis infecciosa
Tripanosomiasis
Parasitismo intestinal
Varias infecciones helmínticas
Larva migrans visceral
Granulomatosis crónica infantil
Lepra
Infecciones crónicas en general
Enfermedades hepáticas
Hepatitis crónica activa
Hepatitis aguda
Cirrosis biliar
Hepatitis lupoide
Trastornos pulmonares
Síndrome de hipersensibilidad pulmonar
Sarcoidosis
Beryliosis
Trastornos autommunes
Lupus eritematoso sistémico
Artritis reumatoide
Muchos estados autoinmunes como
la tiroiditis
Escleroderma
Enfermedad de la aglutinina fría
Púrpura anafiláctica
Otras
Síndrome do Down
Amiloidosis
Adicción a narcóticos
Enfermedad de los lúbulos renales
igE
igA, igE
IgM
igA
Todos los tipos
IgM
IgM o todas
IgM o todas
Todos los tipos
igE
Todos los tipos
Todos los tipos
Todos los tipos
Todos los tipos, con
preferencia de IgG
Predomina IgG
Predomina IgG
Predomina IgM
Todos los tipos
Todos los tipos
Todos los tipos
Todos los tipos
Todos los tipos
igA o todos
Todos los tipos
Todos los tipos
IgM
IgA
Todos los tipos
Todos los tipos
IgM
Todos los tipos
cer esta condición. La inmunoelectroforesis, inmunofijación y determinación
de las inmunoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina
pueden ayudar a confirmar una distribución policlonal o un aumento de uno
o más tipos de inmunoglobulina. El aumento de las inmunoglobulms séricas
puede deberse a un descenso del catabolismo y un aumento de la síntesis.
Los mecanismos de control de estos sucesos no se conocen bien. Las consecuencias de una elevación de inmunoglobulinas son desconocidas. La
mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas frente a un
solo determinante antigénico o grupo de ellos. Además, la mayoría de los
autoanticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los
incrementos persistentes de carácter policlonal en y-globulinas, se relacionan con una estimulación antigénica de naturaleza crónica, o con una pérdida de la regulación de las inmunoglobulinas.
Inmunoglobulinas
monoclonales
Las inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se
han asociado con diversos estados patológicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977;
Benbassat, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobulinas también se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.
887
La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en
estudios de una población no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman.
1965: Axelsson. 1968; Cohén 1985). En labóratenos clínicos se encuentra
una incidencia mucho mayor de resultados positivos, puesto que los sueros
son preseleccionados. El mieloma múltiple, la macroglobulmemia de Waldenstróm y neoplasias de células B son algunas de las enfermedades asociadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. Antes
se creía que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos
de leucemia linfocítica crónica o de linterna Imfocitico bien diferenciado.
Actualmente se ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijación y
la electroforesis de alta resolución para estudiar muestras de estos pacientes,
la mayoria de ellos presentan una gammapatía monoclonal (Keren. 1988).
También se ha demostrado la existencia de gammapatias en pacientes con
linterna de Burkitt y leucemia linfocítica aguda de células B.
Aunque generalmente se desconocen las especificidades antigénicas de
las gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatías paraproteinémicas. Este síndrome clínico generalmente se debe a la interacción de una
paraproteina de IgM con una glucoproleina asociada a la mielina (MAG), gangliósidos (por ej. GM. en la neuropatía motora y GD„, en la neuropatía sensorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 1998).
El término de gammapatía monoclonal de significado indeterminado
(MGUS: monoclonal gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuñado
por Kyle para categorizar individuos en los que se ha demostrado un componente monoclonal en el suero pero que carecen de otras características que
permitan el diagnóstico de un cáncer (Kyle. 1982). Individuos con MGUS pueden tener hasta un 10% de sus células plasmáticas en la médula ósea. Esto
es considerablemente menos que la plasmacitosis de médula ósea que se
asocia con el mieloma múltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con
MGUS desarrollarán un trastorno linfoproliferativo de células B, siendo el más
común de ellos el mieloma múltiple, en un periodo de 10 años. Algunos de los
otros casos pueden desarrollar leucemia linfocítica crónica, amiloidosis. linterna linfocítico diferenciado y otras patologías que afectan a la proliferación de
células B. La mayoria de los casos de MGUS no progresan hacia ninguna otra
patología clínica. Pacientes con MGUS poseen cantidades del componente M
de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no presentan la protema de Bence Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes tengan un seguimiento mediante electroforesis de proteínas séricas cada 6 a 12 meses para
determinar si el proceso progresa o retrocede.
Una consideración especial es el MGUS que se observa en pacientes Irasplantados que han recibido inmunosupresores que afectan a las funciones de
células T incluyendo la modulación de la respuesta B. Estas gammapatias
monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los casos (Radl,
1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (Stanko,
1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el virus de
Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresión probablemente se estimula por los
elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).
Tabla 37-10
Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas
monoclonadas
Mieloma múltiple
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Leucemia linfocítica crónica
Otras leucemias
: Linfomas
I Gammapatía monoclonal "benigna"
j Síndrome de escape capilar sistémico
Amiloidosis
i Enfermedad hepática crónica como la hepatitis activa, o la
cirrosis biliar primaria
Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. el lupus
eritematoso sistémico. la tiroiditis. la anemia perniciosa,
la poliarteritis nodulosa o el síndrome de Sjogren
Enfermedad de Gaucher
| Varios tipos de cáncer
¡ Esferocitosis hereditaria
I Infección por VIH, incluido el sida
888
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
La evaluación en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobulinas puede ayudar en el diagnóstico y tratamiento de las patologías. El
empleo de pruebas de fijación del complemento, de hemaglutinación y otros
inmunoensayos pueden detectar un aumento o cambio en la titración de anticuerpos frente a determinados antigenos, como los que están presentes en
microorganismos.
Las peticiones de examinar un suero para la presencia de proteína monoclonal generalmente vienen de un médico que reconoce en un paciente los
síntomas clínicos y signos de este tipo de trastorno, o del examen clínico de
una electroforesis de proteina sérica que sugiere la presencia de una proteína monoclonal. A menudo la sospecha del médico de la existencia de una discrasia de células plasmáticas viene con la detección de anemia (con una o
más citopenias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumento de las globulinas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuricemía, hipercalcemia, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor óseo o lesiones líticas del tejido óseo en radiografías. Si efectivamente existe un
componente M en la electroforesis de proteínas séricas, una medida cuantitativa de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial, nefelometría u otra técnica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especifica si sólo se
encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobulina.
Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina
monoclonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatías biclonales pueden ser confusas.
El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta útil en la monitorización del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a
distinguir la condición benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de
2 g/100 mi o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una
condición maligna. En muchas inmunocítopatías malignas, la concentración
de inmunoglobulinas no monoclonales se encuentra reducida. Asi, una deficiencia de inmunoglobulinas policlonales sugiere la malignidad. Paradójicamente el paciente que posee una inmunocitopatía maligna es inmunodeficiente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobulinas "sin
sentido" producidas por un clon de células linfoides mal controlado.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijación (IFE)
son muy útiles en la detección de proteínas monoclonales. Asi, en pacientes
que presentan signos sospechosos, síntomas o especialmente cuando se
detectan signos hematopatológicos en sangre periférica, médula ósea o ganglios linfáticos, un IEP puede dar un diagnóstico. El que una electroforesis de
proteina sérica deba preceder a una IEP o IFE depende de la disponibilidad
relativa de estas técnicas y de la sofisticación de cada laboratorio. Por ejemplo, una electroforesis en agarosa de proteínas séricas detecta la mayoría de
los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato de
celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE
es revisando las determinaciones electroforéticas de las proteínas séricas.
Otra manera de abordar el análisis sugerida por Keren y sus colaboradores (Keren, 1988) consiste en determinar los valores del suero y la relación
K/X conjuntamente con una electroforesis de alta resolución. La inmunofijación del suero se realiza si no se detectan anomalías en la electroforesis, ni
hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobulinemia. y si la relación K/X no
se encuentra dentro de los valores de referencia. También se recomienda la
inmunofijación del suero cuando la relación K/X es normal pero aparece una
banda no identificada en la electroforesis.
La IEP es una técnica sensible y relativamente sencilla empleada para
detectar componentes M y sus cadenas pesadas y ligeras. Permite una semicuantificación de la concentración de las inmunoglobulinas. El suero de
pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un grupo •normal". Por
ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se hacen porciones de 1 mi que se congelan rápidamente en hielo seco y acetona y se conservan a -70 °C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a congelar sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 °C.
Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: antisuero completo
humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K y anti-A
(Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros son
semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un componente M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrarse con un segundo antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe compararse con un suero control para su actividad mediante una difusión en gel, y
para su especificidad con suero humano completo mediante IEP. La interpretación de una IEP puede requerir una considerable experiencia, pero
generalmente uno busca una variación de una linea normalmente uniforme, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene diferente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es
una técnica útil pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia
de cadenas pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectivamente una molécula de inmunoglobulina compuesta por dos cadenas
pesadas y dos ligeras.
También es posible, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos
monoclonales por debajo del límite de detección del sistema empleado. El
umbral de detección puede determinarse diluyendo un anticuerpo monoclonal
conocido y probándolo en IEP. Debido a que proteínas monoclonales pertenecientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en cantidades
relativamente pequeñas en comparación con la IgG, la cadena ligera de la
inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapacidad para detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en
menor concentración en presencia de una mayor concentración de IgG, se
denomina efecto sombra (umbrella eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios
otros procedimientos para descartar la enfermedad de Franklin o de cadena
pesada. Es posible que el suero que se está testando y el anticuerpo que se
está utilizando no estén a la concentración adecuada y que no se detecte el
componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que se está usando
no detecte los determinantes disponibles de un componente M concreto. Si
uno tiene una importante sospecha, puede ser útil utilizar un segundo antisuero de distinto origen.
Inmunofijación
La IFE prácticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clínico debido a su rapidez, sensibilidad y facilidad en la interpretación; ambos procedimientos son comparables en cuanto a sensibilidad. La IFE además posee
la ventaja de dar un resultado más rápido ya que no requiere la difusión a
través de gel. Muestras de suero del paciente se someten por duplicado a
una electroforesis en gel de alta resolución antes de añadir un antisuero
monoespecífico directamente sobre las proteínas separadas. Se lava el
gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tiñen y miden directamente
(Fig. 37-7).
De vez en cuando, la concentración de una proteína monoclonal en el suero de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para
lormar complejos que precipiten por IFE. Este fenómeno se corresponde con
la zona de exceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un
halo de complejos precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la
equivalencia) con una zona central clara donde existe el exceso de antígeno.
Aunque este resultado parece atípico, se puede interpretar y comprobar de
forma directa repitiendo el IFE con una mayor dilución del suero del páctenle
(Keren, 1999).
Cualquiera de las dos técnicas puede aplicarse a otros fluidos corporales,
siendo la orina el más común. Se pueden detectar cadenas ligeras monoclonales en la orina (proteína de Bence Jones) de más de la mitad de los pacientes con mieloma múltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974). Cadenas ligeras policlonales pueden detectarse en pacientes con otros trastornos, normalmente
formando parte de moléculas de inmunoglobulina completas. La detección de
la proteína de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. La
IEP/IEF de orina es más específica y más sensible que otros ensayos de Bence Jones más antiguos. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con
suficiente proteina o tras concentración por liofilización o mediante membranas selectivas (Minicon, Amicon). La medida de la viscosidad del suero se
estudia en el Capítulo 27.
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
•I
v
Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijación del suero Se sometieron por duplicado muestras de suero de un paciente a una electroloresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las proteínas separadas reaccionan con un antisuero monoespecilico,
los geles se lavaron, fijaron y tiñeron. SP o SPE = muestra que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reacción con el antisuero: G o
IgG = muestra que ha reaccionado con anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha reaccionado con IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reaccionado con anli-IgM. K o anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccionado con anti- . A. "normar.
B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente
M de cadena .
Prevención de las enfermedades y terapia
La inmunización pasiva es la administración de anticuerpos preformados
obtenidos de otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o
de una especie diferente ( -globulinas heterólogas); proporciona una protección inmediata frente a la infección. La inmunidad dura poco y decae a medida que los anticuerpos se utilizan y catabolizan. La protección pasiva durante el periodo neonatal se basa en la transferencia de anticuerpos maternos a
través de la placenta o el calostro (Pennington. 1991).
Grupos de -globulinas humanas son útiles para la protección temporal frente a varias infecciones víricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstróm,
1990; Desai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de administración, la enfermedad puede modificarse a una forma más suave o puede
prevenirse por completo. El efecto es más completo y predecible si se usan
preparaciones hiperinmunes preparadas a partir del plasma de individuos que
están convaleciendo de la enfermedad en cuestión o que se han inmunizado
frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentración
más elevada de anticuerpos específicos. También se pueden producir anticuerpos en animales, como pueden ser los caballos, y en el pasado han tenido una importante aplicación. Sin embargo, la sensibilización a proteínas
externas puede desencadenar reacciones clínicas como la anafilaxis, enfermedad del suero, pirexia y reacciones de Arthus locales.
Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas áreas de la
medicina, incluyendo la investigación, diagnóstico y terapia. Se han desarrollado anticuerpos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Mountain, 1992: Morrison, 1992; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos
monoclonales. que a menudo reemplazan a los antisueros policlonales. se
usan con fines diagnósticos (Véase Cap. 35). Quizás las aplicaciones terapéuticas más importantes se ven en el campo del trasplante y la oncología
(Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo monoclonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea como
terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotóxicos en
CAPÍTULO 37
•
EVALUACIÓN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL
891
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pacientes de transplante renal (Ortho Multicenter Transplant Study Group.
1985). Se están evaluando muchas aplicaciones clínicas importantes de anticuerpos monoclonales. Un ejemplo reciente es el uso de un anticuerpo monoclonal frente al factor de necrosis tumoral u para prevenir las reacciones de
Jarisch-Herxheimer resultantes del tratamiento con antibióticos en el caso de
infecciones por Borrelia en ovejas (Fekade. 1996). Anticuerpos monoclonales
anticitocinas y antimoléculas de adhesión de neutrófilos pueden resultar efectivos en condiciones asociadas con inflamación aguda y liberación de cilocinas, por ejemplo, inhalación de ácido, isquemia o heridas de reperfusión
(infarto de miocardio, choque hemorrágico, reparación de un aneurisma aórtico); y anticuerpos que inhiben la adhesión de neutrófilos pueden resultar
efectivos en el tratamiento de asma, fibrosis pulmonar, meningitis y malaria
cerebral. Parece razonable esperar que una multitud de aplicaciones terapéuticas aparezcan en el luluro, en que se diseñarán anticuerpos monoclonales que modulen las acciones de uno o más mediadores naturales de inflamación, infección o proliferaciones malignas.
C A P Í T U L O
1
38
Complemento y cininas:
mediadores de la inflamación
Eric Wagner, PhD.
Haixiang Jiang, M.D., PhD
Michael M. Frank, M.D.
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA
DEL COMPLEMENTO
Enfermedades dermatológicas
892
Enfermedades hematológicas
Nomenclatura
Enfermedades neurológicas
C3: molécula central de las vías de activación
Enfermedades cardiovasculares
del complemento
Biocompatibilidad
Vía clásica
Trasplante de órganos
Vía alternativa
UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES
Vía de la lectma fijada a mañosa
DEL COMPLEMENTO
Componentes finales del complemento
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
Anafilotoxinas
Evaluación funcional de la vía clásica
Receptores del complemento
Manejo de las muestras
Biosíntesis del complemento
Preparación de eritrocitos
Preparación de eritrocitos de oveja sensibilizados
con anticuerpos
Genética del complemento
Complemento e inmunidad adquirida
902
COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD
Ensayo del complemento hemolítico total
Ensayo de la vía alterna
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL
COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD
906
Principios generales
Regulación de la activación del complemento
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO
906
903
903
Enfermedades reumatológicas
Niveles del complemento mediante
ensayos antigénicos
Prueba de fijación del complemento
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN DE CININAS
910
BIBLIOGRAFÍA
910
Enfermedades infecciosas
Enfermedades renales
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL SISTEMA
DEL COMPLEMENTO
El término "complemento" se refiere a un grupo de glicoproteínas circulantes
que funcionan facilitando la inflamación y realizan un importante papel en la
defensa del huésped. El daño tisular incontrolado es una posible complicación
de la activación del complemento, y existen una gran variedad de glicoproteinas circulantes así como proteínas tisulares de unión a membrana que funcionan regulando la actividad del complemento y disminuyen la agresión del complemento. La existencia de este sistema de proteínas fue inferido en los últimos
años del siglo xix cuando quedó claro que el suero fresco tenía la posibilidad de
lisar bacterias Gram negativas y vibriones cólera en presencia de anticuerpos
específicos. A medida que las técnicas para la purificación y la identificación de
proteínas se hicieron más sofisticadas con los años, quedó claro que había un
sistema muy complejo con muchas proteínas interaccionando.
En general, el sistema funciona identificando células y microorganismos extraños y destruyéndolos Esto ocurre por lisis directa, por opsonización (el proceso
de cubrirlos con péptidos específicos del complemento reconocidos por receptores específicos de los fagocitos para producir su ingestión) o provocando infla-
mación con la atracción de células fagocitos. También ha quedado claro que el
complemento juega un papel para facilitar la respuesta inmune.
El sistema de proteínas del complemento es más antiguo filogenèticamente que la inmunidad adquirida (anticuerpo) y está presente en muchos organismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un nivel de inmunidad natural y defensa del huésped incluso en ausencia de anticuerpos. Esto lo hace a
través de la vía de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la vía alternativa del
complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporcionan un
nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defensa del huésped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del
descubrimiento del complemento y de las diferentes vias del complemento
(Frank. 1998).
Nomenclatura
Hay tres vias pnncipales de activación del complemento en el suero humano:
la vía clásica, la vía alternativa y la via de la MBL (o vía de la MBLectina). La
Figura 38-1 muestra la secuencia de reacción de cada vía. La Tabla 38-1 proporciona información especifica sobre cada proteina del complemento plasmática La nomenclatura para las proteínas del sistema del complemento
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
C5b678(9)n
893
Complejo de alague de membrana
Figura 38-1. Los componentes de las vías clásica, MBIecitina y alternativa convergen para formar una convertasa que degrada al C3. En la
via clásica, el complejo antigeno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la vía de la MBIectina, la interacción de la
MBL con un carbohidrato en la superficie de un microorganismo origina la formación de un complejo enzimático (MBL-MASP-l-MASP-2, llamado M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C3 sufre la hidrólisis de su enlace tiol-ésler. lo que induce un
cambio en su conformación. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para formar una convertasa que es estabilizada por la properdina (P). El C3b, el producto de degradación del C3, también tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz de activar la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vías continúa secuencialmente mediante la unión con los componentes de aparición final hasta que la secuencia de activación se completa.
generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por
razones históricas, las nueve proteínas de la vía clásica se nombran por la
letra C seguida del número que cuenta su orden de aparición en la secuencia
de reacción. Una excepción importante es C4, que aparece antes que C2. Las
moléculas que son parte del complejo C1 se denominan Clq, Clr y Cls. Las
proteínas que reaccionan únicamente en la vía alternativa son llamadas factores y se denominan con una letra mayúscula (p. ej., factor B. factor D).
Además, los fragmentos de las proteínas del complemento resultantes de la
ruptura proteolítica se denominan con una letra en minúscula (p. ej.. C4a,
C4b) donde a representa el fragmento pequeño y b representa el fragmento
grande. La excepción a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande
y C2b es el fragmento pequeño. Los posteriores fragmentos degradantes de
los fragmentos grandes del complemento en un componente son denomina-
dos con una letra en minúscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han
perdido su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minúscula (p. ej.. iC3b, iC4b). Las cadenas polipeptídicas de la proteína nativa del
complemento se denominan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq,
cuyas cadenas son denominadas A, B y C. Los componentes simples o complejos multicomponentes que tienen actividad enzimática se denominan con
una barra sobre el componente o los componentes. Las proteínas de la
recientemente descrita vía MBLectina son denominados con las abreviaturas
de los nombres de las proteínas (p. ej., MBL para lectina lijada a mañosa,
MASP para la proteinasa sérica asociada a la MBL). Las proteínas reguladoras son denominadas con un lítulo o una letra descriptiva (p. ej.. proteína unida a C4, factor H). Las proteínas reguladoras de unión a la membrana han
sido denominadas con números CD y títulos descriptivos (p. ej., proteína
894
SECCIÓN V
Tabla 37-8
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Proteínas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o
Proteina
Común a todas las vias
C3
Via clásica
C1q
Cir
C1S
C4
C2
Via alternativa
Factor B
Factor D
Properdina
Vía MBLecitina
MBL
MASP-1
MASP-2
Complejo de ataque a la membrana
C5
C6
C7
C8
C9
Proteínas de control
C1inh
C4bp
Factor I
Factor H
Proteina S
Clusterin
Factor J
P e s o molecular (kDa)
Localización c r o m o s o m i c a
Concentración (mg'ml)
185
19p13.3-p132
1 200-1.300
460
85
85
205
102
1p34.1-36.3
12p13
12p13
6p21.3
6p21 3
150
50
50
300-600
20
93
24
55 (monomoro)
6p2t 3
Desconocido
Xpl 1 4-p 11 2
200
2
25
200-400
93
7C
10p11 2-q21
3q27-28
1p36 3-36.2
0.002-10
1,5-13
Desconocida
190
110
too
150
70
9q33
5p13
5p13
1p32 (cadenas u y ß) 9q22 3-q32 (cadena y)
5p13
80
45
90
55
60
105
550
88
150
84
70
20
11q11-q13.1
1q32
4q25
1q32
17q11
Desconocido
Desconocido
240
250
35
300-450
500
50
-5,4
cofactor de membrana. CD46) y los receptores del complemento son denominadas con números que siguen al pretijo CR (para los receptores del complemento 1 a 4). Los otros receptores del complemento se denominan con
símbolos del complemento seguidos por la letra mayúscula R.
En presencia de un aceptor adecuado, el tiol-éster interno puede no sufrir
la hidrólisis y degradarse, pero puede reaccionar con un nucleófilo en una
célula diana para formar una unión amida o éster con el sustrato diana del
complemento de ataque. De este modo, la activación del C3 con la consiguiente degradación del tiol-éster puede originar una unión covalente de la
molécula de C3 a ia superficie de la célula diana.
C3: molécula central de las vías de activación
Así queda cubierta una diana con C3b. pudiendo interaccionar con las céludel complemento
las que expresan receptores de C3b. Estas incluyen todos los fagocitos, los
La proteína lamada C3 es fundamental para la función de las tres vias de
linfocitos B y una población de linfocilos T,
activación del complemento (la via de la MBLectina, la via alternativa y la vía
El C3, con su cadena a' unida covalentemente a la diana y la cadena \i
clásica) y la comprensión del C3, su mecanismo de acción y sus funciones es unida debido a la unión disulfuro intracatenaria. se denomina C3b (Fig. 38-2).
esencial para comprender la activación y la función de todas las vias del comEs la forma en la que el C3 continúa la cascada del complemento conducienplemento.
do a la lisis. Además, de esta forma, la molécula puede interaccionar con las
El C3 es una molécula de dos cadenas sintetizada en muchas células, pardos glicoproteinas circulantes, los factores H e I. siendo la segunda una enziticularmente en los hepatocitos. formada a partir de una molécula de cadena
ma proteolítica que degrada el C3 de la sangre. En la interacción con los facúnica, el pro-C3, y liberado a la circulación. Las dos cadenas (a y p) están
tores H e I. un pequeño fragmento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, siguiendo
estabilizadas por puentes disulfuro mtracatenario, y hay un puente disulfuro
dos degradaciones adicionales de la cadena a en una curva disulfuro dentro
intercatenario estabilizando la interacción de la cadena a y la p (Fig. 38-2).
de la cadena que conecta las porciones amino y carboxi-terminal de la cadeLas interacciones hidrofóbicas son también importantes, y la reducción de los
na a' (Fig. 38-2). Debido a las diferentes uniones disulfuro, la mayoría del
puentes disulfuro intracatenano no origina la separación de las cadenas en
C3b permanece unido a la diana del complemento.
ausencia de agentes que rompan la interacción hidrofóbica.
Una vez realizada la degradación del C3b por los factores H e I. todavía
En la cadena a del C3. hay un tiol-éster uniendo el sulfhídrilo de la cisterna
ocurre otro cambio conformacional. Esta molécula, ahora lamada iC3b. interen la posición 988 con un residuo de glutamina de 3 aminoácidos. Este tiol-éster
acciona pobremente con el CR1. el receptor C3bC4b. pero interacciona con
interno confiere una estructura inestable a la molécula de C3 El tiol-éster interla integrina p\, CR3 (CDl1b CD18). El iC3b ya no puede interaccionar con las
no está oculto en el centro hidrofóbico de la molécula. Puede ser degradado por
proteínas de la parte final del complemento para inducir la lisis.
la hidrólisis gradual a medida que el agua penetra en la molécula. Es degradaIgual que con el C3b. el iC3b facilita la fagocitosis uniendo la diana del comdo mucho más rápidamente una vez degradada la cadena alfa del C3 con libeplemento a los fagocitos mediante los receptores de iC3b. Estos incluyen
ración del C3a (fragmento de 9 kDa) en el extremo amino-terminal de la cadetodos los lagocilos y los macrófagos, pero no incluyen los linfocilos B o las
na a. La cadena restante se lama a'. El C3 nativo, presente en 1,2 mg'ml en células T. En presencia de CR1, el C3b y el iC3b pueden sufrir posteriores
el plasma normal, no interacciona con las células que expresan receptores de
degradaciones por el factor I. En ese caso, una degradación adicional se proC3. Sufre una gran alteración conformacional con la degradación del tiol-éster
duce en la porción amino-terminal de la cadena (/.. Una porción de 41-kDa de
interno. El C3 con el tiol-éster hidrolizado interactúa con las células que exprela cadena a unida por enlaces amino o éster a la diana permanece detrás, y
san receptores de C3b. especialmente CR1 (receptor C3b C4b, CD35).
es liberado el C3c. que contiene las porciones amino-terminal y carboxi-ter
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
895
mínal del C3b. unidas por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro a
convertasa de la vía alternativa descrita antes, degrada las moléculas adiciola cadena |5 (Fíg. 38-2). La porción restante unida covalentemente a la diana
nales del C3 continuando la cascada del complemento {vide mira).
se denomina C3dg y puede sufrir una posterior degradación a C3d. De nueDatos recientes sugieren que existe una vía MBLecitina que actúa via MBL
vo, existe un receptor específico para el C3d y para el C3dg (CR2, CD21).
y serin proteasas lamadas MASP-1 y MASP-2 ya sea para la degradación
Este receptor está presente en todos los Imfocitos B, en algunos linfocitos T
directa del C3 por una de las enzimas MASP o para la activación de la vía cláy en algunas células epiteliales, pero no está presente en los fagocitos. Se
sica para formar la C3 convertasa de la vía clásica. En cualquier caso, el C3a
analiza con más detalle posteriormente.
se degrada de C3. El tioléster es degradado y la molécula entonces es capaz
de unirse a las dianas. Debe quedar claro que el C3 sufre una hidrólisis o la
El C3 en su configuración nativa no activa la via alternativa. Sin embargo,
escisión a C3b, una posterior degradación a iC3b, y después la posterior
el C3 (H 0) (también lamado iC3) y el C3b interaccionan con los factores
proteicos D, B y properdina de la via alternativa para formar una nueva enzi- degradación a 3dg y a C3d. Los diferentes receptores celulares interaccionan
ma, el C3bBb. la convertasa da la vía alternativa. Esta enzima es capaz de con el C3 en etapas específicas en la vía de degradación.
degradar posteriormente el C3 separando la cadena a de las moléculas adiDe este modo, el C3 representa la proteina central de las tres vias del comcionales del C3 nativo. La hidrólisis interna gradual del C3 a C3(H-,0). por lo
plemento. La proteina no interaccíona con ningún receptor en su lorma natitanto, puede mediar la activación de la vía alternativa activando el C3 a una
va. Debe ser hidrolizada para activar la vía alternativa e mteraccionar con los
configuración hidrolizada de C3. uniendo los factores B. D y properdina y
receptores de C3b. La separación del C3a de su cadena a produce el mismo
degradando moléculas adicionales de C3. Esto se denomina "señal" interna
efecto. Esto puede ocurrir a través de la activación de cualquiera de las tres
y se cree que es bastante importante en la activación inicial del C3 por la vía
vías del complemento. La posterior degradación, como se describió, conlleva
alternativa.
a una progresiva interacción con los receptores en diferentes etapas de las
células presumiblemente mediando la fagocitosis por un lado y la regulación
El anticuerpo y los componentes de la vía clásica originan la producción de
de la respuesta inmune por el otro.
una vía clásica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, como la C3
2
Figura 38-2. Secuencia de degradación del C3 e inactivación del C3b. El peso molecular aproximado de cada
cadena o fragmento se da en kilodaltons. Las enzimas y
cofactores responsables de cada degradación (designados en letras mayúsculas) son: A. C3 convertasa: B, factor H o CR1 + factor I; C. CR1 + factor I; D, tripsina, elastasa o plasmma.
896
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
al anticuerpo Ig G cuando esta inmunoglobulina es la iniciadora de la activación
de la vía clásica del complemento (Brown. 1983). El nuevo complejo generado
(C4b2a3b) representa la C5 convertasa de la vía clásica y dispara la sedimenLa activación de la via clásica del complemento, descrita alrededor del año
1900. fue la primera en ser estudiada. Esta via es responsable de la activa- tación de los componentes finales del complemento en la superficie diana.
ción del complemento en la mayoría de las células sensibilizadas con antiLa IgM y la IgG difieren en su capacidad para activar la vía clásica del comcuerpos. Los detalles de esta vía están publicados en otras obras (Volanakis.
plemento. Parece que una molécula simple sobre todo de anticuerpos Ig M uni1998: Fries, 1987). Nueve proteínas numeradas componen la vía clásica. La da por múltiples lugares del anticuerpo a un antígeno puede unir una molécuactivación de la via clásica normalmente requiere la interacción entre un antíla de C1 y disparar una secuencia completa de activación del complemento.
geno y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglobulina M La Ig M. con sus cinco sitios de unión antigénicos, adopta una conformación
(Ig M) y la Ig G son efectivas en activar la via clásica. La eficacia de la acti"básica" en la superficie antigénica para permitir múltiples interacciones con los
vación de la vía clásica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig G3>lg
antígenos. En contraste, la unión del C1 a la Ig G requiere dos moléculas de
G1>lg G2; la Ig G4 no es capaz de activar el complemento. Interesantemen- Ig G una al lado de la otra en la mayoría de los estudios experimentales (Borte, un número de moléculas, diferentes de las inmunoglobulinas. tiene la
sos, 1965). Ya que los anticuerpos Ig G se unen a una superficie diana de forcapacidad de activar la via clásica a través de la interacción directa con el
ma aleatoria y ya que los antígenos pueden no ser distribuidos de forma uniC1q. Estas incluyen la proleína C reactiva, el componente sérico del amiloide
forme en un organismo diana, puede ser necesaria la unión de cientos o miles
P, el fi-amiloide. algunas bacterias gram negativas, ciertos virus, el micoplas- de Ig Gs para generar un lugar de unión para el C1. La activación de la vía cláma, protozoos y componentes intracelulares como el ADN, las membranas
sica por el complejo Ig G-antígeno también parece facilitar la vía alternativa
mitocondriales y los filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesan(véase siguiente sección) sobre la superficie del activador (Moore, 1981).
temente, las células apoptóticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capaLa capacidad de las inmunoglobulinas agregadas para unir el Ciq ha procidad de activar la vía clásica. Esto puede ser de importancia crítica en la eliporcionado las bases para un número de pruebas diseñadas para detectar la
minación de las células apoptóticas de la circulación.
presencia de complejos inmunes solubles en las muestras de sangre de los
Vía clásica
pacientes. El C1q radiomarcado se añade a la muestra de suero o de plasma,
Nos centraremos en la activación del complemento como sucede en las dianas sensibilizadas a anticuerpos. Una vez unida la inmunoglobulina al objetivo, y se usa una de las técnicas existentes para separar el Ciq libre del unido a los
componentes proteicos del suero. El Ciq unido sugiere la presencia de comel C1 se une a la inmunoglobulina y se activa. La naturaleza precisa de la interplejos de inmunoglobulinas en la muestra de suero o de plasma (Zubler. 1976).
acción antígeno-anticuerpo-C1 no está clara. El C1 es una macromolécula de
740 kDa que consta de una molécula simple de C1q compleja con dos cadenas
C1r y dos cadenas C1S unidas todas en presencia de iones calcio. El C1q está
Vía alternativa
formado por seis subunidades, cada una conteniendo tres cadenas polipeptídicas (designadas A. B y C). Las tres cadenas forman una triple hélice parecida al
La presencia de una segunda vía de activación del complemento fue
colágeno con regiones globulares que constituyen la porción carboxi-terminal de
propuesta por primera vez por Piilemer (1954) pero fue aceptada por la
la molécula. El C1q se une a las inmunoglobulinas a través de sus cabezas glo- comunidad científica dos décadas después. Esta vía de activación del combulares, mientras que se une a otros activadores de la vía clásica como la proplemento parece ser importante en la defensa precoz contra los microorteina C reactiva y el ADN a través de su región parecida al colágeno. Las cadeganismos patógenos (Pangburn. 1984). Los anticuerpos pueden activar la
nas C1r y C1S se unen a la región similar al colágeno del C1q. Se sabe que el
via pero normalmente no son necesarios. El comienzo de la via alternativa
primer componente de la via clásica, el Ciq. se une al dominio Cy2 de la Ig G o
en la superficie de un aceptor depende de la capacidad del grupo carbonil
al dominio Cu3 de la Ig M. Una vez unido a la inmunoglobulina, el C1q adopta del grupo tioléster expuesto del C3b de interaccionar ya sea con un grupo
un cambio conformacional que conlleva la autoactivación de las dos cadenas
amida o con uno hidroxilo de la proteína o del carbohidrato presente en la
C1r. Se cree que esto origina la degradación de las dos cadenas C1r para crear
superficie del objetivo (Law, 1979). La generación del C3b se consigue por
un sitio activo enzimáticamente en cada cadena. El C1r activado se escinde
la denominada C3 convertasa de iniciación. En el suero, el C3 es hidrolientonces en dos cadenas C1s. Este C1 "activado" es una proteasa y tiene ade-zado a un índice de 0,2% a 0,4% del depósito plasmático por hora (Pangmás, en algunos sistemas modelo, actividad estearasa. El C1s aclivado degra- burn, 1981). El C3 con un tioléster hidrolizado sufre un cambio conformada el siguiente componente de la cascada, el C4. El fragmento mayor, C4b, se cional que le permite interaccionar con las proteínas que no interaccionan
une a la superficie del activador, mientras que el fragmento pequeño, el C4a, es
con el C3 nativo y se denomina C3(H,0) (también lamado iC3). El 03(^0)
liberado en la fase de fluido. El C4a es una anafilotoxina y se describe en otra entonces tiene la capacidad de interaccionar con el factor B en presencia
sección de este capítulo. El C4b es altamentente reactivo químicamente durande iones magnesio. El factor B. una vez unido al C3(H,0), puede interacte unos momentos después de la degradación del C4 y puede unirse a la super- cionar con el factor D y es degradado para generar la convertasa de inificie del activador. La unión a la superficie del activador es relativamente ineficaz. ciación C3(H;0)Bb y liberar un pequeño fragmento, el Ba. Esta degradaPor lo tanto, la mayoría del C4b generado es hidrolizado y permanece en la fase ción es mediada por el factor D, una proteasa sérica que adopta una
de fluido. De cualquier manera, algunas de las moléculas de C4b generadas se
configuración activa una vez reconocido su sustrato y vuelve a una conforunen a la superficie del activador como un grupo alrededor del lugar antígenomación inactiva una vez que se produce la degradación proteolítica (Volaanticuerpo-Cl. Un lugar simple antígeno-anticuerpo-C1 puede entonces condunakis, 1996). La convertasa de iniciación C3 degrada el C3 para generar
cir a la sedimentación de muchas moléculas de C4b.
un C3b metaestable a un índice constantemente bajo en la circulación. El
C3b metaestable puede unirse covalentemente a la superficie del activador
En presencia de iones magnesio, el C4b actúa como un lugar para la unión
y entonces, como el C3(H 0). unirse al factor B. Se ha propuesto que la
y posterior degradación del C2. El C1s, en asociación con el C4b. degrada el
presencia de ácido siálico en las glicoproteínas y glicolípidos asociados a
C2 en dos fragmentos. El fragmento mayor. C2a, permanece unido al C4b,
la membrana previene la formación de una C3 convertasa de la vía altermientras que el pequeño, el C2b. se libera en la fase liquida. Esle complejo
nativa aumentando la afinidad del factor H (véase después en Regulación
molecular (C4b2a) es inestable y tiene una vida media relativamente corta debide la activación del complemento) para el C3b (Kazatchkine, 1979). Como
do a la desintegración que resulta de la disociación de C2a en una forma inacen la C3 convertasa de iniciación, el factor D degrada al factor B para
tiva. Este complejo (C4b2a) representa la convertasa C3 de la vía clásica requegenerar la C3 convertasa de unión celular C3bBb. Este complejo se desinrida para la unión y degradación del C3. El C2a en el complejo C4b2a es la
tegra rápidamente pero es estable una vez unido a la properdina. que proenzima que degrada el C3 en la siguiente etapa de la cascada de activación y
longa la vida media de la C3 convertasa de uno a dos minutos a 18 minudel C5 en una etapa posterior. El C2a degrada el C3 en un fragmento grande,
tos (Fearon, 1975). Esta C3 convertasa estabilizada rápidamente degrada
el C3b, que se une a la superficie del activador, y un fragmento pequeño, el
más C3, que puede unirse a la superficie del activador y entonces se conC3a. que es liberado en la fase de fluido y sirve como una anafilotoxina. Como
sidera como la amplificación de la C3 convertasa de la vía alternativa. Esta
en el caso del C4. no todo el C3b se une a la superficie del antigeno objetivo.
amplificación del C3b depositado en la superficie del activador permite la
En algunos sistemas modelo, alrededor del 5% del C3 activado se une al objeformación de una C5 convertasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la
tivo. Además, en algunos modelos, un alto porcentaje del C3 del objetivo se une
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CAPÍTULO 38
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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
capacidad de disparar la activación de los componentes terminales del sistema del complemento.
897
embrago, es necesaria la inserción de múltiples copias de C9 a través de la
bicapa lipídica a través de la interacción inicial con la cadena a del C8 para
producir la completa actividad citolítica del MAC (Plumb. 1998). Se cree que
el complejo C5b-8 sirve como un iniciador para la polimerización del C9 en
Vía de la lectina fijada a mañosa
la membrana celular. El MAC, por microscopía electrónica, muestra una
estructura parecida a un cilindro hueco formada por el ensamblaje de sus
Recientemente se ha descrito una tercera via de activación del complecomponentes en presencia de un exceso de C9 (Podack. 1984). El mecamento que utiliza una proteina sérica, presente en alrededor de 1.5 ug mi.
nismo por el que el MAC rompe la membrana celular todavía es controverla MBL (también lamada lectina unida a mañosa o proteína fijadora de
tido y puede incluir la distorsión de la bicapa lipídica para formar parches
mañosa). La MBL está presente en todos los mamíferos y pájaros, y peragujereados" (Esser, 1991) o, más probablemente, la lormaaón de un poro
tenece a la familia de moléculas lamadas colectmas (Turner, 1996: Epstransmembrana con un centro hidrofílico a través del que los iones pueden
tein, 1996). La familia de las colectinas incluye, además de la MBL, las propasar libremente (Bhakdi. 1991). La formación del MAC induce la lisis de
teínas del surfactante pulmonar A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina
ciertas bacterias y virus, y de eritrocitos heterólogos. La mayoría de las
y la CL-43 bovina (Epstein. 1996). La MBL está estructuralmente relaciocélulas nucleadas resisten la citotoxicidad inducida por el MAC. Esta pronada con el C1q. Su estructura primaria es una cadena polipeptidica fortección, especialmente del ataque del complemento por las proteínas del
mada por un núcleo colágeno y un dominio globular carboxi-termmal (Hancomplemento propias, es mediada por las moléculas reguladores asociadas
sen, 1998). Tres de las cadenas se asocian para formar la subunidad de la a la membrana que previenen la formación del MAC (véase después Regumolécula. En el suero, la MBL se encuentra como una mezcla de dímeros
lación de la activación del complemento) asi como por la liberación de proy hexámeros de su subunidad primaria. La MBL reconoce ciertos carbohiteínas del complemento activadas por la sangre de la superficie celular. La
dratos expresados en la superficie de los microorganismos (es decir, no
lisis de las células nucleadas mediada por el MAC puede ocurrir pero
reconoce carbohidratos como la galactosa y el ácido siálico que son los
requiere múltiples lesiones por el MAC para producirse (Koski, 1983). Se na
azúcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamíferos)
propuesto que la pérdida de cantidades subliticas de MAC puede proteger
(Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la MBL son:
a la célula del consiguiente ataque del complemento (Reiter, 1992). Las
mañosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa
células nucleadas están protegidas en parte de los efectos del MAC debido
(Hansen, 1998). Esto permite a la MBL discriminar entre lo propio y lo
a la eliminación activa de la superficie celular a través de la reparación de
extraño. Se informó que la MBL reaccionaba con un amplio numero de bacla membrana unida al recambio lipidico (Mold, 1998). La formación del MAC
terias no capsuladas Gram positivas y Gram negativas, con virus, levadu- tiene un efecto estimulante sobre muchos tipos de células nucleadas. Entre
ras, micobactenas. parásitos y protozoos (Epstein, 1996). Una vez reconootros, estos efectos incluyen la producción de radicales reactivos del oxígecido su carbohidrato ligando, la MBL adopta un cambio conformacional que no por los neutrófilos y los macrófagos, la liberación de eícosanoides por las
conleva la activación de dos proteasas séricas asociadas a la MBL, la
células tagociticas. la inducción de actividad procoagulante por las plaqueMASP-1 y la MASP-2 (Thiel, 1997). Tanto la MASP-1 como la MASP-2
tas y las células endoteliales. la actividad proinflamatoria en las células
muestran homología estructural con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes
endoteliales y las células del músculo liso, la proliferación de células del
con el complejo C1 (C1qrs). Una vez activada, la MASP-2 degrada el C4 músculo liso y de células endoteliales. y la iniciación de las vias de transpara generar la C3 convertasa C4b2a (Vorup-Jensen. 1998). La MASP-1
ducción de señales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen.
tiene la capacidad de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo que
1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993).
esto puede desencadenar directamente la activación de la vía alternativa
(Schweinle, 1989). Después de la generación de la C3 convertasa de la vía
clásica, la C4b2a, por el complejo MBL-MARSP-1-MASP-2, la activación
Anafilotoxinas
del complemento se produce como en la vía clásica con el posible reclutamiento de la vía alternativa también (Suankratay. 1998). La via de la MBLeLa activación de la vía clásica, alternativa o de la MBLectina del complecitina también puede dispararse por un complejo antígeno-anticuerpo Se
mento origina la generación de los fragmentos proteicos de! complemento
demostró que una fracción de las moléculas de Ig G que carecen de resique tienen importantes papeles en diferentes funciones biológicas como la
duos galactosa terminal (llamados Ig G-GO), tal y como se encuentran en
opsonización. la fagocitosis, la inmunomodulación y la generación de reacel plasma de pacientes con condiciones patológicas como la artritis reuciones inflamatorias. La opsonización, la fagocitosis y la inmunomodulación
matoide. tienen la capacidad de interaccionar con la MBL y activar la vía
dependen en su mayor pane de los receptores del complemento expresados
clásica (Malhotra, 1995). La MBL puede jugar un papel en la eliminación de
en las diferentes células del cuerpo, y se discuten en una sección posterior.
organismos diana por los fagocitos a través de la interacción con un recepComo se discutió previamente, la activación del complemento origina una
tor específico presente en estas células (Hansen. 1998: Tenner. 1995). La
degradación proteolitica de muchas proteínas del complemento con la consiregulación de la vía de la MBLecitina parece ser mediada por el Cl inhibiguiente liberación en la fase de fluido de pequeños fragmentos que tienen
dor (Matsushita. 1996) y por la cx-macroglobulina (Terai. 1995).
efectos biológicos. Tres de estos fragmentos liberados se laman anafilotoxinas. Son el C4a. el C3a y el C5a. Las caraclerislicas estructurales y funcionales de estas moléculas se describen en un mlorme excelente sobre el tema
(Ember. 1998). El C4a es un péptido de 8.7 kDa liberado del C4 una vez
Componentes finales del complemento
degradado por el Cls . El C3a es un fragmento peplidico de 9 kDa liberado
durante la degradación proteolitica selectiva de la cadena C3r/ por el C2a en
Las tres vías principales de activación del complemento convergen en la
la vía de activación de la C3 convertasa clásica y MBLectina. También es libeactivación del C3 y en el ensamblaje del complejo de ataque a la membrana (MAC), que está formado por los componentes C5 a C9, Una vez forma- rado por la degradación proteolitica del C3 por el péptido enzimáticamente
activo, Bb, en la via de la C3 convertasa alternativa. El C5a es un péptido de
das las convertasas de la via clásica, de la MBLecitina (C4b2a3b) y de la
11 kDa liberado de la cadena a del C5 por la degradación inducida por el C2a
alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El fragmento grande (C5b) puede asociarse con la membrana celular e interaccionar con el C6. La siguien- en la vía de la C5 convertasa clásica o MBLectina o por el Bb (y quizás en la
MBLectina) en la vía de la C5 convertasa alternativa. En general, las anafilote etapa incluye la interacción del complejo C5b-6 con un fluido fase C7 forloxinas se definen por sus efectos biológicos sobre las células del músculo
mando un complejo triménco con propiedades anfifílicas (alta afinidad por
liso, los maslocitos, los pequeños vasos sanguíneos y los leucocitos de sanlos constituyentes lipidíeos de la membrana celular) (Podack, 1979). El C5bgre periférica. Los efectos específicos mediados por estos péptidos incluyen
7 se inserta en la bicapa lipídica de la membrana celular pero no es suficiente para que ocurra la lisis celular. El C8 se asocia con este complejo tri- la degranulación de los mastocitos y los basófilos con la consiguiente liberación de diferentes mediadores como la histamina o la serotomna. Además,
molecular a través de la interacción con el C5b expuesto. El complejo C5b-8
inducen la agregación neulrofílica humana, la contracción del músculo liso, el
penetra a través de la bicapa lipídica para formar un pequeño poro transmembrana y puede originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin aumento de la permeabilidad vascular, la inducción de la liberación de tromL
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SECCIÓN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
boxano de los macrólagos del conejilo de Indias, y la estimulación de la
Reguladores del fluido sanguíneo
secrección de moco por las células caliciformes (Marón, 1985). Un efecto
importante de las anafilotoxinas sobre los basófilos es originar vasodilatación
El control del primer componente de la via clásica, el C1. está mediado
a través de la liberación de histamina, conduciendo a un aumento del flujo sanpor el C1 inhibidor (C1inh). El Clinh es una proteína altamente glicosilada
guíneo en el lugar de la inflamación. La función del C4a generalmente es simide 105 kDa que tiene la capacidad de disociar el C1 activado (Davis. 1989).
lar a la del C3a. Sin embargo, el C4a es mucho menos efectivo en sus efectosEl Clinh inhibe la autoactivación del C1. la activación del C1 en el fluido sanbiológicos sobre una base molecular. El C5a es sin duda la más potente de las
guíneo, y la activación del C1 en la superficie de los activadores de la vía cláanafilotoxinas humanas. Por ejemplo, el efecto del C5a es 200 veces mayor sica pero no en la mayoria de los complejos inmunes (Doekes. 1983). El Clinh
que el del C3a y 3.000 veces mayor que el del C4a originando la contracción es un inhibidor serín proteasa (serpin) que disocia el complejo C1 activado
del músculo liso del Íleon del conejilo de Indias Debe observarse, sin embaruniéndose a las subunidades de C1r y C1s del complejo. Mientras el C1q per
go, que la relativa efectividad de estos péptidos es tanto específica de tejido
manece en la superficie del activador, el C1r y el C1s son liberados al fluido
como de especie. Se ha sugerido que el C3a es efectivo selectivamente sobre sanguineo en forma de dos complejos de Ciinh-Clr-Cls-Clmh (Ziccardi.
los eosinófilos localizados en los lugares alérgicos, mientras que el C5a tiene
1979). Recientemente, se propuso que el Clinh tiene la capacidad de separar
efecto en muchos otros tipos celulares (DiScipio. 1999).
el complejo Clqr s entero de las inmunoglobulinas que tienen una baja afinidad por el Clq (Chen, 1998b) o de objetivos sensibilizados con dosis bajas de
Además de este papel como anafilotoxina. el C5a tiene otras muchas proIg G humana (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh inactiva la manosa fijadora de
piedades biológicas importantes. La unión del C5a a los neutrólilos origina un
lectina asociada a serín proteasas (MASP) (Matsushita. 1996). El Clinh tamaumento de la adhesión, la agregación y la inducción de una respuesta oxibién inhibe al factor Xlla y a la calicreína del sistema de contacto. Este tema
dativa, y la liberación de enzimas lisosómicas. Además, el C5a es fuertemenserá tratado en la sección Cinmas y el sistema de generación de Cinmas. Intete quimiotáctico para los monocitos y los neutrófilos. induciendo la migración
resantemente, el Clinh demostró interferir con la proliferación in vitro de los linde las células hacia la fuente de activación del complemento. De este modo,
focitos T y con el desarrollo de linfocitos T citotóxicos bloqueando la degradauna reacción inflamatoria de activación del complemento local puede por tanción de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina por los linfocitos T
to inducir un aumento del flujo sanguíneo al tejido, la adherencia de los neuactivados y por el C1r (Nissen. 1998). Sin embargo, la relevancia in vivo de
trófilos al endotelio local, y la migración directa de los fagocitos a los lugares
estos hallazgos no está aún clara. Se ha informado una proteina de 20 kDa
inflamatorios. Los neutrófilos agregados por el C5a pueden embolizar al pulcon actividad inhibitoria sobre la función C1. lamada factor J (Lopez-Trascasa.
món, originando cambios en el intercambio gaseoso pulmonar e incluso la
1989). Se informó que inhibía la formación del complejo C1 (Lopez-Trascasa.
muerte. Se cree que mucha de la inflamación de los pulmones causada por
1989) y después actuaba sobre la vía alternativa inhibiendo la degradación del
la formación del complejo inmune está mediada por el C5a (Ward, 1997). En
un modelo experimental de sepsis en ratas, se ha demostrado recientemente C3 por el factor B (González- Rubio. 1994) La defensina, péptido-1 neulrofílico humano (HNP-1 ). también puede inhibir al C1 en los lugares de inflamación.
que el C5a puede bloquear las funciones bactericidas de los neulrófilos si se
Se demostró que se unía al C1q en el fluido sanguíneo y bloqueaba la activaproduce en cantidades suficientes, sugiriendo un papel para la activación del
ción del complemento mediada por la via clásica (van den Berg. 1998).
complemento en los altos índices de mortalidad observados en la sepsis
(Czermak. 1999).
La actividad del C4b es regulada por el factor I (antes denominado inactivaLos efectos biológicos de las anafilotoxinas están mediados por los recepdor del C3b'4b) (Fries. 1987). El factor I degrada la cadena a del C4b para
tores específicos expresados por los dilerentes tipos celulares. Estos recepgenerar dos Iragmentos. el C4c y el C4d; el último fragmento permanece unido
tores se describen en la sección de los receptores del complemento.
a la célula. Para la proteóhsis se necesita un cofactor. la proteína fijadora de C4
(C4BP). El C4BP es una proteina de 570 kDa que también puede unirse al C4b
unido a partículas y sanguíneo, y desplazar al C2a de la via clásica de la C3
Regulación de la activación del complemento
convertasa C4bza (Gilgli, 1979). Además, el C4BP circula en asociación con
aproximadamente el 60% de la proteina S, un cofactor dependiente de la vitaLos graves efectos de la activación del complemento para inducir el daño
tisular requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- mina K para la proteina C mediando la degradación de los factores de la coagulación Va y Villa. Esta asociación inhibe la actividad del cofactor de la proteición diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activación, y (3) proteger las
na S (Dahlbáck, 1986) y parece inhibir la activación del factor X a través de las
células huésped de la lesión inadvertida. Se ha implicado un potente sistema
interacciones del C4BP tanto con la proteína S como con el factor VIII (Koppelde regulación para controlar la activación del complemento en cualquier etaman. 1995). Una proteína de 120 kDa con similitudes estructurales con el C2
pa de la cascada de la activación. Asi existen proteínas sanguíneas o asopero funcionalmente distinta del C2 fue aislada, y puede tener actividad regulaciadas a membrana que desarrollan una acción reguladora en la activación
dora sobre el sistema del complemento uniéndose al C4b (Hammer, 1989).
del complemento (Tabla 38-2).
?
Tabla 38-2 Proteínas reguladoras del complemento
Proteínas
Peso molecular (kDa)
Objetivo
Mecanismo de acción
Fases del fluido
Cl inhibidor
Factor H
Proteína fijada a C4
Proteína S (vilronectina)
Clusterin
Factor J
Célula asociada
105
150
550
84
70
20
C1
C3b
C4
C5b-7
C5b-7
Disocia el complejo C1 uniéndose al C1r y C1s
Colador para la inactivación del C3b por el (actor I
Cofactor para la inactivación del C4b por el factor I
Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares
Inhibe la inserción del MAC en las membranas celulares
C1. C3. B
CR1
190"
C3b. C4b
DAF (CD55)
MCP (CD46)
CD59 (protectina)
HRF
70
45-70
18-20
65
C3bBb. C4b?a
C3b (C4b)
C8, C9
C8, C9
Inhibe la formación del complejo C1 inhibe la degradación
de C3 por el Bb
Disociación de las C3/C5 convertasas cofactor par la
inactivación del C3b y el C4b por el factor I
Disociación de las convertasas C3/C5
Cofactor para la inactivación del C3b por el factor I
Inhibición de la formación del MAC
Inhibición de la formación del MAC
•Isoterma más frecuente del CRI
CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor acelerador de la degradación, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de restricción homologo
CAPITULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Debido a su papel crucial en las tres vías de activación del complemento,
el C3 está bajo un control rígido. El C3b sanguíneo y el C3(H 0) son rápidamente inactivados por el factor I que degrada los tres péptidos unidos de la
cadena a' del C3b (Davis. 1982]. generando entonces una lorma inactiva de
la molécula, la iC3b. que es incapaz de atraer al C5 o al factor B. Esta degradación mediada por el factor I requiere al tactor H como cofactor. El factor H
es una proteína de 150 kDa que se une al C3b y tienen actividad aceleradora de la desintegración a través de la vía alternativa de la C3 convertasa además de su actividad de cofactor para la degradación del C3b mediada por el
factor I. Además de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor H se une
al C3b unido a la célula y dispara la degradación por el factor I. limitando asi
la activación por la vía clásica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degradado en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede ínteraccionar con el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las células fagocíticas y promover la fagocitosis (véase después en Receptores del
complemento).
?
Hay un número de inhibidores sanguíneos de los componentes terminales
del complemento que previenen la inserción del complejo de ataque a la
membrana en las membranas celulares. La proteína S [S-protein). también
llamada vitronectina, se une al complejo C5b-7. previniendo así su inserción
en la membrana celular (Podack. 1977) e inhibiendo la polimerización del C9
(Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado que la proteína S se une
al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al receptor de la
cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la proteina
S en la regulación de la activación del complemento in vivo es incierta. Peake y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuando el complemento es activado en conejos y que este complejo todavía tiene la capacidad de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de
oveja sensibilizados llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Peake. 1996). Clusterin (también llamado Sp-40.40 o apolipoproteína J) es otro
inhibidor sanguineo de los componentes finales del complemento. Como la
vitronectina. clusterin previene la inserción del complejo C5b-7 en la membrana celular (Choi, 1989) y regula el complejo de ataque a la membrana en
los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todavía se desconoce el papel in vivo
del clusterin. aunque recientemente se publicó que el clusterin se deposita
en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer
iVerbeek. 1998). También, se ha publicado recientemente una asociación
significativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clínicos del
lupus eritematoso sistémico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la
inflamación mediada por anticuerpos (Newkirk, 1999).
Proteínas reguladoras asociadas a las células
Además de estar regulado en la lase liquida, la activación del complemento
también está regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la
lesión inadvetida a las células huésped. Algunas de estas proteínas no solo se
unen a las proteínas del complemento sino que actúan como receptores. Una
de estas proteínas es el receptor del complemento tipo 1 (CR1). La estructura
del CR1 se describe con más detalle en la sección Receptores del complemento. La función del CR1 es unirse al C4b y C3b activado y servir como cofactor para la degradación mediada por el (actor I de estos componentes en sus
productos de degradación inactivos. Además de servir como colador para la
degradación mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 también promueve la degradación posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser
degradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la tripsina y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 también tiene una actividad aceleradora de la desintegración hacia las convertasas C3 y C5 de la vía
alternativa y la clásica de la activación del complemento. Al unirse a C4b o C3b.
el CR1 también desplaza al C2a (vía clásica) o al Bb (vía alternativa), acelerando entonces la eliminación de las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1
promueve la eliminación acelerada de la C3 convertasa unida a la superficie de
la vía alternativa mucho más eficientemente que de la vía clásica (Ross. 1982;
Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expresa en los eritrocitos, más que
sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al trasporte de los complejos inmunes
que llevan el C3b a los lugares de degradación de las células de Kupffer del
hígado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del complemento, el CR2,
899
también tiene la capacidad de servir como colador para la degradación mediada por el factor I de iC3b en fragmentos pequeños (Mitomo. 1987).
El control del C4b y C3b depositado en la membrana celular se lleva acabo posteriormente por la proteina cofadora de membrana íMCP, CD46). Esta
proteína es expresada en casi todas las células, con la importante excepción
de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degradación del C4b y el C3b
en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el factor I (Seya. 1986.
1989) pero es incapaz de promover la posterior degradación del iC3b Se
informó que el MCP protege a la célula de la activación de la vía alternativa
más eficazmente que de la activación de la vía clásica (Kojima, 1993). Se ha
sugerido que esta proteína de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en prevenir el daño celular mediado por el complemento en aquellas células en las
que se expresa (Liszweski, 1992). A diferencia del DAF. no protege a las células vecinas (viúeintra).
Otra proteina asociada a la membrana celular que controla la activación del
complemento a nivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la
eliminación (DAF. CD55). El DAF es expresado por todas las células de la circulación, las células endoteliales y un número de células epiteliales iMorgan.
1994b). Esta proteína de 70 kDa lunciona. como su nombre implica, acelerando la eliminación de las C3 y C5 convertasas tanto de la via clásica como
de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor capacidad de afectar a la
C3 convertasa de la vía clásica que a su contrapartida de la vía alternativa
(Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociación del C2a y el Bb de las
C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que tienen la
capacidad de bloquear la unión de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF está
unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol más que
por un dominio hidrofóbico transmembrana, que ofrece a la molécula una gran
mobilidad y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del complemento (Davitz. 1987). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para
la degradación del C3b y C4b mediada por el fador I.
El control de los componentes finales del complemento en la superficie
celular se lleva a cabo por dos proteínas unidas al glicosil fosfatidilinositol. llamadas factores de restricción homólogos (HRF) o proteina fijadora de C8 y
CD59 (también llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la lisis
reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritro
citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrófilos y los monocitos (Morgan. 1994b). El HRF funciona uniéndose al C8. inhibiendo la polimerización del C9 (Morgan, 1994b). Otra proteína que inhibe el complejo de
ataque a la membrana es el CD59, El CD59 es una proteína de 20 kDa que
se encuentra en una amplia variedad de células incluyendo todas las células
circulantes, las células endoteliales, las células epiteliales, los espermatozoides, los podocitos glomerulares. numerosas líneas celulares (Morgan. 1994b)
e incluso las células del cerebro (Morgan. 1996). Se demostró que se unía
tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del C9 (Chang. 1994). Inhibe la formación del MAC sobre las células huésped y actúa de un modo intrínseco, esto es, proteger a la célula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y
CD59 están ausentes en las células de los pacientes con hemoglobinuria
paroxística nocturna (HPN). debido a la unión de su glicosil fosfatidilinositol a
la membrana celular (Volanakis. 1998).
Receptores del complemento
Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento
han sido descritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efectos biológicos de los péptidos de activación del complemento y están unidos a
muchas otras funciones celulares (Tabla 38-3). Esto será descrito para cada
receptor del complemento. Los receptores del complemento que han sido mejor
estudiados son aquellos que se unen a los fragmentos de degradación del C3.
El receptor del complemento tipo 1 (CR1. CD35, receptor de C3b'C4b) es
una glicoproteína de cadena simple de 190 kDa (isoforma más frecuente). En
humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucleares. eosinófilos. linfocitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerulares, células dendríticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este receptor del
complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, al iC3b.
Se informó recientemente que el CR1 se unía también al Clq (Klickstein.
1997). Existen cuatro formas alélicas diferentes del CRl que difieren en tama-
900
Tabla 38-3
Receptor
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m e n t o
Peso molecular (kDa)
Ligando
Papel fisiológico
C3b, C4b. iC3b
C3d. C3dg, iC3b
iC3b C3d. C3b
Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune
Activación de las células B
Fagocitosis, adhesión celular
C1qRp'
C3aR
190 (isoforma más frecuente)
140
165 (cadena u)
95 (cadena (5)
150 (cadena a)
95 (cadena |5)
126
48
C5aR
43
C5a C5a desArg
CR1
CR2
CR3
CR4
iC3b. C3b
Adhesión celular
C1q. MBL. SP-A
C3a
Fagocitosis
Quimiotaxis, degranulación de los mastocitos del suero,
aumento de la permeabilidad vascular
Quimiotaxis. degranulación de los mastocitos del suero.
aumento de la permeabilidad vascular
' También han sido descritos otros receptores del Ctq.
CR1 = receptor del complemento tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complemento tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4;
C1qRp = receptor para la región del colágeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = mañosa fijadora de lectma: SP-A = proteina surfactante A; C5a desArg = pérdida del residuo argiruna terminal del C5a tras la inactivación por la carboxipeptidasa-N.
ño y número de lugares de unión. La forma alélica más frecuente (llamada
alotipo A o F) está formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminoácidos, la mayoría de las cuales están altamente conservadas. Estas unidades
repetidas son llamadas repeticiones consensuadas cortas (SCR). De estos 30
SCR, 28 están agrupados en cuatro parejas de repetición de siete SCR cada
uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones homologas largas
(LHR). Como se señaló en la sección Regulación de la activación del complemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradación del C3b mediada
por el factor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminación
tanto sobre la via de la C3 y C5 convertasa clásica y alternativa. Un papel
fisiológico más importante del CR1 está relacionado con la fagocitosis de las
partículas envueltas por el complemento (partículas opsonizadas). El CR1
puede aumentar la unión de las partículas envueltas con Ig G y C3b o iC3b a
los monocitos o los neutrófilos, aumentando entonces la eficacia de la fagocitosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1985; Sengelov. 1995). El CR1
también puede disparar la fagocitosis de los objetivos envueltos por el C3b en
ausencia de IgG en los macrólagos activados por varios estimuladores como
la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interferón-y y la anafilotoxina C5a.
El CR1 sobre los eritrocitos regula la función C3b sirviendo como cofactor
para la degradación del C3b mediada por el factor I y aumentando la eliminación de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel importante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacándolos del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradación
en el higado y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que
la captación dependiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritrocitos de la circulación puede servir como mecanismo de inhibición de la activación excesiva de las células fagocíticas o las células B (Nielsen, 1997). El
CR1 también es expresado en las células B humanas y en las células dendríticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmunorregulador en
estas células. Este tema se analiza con más detalle después, en la sección
Complemento e inmunidad adquirida.
Un receptor para el fragmento C3d del C3 se encuentra en las células
humanas |i las lineas celulares B, las células dendriticas foliculares, algunas
células T periféricas, algunas lineas celulares T, timocitos (Ahearn. 1998) y
astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es una glicoproteina transmembrana tipo I, de 140 kDa, que sirve como receptor para
el C3d. el C3dg, y se une débilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de
servir como cofactor para la degradación de iC3b unido a los objetivos mediada por el factor I (Mitomo. 1987). El CR2 también es el receptor o sitio de
unión a través del cual el virus de Epstein-Barr entra en las células B, en la
sangre, modalidad independiente del complemento, para causar la mononucleosis infecciosa (Fingeroth. 1984). Se cree que la principal función del CR2
es la regulación de la respuesta inmune de las células B ante el antigeno
(Carroll, 1998b). Este tema se discute con más detalle después, en la sección
Complemento e inmunidad adquirida.
Un tercer receptor del complemento, el CR3 (también denominado Mac-1,
Cd11b'CDi8) es un miembro de la familia de moléculas de sdhesión de la |3
2
integnna leucocítica. Está formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos
moleculares de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998).
Otros dos miembros de la familia de moléculas de adhesión de la |i, integrina (LFA-1 y CR4) comparten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se
expresa en los fagocitos mononucleares, granulocitos y células asesinas
naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las células microgliales (Morgan. 1996).
El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con menor afinidad (Brown.
1991). En las células fagocíticas, el CR3 dispara el proceso fagocitico de un
modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partículas recubiertas
con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante del CR3
es la adhesión de los monocitos y los neutrófilos a las células endoteliales a
través de la interacción con su contraligando, molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM-1). Esto permite la acumulación de los fagocitos en los lugares de daño tisular donde las células endoteliales son activadas.
El receptor del complemento tipo 4 (CR4. CD11c/CD18) es una glicoproteína que comparte características con el CR3. También es un miembro de la
familia de moléculas de adhesión de las miegrinas con una única cadena a de
150 kDa. Se expresa en las células mieloides. células dendriticas. células NK.
células B activadas, algunas células T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y
células microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en menor
medida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en términos de
activación del complemento es desconocido y, como esta glicoproteína es una
molécula de adhesión, puede servir para ayudar" a la adhesión de los neutrófilos al endotelio durante el proceso inflamatorio (Sengelov, 1995).
Se han descrito varias moléculas de superficie celular con actividad receptora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, modificadores de la respuesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado de las células B). y
proteínas de unión (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una glicoproteína de 126 kDa expresada en las células de origen mieloide. en las células
endoteliales, en las plaquetas y en las células microgliales (Nepomucenc,
1998). Se ha mostrado que se une a la región tipo colágeno del C1q (tenner,1998) y a las colectinas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostró que
este receptor aumenta la fagocitosis de partículas subóptimamente recubiertas con complemento o Ig G mediada por el CR1 y por el receptor Fe. Un
segundo receptor, todavía pobremente caracterizado, es denominado
C1qR , se une al C1q e inicia la generación de radicales tóxicos del oxígeno
por los neutrófilos, los eosinófilos y las células del músculo liso vascular
(Tenner. 1998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es
una proteina de 33 kDa expresada en las células B, en los fagocitos mononucleares, en los neutrófilos, en las plaquetas y en las células endoteliales.
Se ha informado que induce la quimiotaxis de neutrófilos humanos (Nepomuceno, 1998). También se ha informado que otra molécula de superficie celular se une a la región tipo colágeno del C1q (cClqR). Esta proteína de 56 kDa
se expresa en una variedad de células, se une la Clq, a la MBL y a la SP-A
(Hansen, 1998) y tiene homología con la calreticulma. Puede inducir la fagocitosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxicidad,
la producción de anticuerpos y la secreción de citocinas. El papel del CR1 una
3
o2
CAPITUIO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
901
vez unido al C1q es totalmente desconocido. Es importante realzar que el
zados por los hepatocitos o por las células extrahepálicas a menudo requiere
papel exacto que juegan in vivo estas proteínas unidas al C1 q asociadas a las
un estímulo generado en las respuestas inflamatorias como la interleucina-lu,
células sigue estando poco claro.
la interleucma-6 o el interferón-y. En oirás obras se puede ver una mejor desComo se trató anteriormente en la sección Anafilotoxinas, los fragmentos pepcripción de la regulación de la síntesis de las proteínas del complemento por las
tídícos pequeños liberados tras la degradación proteolitica del C4. C3 y C5 tiediferentes células (Collen. 1998) Interesantemente los datos del higado y la
nen profundos efectos en la respuesta inflamatoria. Esto incluye el aumento de médula ósea humana (Naughton. 1996) y el trasplante renal (Tang, 1999)
la permeabilidad vascular, la degranulación de los mastocitos y la inducción de
demostraron que. aunque el higado es el lugar más importante de la síntesis del
la quimiotaxis. El receptor del C3a humano (C3aR) ha sido clonado recientecomplemento, los lugares extrahepáticos pueden contribuir a ios niveles de los
mente. Es una proteina transmembrana unida a la proteína G. de cadena única
componentes del complemento en el plasma.
de 48 kDa (Ember, 1998). El C3aR se expresa en las plaquetas del conejilo de
Indias, en los mastocitos de rata, en los macrófagos alveolares humanos, en los
neutrófilos. en los basófilos y en los eosinófilos (Ember, 1998). Recientemente,
Genética del complemento
se ha demostrado que se expresan en las células B de las amígdalas humanas
Muchos de los genes que codifican las proteínas, los receptores y las molé(Fisher, 1997) y en varias células del cerebro humano inflamado (Gasque. 1998).
c
u
l
a
s reguladoras del complemento han sido clonados y se les ha asignado
Se ha informado que el C3a unido a su receptor origina quimiotaxis eosinofilica:
una localización cromosómica (Tabla 38-1). Interesantemente, existe una
la degranulación de los eosinófilos. los mastocitos y las plaquetas: la adheson
unión para un número de genes que codifican las moléculas relacionadas con
de los eosinófilos y las plaquetas; y la supresión de las funciones de las células B amigdalares incluyendo la producción de inmunoglobulinas. Debido a las el complemento. Estos grupos de unión incluyen los genes del MHC clase III
(C2. factor B y C4), los genes de los reguladores de la activación del complesimilitudes estructurales entre el C3 y el C4, se pensó que el C4a era capaz de
interaccionar con el C3aR. Sin embargo, parece que no es así y el C4a humanomento (proteína fijadora de C4. CR1. CR2, DAF, MCP y factor H). y los genes
no puede interaccionar con el C3aR humano (Ames. 1997). aunque parece que de las proteínas del complejo de ataque a la membrana (C6. C7 y C9) (Schneider, 1999). Las moléculas de cada uno de estos tres grupos muestran homo
interacciona con el C3aR del conejilo de Indias (Lienenklaus. 1998).
logia estructural, lo que sugiriere que las proteínas del complemento pueden
Un receptor para la analilotoxma C5a (C5aR) se expresa en los neutrófilos.
derivar de una duplicación genética de un número limitado de genes ancestralos monocitos, los basófilos, los eosinófilos, las plaquetas, los mastocitos, las
les. Es de interés que existen dos genes para el C4. Originan dos isolipos de
células del parénquima hepático, las células del músculo liso vascular del pulC4 lamados C4A y C4B, los cuales son producidos con frecuencia (O'Neill.
món, las células endoteliales vasculares del pulmón y umbilicales, las células
1978a: Awdeh, 1980). Estos dos productos génicos difieren funcionaimente y
epiteliales bronquiales y alveolares, los astrocitos, las células microgliales
tienen diferente eficacia hemolitica. Una vez expuestos al grupo tíoléster de la
(Ember. 1998) y las células T humanas (Nataf. 1999). El C5aR es una proteímolécula. C4A forma un enlace amida con un aceptor de la molécula en su
na transmembrana asociada la proteina G de 43 kDa El C5a unido al C5aR microambiente. mientras que la forma C4B forma un enlace áster. Además, se
induce una amplia variedad de efectos dependiendo del tipo de célula diana.
descubrió que el C4A se une al CR1 con mayor afinidad que el C4B (Reily.
Estos incluyen las quimiotaxis de neutrófilos. eosinófilos. basófilos y fagocitos
1997). También todas las proteínas relacionadas con el complemento muesmononucleares; la degranulación de los mastocitos de las serosas; la protran polimorfismo (es decir, existen múltiples alelos con variables frecuencias
ducción de radicales del oxigeno: facilitar la adhesión celular; y la producción
en humanos). El componente más polimórfico del complemento es el C4, con
de leucotrienos y prostaglandinas en los neutrófilos y los eosinófilos. En
más de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). La degradación de los Itagvarios estudios el C5a también demostró inducir la producción de proteínas
mentos del C4A y C4B y su unión a los eritrocitos origina a los antigenos de
de fase aguda, citocinas y anticuerpos (Ember, 1998).
grupo sanguíneo Rodgerds y Chido. respectivamente (O'Neill. 1978b). Las
Los receptores de los factores H y B se han descrito en muchos tipos de variaciones alélicas del factor acelerador de la degradación (DAF) originan el
leucocitos y están descritos en otras obras (Fríes. 1987). Sin embargo, el sigsistema de grupo sanguíneo Cromer con el fenotipo Inab que carece de DAF.
nificado fisiológico de estos receptores todavía no está claro.
Las mutaciones puntuales, las inserciones o las deleciones de los ácidos
nucleicos normalmente van unidas con defectos de las proteínas del complemento (Schneider, 1997). Como se discute después en la sección Defectos
Biosintesis del complemento
genéticos del complemento, estas son normalmente poco frecuentes entre la
Se calcula que el 90% de los componentes del complemento del plasma sonpoblación. El polimorfismo de las proteínas del complemento se evalúa tanto
por los análisis fenotipicos como por los genotipicos. Los detales de estos
sintetizados en el hígado y son proteínas de fase aguda (es decir, su síntesis
por el higado aumenta en la respuesta inflamatoria para aumentar los niveles métodos no serán discutidos en este capítulo y el lector es remitido al Capitulo 41 y otros capítulos sobre el tema (Schneider. 1997; Mauff. 1997).
del plasma). El hepatocito produce la gran mayoría de los componentes del
complemento, con la excepción del C1q. el factor D, la properdina y el C7 (Morgan, 1997a). El C1q parece que es sintetizado por las células epiteliales, los
monocitos 'macrófagos y los fibroblastos. El principal productor de factor D es
Complemento e inmunidad adquirida
el adiposito. La properdina es sintetizada mayontariamente por los monocitos y
los macrófagos ocurriendo algo de la síntesis en los linfocitos y en los granuloEstá quedando claro que el sistema del complemento juega un papel
otos. La mayoría del C7 del plasma también parece originarse por los monociimportante en el establecimiento de las respuestas inmunes adquiridas. La
tos y los macrófagos. aunque los leucocitos polimorfonucleares parece que
depresión de las respuestas de anticuerpos a la estimulación anligénica se
almacenan C7. Es de interés que muchos otros tipos celulares han sido descridemostró en animales deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys, 1974),
tos como sintetizadores de los componentes del complemento in vitro. Se ha
en animales con defectos genéticos en el C2. C4 o C3 (Bötger, 1985; Ochs,
publicado una exhaustiva lista de células que producen componentes del com1983; O'Neil, 1988), y en pacientes con defectos genéticos en C2, C4, C3 o
plemento (Morgan, 1997a). Brevemente, se ha informado que los linfocitos B y CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo reciente de ratones knockout sin C4, C3. o
T, los monocitos, las plaquetas, los neutrófilos. los macrófagos. los fibroblastos,
receptores del complemento tipos 1 y 2 (CR1 y CR2 son productos de la divilas células endoteliales. las células epiteliales, los queratinootos. los mioblassión de un mismo gen en el ratón en oposición a los humanos) ha permitido
tos. las células del músculo liso, los adipocitos y las células de la sinovial. cereun mejor conocimiento del papel del complemento en las respuestas de antibro y tracto genital sintetizan uno o más componentes del complemento. Inte- cuerpos al antigeno. Este efecto ha sido revisado recientemente (Carroll.
resantemente, los monocitos. los macrófagos. las células del tejido sinovial y los
1998a: 1998b: Fearon, 1998). El complemento puede influir en la respuesta
astrocitos del cerebro tienen la capacidad de sintetizar todos los componentes de anticuerpos al antígeno de muchas maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son
de las vías clásica y alternativa. Esto puede tener importantes implicaciones en
expresados en las células B y en las células dendriticas foliculares (que están
la inflamación especifica de tejido, donde debe estar presente un mecanismo
presentes en el bazo). EL CR2 está presente en la superticie de las células B
localizado de defensa del huésped para eliminar las partículas extrañas eficazen asociación con el CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el receptor
mente. La producción de componentes del complemento normalmente sintetide la célula B para el antigeno y para el CR2 (como ocurrirá cuando el antí-
902
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
geno eslé unido al C3d), disminuye drásticamente el umbral para la activación
de la célula B. También, el complemento ayuda en el atrapamiento de los
complejos inmunes por las células dendriticas foliculares en el bazo. Esto
facilita la formación de centros germinales donde las células B adquieren el
fenotipo memoria. Por lo tanto, la pérdida de uno de los componentes iniciales de la via clásica de la activación del complemento o la pérdida del CR1 y/o
el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropiada al antígeno y, en algunos casos, puede conducir a la incapacidad para producir una respuesta de
anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en la generación de células B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales"
(Carroll. 1998a). La activación adecuada de las células B en respuesta a antigenos parece depender, en algunos casos, de la activación de los anticuerpos "naturales" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemente, el complemento parece importante en el mantenimiento de la tolerancia de
las células B a los antígenos propios. Esto parece depender del componente
del complemento C4, y del CR1 y del CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el
complemento (especialmente el C3) ayuda a la generación de una respuesta
inmune adquirida al antígeno a través de las células presentadoras de antígeno (APCs). La presencia de productos de degradación de C3 sobre los antígenos aumenta la captación del anligeno por las APCs (células B y otras
APCs profesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la
eficacia de la presenlación antígénica a las células T con la consiguiente respuesta mediada por las células T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
DEFICIENCIAS GENÉTICAS DEL COMPLEMENTO
Los pacientes con deficiencias del complemento genéticamente controlados
son muy raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel
de los componentes del complemento en distintos fenómenos biológicos y en
diferentes estados de enfermedad. En general, la ausencia de un componente sigue los principios de la genética mendeliana simple y es heredada como
un rasgo autosómico recesivo. Por ello, los pacientes heterocígóticos tienden
a tener la mitad de los niveles normales o menos, y los pacientes con defectos homocigóticos tienen poca o indelectable actividad del complemento. El
gen de la properdina está en el cromosoma X. Se conocen deficiencias para
todas las proteínas ligadas a la activación del complemento (Tabla 38-4). Con
el descubrimiento reciente de la vía de la MBL de la activación del complemento llegó el sorprendente hallazgo de que el déficit en suero de MBL es bastante frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la población tiene
una de las tres mutaciones genéticas reconocidas que conducen a la deficiencia de MBL (Sumiya. 1997). Se ha descrito una correlación entre la deficiencia
de MBL y las infecciones del tracto respiratorio superior, especialmente entre
los 6 y 18 meses de edad, demostrando la importancia de la vía de la MBLecitina en la primera infancia (Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la
variación de genes de la MBL puede estar asociada con al menos un tercio de
las inlecciones meningocócicas en la infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa-
-•
?
Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las proteínas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o
Patrón de herencia
Principal correlación clinica'
Proteina
Común a todas las vías
C3
Vía clásica
C1q
C1r
C1S
C4>
C2t
Vía alternativa
Factor B
Factor D
Properdina
Via de la MBLectina
MBL
Complejo de ataque a la membrana
C5
C6
C7
Autosómica recesiva
Infecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Glomerulonefritis. LES
Glomerulonefritis. LES
Glomerulonefritis. LES
LES
LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Ligada al X
Infecciones por Neisseria meningitidis
Infecciones piógenas recurrentes
Infecciones piógenas recurrentes, meningococcemia fulminante
Autosómica dominante
Infecciones recurrentes
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Autosómica recesiva
Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES
Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria
Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad
de Raynaud
Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria
Nada
C8 (cadenas ß y a-y)
Autosómica recesiva
C9
Autosómica recesiva
Proleinas de control del fluido sanguineo
C1inh
Autosómica dominante o adquirida
C4bp
Autosómica recesiva
Factor I
Autosómica recesiva
Factor H
Autosómica recesiva
Proteínas unidas a células
CR1
Autosómica recesiva '
CR3
Autosómica recesiva"
DAF/CD59/HRF
Adquirida
1
Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes'
Angioedema, síndrome semejante al Behcet
Inlecciones piógenas recurrentes
Inlecciones piógenas recurrentes, glomerulonefritis
Asociación entre la expresión baja en eritrocitos y el LES
Infecciones piógenas recurrentes, leucocitosis
Hemoglobinuria paroxística nocturna
* Véase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, están clínicamente bien.
Un número sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 están asociadas con un CH50
de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 están asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 eslán asociadas
con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 está asociada con la ausencia o disminución de la actividad quimiotáctica en
suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucocítica a la infección.
i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales
deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigóticos para la deficiencia de C2 también tienen un
aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes.
Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 está siempre normal, y el nivel de C4 eslá disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 están disminuidos, el nivel del antigénico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido.
La homocigosis para la expresión numérica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES También puedo
detectarse un defecto adquirido en el número de CRI
Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayoría de los niños con delicit de CR3.
LES = lupus eritemaloso sislémico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de mañosa
1
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
903
do que las infusiones de MBL purificada corrigen el defecto y la susceptibilidad Es importante reconocer que la medición de los niveles del complemento
a las infecciones en los niños con deficiencias del MBL (Valdimarsson, 1998).
sérico representa los niveles estáticos de proteínas que se recambian rápiAdemás, se ha sugerido que la deficiencia de MBL conduce a enfermedades
damente. Incluso en los individuos normales, el Índice fraccional catabólico
autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (Turner. 1996) y que es un
de la mayoría de los componentes que han sido medidos está alrededor del
factor de riesgo para el aborto recurrente (Christiansen. 1999).
2% por hora. Muchas de estas proteínas se comportan como reactantes de
La deficiencia en cualquiera de los componentes de la cascada del com- fase aguda, y sus niveles en suero pueden aumentar drásticamente en los
estados inflamatorios. Sus índices de catabolismo pueden aumentar en
plemento tiene alguna asociación con la susceptibilidad a infecciones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). Debido al papel central que el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminución del nivel
del complemento puede avalar la sospecha de que el sistema del complenización, la deficiencia de C3. de otros componentes de la vía alternativa, o
mento participa en el daño tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel
de las moléculas reguladoras como los factores H e I está asociada con un
normal de complemento en el suero no excluye la participación del compleaumento de la incidencia de infecciones. Interesantemente, las deficiencias
mento en el daño tisular. Por ejemplo, los pacientes con cirrosis biliar tienen
de los componentes del complejo de ataque a la membrana (C5-C9) están
un aumento del Índice catabólico de C3, y se ha sugerido que el C3 puede
altamente asociadas con un aumento de la incidencia de infecciones por
jugar un papel en el desarrollo de esta enfermedad. No obstante, el nivel de
Neisseria meningitidis, sugiriendo la importancia de la lisis mediada por el
C3 en el suero de los pacientes con cirrosis biliar está casi siempre elevado.
complemento en el control del meningococo La vacunación empleando un
En este caso, el aumento de la síntesis encubre el catabolismo aumentado.
polisacárido capsular multivalente para Neisseria meningitidis demostró ofreTambién debe reconocerse que la función del complemento en los diversos
cer alguna protección frente a la infección menmgocócica en los pacientes
compartimentos del cuerpo puede ser diferente. La actividad del complecon deficiencia del complemento (Fijen. 1998).
mento en la sangre de pacientes con artritis reumatoide seroposítiva puede
Otra característica de la deficiencia del complemento, especialmente en los
ser normal o elevada; sin embargo, la actividad del complemento del liquido
componentes iniciales de la via clásica (C1. C4, C2). es la asociación con
enfermedades autoinmunes como el LES. Ya que el complemento es impor- sinovial puede eslar severamente disminuida.
tante en el aclaramiento de los complejos inmunes de la circulación, puede ser
Muchos investigadores han intentado identificar qué vía de activación del
que la deficiencia de los componentes iniciales del complemento conduzca a complemento predomina en la mediación del daño tisular o en los niveles disuna degradación inadecuada de los complejos inmunes con su acumulación
minuidos del complemento en una y otra enfermedad estableciendo el" perfil
en los tejidos como el riñon. Recientes datos experimentales que emplean
del complemento". La aproximación más simple a este problema examina los
ratones transgénicos sugieren que la autommumdad asociada con la deficienniveles de varios componentes y da por hecho que los niveles disminuidos de
cia de Clq origina un aclaramiento inadecuado de las células apopléticas que.
un complemento dado de una de las vias de activación del componente es
a su vez. conduce al desarrollo de anticuerpos autorreactivos (Bofto. 1998). más frecuente que ocurra cuando la vía está activada. Por lo tanto, si un
Como se discutió previamente en la sección Complemento e inmunidad adqui- paciente tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles normales de factor B,
rida, la deficiencia del complemento (especialmente de C4 o CR1 CR2) tam- seguramente estará implicada la vía clásica. Si un paciente tiene niveles disbién puede alterar el mecanismo por el que las células B se hacen tolerantes
minuidos de C3, factor B y properdina, y niveles normales de C4, probablea los antígenos propios, conduciendo por ello a una autoinmunidad (Prodeus,
mente estara activada la vía alternativa. De esta manera, la determinación de
1998). Existen deficiencias en las moléculas reguladoras del complemento
los niveles de un número limitado de componentes puede proporcionar
unidas a la membrana. La deficiencia de CR3 origina severas infecciones pió- mucha información. Exceptuando el caso de alteraciones conlroladas genétigenas y defectos en la adhesión leucocitana (Fríes. 1986; Morgan. 1991). La
camente del complemento, uno nunca necesita conocer los niveles de todos
deficiencia en la capacidad para generar el enlace glicosil fosfatidilinositol que los componentes excepto para objetivos de investigación.
une algunas proteínas de control del complemento a la membrana celular oriUn importante avance en este área es el empleo de ensayos de enzimas
gina HPN. Los pacientes con tal enfermedad no tienen DAF. CD59 y HRF en fijadoras inmunoabsorbentes (ELISAj para detectar los complejos estables
la superficie de sus células y sufren una hemolisis intravascular crónica, tromformados en el suero durante la activación del complemento. Estos ensayos
bocilopenia y disminución de la hematopoyesis (Jarva, 1999). La deficiencia
son muy sensibles y pueden demostrar rápidamente que vía del complemendel C1 inhibidor origina el angioedema hereditario, una enfermedad caracteri- to está activada en varios estados de enfermedad (Morgan. 1994a).
zada por episodios recurrentes de edema subcutáneo y submucoso. Esta defiEn la activación, muchas proteínas del complemento expresan nuevos
ciencia puede heredarse o adquirirse tras el desarrollo de autoanticuerpos conantigenos (neoantígenos) que no son expuestos en la proteína nativa plastra el C1 inhibidor. Los pacientes con deficiencia del C1 inhibidor a menudo
mática. El neoantígeno presente en el MAC pero no presente en los compomuestran niveles bajos de C4 y C2. demostrando una activación incontrolada
nentes nativos termínales es quizás el más interesante. El anticuerpo para
del C1. Se cree que el angioedema hereditario es causado principalmente por
este neoantígeno existe y se ha utilizado para estudiar el nivel de neoantíla pérdida de la regulación del sistema generador de cininas por el C1 inhibigeno por inmunofluorescencia así como por ELISA (Falk. 1983; Sanders.
dor (Cugno. 1998; Davis. 1998).
1985). El nivel de neoantígeno está elevado en sangre y en líquido cefaloLos pacientes con hypogammaglobulinemia o inmunodeficiencia combinada rraquídeo en muchos pacientes con activación consiguiente del complemensevera a menudo tienen disminuidos los niveles de Clq. En parte, estos nive- to (Sanders. 1986). Además, está presente en los tejidos en los lugares de
les disminuidos de C1q se relacionan con los niveles bajos de IgG en la circu- depósito del complejo terminal. Por ejemplo, está presente en el tejido lesionado en los glomérulos de los pacientes con glomerulonefritis (Falk. 1983) y
lación. Parece que el Clq interacciona con la IgG en la circulación y que esta
en la piel lesionada en los lugares de LES activo (Biesecker. 1982). A queinteracción conduce, a su vez. a una disminución del catabolismo del Clq.
rencia del C3 depositado en la piel normal de pacientes con LES y con test
de banda para el lupus positivo, el neoantígeno MAC solo se encuentra en
las lesiones.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL
COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD
COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD
En muchos contextos de enfermedad, las funciones del complemento son
normalmente producir inflamación o daño tisular. Cuando el complemento juega un papel en el desanollo de la enfermedad, a menudo es activado por un Enfermedades reumatológicas
anticuerpo anormal, un complejo inmune o por material extraño. FrecuenteLa enfermedad reumatológica que ha sido evaluada más extensamente
mente es importante evaluar el nivel de uno y otro componente del comple- en cuanto a la contribución del complemento a la actividad de la enlermedad
mento como medida de la actividad de un proceso de enfermedad. Por ello, loses el LES (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta enfermedad se forman
pacientes con LES activo pueden tener disminuidos los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades de complejos inmunes. Se encuentran inmunocomplejos
estos niveles disminuidos del complemento pueden seguirse como un marca- circulantes y unidos a tejidos. Estos inmunocomplejos activan el compledor aproximado de la actividad de la enfermedad.
mento, y los productos de activación del complemento contribuyen a que
904
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
matismo severo o sepsis incontenible. Hay evidencia de activación masiva
continúe la inflamación. A menudo están disminuidos los niveles de C3 y C4
en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes condel complemento en estos pacientes, lo que sugiere que las bacterias y los
productos bacterianos activan el complemento (Hammerschmidt, 1980).
enfermedad activa. Algunos sugieren que un nivel bajo de C4 es el mejor
Parece que se activan la vía clásica y la vía alternativa (Langlois. 1988). Se
indicador de que la enfermedad continúa activa. Sin embargo, hay pacientes
forman factores inflamatorios como el factor activador de neutrófilos y el C5a.
con enfermedad activa que muestran niveles normales de C4. De acuerdo
Hay evidencia de que los neutrófilos infiltran el pulmón, y se cree que los procon otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantígeno del MAC puede ser
ductos oxidativos neutrofílicos y las proteasas son responsables de mucho
un indicador mejor de enfermedad activa (Gawryl, 1987). Como se trató previamente, el complemento parece jugar un papel esencial en el aclaramien- del daño pulmonar que ocurre.
to de los inmunocomplejos circulantes, particularmente de aquellos que contienen isotipos activantes del complemento IgM o IgG. El depósito de C3b
sobre el inmunocomplejo procede de la activación del complemento, que
Enfermedades renales
permite la interacción con células que poseen el receptor de C3b (CR1). Con
la unión a los eritrocitos a través del CR1. se impide que los complejos inmuEl complemento parece ser una clave importante en el daño glomerular en
nes se difundan del plasma a los tejidos donde pueden originar daño. Los erimuchas de las glomerulonefritis (West, 1998). Esto se demuestra a menudo
trocitos que unen a inmunocomplejos circulan hacia el hígado, donde los
por el depósito de C3 y otros componentes, en o cerca de la membrana basal
inmunocomplejos son eliminados por un proceso que no disminuye la vida
glomerular. Además, el MAC ha sido reconocido en el daño glomerular en
media de los hematíes (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). En las enferpacientes con glomerulonelritis y LES. Se ha demostrado que los pacientes
medades en las que el complemento es activado y estos productos inmuno- con enfermedad del suero debida a inmunocomplejos circulantes tienen
lógicamente activados se forman en la circulación, el número de CR1 por erilesión glomerular. En el análisis del suero, estos pacientes mueslran la actitrocito está disminuido. Esto puede resultar de la eliminación de algunos de
vación de las vías clásica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se ha
los CR1 cuando el complejo inmune es retirado del eritrocito en el hígado
creído que los complejos son depositados en los glomerulus a medida que
(Ross, 1985). Además del LES, se ha publicado que los eritrocitos de paciense filtra el plasma que contiene los inmunocomplejos. Una vez depositados,
tes con enfermedad crónica por aglutininas frías. HPN, anemia hemolíhca
estos complejos activan el complemento. Un punto de vista alternativo es
autoinmune. síndrome de Sjogren y neumonía por Mycoplasma pneumoniae
que los anticuerpos contra las estructuras glomerulares forman inmunocomtienen reducido el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depósitos inmunes
plejos en el riñon que luego activan el complemento para causar daño local
han sido eliminados de los eritrocitos en estas enfermedades (Atkinson,
(Daha, 1979). Aunque los anticuerpos frente a las estructuras de la mem1986: Ross, 1985).
brana basal glomerular son claramente importantes en el síndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es más cuestionable. El
Las proteínas del complemento actúan como reactantes de fase aguda y
papel del complemento en la enfermedad intersticial y tubular está menos
los niveles pueden no estar disminuidos incluso en situaciones en las que
claro; sin embargo, hay quienes creen que el complemento también funcioocurre la activación del complemento. Se encuentran niveles séricos del complemento normales o aumentados en la artritis reumatoide juvenil, en el reu- na en estos trastornos. Interesantemente, en algunos pacientes con glomerulonefritis con niveles muy bajos de C3. una proteina lamada factor nefrítimatismo palindrómico. en la seudogota. en la gota, en el síndrome de Reiter
co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la vía de la C3 convertasa alternativa. Este
y en la artritis gonocócica. AI mismo tiempo, parecen existir niveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb que aumenta la vida media
dos del complemento en el líquido sinovial en un número de otras enfermede la C3 convertasa de la via alternativa en más de 10 veces (Daha. 1979.
dades reumatológicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se cree que la dis1976). El C3NeF parece proteger a la C3 convertasa de la vía alternativa de
minución de la actividad hemolitica total del complemento (CH50; véase
l
a eliminación por la disociación por el factor H (Fearon, 1980). Se cree que
después en Ensayos del complemento) y la presencia de productos de degrael
C3NeF es responsable de los niveles tan bajos de C3 presentes en estos
dación del C3 y del factor B representan la activación intraarticular en el líquipacientes pero no se cree que juegue un papel central en el desarrollo de la
do sinovial de muchos pacientes con artritis reumatoide seronegativa. LES,
nefritis.
seudogota, gota, síndrome de Reiter y artritis gonocócica. Esto no es cierto
a
en fluidos obtenidos de pacientes con artritis degenerativa.
Enfermedades dermatológicas
Enfermedades infecciosas
Como en los otros grupos de enfermedades señalados, se cree que el
complemento toma parte en el daño tisular en una variedad de enfermedaComo se mencionó anteriormente y como se evidenció en hallazgos clínides dermatológicas. Estas incluyen el penfigoide ampollóse el penfigoide
cos en pacientes con deliciencias genéticamente controladas del complemento, el sistema del complemento juega un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermólisis ampolosa adquirida, la
tra los microorganismos. Los pacientes con septicemia por Gram negativos dermatitis herpetiforme y el pénfigo vulgar (Yancey, 1998). Es importante
a menudo tienen niveles disminuidos de C3 y de componentes de la vía alter-saber que los niveles séricos del complemento suelen estar normales o elevados en estos estados inflamatorios, y de que la importancia del complenativa, al igual que pacientes con ciertas enfermedades fúngicas como la
mento es estimada por análisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisusepticemia criptocócica. El complemento puede estar implicado en el daño
lares y por estudios del liquido de la ampolla. Además. Gammon y cois.
tisular asociado con la infección crónica. Se sabe que los pacientes con
(1984) han desarrollado un modelo in vilro útil para el estudio de enfermehepatitis infecciosa HbsAg positiva tienen una caída precoz en el C3 sérico,
que posteriormente vuelve a la normalidad. Esto puede estar asociado con dades cutáneas mediadas por anticuerpos anli-membrana basal. Estos
autores han mostrado concluyentemente que el C5a es un elemento clave
signos de enfermedad por inmunocomplejos (esto es, la artralgia). De una
forma similar, el complemento parece jugar un papel importante en muchas en la patogénesis del penfigoide ampolloso y de la epidermólisis ampollosa
adquirida. El C5a actúa como un quimioatrayente necesario para el aflujo de
infecciones parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la
leucocitos polimorfonucleares a los lugares de daño tisular en estas enfergiardiasis y la malaria. La discusión detallada de las interacciones entre el
medades.
sistema del complemento y los parásitos, las bacterias y los virus no se
encuentra dentro de los objetivos de este capitulo y el lector debe remitirse
a revisiones sobre el tema (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt,
1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante reconocer que los nive- Enfermedades hematológicas
les del complemento sérico en general no son un índice fiable de actividad
de enfermedad en estas condiciones.
En muchos tipos de anemia hemolitica autoinmune, el complemento juega
un papel importante en la opsonización de los eritrocitos, conduciendo a su
Se ha estudiado el papel del complemento en el síndrome de dificultad
respiratoria del adulto (SDRA), un proceso frecuente en pacientes con trau- aclaramiento por las células del sistema reticuloendotelial.
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento está
claramente implicado, los niveles séricos del complemento suelen ser normales. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de
células recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos
autoanticuerpos (aglutininas frias) están asociados con trastornos linfoprolíferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas frías generalmente se unen óptimamente a temperaturas subfisiológicas, que se encuentran en algunas
áreas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las
orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas frías son anticuerpos IgM. El síndrome de la hemoglobinuria paroxistica fría (HPF), por
ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen
a las células a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez
calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatológicos son
similares.
Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen más eficazmente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son
del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolíferativas y con infecciones virales. La mayoría de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la
anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres activadores del complemento en contraposición con las aglutininas frías y con
los anticuerpos frente a los grupos sanguíneos anti-A y anti-B. Sin embargo, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la
lisis.
En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria
paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de
lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se
lleva a cabo por la vía alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los
niveles séricos del complemento siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una pérdida de proteínas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las células de los
pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A).
Entre otras proteínas de unión a través de este enlace de membrana están
el DAF y el CD59. dos moléculas que controlan la activación del complemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (véase
anteriormente en Regulación de la activación del complemento). Se cree que
la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activación incontrolada del complemento en la superficie de estas células. Recientemente, se
informó de que, aunque la pérdida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad
a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una
mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima,
1999).
905
temente, el tipo de célula glial más abundante, el astrocito, demostró sintetizar in vitro todas las proteínas del complemento en condiciones inflamatorias
(Morgan. 1996). Además, los astrocitos y las células microgliales expresan
receptores del complemento ¡n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar
de la barrera hematoencefálica. el cerebro tiene la capacidad de preparar
una reacción inflamatoria dependiente del complemento como mecanismo
de defensa.
Enfermedades cardiovasculares
Se admite la implicación del sistema del complemento en la lesión por
isquemia'reperfusión miocárdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi.
1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo
de miocardio en los pacientes todavía no está claro. Sin embargo, se han
demostrado los depósitos de los componentes de las vías clásica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La producción de analilotoxmas
que acompañan a la activación del complemento parece ser responsable de
la reacción inflamatoria local. La demostración más clara del efecto del complemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del
modelo animal de oclusión de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficiencia genéticamente controlada de C6 muestran una significativa reducción del tamaño del infarto en comparación con los conejos normales. Además, la infiltración neutrofilica se redujo significativamente en los
conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componentes finales del complemento en la generación de inflamación local.
El complemento también parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones
de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el
que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arterioscleróticas
no está claro. Sin embargo, el depósito de los componentes finales del complemento (C5b-9) ha sido demostrado en las íntimas adelgazadas y en las
placas fibrosas. La activación del sistema del complemento está asociada con
etapas prelesionales y con la progresión de lesiones arterioscleróticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con déficit de C6 demostraron ser
menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arterioscleróticas
inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).
Biocompatibilidad
Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, particularmente la vía alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En
contacto con la sangre o con los líquidos tisulares. estos materiales pueden
activar el complemento y producir inflamación local o daño tisular. Los materiales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.
Trasplante de órganos
Enfermedades neurológicas
El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema
nervioso se ha hecho evidente en los años recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la barrera hemaloencefálica bloquea eficazmente la penetración del complemento en el liquido cefalorraquídeo. La activación del complemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la
esclerosis múltiple, el lupus cerebral, el síndrome de Guillain-Barré y la
enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depósito
de proteínas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y
se demostró la activación del complemento en el líquido cefalorraquídeo
(LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente,
la inflamación origina una ruptura de la barrera hematoencefálica con la
penetración local de proteínas del complemento. Además, algunas células
sintetizan proteínas del complemento. Hay evidencia de que la activación del
complemento puede estar implicada en el daño a la mielina, originando de
este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del periférico. También se demostró que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un péptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y
activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. Interesan-
El éxito del trasplante de órganos ha creado un gran problema, la escasez de órganos humanos para satisfacer las demandas para un número de
pacientes que no deja de crecer que lo están esperando como técnica quirúrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el cerdo en este campo como una lógica alternativa a los órganos
humanos. Sin embargo, los órganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reacción de rechazo, denominada rechazo hiperagudo.
cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso,
1992). Esta reacción es mediada por anticuerpos que se unen a las células
endoteliales y la activación del complemento. Se demostró que la activación
del complemento era crucial en el daño tisular en la reacción hiperaguda
de los xenotransplantes. La activación del complemento en las células
endoteliales xenogénicas origina su activación (es decir, las células endoteliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis
intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reacción se debe a la
incapacidad de las moléculas reguladoras del complemento asociadas a
las células porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activación
del complemento humano. Por lo tanto, el éxito de esta prometedora intervención terapéutica recae en la capacidad de controlar la activación del
complemento. El papel del complemento en el rechazo de órganos huma-
906
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activación del
complemento contribuye de algún modo a los episodios de rechazo agudo
y crónico (Baldwin, 1995).
UTILIDAD CLÍNICA DE LOS INHIBIDORES
DEL COMPLEMENTO
La activación del complemento contribuye indudablemente al daño lisular observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el
empleo de agentes que bloquean la activación del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el daño tisular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la práctica clínica. Se están realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren
eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control
de la infección, un inhibidor del complemento adecuado no debería interferir con esta función del complemento. También se sabe que el C3a y el C5a
son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el
inhibidor deseable deberá actuar a nivel de la C3 convertasa clásica y
alternativa para evitar la producción de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemente y están siendo desarrollados
actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se muestran como promesas en el área clínica. Para una descripción más completa de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento,
se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998;
Wagner, 1998).
Como se discutió previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la
via clásica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegración
de las C3 y C5 convertasas de ambas vías y sirve como cofactor para la
degradación del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta
molécula representa un excelente candidato para la inhibición terapéutica del
sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostró mantener todas las propiedades de la proteína nativa unida a la membrana. En
una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe
que la activación del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros:
xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveolítis en un modelo de reacción pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesión
tisular de isquemia/reperfusión miocárdica (Weisman, 1990), desmielinización
en un modelo experimental de encefalomielitis alérgica en ratas (Piddlesden,
1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase
I de los ensayos clínicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras.
Otro inhibidor del complemento que ha entrado también en la fase I de los
ensayos clínicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el
C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la activación del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe
que promueve el potente daño tisular debido a la inflamación y a la activación celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostró en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los órganos porcinos en sistemas de perfusión in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de
artritis en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Wang. 1995),
para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratón de LES (Wang,
1996) y para disminuir el tamaño del infarto en un modelo de rata con un
modelo de lesión de isquemia/reperfusión miocárdica (Vakeva. 1999). EL
anticuerpo anti-C5 humanizado demostró ser un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos
clínicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el
daño al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirúrgico cardiopulmonar ¡Rollins, 1998).
Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso
(IVIG) se han empleado en un número de enfermedades autoinmunes e
inflamatorias como la púrpura trombocitopénica idiopática, la enfermedad de
Kawasaki, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia gravís (Dwyer. 1992).
Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su acción bene-
ficiosa no está claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a través de las
interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en
las células lagocíticas, la modulación de las funciones de las células T y B y
la selección de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un
efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demostrado interferir en la reacción de shock dependiente de la via clásica de Frossman en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del
xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Además, el tratamiento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibió el
depósito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activación del complemento a través de su porción Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG
bloquea la activación del complemento en la superficie del objetivo todavía no
se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede
prevenir el daño tisular mediado por el complemento interactuando directamente con el C 1 o previniendo la unión del C4 con la célula diana (Mollnes,
1995; Miletic, 1996).
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
Principios generales
Están disponibles los métodos que permiten asegurar la determinación de
los niveles de cualquiera de los componentes de las vías clásica, alternativa
y de la MBLectma, así como muchas enzimas y reguladores del sistema del
complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no están disponibles
en los laboratorios clínicos de rutina y están restringidos los laboratorios de
investigación. Centraremos nuestra atención sobre las técnicas que no
requieren para su realización un laboratorio especializado en la investigación
del complemento. Para más detalles relativos a métodos que requieren técnicas más especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley,
1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Würzner, 1997). Los ensayos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que
miden las proteínas del complemento como antigenos en los líquidos biológicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado.
Ambos tipos de técnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los métodos de
análisis antigénico (inmunoquimicos) generalmente son fáciles de realizar.
Estos ensayos antigénicos con altamente específicos, requieren menos
reactantes especializados, son más baratos y se realizan en una cantidad de
tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las proteínas del
complemento humano y para las proteínas purificadas del complemento
humano están comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es una guía útil para conocer los
reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos,
en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los métodos comunes
de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razón, los ensayos antigénicos son fácilmente adaptables al laboratorio clínico. Por otra parte, los
ensayos antigénicos no proporcionan información sobre la actividad de un
componente ya que pueden detectar los productos de degradación asi como
los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de pequeños fragmentos de una proteina con actividad antigénica puede confundir los
resultados. Algunos ensayos antigénicos emplean inmunodifusión radial. En
estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir más rápidamente que
la molécula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados.
Como ejemplo, el ensayo antigénico más frecuentemente empleado para el
C3 mide su principal producto de degradación, el C3c. por inmunodifusión
radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C
durante un número de días para permitir la completa conversión de C3 en
C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeño y normalmente no tiene consecuencias clínicas. En general, los ensayos antigénicos no son tan sensibles como
los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un componente presente en ciertos líquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos
antigénicos en cierto grado de la concentración del anticuerpo empleado, y
con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antigénica tan pequeña como 10 pg/ml.
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
907
Hay kits disponibles que emplean la inhibición de la unión de un sustraTabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los
to radiomarcado para detectar varios péptidos del complemento. Estos
e n s a y o s del complemento
equipos están disponibles para la medición del C3a. C4a y C5a. La utilidad
Soluciones stock*
de estas mediciones todavía está debatiéndose. Está disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS)
me detallado sobre los procedimientos de medida de la actividad lítica funDisolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1.5 I de
cional y sobre los niveles antigénicos de los componentes de la vía alteragua destilada. Ajustar el pH a 7.35±0.05 con CIH IN y llevar hasta 2
l de volumen con aguda destilada Esta solución es cinco veces la
nativa (Minta, 1985). También se han descrito ensayos diseñados para
concentración de una solución isotómca y puede almacenarse a 4"C
medir la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el
durante al menos un mes.
suero humano pero requieren reactantes especializados que pueden no
2.
Ácido
disodio etilendiaminetertetr acético 0.01 M (stock EDTA)
estar disponibles comercialmente (Gaither. 1979). Han sido desarrollados
Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila
ensayos con ELISA para la medición de productos de degradación de las
da. Ajustar el pH a 7.65±0.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluproteínas del complemento o para los complejos formados tras la activamen con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al
menos tres semanas con almacenaje a 4"C.
ción del complemento. Hay equipos comercialmente disponibles (Quidel.
San Diego. CA). Estos miden los productos de degradación de las proteí3. Dextrosa con CaMg •' y gelatina (D5wg++)
Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepanas del complemento a medida que se generan tras la activación del comrado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentánplemento empleando anticuerpos monoclonales específicos. La activación
dolo hasta que los granulos de gelatina estén disueltos Añadir la
del complemento por la vía clásica puede medirse siguiendo los niveles de
solución de gelatina a la solución de dextrosa Añadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. También, la medición por ELISA de los
ción stock 4 y 2 mi de la solución stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a
7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solución
complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona una medida de la activación del
puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C
complemento a través de la via clásica. La activación de la vía alternativa
4. MgCI. 1 M
puede medirse por ELISA evaluando los niveles de los complejos Bb, o
Preparar 100 mi de solución que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulación (Mayes, 1984). Se informó de que las
mente. Medir la gravedad especilica de la solución y determinar la
mediciones de dichos complejos cuantifican tan poco como 10 a 20 ng/ml
concentración de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics'
de C3bP en suero. Este ensayo puede también emplearse para medir los
(tablas de conversión para valores concentrados de soluciones acuocomplejos de activación unidos a la superficie. La activación a través de
sas) A|ustar la concentración a 1 M añadiendo agua destilada Almacenar a 4°C.
cualquier via puede monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M
ma soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Además, los
Se preparan 100 mi de una solución de CaCK.3 M aproximadamente
kits de ELISA están disponibles para medir la generación de anafilotoxmas
Medir la gravedad especilica de esta solución y determinar el CaCl,
en sueroplasma. Ya que el C3a y el C5a son rápidamente convertidos en
como se describe arriba Ajustar a 0 15 M añadiendo agua destilada
sus fragmentos desArg inactivos por carboxipeptidasa-N en el suero, estos
Almacenar a 4"C.
ensayos emplean anticuerpos monoclonales específicos para el C3a-desSoluciones de trabajo
Arg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI¡ 1. VBS isolónico con gelatina y metales (GVBS++)
SA proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activación del
Añadir 200 mi de la solución stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destilacomplemento en los líquidos biológicos a través lanto de la via clásica
da en un malraz alorado de 1 I de volumen Añadir 1 mi de la solución
como de la vía alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente son
stock 4 y 1ml de la solución stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi
de agua destilada calentando como se describió en la solución stock
caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilución están3. Añadir la solución de gelatina y ajustar el pH a 7.35±0.05 Llevar
dar. Por lo tanto, en un solo kit se puede incluir una cantidad limitada de
hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe prepararmuestras.
se en Iresco una vez cada semana
2. Dextrosa-VBS Daß en iones con metales y gelatina (DGVBStt)
Evaluación funcional de la vía clásica
Los ensayos funcionales del complemento son herramientas sensibles y
precisas para proporcionar información sobre la actividad de un componente.
Algunos de estos métodos pueden utilizarse para cuantificar la actividad del
nivel molecular, y otros para expresar la función del complemento en unidades arbitrarias. Los reactantes comerciales están disponibles para valorar
cada componente de las vias clásica y alternativa. Sin embargo, para la
mayor parte, estos ensayos son desarrollados en un limitado número de centros de investigación. Muchos ensayos funcionales requieren procedimientos
que requieren tiempo y componentes del complemento relativamente muy
purificados, que son más caros que aquellos requeridos por los ensayos antigénicos. Por lo tanto, se limitará la descripción de los ensayos del complemento a los métodos de referencia para la evaluación de la activación tanto
de la via clásica como de la alternativa. Los amortiguadores que se emplean
frecuentemente en la mayoría de los laboratorios donde se desarrollan los
ensayos del complemento se describen en la Tabla 38-5. Uno debe darse
cuenta de que la preparación precisa de estos amortiguadores es crítica ya
que cambios en la molaridad y en la concentración del ion metal pueden afeelar a los títulos obtenidos.
Los amortiguadores de diferentes potencias iónicas son preparados
mezclando la solución stock 3 con la solución de trabaio 1. El
DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solución
citada primero con dos partes de la segunda solución. El DGVBS+t
debe prepararse en Iresco.
3. EDTA-VBS isotómco (EDTA-GVBS—)
Preparar el GVBS como en la solución de trabajo 1 con la excepción
de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las
soluciones 4 y 5 no se añaden a esta solución. Añadir 100 mi de la
solución stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de
1 i con agua destilada Esta solución es estable durante al menos una
semana a 4°C
4. VBS isotónico con glicol etilen bis (b-aminoetil éter) N. N N. N • acido
tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)
Añadir 50 mi de la solución stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un
matraz aforado de 250 mi de volumen Añadir 1.25 mi de la solución
stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calentando como se describió en la solución de Irabaio 1 y añadir a la solución. Preparar una solución stock EGTA añadiendo 0.761 g de EGTA a
5 mi de agua destilada Disolver EGTA con NaOH 5 NI A|ustar el pH a
7,35±0.05 con acido acético al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con
agua destilada Añadir esa solución stock de EGTA a la solución de
trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con
agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco.
I " Las soluciones stock 1. ? y 3 deben almacenarse de 20"C a -50"C durante un
Los ensayos que miden la actividad hemolitica total en una muestra (CH50) periodo de lempo indefinido
* De West RC (ed) CRC Handbook Ol Chemistry and F-hysics Boca Ratón FL. CRC
o la actividad funcional de los componentes del complemento aislados en
Press 1985-t986. con permiso
general emplean eritrocitos de oveja como objetivos de la lisis mediada por el
complemento. Los eritrocitos de oveja son más sensibles a la lisis por anticuerpos y mediada por el complemento que los eritrocitos de otras especies. adecuados están comercialmente disponibles. La activación de la via alternaAdemás, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolípido (antígeno de Forsstiva del complemento se mide fácilmente empleando eritrocitos de conejo.
man) que provoca una respuesta potente de los anticuerpos en conejos una Estas células son particularmente sensibles a la lisis independiente de antivez inmunizados estos animales con eritrocitos de oveja. Los anticuerpos
cuerpos mediada por el suero humano.
908
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
Manejo de las muestras
tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo.
Como se describió anteriormente, este antígeno es altamente inmunógenc e
induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmunizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detalle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antisuero es destruida por la inactivación con calor a 56 C durante 30 minutos.
Los métodos para la titulación del anticuerpo y para la preparación de las
células óptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither,
1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los
eritrocitos de oveja de modo que pequeñas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpo se denominan EA Los componentes intermediarios de la célula con componentes del complemento unidos a la
membrana, que se utilizan en la titulación funcional individualizada de los
componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento
purificados Los métodos para la preparación de estos intermediarios celulares ya se han descrito (Gaither, 1984).
El correcto manejo de las muestras es crítico para el correcto análisis funcional del sistema del complemento. Par la mayoría de los ensayos funcionales, se prefiere el suero al plasma para el análisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las
muestras son diluidas más de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del
plasma puede emplearse ya que la dilución sobrepasa el electo quelante. Para
obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y después en hielo
durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a
la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso,
la polimerización completa del coágulo parece facilitar la precisión del ensayo.
Para separar el suero, se recoge el coágulo y se centrifuga de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la
centrifugación y formación del coágulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya
que puede ocurrir la fijación del complemento si la muestra se enfría. En ciertos casos, la congelación disminuirá los títulos de complemento considerablemente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del complemento hemolítico total
te que un título considerablemente disminuido de complemento sólo puede
reflejar un artefacto de una preparación sérica inadecuada. Si se sospecha
El ensayo más simple sobre la vía clásica mide el complemento hemolítico
esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activación
total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en
del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios
los pacientes con déficit genético homocigotos. generalmente origina un títuvolúmenes pequeños y almacenarse inmediatamente a una temperatura de
lo de complemento hemolítico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor
-40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales.
dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin pérdida de la
Cuando la historia y los síntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes
ciencia, deben pedirse los títulos hemolitico y anligénico de los componentes
de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco.
individuales. A menudo, el título de CH50 será una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.
Preparación de eritrocitos
La sangre de oveja estéril se obtiene de una solución estéril de Alserver. La
sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede emplearse durante un máximo de seis semanas si se mantiene
estéril. La edad de las células afecta mucho a los títulos de la mayoría de los
componentes del complemento, y los títulos pueden ser falsamente bajos si
se utilizan células frescas. En condiciones estériles, se extrae asépticamente
y se centrifuga a 4 C un volumen de células. Se extraen el sobrenadante y la
capa leucocitaria. y se remtroducen las células en una solución tampón adecuada. Los detalles del lavado y sensibilización de las células con anticuerpos
se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa,
se extrae asépticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa
como la sangre de oveja.
Preparación de eritrocitos de oveja
sensibilizados con anticuerpos
Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individuales o el título de complemento hemolítico total emplean eritroci-
El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la
dilución de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan
diluciones seriadas de la muestra y se añaden al EA (Tabla 38-6). En este
caso, el punto linal del 50% se determina por la transformación de los datos de
Von Krogh. Esta fórmula derivada empíricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una función lineal. Se calculan los valores de / / 1 - /
donde Yes la fracción de glóbulos rojos usados en el test de dilución. Se construye una gráfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del
complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se
obtiene una línea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo
de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide por
el reciproco de la dilución sérica original (1:60 para el suero humanoi para calcular la concentración de complemento sérico que lisa el 50% de las células
El título de complemento representa el número de unidades hemoliticas 50%
que están presentes en 1.0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970).
El suero de los conejillos de Indias con déficit de C4 está disponible comercialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una
muestra. El método se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un número limitado de laboratorios está disponible el suero de humanos y conejillos de
CAPÍTULO 38
•
COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN
909
Tabla 38-7 Titulación funcional de la vía alterna (ensayo AH50)
'Si una muestra se suero muestra algún grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero
no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que están mezclados con E
EGTA GVBS+ = salmo isotónico tamponado con Veronal con gelatina, EGTA y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS— = salino isotónico tamponado con Veronal con
EDTA; CB = E solo con lampón; CL = E con agua destilada (lisis completa).
:
inmunodifusión. Existen disponibles equipos de inmunodifusión radial para
Indias con délicil de C2 y el de conejos con déficit de C6. Estos sueros son
una aceptable alternativa al empleo de intermediarios celulares para titular los todos los componentes de la vía clásica y alternativa. Estos equipos consisten en cristales cubiertos de una tina capa de agarosa al 2% que contienen
componentes individuales, ya que solo tienen la pérdida de una proteína del
anticuerpos monoespecíficos. El suero proteico estándar (un pool estabilizacomplemento,
do de suero humano normal) se suministra, normalmente, en soluciones prediluidas. Cada solución estándar contiene una cantidad específica de la proEnsayo de la vía alterna
teína que se está midiendo para su uso en la construcción de la curva de
En este ensayo, el suero humano (normalmente diluido primero a 1:5) se referencia.
diluye seriadamente y se añade a eritrocitos de conejo que no están sensibilizados con un anticuerpo específico en un tampón que contiene iones magPrueba de fijación del complemento
nesio y ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) para quelar los iones calcio (los
Se dispone de una descripción detallada de este ensayo (Mayer. 1961), y
iones calcio son necesarios para la activación de la via clásica, no para la actiaquí no se detallará. Sin embargo, ya que las reacciones de fijación del comvación de la via alternativa) (Pangburn, 1988) (Tabla 38-7). El título de la vía
alternativa se denomina AH50 y representa la dilución final del suero humano plemento son de gran importancia en el diagnóstico clínico, se tratarán brevemente. La técnica de la prueba depende de la capacidad del complemento
en el ensayo que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una gráfica
del suero fresco de interaccionar con complejos antígeno-anticuerpo. En la
similar a la descrita para la litulación del complemento hemolítico total para
primera etapa de la reacción, el complemento es incubado con los materiales
determinar el AH50. El suero humano puede poseer a veces anticuerpos
que pueden contener el antigeno y el anticuerpo. Si se forman complejos antí"naturales" para un carbohidrato expresado ampliamente en las células de
otras especies diferentes de los humanos y de los primates. Si se mezcla una geno-anticuerpo, interaccionan con el complemento del mismo modo que los
complejos de anticuerpo sobre el antigeno de superficie celular interaccionan
alta concentración de suero con los eritrocitos de conejo se puede inducir la
con el complemento. El complemento es activado, los componentes son fragaglutinación, que puede alterar la interpretación del titulo de AH50 (Tomlinson,
mentados, y el complemento es "utilizado" o "fijado". En la segunda etapa, se
1997). Por lo tanto, puede ser útil absorber el suero con concentrado de eritrocitos de conejo lavados en hielo durante 15 a 30 minutos para extraer una añaden las células de oveja sensibilizadas (EA). y la mezcla se incuba a 37 C
durante una hora. Si el suero de la prueba contiene el anticuerpo contra el
cierta proporción de anticuerpos naturales, disminuyendo asi la aglutinación
antígeno utilizado, el complemento se lija y por lo tanto no está disponible pacelular en el ensayo.
ra lisar el EA. Por ello, la ausencia de lisis indica una reacción positiva, y la
lisis completa indica un resultado negativo.
Niveles del complemento mediante
Hay dos aproximaciones generales de las pruebas de fijación del compleensayos antigénicos
mento. En la primera, el suero concentrado es el que proporciona el complemento, y la cantidad de complemento fijado se determina por la titulación del
Para utilizarla en ensayos antigénico, la muestra (ya sea suero o plasma)
suero antes y después de la fijación. En la segunda, se emplea una dilución
se almacena congelada (20°C o menos). La contaminación bacteriana puede suero que proporciona suficiente complemento para la lisis de EA o poco
de originar la desnaturalización o la fragmentación de las proteínas, mientras
que el hielo y el deshielo no tienen un electo adverso importante sobre los más del suficiente (tres a cinco unidades CH50) En este caso, se añaden las
células sensibilizadas sin dilución posterior de la cantidad de complemento.
niveles antigénicos. En ciertos ensayos del complemento, la muestra se diluLa incubación del material del test con el complemento puede hacerse a 37 C
ye en salino para obtener el índice corréelo de concenlración para la adecuadurante una hora o toda la noche en frió. En general, la incubación en frió orida cuantificación.
gina títulos mayores. El complemento puede activarse por un número de
Los análisis antigénicos de las proteinas del complemento hacen uso de
agentes diferentes de los complejos antígeno-anticuerpo como las bacterias,
una de las muchas técnicas de precipitación inmune. La inmunodifusión radial
endotoxinas y y-globulinas agregadas. Por lo tanto, son necesarios los consimple (RID) utilizando el método ya sea de Fahey o de Mancini es el métotroles pata demostrar que ni el suero ni el antígeno aislados fijarán el comdo empleado más frecuentemente para calcular una cuantificación específica
plemento. El test de fijación del complemento es de particular valor en tanto
de una proteína. En ambos métodos, el antígeno se añade a los pocilios en
que no necesita que los antigenos o los anticuerpos estén presentes en su
un gel que contiene anticuerpo, y se forman anilos de precipitación. El métoforma altamente purificada. Pueden utilizarse tanto antígenos solubles como
do de Fahey emplea un anticuerpo que no está en exceso. El tiempo de difuparticulados, y se pueden medir tanto los antígenos como los anticuerpos.
sión al que los resultados son leídos es por ello crítico. Los puntos de difusión
finales no se alcanzan y pueden levar a mediciones inadecuadas de los nive-Una aproximación alternativa al test de fijación del complemento es el empleo
de ensayos con ELISA que miden los productos de fragmentación de las proles del complemento antigénico. El método de Mancini utiliza un exceso de
teínas del complemento o de los complejos formados tras la activación del
anticuerpo en un gel y es más sensible y exacto. El método de Mancini se uticomplemento, como se discutió previamente. De cualquier modo, estos ensaliza por muchas firmas comerciales para la preparación de los cristales de
910
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados
con la prueba de fijación estándar.
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIÓN
DE CININAS
El sistema de generación de cininas es una vía mediadora secundaria presente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la generación de péptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aquí
será descrito brevemente. Para más detalles, se remite al lector a recientes
revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius.
1995). El péptido biológicamente activo más importante generado por este
sistema parece ser la bradicinina, un nonapéptido con potente actividad en
muchos sistemas biológicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascular, vasodilatación, hipotensión, inducción del dolor, contracción de muchos
tipos de células musculares lisas, y activación del sistema de la fosfolipasa A,
con su función de activación del metabolismo del ácido araquidónico celular.
Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema
de generación de cininas del plasma es más simple debido a que está compuesto solo por cuatro proteínas plasmáticas. Los elementos tisulares también generan cininas.
Las principales proteínas del sistema de generación de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulación XI, la precalicreína y el quininógeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el
plasma como un complejo con el quininógeno de alto peso molecular con una
relación molar de 2:1. La precalicreína también circula en un complejo con el
quininógeno de alto peso molecular con una relación molar de 1:1. En contraste, el factor de Hageman circula como una proteína plasmática de cadena simple, no formando complejos.
Al igual que en la secuencia de activación del complemento, la secuencia
de generación de cininas sigue una vía específica. Interaccionando con superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente
con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biológicamente como el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de
Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa)
tiene actividad proteolítica y después activa y degrada las moléculas del tactor de Hageman adicionales para generar más aHFa. La degradación de la
cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las
cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimático activo
del factor de Hageman reside en la cadena ligera.
Muchas enzimas proteolíticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y
activar al factor de Hageman. El «HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quininógeno de alto peso molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activación de la cascada intrínseca de la coagulación. El
«HFa también interacciona con el complejo quininógeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicreína en una
molécula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes
disulfuro. La precalicreína degradada tiene actividad enzimática proteolítica
localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones
ocurren mucho más eficazmente cuando las proteínas se unen a superficies
cargadas negativamente, las cuales son críticas para la activación de la cascada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular
en muchos lugares, liberando bradicinina.
La calicreina activa, generada por la degradación de la precalicreína, también es capaz de degradar posteriormente el «HFa a un producto de menor
peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede
degradar y activar al complejo quininógeno de alio peso molecular- precalicreína pero no permanece en la superficie de unión y no interacciona eficazmente con el complejo quininógeno de alto peso molecular-factor XI.
La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rápidamente
por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molécula ya no tiene la actividad de la bradicinina de contraer el músculo liso y no puede inducir la salida de líquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus
efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar péptidos de bajo peso molecular que pierden su actividad biológica.
Los inhibidores del sistema de generación de cininas incluyen el C1 inhibidor, la «,-macroglobulina, y el «.-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la
«¿-macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa,
ejerciendo el C1 inhibidor la influencia más potente. El C1 inhibidor y la
«,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo.
El angioedema hereditario resulta de la deficiencia genética o adquirida del
C1 inhibidor. Se cree que las características clínicas asociadas con esta enfermedad surgen de la pérdida del control adecuado del sistema de generación de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998)
También existen en el plasma los quminógenos de bajo peso molecular y
pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los quminógenos no son fáciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares presentes en las células pueden degradar el quininógeno de ba|0 peso molecular
a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradicinína sufre la misma vía de degradación que la bradicinina,
Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el
fluido nasal en la rinitis. También se ha sugerido un papel patogénico para la
bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la inflamación. Está claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema
generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus
derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados
con la inflamación.
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CAPÍTULO 38
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C A P Í T U L O
39
Gtocinas y moléculas
de adhesión
• H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S.
• Richard A. McPherson, M.D.
CITOCINAS
914
lnterleucina-14
lnterleucina-1
lnterleucina-15
lnterleucina-2
lnterleucina-16
lnterleucina-3
lnterleucina-17
lnterleucina-4
lnterleucina-18
lnterleucina-5
Factor transformante del crecimiento |i
lnterleucina-6
Factor de necrosis tumoral
lnterleucina-7
Interferón-y
lnterleucina-8 y las quimiocínas
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR
lnterleucina-9
Integrinas
lnterleucina-10
Selectinas
922
lnterleucina-11
lnterleucina-12
lnterleucina-13
CITOCINAS
La secreción y la unión de las citocinas es el equivalente celular a estar
"en línea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un
Internet" de comunicación entre las células. Las señales de las citocinas
son recibidas sobre la superficie celular y no sólo como simples mensajes,
sino también como combinaciones complejas e imperceptibles sinérgicas y
antagónicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migración
celular y la cicatrización de las heridas. Para responder a los mensajes
específicos de las citocinas, las células despliegan miles de receptores de
superficie de citocinas, presentados como múltiples antenas. Utilizando
estos receptores, las células seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citocinas solubles y de unión a sustratos de manera dependiente de la densidad y el estado de activación de los receptores de superficie. El término "citocina" se refiere a los productos solubles de las "células"
en senlido genérico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas,
pero para la mayor parte son la célula T y el macrófago las factorías virtuales de citocinas. y por esta razón muchas familias de citocinas se conocen
como interleucinas (IL).
PERSPECTIVAS
924
BIBLIOGRAFÍA
924
lnterleucina-1
La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres proteínas: la IL-1r/. y la IL-1|3
(los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA),
un antagonista específico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello,
1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la
IL-115 son sintetizadas como proteínas precursoras intracitoplasmáticas de
31 kDa que son degradadas para generar las formas biológicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a través de
la acción de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada
puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los
queratinocitos, por las células T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timocitos. La pro-IL-l f5 se convierte intracelularmente en su forma biológicamente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la apoptosis.
Aunque los bioanálisis son a veces el método de referencia para la detección de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son
difíciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con
enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) están ampliamente disponibles
para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las técnicas moleculares
(reacción en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridación ¡n situ) se emplean
en laboratorios más modernos para identificar la presencia de citocinas con
alta sensibilidad y para localizar más precisamente una citocina de un tipo
celular particular.
Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 kDa
ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la señal cuando se une tanto a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa más restringido (para
neutrófilos, monocitos y células B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la señal
intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo
tanto se ha descrito como un receptor "señuelo" que actúa como un "escondite" para las moléculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se
asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos señalizan el núcleo a
través de muchas vías de cinasas de proteínas asociadas a macrotúbulos
(MAP) que activan los factores de transcripción nuclear incluyendo el factor
nuclear (NF) K(Í. entre otros (O'Neill, 1996). La molécula antagonista IL-IRA
es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la señal de transducción
intracelular.
En los años recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero sólo se presentan aquellas para las que se conoce suficiente información.
Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la
IL-1 exhibe miles de efectos biológicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el
CAPÍTULO 39
•
CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
complejo mayor de histocompatibilidad antígeno.'receptor de células T
(MHC/TCR) mediando la activación de las células T como un componente
importante de señal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la célula T como la IL-2 a través de la regulación a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la proliferación de la célula progenitora hematopoyética (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias
hematopoyéticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia derivadas de la médula ósea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en promover el crecimiento y proliferación de algunas lineas celulares leucémicas,
pero es citotóxica directamente para algunas células mlecladas por virus y
para algunas células tumorales.
La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del ácido araquidónico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos
como intermediarios, y su capacidad para inducir la producción y liberación
de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los lugares de inflamación, la IL-1 origina una regulación a la
alta de los receptores de moléculas de adhesión sobre el endotelio vascular y estimula la producción de quimiocinas conduciendo a la acumulación
local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1,
la IL-1 puede aumentar la liberación de histamina de los basófilos y eosinófilos, contribuyendo esto a la broncoconstricción al estimular al músculo liso
vascular.
La IL-1 es responsable de la producción de reactantes de fase agua por
el hígado (p. ej.. complemento, péplido C reactivo) a expensas de proteínas
transportadoras como la albúmina. Para pagar el coste de los aminoácidos
de la síntesis masiva de péptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular,
acontecimiento que explica la mialgia que acompaña a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la dilatación vascular y a la hipotensión en el choque séptico a través de la inducción de óxido nítrico (NO) en las células
endoteliales. y también puede ser un significativo mediador del choque cardiogénico.
En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la añorexia, el sueño de ondas lentas y la letargia, así como la liberación de corticoïdes del hipolálamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la proliferación de células sinoviales. el depósito de colágeno, la resorción del cartílago
y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias
como la artritis reumatoide (AR).
Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis
bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompañante de la hematopoyesis, que puede disminuir el punto más bajo y acortar el periodo de supresión
medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991).
Sin embargo, el efecto beneticioso de la administración de IL-1 está limitado
por su profunda toxicidad.
Un nivel elevado de IL-IRA puede ser más sensible como marcador de
actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1.
El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio,
los procedimientos de cirugía general, y en personas asintomáticas que tienen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Además, la
severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de
IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades
del hígado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998).
La elevación del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para
minimizar los intensos efectos tóxicos de los niveles sistémicos aumentados
de IL-1: la inyección de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina
intravenosa aumentó la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes
con choque séptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente
medida al día 28, pero este efecto no se observó uniformemente en ensayos posteriores más grandes (Fisher, 1994). El mejor éxito con la terapia
con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reducción dependiente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reducción significativa en las nuevas erosiones óseas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clínicos
que evaluaban la eficacia de la administración de IL-1 RA en la enfermedad
injerto contra huésped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la
mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).
915
lnterleucina-2
La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminoácidos, miembro
de la familia de las citocinas de cuatro hélices-!/ (Bazam, 1990), con dos
puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido
secuenciado en el cromosoma 4. La activación de las células T y la liberación
de la IL-2 resulta de la interacción entre el TCR y el anligeno presentado en
asociación con las moléculas de MHC sobre las células presentadoras de
antigeno (APCs) (Fraser, 1991).
El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 kDa y una
cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja
afinidad hecho solo de IL-2Ru.
Solo el IL-2R</|ly y el IL-2R|iy son capaces de Iransducir la señal tras la
unión con el ligando. En las células T y en las células asesinas naturales (NK).
la IL-2 activa vías mtracelulares incluyendo la JAK-1 y la JAK-3 de la familia
de las cinasas Jane, que actúan a su vez en sus sustratos. STAT-3 y STAT-5.
de transductores de la señal y activadores de la familia de Iranscnpcion de los
factores de transcripción. Los genes diana de las vías de señalización activadas por IL-2 incluyen el bcl-2. c-myc. c-jun. y c-los (Gómez, 1998).
Ya que comparten las cadenas ot y y de las subunidades del receptor, la IL-2
y la IL-15 tienen actividades biológicas solapadas. Junto con la IL-15. la IL-2
estimula la proliferación in vitro de las células T CD4/CD8+ activadas, las subpoblaciones de células T y/5, y las células NK (Burlón, 1994), mientras que
promueve la función citolítica de los linfocitos T citóxicos (LTCs) y de las células asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Burton, 1994; Grabstein. 1994).
Además, ambas citocinas pueden inducir la proliferación de las células B estimuladas, y la síntesis de IgM. La IL-2 es también quimiotáctica para las células T (Wilkinson. 1995: Armitage. 1995).
In vivo, la IL-2 puede jugar un papel indispensable en el mantenimiento de
tolerancia a lo propio, ya que los animales con déficit de IL-2 desarrollan
enfermedades de inmunodeficiencia y autoinmunes como la anemia hemolitica y la enfermedad inflamatoria intestinal (vVillerford, 1995). Los ratones sin
IL-2R-|5 desarrollan espontáneamente activación de células T y diferenciación
celular plasmática de células B. con aumento de los niveles séricos de IgG e
IgE (Suzuki, 1995: Wang. 1996). Esto sugiere que la IL-2 puede provocar la
inducción a la anergia o a la apoptosis en la muerte celular de células T por
activación (AICD).
La readministración de linfocitos infiltrantes de tumor aislados (TIL) que han
sido expandidos y activados in vitro con IL-2 y OKT3. con infusiones farmacológicas de dosis de IL-2. son terapias prometedoras para los tumores malignos inmunogenicos como el melanoma maligno (Goedegebuure. 1995). La
actual terapia inmunosupresora para los receptores de alotransplantes incluye los inmunosupresores ciclosporina A, FK-506, y Rapamicina. Estos agentes se unen a las dianas inmunofilinas inlracelulares, creando un complejo fármaco-inmunofilina que bloquea la capacidad del factor nuclear de las células
T activadas (NF-AT) de activar los genes de la IL-2 necesarios para la proliferación de las células T, y otros genes necesarios para la activación de las
células B (Ho. 1996), produciendo asi inmunosupresión.
lnterleuc¡na-3
La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfocitos espíemeos de ratón, donde inducía a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide
deshidrogenasa (Ihle, 1981). Es una proteína de 26 kDa sometida a un
estricto control regulador y expresada en una población de células restringida que incluye las células T activadas, las células NK. los mastocitos y
algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La síntesis adecuada de IL-3
requiere la activación de las células T a través del complejo TCR'CD3 Esto
inicia las vías mtracelulares conduciendo a la activación del NF-KB, que se
introduce en el núcleo para transactivar la expresión del gen IL-3 (Park,
1993: Link, 1992).
El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia génica de los receptores de citocinas y tiene una cadena |5 específica de ligando asociada no
covalentemente con una cadena de transducción de señal |i. El gen que la
codifica ha sido secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)
916
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Las células diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las células T
y células B. La administración in vivo de IL-3 a dosis farmacológica origina un
aumento de la producción de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones,
mientras que la sobreexpresión de IL-3 mediada por retrovirus en las células
medulares conlleva el desarrollo de un síndrome míeloproliferativo no neoplásico (Metcalf. 1986; Chang, 1989). Se ha sugerido un papel para la IL-3 en
el desarrollo de la hipersensibilidad por contacto, ya que los ratones con déficit de IL-3 muestran un desarrollo escaso de la hipersensibilidad retardada del
tipo hapteno específico (Mach. 1998). Además, evidencias muestran un papel
para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chiang. 1996).
lnterleucina-4
La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulación de la
producción de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamación y en el
desarrollo de las respuestas T celulares efectoras. Es una proteína compleja
con muchos puentes disulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosilación cuyo gen ha sido secuenciado en el cromosoma 5. La producción de
IL-4 está altamente regulada y se restringe a las poblaciones de células T activadas, mastocitos, basótilos y eosinófilos.
Los efectos biológicos de la IL-4 están mediados a través de receptores de
IL-4 de alta afinidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. específica de
ligando, y una cadena y de señal de transducción compartida por muchas
otras citocinas incluyendo la IL-7 y la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R
tiene homología con el IL-5Ra y con el IL-6R.
La IL-4 activa las células B y promueve su diferenciación, reflejando el
hecho de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de
cultivos de células T activadas y factor de crecimiento de célula B duplicado.
Además de inducir la expresión de CD23 y moléculas de MHC en las células
B, regula la apoptosis de las células B y el cambio de isotipo. particularmente de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4
estimula la formación de colonias por los precursores eritroides, megacariocíticos. mastociticos y granulocito/monocíticos, mientras promueve el
desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Erard, 1993).
En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferación de células endoteliales, y origina una regulación a la alta de las moléculas de adhesión celular del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el
aumento de la adhesión leucocítica a la superficie de los vasos de modo que
las células inflamatorias migran a los lugares de inflamación local. Además, la
IL-4 es quimiotáctica para los eosinófilos y facilita la citotoxicidad de los monocitos y de las células T (Tepper, 1989; Crawford. 1993).
Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 en enfermedades alérgicas como la dermatitis atópica y en la fiebre del heno, y los ratones transgénicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alérgico en el párpado (Tepper,
1989). La IL-4 también puede conferir un grado de protección ante algunos
parásitos extracelulares, y disminuir el daño de las respuestas autoinmunes
inhibiendo las respuestas prolongadas de células T (Finkelman, 1986; Rapoport, 1993).
La IL-4 participa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las células
NK efectoras o la actividad tumorícida de los macrófagos (Bosco, 1990). Al
mismo tiempo, la IL-4 está implicada en el crecimiento de las leucemias de
células T humanas in vilro. Como está asociada con un cambio de las células
efectoras CD8+ a células no citotóxicas, la IL-4 puede jugar un papel en la progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Erard, 1993).
Los niveles elevados de IL-4 en las lágrimas y en la sangre de pacientes
atópicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la enfermedad alérgica y puede servir como marcador de severidad de la enfermedad (Páranos, 1998: Fujishima, 1995).
lnterleucina-5
La IL-5 es un homodímero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminoácidos, que juega un papel central en la maduración, activación y supervivencia de los eosinófilos, y en el desarrollo de enfermedad atópica y eosinofilia. El gen IL-5 reside en el cromosoma 5 en un grupo de genes que
codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF). Estructuralmente, está relacionado con el grupo de
citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL-5 (IL-5R) consis-
te en una cadena u específica de ligando y una cadena |5 de transducción de
señal común a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 1991). Los
dominios intracitoplasmáticos de las subunidades </. y \i contiene regiones
implicadas en la unión del JAK-2 y el JAK-1. respectivamente, que son necesarios para la transducción de señales. No se ha descrito completamente la
total distribución tisular del IL-5R. pero parece estar restringida a los basólilos
y eosinófilos.
La IL-5 es producida por las células Th2 que liberan la cilocma cuando son
estimuladas apropiadamente. Los mastocitos. las células NK. las células B,
los eosinófilos, las células malignas y algunas células transformadas por virus
son capaces también de secretar IL-5. La IL-5 promueve la diferenciación, la
migración, la activación, la degranulación y la supervivencia de los eosinófilos. Estudios en ratones implican a la IL-5 aislada en la estimulación de la producción de eosinófilos in vivo (Tominaga. 1991; Dent, 1990). La IL-5 es responsable de la inducción de la acumulación, activación y degranulación de los
eosinófilos tras el contacto antigénico, posiblemente a través de su gran actividad quimiotáctica, de su capacidad de producir una regulación a la alta de
ciertas moléculas de adhesión presentes en los eosinófilos como CD11b. y
promoviendo la liberación de granulos de IgG inducida (Wang, 1989: Walsh,
1991; Fujisawa. 1990).
El papel de la IL-5 en la enfermedad humana puede incluir la producción
de daño en la membrana basal observado en el penfigoide ampollóse promover la infiltración eosinófila en los lugares de infestación parasitaria, y promover la producción de anticuerpos del receptor de la antitirotropma en la
enfermedad de Graves. Además, la eosinofilia local de la enfermedad de
Hodgkin puede estar asociada con la capacidad de las células de Reed-Sternberg de liberar IL-5. En las respuestas alérgicas, la IL-5 liberada por los mastocitos lisulares puede servir para promover la acumulación de eosinófilos en
los tejidos (revisado en Lalani. 1999).
Actualmente, se emplea el ELISA para la medición in vilro de la IL-5, y las
técnicas de inmunofluorescencia permiten la localización de IL-5 en células
especificas, mientras que la hibridación in silu permite la precisa localización
de la IL-5 en las células individuales.
lnterleucina-6
La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de
células T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferación de
una inmunoglobulína secretada por las poblaciones de células B. Sin embargo, sus acciones se extienden a muchas células diana y ahora se reconoce
como una citocina importante inmune, hematopoyética y proinflamatoria (Hirano. 1998). La IL-6 es secretada como un péptido de 184 aminoácidos de
alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosilación. El gen que
codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano, 1986). La
molécula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conectadas
por asas de péptidos interpuestas (Bazan, 1990).
El complejo del receptor de la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un
miembro de la supertamilia de receptores de citocinas y está compuesto de
una cadena de unión a específica de ligando de 80 kDa (IL-6R«) y una cadena de señalización |i no asociada covalentemente. la gp130. La subunidad (i
es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-11 y del GM-CSF,
y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un dominio triptófano-serina-X-triptófano-serina en su región amino-terminal. Esto puede
explicar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas
citocinas. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad
para la IL-6. permitiendo la señal de transducción a través de las vías de la
JAK/STAT.
Una variedad de células producen IL-6, incluyendo las células T y las células B, los monocitos y macrólagos, los fibroblastos, los queratinocitos, los
sinoviocitos, los condrocitos y las células endoteliales. La IL-6 actúa sobre las
células T, los hepatocitos, los progenitores hematopoyéticos y las neuronas.
Es un potente factor de crecimiento para las líneas celulares del míeloma y
el plasmocitoma humano, y tienen una acción autoenna y paracrina sobre
los mielomas humanos trasplantados al ratón. En los hepatocitos. la IL-6
estimula la producción de varios reactantes de fase aguda, y en los ratones
knockout por IL-6. están muy disminuidas la liberación de reactantes de la
lase aguda y de Ig.
CAPÍTULO 39
•
CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
En las células hemalopoyéticas, la IL-6 origina la proliferación y diferenciación de células T, aumenta la formación de colonias de progenitores hematopoyéticos multipotenciales e induce la maduración de los megacanocitos.
Estimula la formación de osteoclastos, la proliferación de las células del músculo liso vascular, e induce la producción del factor de crecimiento derivado
de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 permite la supervivencia de las
neuronas colinérgicas, mientras que en el sistema reproductor induce la
secreción de gonadotropina coriónica humana (hCG) por el trofoblaslo.
Han sido observadas alteraciones en la producción de IL-6 en pacientes
con AR, y se ha demostrado una significativa correlación entre las concentraciones de IL-6 e IgG en el líquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988;
Hermana 1989). En los modelos animales, la administración de IL-6 parece
participar en el desarrollo de la glomerulonelritis membranosa proliferatíva
acelerada, simulando cambios encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) (Rytfel. 1994). Otros estudios en ratones transgénicos
sugieren un papel para la IL-6 en la aparición de la diabetes tipo I y en la
generación de los plasmocitomas monoclonales malignos (Suematsu, 1989;
Hirano, 1991). La evidencia clínica sugiere que la determinación de los niveles séricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cáncer
en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neonatos con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios
febriles se deben a la quimioterapia más que a la sepsis.
lnterleucina-7
La IL-7 se identificó por primera vez como una glicoproteína murina de
25 kDa que mostraba electos poliferativos in vilro en las células pre-B
(Ñamen, 1988). Aunque inicialmente se describió como un factor de crecimiento de las células B, después se encontró que la IL-7 era crítica tanto para
la linfopoyesis de las células T como B, así como para movilizar las células
progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En humanos, el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en órganos inmunes y
hematopoyéticos, como el timo, el bazo, la médula ósea y el hígado fetal
(Komschhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epidérmicos, las células epiteliales intestinales y las células estromales de la
médula ósea y el timo.
El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamilía de receptores de la hematopoyetina, teniendo una cadena y en común con los receptores de las interleucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efectos solapados y redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de
células T. El IL-7R ha sido identificad tanto en células mieloides como linfoides (Foxwell. 1992)
Los ratones transgénicos para la IL-7 desarrollan un aumento del número
de células B y T y de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el
IL-7R administrados a ratones originan una gran disminución del número de
timocitos, y células de linaje B medulares, con disminución del número de
células B y T en el bazo y en los ganglios linfáticos (Peschon, 1994). Los ratones knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran aún mayores reducciones de
las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importante función linfopoyética, la IL-7 acelera la reconstitución de las células T y B en los ratones
irradiados letalmente. con mínimos efectos en el compartimento mieloide. La
IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotóxica sobre las células T maduras y las células T citotóxicas, respectivamente. In vitro. las células T aisladas de la lámina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exógena y muestran un aumento de la capacidad de responder a anticuerpos
anti-CD3 y a IL-2, sugiriendo un papel para esta citocina en el aumento de las
respuestas inmunes mediadas por células (Watanabe, 1995).
Se han sugerido papeles clínicos para la IL-7. Estos van desde aumentar
los compartimentos de las células T de aquellos que padecen SIDA, hasta el
tratamiento de cánceres a través del aumento de la actividad LAK.
lnterleucina-8 y las quimiocinas
La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable
de la acumulación de neutrófilos en los lugares de inflamación (Hoch. 1996)
Induce la traslocación del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polimerización de la actma. y posiblemente también la actividad de 'a cadena respi-
917
ratoria en los macrófagos También es quimiotáctica para los basófilos y para
un subgrupo de células T CD4/CD8+.
Muchos tipos de células producen el pequeño peptido IL-8 incluyendo las
células endoteliales, las células epiteliales, los fibroblastos, los neutrófilos. los
monocitos. los macrófagos y las células T y. dependiendo de la célula de origen, la IL-8 variará en la longitud de aminoácidos. Tras la degradación proteolitica de su secuencia precursora de 99 aminoácidos, la IL-8 es secretada
por las células endoteliales existentes predominantemente como una proteina de 77 aminoácidos y como una proteina de 79 aminoácidos cuando es producida por los leucocitos mononucleares.
La IL-8 es liberada en respuesta a varios estímulos como los lipopoiisacandos (LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero unido no covalentemente, tiene su gran actividad quimiotáctica como un monomero (Paohni. 1994). Dos receptores con significativa homología en los
aminoácidos median los electos biológicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL8RA) y el receptor B de IL-8 (IL-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando.
El IL-8RA aparentemente tiene mayor afinidad y especificidad por el ligando,
mientras que IL-8RB muestra menor afinidad y especificidad por el ligando y es
capaz de unirse a otras proteínas quimioatrayentes relacionadas con la IL-8.
La inyección intradérmica de IL-8 origina una intensa e inmediata infiltración de neutrófilos alrededor de las venas con un exudado de plasma local.
Para alcanzar las áreas de inflamación, sin embargo, los leucocitos deben
primero atravesar el endotelio local. Esto está en parte facilitado por la IL-8.
que altera la expresión de integrinas neutrofilicas activando el CD11Ó/CD18
a su conformación de alta afinidad, y dispara la expresión de la L-selectina.
La IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta
unido a la superficie celular de las células endoteliales vecinas a la inflamación que siguen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 forma un gradiente quimiotáclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extravasados a los lugares de inflamación. Además de la secreción de IL-8
inmediatamente tras su producción, la IL-8 puede ser almacenada en los
cuerpos de Weibel-Palade. donde está disponible para la liberación inmediata independíente de su síntesis (Rot, 1996). Interesantemente, aunque actúa
predominantemente como quimiotáctica. el aumento de los niveles de IL-8 en
el sistema circulatorio está asociado con la disminución de la acumulación de
neutrófilos en los lugares de inflamación, aunque se observa una neutroM ¡a
sistémica (Hechtman. 1991). Esto también sugiere una (unción antiinflamatoria para la IL-8.
Los estudios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflamatorios desde la artritis crónica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los
niveles de IL-8 en orina como medida para monitonzar la severidad de la
enfermedad glomerular (Wada. 1994).
Desde la identificación de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la
superfamilia de las quimiocinas ha sido una colección de pequeñas moléculas solubles siempre en aumento importantes para la migración de los leucocitos a los lugares de inflamación. Las quimiocinas desarrollan su papel eficazmente y con gran especificidad por medio de la activación de integrinas
leucocitarias, particularmente la LFA-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el
ICAM-1 y el VCAM-1 de las células endoteliales. Las quimiocinas son críticas
en la hematopoyesis, en la angiogénesis, en la activación de las células T y
las células NK, en la patogénesis del VIH y en el desarrollo del SNC
La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la
posición de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de aminoácidos. La lamilia CXC (familia u) tiene un aminoácido que separa las primeras dos cisteinas: la familia CC (familia |i) no tiene aminoácidos intercalados; en la familia C (y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y
la familia de quimiocinas CX3C (6) tiene tres aminoácidos intercalados.
La familia CXC se divide posteriormente en miembros que tienen un residuo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y que poseen actividad angiogémca y actividad quimiotáctica neutrofílica.
La familia de quimiocinas CC contiene miembros quimiotácticos para los
monocitos, los linfocitos, los eosinófilos, los basófilos, los mastocitos y las células NK. Sus miembros pueden también regular la hematopoyesis en la cavidad
medular, e inducir la degranulación de los mastocitos y los eosinófilos. La linfotactina es el único miembro de la familia de quimiocinas C. Tiene su mayor
expresión en el timo, donde sirve para reclutar precursores de células T inmaduros de la médula ósea. Aún no se ha definido otras funciones para esta qui-
918
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
miocína. La familia de quimiocinas CX3C también tiene un solo miembro en la
actualidad, la fractalcina (la neurotactína). Es diferente de las otras quimiocinas
en que es relativamente grande, con 373 aminoácidos, con el dominio quimiocina encontrado en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celulares por un tallo tipo-mucina, la porción extracelular puede ser liberada de la
superficie celular para actuar como quimiotáctica para los monocitos, las células T y las células NK in vitro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el
proceso inflamatorio debido a su regulación a la alta del endotelio en el SNC de
ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en presencia de
factor de necrosis tumoral (TNF). Ya que la fractalcina también se expresa en el
cerebro normal, también puede jugar aquí un papel no patológico.
La mayoría de las quimiocinas se encuentran en la familia CC, mientras
que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las quimiocinas
ejercen sus efectos a través de la unión a miembros de la superfamilia de
receptores de siete dominios transmembrana, una familia de moléculas acopladas a la proteína G que crece rápidamente. Las células no inmunes como
los fibroblastos y las células del músculo liso vascular pueden también producir y liberar quimiocinas para dirigir a las células inflamatorias a los lugares
de inflamación, y pueden responder ellas mismas a las quimiocinas.
Las quimiocinas pueden promover la progresión de enfermedades. En la sepsis, la IL-8 es central en la acumulación de neutrófilos en varios órganos, y en la
progresión del desarrollo del estado final de enfermedad. Otras quimiocinas
incluyendo RANTES (reguladas en activación células T, normales expresadas y
secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque séptico, y puede proporcionar dianas para la intervención terapéutica. En las respuestas granulomalosas, la presencia de MIP-1« se correlaciona con la formación de granulomas.
Del mismo modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis múltiple, la progresión y la recaída de la enfermedad está afectada positivamente por la administración de anticuerpos neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.
lnterleucina-9
La proteína IL-9 humana todavía no ha sido purificada, pero a través de la
expresión del ADNc (Renauld, 1990) se cree que la proteína madura contiene 144 aminoácidos con cuatro lugares de glicosilación potencial. Su gen se
ha secuenciado en el cromosoma 5, donde los genes de otros factores de crecimiento y de los receptores de los factores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5,
GM-CSF y CSF-1R) se agrupan.
El ADNc para el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522
aminoácidos especifica de ligando miembro de la superfamilia de receptores
hematopoyéticos, que se asocia con una cadena y de señalización de transducción que es compartida con la IL-2, IL-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que
haya una subunidad del receptor común utilizada por estas citocinas puede
explicar algunas de las redundancias de la actividad observadas entre ellas.
Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la actividad de la tirosina cinasa
JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras que la IL-9Roc se asocia
con la JAK-1. También puede presentar un papel para la proteina de adaptación 4PS/IRS2 (Yin, 1995).
En humanos, la expresión de IL-9 está aparentemente limitada a las poblaciones de células T CD4+ CD45 RO positiva (células T memoria), y a las células T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se requiere
una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para mediar su
expresión. Además, el virus tipo 1 linfotrópico de células T humanas (HTLV-1)
transformante de células T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una
ruta de inducción aún desconocida.
El papel fisiológico de la IL-9 en las células normales lodavía no es conocido, pero las células T aisladas en fresco en cultivos a largo plazo responden
a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y en cultivos
de células T murinas sufren transformación tumoral (Uyttenhove, 1988). Interesantemente, del 5% al 10% de los ratones transgénicos que sobreproducen
IL-9 desarrollan espontáneamente linfomas linfoblásticos (Renauld, 1994). y
la IL-9 es producida en las células tumorales de la enfermedad de Hodgkin y
del linfoma anaplásico (Merz, 1991). Lo último muestra la posibilidad de una
curva de respuesta autocrina de la IL-9 (Demoulin. 1998).
En el sistema hematopoyético. la IL-9 y la eritropoyetina parecen reforzar
la maduración de los progenitores entroides in vitro, y pueden promover el
crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/macrófagos
(CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerce su actividad de promover el crecimiento sobre las líneas de mastocitos, y también puede regular
la diferenciación de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido que la IL9 induce la resistencia a parásitos in vitro de las células dependientes de los
mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la producción de IgE e IgG (Louahed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad
de mantener el aumento de la extensión neuronal y promover la excitabilidad
sobre cultivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones
inmortalizados (Mehler, 1993).
lnterleucina-10
La IL-10 es una potente atocina antiínflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una
proteína de 160 aminoácidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim,
1992), que contiene cuatro residuos cisteína y dos puentes disulfuro que mantienen su estructura helicoidal y su actividad biológica. La codifica un gen
secuenciado en el cromosoma 1. El receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado
sobre todo en las células hematopoyéticas, y es una proteina de 90 a 110 kDa
cuyo dominio extracelular se une a las moléculas dimerizadas de IL-10 (Tan.
1995). La transduccíón de señales de la IL-10 está mediada a través de la vía
de la JAK/'STAT (Lalani. 1997).
Aunque muchos tipos de célula, incluyendo las células Th2. las células T
CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrófagos, los mastocitos, los queratinocitos, los eosinófilos, las células epiteliales y muchas células tumorales son
capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la mayor cantidad
de IL-10 en la mayoría de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997). Ya que
puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia producción a
través de mecanismos de retroalimentación negativos, la IL-10 regula la respuesta inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10
actúa Inhibiendo la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la
IL-íB, la IL-6, la IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas incluyendo la IL-8 y la MIP-1u, suprimiendo la transcripción de sus genes correspondientes (Goldman, 1997). La IL-10 también suprime la liberación de los
radicales libres del oxígeno e inhibe la actividad microbicida dependiente del
óxido nítrico en los macrófagos (Fleming, 1996).
En situaciones alérgicas como el asma, la producción de IL-5 es crucial en
la iniciación del evento. In vitro, la IL-10 previene la producción de IL-5 en las
células T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresión de MHC de
Clase II sobre las APCs. También inhibe la expresión de MIP-1u en los neutrófilos, monocitos y macrófagos humanos; inhibe la producción de químiotácticos activos en los lugares de inflamación crónica; y puede ¡nactívar directamente la función de los eosinófilos y causar la muerte del eosinófilo. Estos
hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la inllamación aérea
crónica (Petrolaní, 1999).
Los estudios con animales también han sugerido un papel terapéutico para
la IL-10 en proporcionar una protección mucosa en la enfermedad inflamatoria intestinal, y en disminuir los niveles séricos de IL-8 en los animales con
pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los ratones inyectados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneales de
endotoxina que. de otro modo, serían letales. La IL-10 puede servir como factor de crecimiento para muchas líneas celulares malignas como los linfomas
de células B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las células
del mieloma maligno. La producción de IL-10 en otras enfermedades malignas puede proporcionar una forma de eludir las respuestas locales de las
células T. Sin embargo, los estudios también demuestran la capacidad de la
IL-10 de inhibir el crecimiento de las células de la leucemia mieloide crónica
in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995).
La IL-10 puede participar en la inducción y perpetuación del LES y la actividad de la enfermedad se correlaciona con los títulos de IL-10 (Houssiau,
1995). Está implicada en otras enfermedades autoinmunes incluyendo la
miastenia gravis, la enfermedad de Graves, el síndrome de Sjógren, la polimiositis, la psoriasis, la esclerosis sistémica, el pénfigo vulgar, el penfigoide
ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani, 1997). Además, la detección
de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en pacientes con carcinoma de células pequeñas de pulmón y adenocarcinoma de colon puede ser un
predictor útil de la progresión de la enfermedad clínicamente indetectable (De
Vita. 1999, 2000).
CAPÍTUIO 39
•
CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
lnterleucina-11
La IL-11 es una citocma pleotrópica con numerosos efectos en muchos tejidos incluyendo la médula ósea, el cerebro, el intestino y los testículos. El
ADNc de la IL-11 codifica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminoácidos, con una secuencia líder de 21 aminoácidos que parecer carecer de
lugares potenciales de glicosilación y de residuos cisteina. El gen codificante
se ha secuenciado en el cromosoma 19, y su estructura tridimensional contiene probablemente cuatro residuos (5-hélíce (Czupryn, 1995).
El receptor de la IL-11 (IL-11 R) está formado por una asociación no covalente de una cadena i/, específica de ligando y una cadena p de transducción de señal, la gpl30. El complejo IL-6R también utiliza la subunidad
gp130 como cadena de señalización, explicando algunos de los solapamientos en las acciones de estas cilocinas (Cherel, 1996). Cuando se asocia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unión para la IL-11 es mayor y se
genera una señal biológica a través de la formación de homodímeros de
gp130. Se cree que estos activan las vías de transducción incluyendo las
cinasas JAK. las cinasas MAPK. las proteínas cinasa ribosomales S6, y la
familia de cinasas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detectado en muchos tejidos estimulados incluyendo los fibroblastos, las células
epiteliales, los condrocitos. los sinoviocitos, los osteoblastos y las células del
glioblastoma.
Las evidencias indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria
(Trepicchio. 1998: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la
baja la función efectora macrofágica inhibiendo la expresión de los genes del
TNF-a, la IL-1p. la IL-12 y el óxido nítrico, a través de la prevención de la
translocación nuclear del factor de la transcripción nuclear NF-Kp" (Trepicchio.
1998). Sus efectos hematopoyéticos (Du. 1995) incluyen un papel en la
megacariocitopoyesis, y la estimulación de la eritropoyesis, la proliferación y
diferenciación macrofágica, y la producción de inmunoglobulinas por las células B. Además, regula la diferenciación y maduración de los progenitores de
células mieloides en combinación con el factor de células madre (SCF), y puede participar en la linfopoyesis. En cultivos de médula ósea a largo plazo
(LTBNMCs). la IL-11 aumenta la celularidad de las células estromales adherentes y promueve la hematopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en
quimioterapia, la terapia con IL-11 mejora la recuperación de la hematopoyesis y de la función inmune, y disminuye la morbilidad de la supresión de la
médula ósea por la quimioterapia.
La IL-11 tiene también extensos efectos no hematopoyéticos (Du. 1995). La
IL-11 puede funcionar en la inflamación pulmonar y es producida por la estimulación alveolar y por las células pulmonares epiteliales en grandes cantidades. Los virus respiratorios son potentes estimuladores de la síntesis de IL-11
en el pulmón, y la IL-11 es detectada en las secreciones nasales de niños con
infecciones del tracto respiratorio superior (Einarsson, 1996). La IL-11 también está implicada en el control del crecimiento de las células epiteliales gastrointestinales, ya que muestra una inhibición reversible de la proliferación de
las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vitro. La IL-11 también
puede ser capaz de conferir protección mucosa al epitelio gastrointestinal tras
la radiación y la quimioterapia (Keith. 1994).
Otras actividades de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in
vilro. un papel en la supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como
motoras, la estimulación de la liberación in vivo e in vitro de reactantes de lase
aguda y la regulación del metabolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la
biología lumoral, la IL-11 actúa sinérgicamente con otras citocinas para promover el crecimiento de las lineas celulares de la leucemia humana y estimula
la formación de la colonia de blastos leucémicos (Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se
ha detectado un efecto trombootopoyético beneficioso en pacientes con
enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999).
Interleucina-12
La IL-12 es una citocina heterodimérica de 70 kDa formada por dos cadenas unidas covalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes
separados (Trinchieri. 1994). La IL-12 promueve la diferenciación de las células humanas tipo Th1, preparándolas para incrementar la producción de interferón-y (IFN-y). y aumenta las capacidades citolíticas de las NK y de las células T (Heufler. 1996). Estudiado inicialmente en las células T activadas y en
919
las células NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la
superfamilia de receptores hematopoyéticos y tiene una homología significativa con la gpl 30 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leucemia (LIF). La IL-12 es producida principalmente por los monocitos y los
macrófagos, por las células dendriticas (APC profesionales) y, en una pequeña
cantidad, por los neutrófilos y los queratinocitos. Su producción está regulada a
la baja por la IL-10 y el TGF-p. y su síntesis esta aumentada por el IFN-y. La
síntesis de IL-12 es inducida rápidamente en las células fagociticas por ciertos tipos de bacterias, patógenos intracelulares incluyendo los protozoos y los
hongos, y en menor medida los virus. También puede producirse con la interacción homotipica del antigeno CD40 en las células T activadas y en los fagocitos (Trinchieri, 1997).
La IL-12 tiene un papel vital como citocina proinflamatoria. En modelos de
choque séptico implicando inyecciones intraperitoneales de endotoxina en
ratones, se encontró que la IL-12 promueve la sobreproducción de IFN-y. que
por un mecanismo de relroalimentación positivo induce la liberación de más
IL-12. Finalmente, la sobreproducción de IFN-y origina la muerte del animal.
El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la
observación de que la inyección de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en
ratones rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994).
Las evidencias sugieren que la IL-10 inhibe la producción de IL-12 por los
fagocitos, y que la IL-12 por si misma estimula la producción de IL-10, sirviendo por ello como regulador negativo de su propia producción (Meyaard,
1996).
Las evidencias experimentales en animales sugieren un papel exacerbante para la IL-12 en ciertas enfermedades autoinmunes incluyendo la diabetes
autoinmune. la artritis, el modelo animal de la esclerosis múltiple (EAE) y la
colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones alérgicas, la IL-12 juega un papel
paliativo a través de su capacidad de regular a la baja la producción de IL-4,
IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespuesta de la vía aérea inducida por antigeno en modelos de ratón (Gavett. 1995).
La IL-12 tiene significativos efectos antitumorales y antimetastásicos en
modelos de ratón in vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la
producción de IFN-y y por otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se
ha notado toxicidad gastrointestinal, hepática y hematológica en ensayos clínicos con rlL-12 sobre pacientes con carcinoma de células renales. Debido
a su papel en promover las respuestas de memoria de Th1 a las vacunas, la
IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacunas.
lnterleucina-13
La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminoácidos, clonada por primera vez de linfocitos T activados y clones de células T en 1993, con cuatro lugares de N-glicosilación y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuenciado en el cromosoma 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4,
la IL-5, la IL-9 y el GM-CSF. Se cree que posee una estructura («-helicoidal,
con cuatro hélices r* y dos cadenas plegadas p,
El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las células B. monocitos,
basófilos. eosinófilos. mastocilos. células endoleliales, fibroblastos, queratinocitos y ciertas células tumorales. Aparentemente, no se expresa en linlocitos T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor
común, el gp140, una proteína de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de
baja afinidad (IL-13Ra) para la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru).
No es sorprendente, entonces, que la IL-13 simula muchas de las acciones
biológicas de la IL-4. Cuando se une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R inducen la fosforilación de la tirosina del JAK-1 en las células hematopoyéticas. y
del JAK-2 en las células no hematopoyéticas. seguido por la activación del
STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995).
La IL-13 es liberada por las poblaciones clónales de células T CD4CD8+
ThO, Th1 y Th2 en respuesta a la estimulación antigénica específica o a la
activación policlonal, y por los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos tras
la estimulación a través de sus receptores de alta afinidad para la IgE (CD23)
(Keegan. 1996). El ARNm de la IL-13 es inducido en las células B normales
tras la correcta estimulación, y la proteína IL-13 y su ARNm han sido detectados en enfermedades malignas y en células B transformadas por el virus de
Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la IL-13 en el desarrollo
de enfermedades malignas de las células B (de Vnes, 1998).
920
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrófagos, la IL-13 induce una aumento significativo de la expresión de moléculas de MHC Clase II y CD23, sugiriendo un papel para la IL-13 en facilitar la capacidad de presentación de antigenos de estas células a las células T. Es quimiotáctica para los monocitos. y
promueve la proliferación de las células B activadas, e in vitro parece promover la formación de colonias de megacariocitos y aumentar la proliferación de
células progenitoras murinas en la médula ósea.
La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado
un importante papel para ella en la respuesta alérgica. La IL-13 es capaz de
inducir la secreción de IgE de cultivos de células B humanas y de aumentar
la expresión de la molécula de adhesión proinflamatona VCAM-1 en las células endoteliales. Este hecho y la observación de que la síntesis de IL-13 está
aumentada en situaciones atópicas en el pulmón en los asmáticos y en
pacientes con sinusitis crónica mientras que está disminuida en respuesta a la
administración de corticoesteroides pone de relieve la importancia de la IL-13
en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo, la IL-13 parece atenuar la respuesta alérgica regulando a la baja la capacidad de las células endoteliales y de las células del músculo liso de la vía aérea de liberar el
quimiotáctico RANTES de los linfocitos T y de las células inflamatorias (Tony.
1994).
El pretratamiento con IL-13 inhibe la producción de citocinas proinflamatorias como la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos activados
por LPS. Su regulación a la baja de la producción de factor tisular y su regulación a la alta de la producción de trombomodulina pone de relieve también
su naturaleza antiinflamatoria.
estimula la proliferación de mastocitos in vitro e m vivo. La IL-15 es quimiotáctica para las células T, recatándolas a los lugares de inflamación, y se
ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnnes,
1996). Otras evidencias indican un papel para la producción de IL-15 en las
situaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoidosis. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfocitos activados hacia áreas de inflamación donde serán capaces de liberar
citocinas adicionales proínflamatorias y ejercer sus efectos citotóxicos (Kirman. 1998).
Interleucina-16
Reconocida inicialmente como un factor quimiotáctico en cultivos de
células mononucleares de sangre humana periférica estimuladas con mitógenos (Center, 1982), la IL-16 está reconocida como un quimiotáctico
promflamatorio de células T. Los linfocitos estimulados con mitógenos producen IL-16 como una molécula precursora que es degradada y secretada
como una proteína de 17 kDa, 130 aminoácidos. Solo tras la agregación en
homotetrámeros la IL-16 parece poseer actividad biológica (Bazan, 1996).
Se cree que la IL-16 contiene seis láminas de pliegues (i incluyendo la
secuencia de aminoácidos, glicina-leucina-glicína-fenilalanma. que se cree
que facilita las interacciones proteina-proteína como la autoagregación. El
gen que codifica la IL-16 ha sido secuenciado en el cromosoma 15. La
superficie de las células CD4 parece servir como receptor de superficie
para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la señalización
biológica (Cruikshank, 1994) a través de vías que pueden incluir la fosforilación del p56 .
w
Interleuc¡na-14
La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser
una molécula distintiva.
Interleucina-15
La IL-15 es una proteína de 14 a 15 kDa, 114 aminoácidos, identificada por
primera vez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de
las lineas celulares epiteliales de ríñones de mono (Grabstem. 1994). Aunque
su secuencia de aminoácidos primaria es única, su estructura tridimensional
contiene dos puentes disulfuro y se parece bastante a la de otros miembros
de la familia de citocinas de cuatro u hélices de unión, que incluye a la IL-2.
citocina con una actividad funcional similar. El gen que codifica la IL-15 se ha
secuenciado en el cromosoma 4. cerca del gen de la IL-2 (Anderson. 1995a).
El receptor de la IL-15 (IL-15R) está compuesto de tres subunidades proteicas: una cadena IL-15Ra específica de ligando, y unas cadenas p y y
idénticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las actividades
similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homología con la IL-2Ra,
aunque su distribución tisular es diferente, y al igual que la IL-2R«, es incapaz de transducir una señal a menos que esté asociada con las cadenas
de Iransducción de señal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R
en las células T utiliza al JAK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la vía
JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995).
Los macrófagos. los fibroblastos, los queratinocítos. las células epiteliales
y otros tejidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por
los linfocitos. De cualquier modo, la distribución tisular de la IL-15 es amplia,
identificándose también transcripción de ARNm en monocitos y macrófagos,
células de Langerhans. células dendritas y células endoteliales. El ARNm de
la IL-15 parece almacenarse en una muestra translacionalmente inactiva que
está disponible para la traslocación precoz en la respuesta innata a la infección. La producción de IL-15 por los macrófagos en la fase inicial de la infección microbiana puede servir para activar a las células NK como parte de la
respuesta a la infección (Cosman. 1995).
Al igual que la IL-2, se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimulación de las células T en proliferación, en la inducción de la actividad de citocinas en las células T. en la proliferación de las células NK. y en la activación
de la proliferación de las células B y liberación de mmunoglobulinas (Kirman,
1998). Los modelos murinos sugieren un papel esencial para la IL-15 en el
desarrollo de las células NK. A diferencia de la IL-2. la IL-15 puede aumentar anabólicamente la masa muscular esquelética, y se ha demostrado que
La IL-16 es liberada por las células T tras la estimulación con mitógenos.
antígenos, histamina y serotonina. Los cultivos de eosinófilos y mastocitos
también liberan IL-16 en presencia de GM-CSF. y también PMA e ionóforos
de calcio, respectivamente. La IL-16 también ha sido identificada en los
sobrenadantes de cultivos de células epiteliales respiratorias extraídas de
asmáticos.
La IL-16 sirve como quimioláclico para las células T CD4+ y otras células periféricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los monocitos y
eosinófilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y estimula
la progresión del ciclo celular en células CD4+ humanas (Cruikshank.
1994). Además, la IL-16 promueve el aumento de la adhesión al ECM por
los eosinófilos, y regula a la alza la expresión de HLA-DR sobre los monocitos (Wan, 1995). Sobre los cultivos de células T, la IL-16 inhibe la expresión
del IL-2R mediado por el TCR y la producción de IL-2, y puede hacer a estas
células insensibles al AICD. El resultado in vivo puede ser el aumento de la
acumulación de células T CD4+ cebadas que responden a citocinas en los
lugares de inflamación, que están protegidas de la AICD mediada por TCR
(Cruikshank, 1994).
Se ha informado que los asmáticos tienen IL-16 constantemente presente en el epitelio de su vía aérea con células T CD4+, sugiriendo un papel
para la IL-16 en el reclutamiento de estas células en el asma. Los modelos
murinos sugieren un papel para la IL-16 en la inflamación granulomatosa.
La IL-16 también parece suprimir la transcripción del VIH en las células T
infectadas por el VIH a través de la activación de un factor represor no identificado.
Interleucina-17
Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotóxicos
(CTLA-8), la IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada como
homodímeros unidos covalentemente por un restringido grupo de células T
memoria activadas (Yao, 1995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta citocina descrita recientemente ha sido mapeado en el cromosoma 2 y su expresión parece estar estrechamente regulada. La IL-17 se expresa predominantemente por las células T CD4+ CD45-RO en respuesta a una variedad de
señales de activación incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 mAb, el antiCD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996).
Los estudios en ratones sugieren que. en contraste con la expresión restringida de la IL-17. el receptor de la IL-17 (IL-17R) es una proteína novel
ampliamente distribuida especialmente abundante en el bazo y el riñór
CAPÍTULO 39
•
CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
Evidencias recientes implican la vía de señalización JAK/STAT en la transducción de señales por el IL-17R (Subramaniam. 1999).
Algunas evidencias parecen sugerir un papel para la IL-17 como inhibidora del crecimiento de las células T activadas en ratones (Yao. 1995a). Esto
mismo aún no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-17 también
parece regular al alza la producción de IL-6. IL-8. PGE y óxido nítrico, y su
secreción por los fibroblastos cutáneos, los sinoviocitos. las células endoteliales, las células del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma
de riñon. La IL-17 induce indirectamente la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente
promueve la diferenciación de estas células a neulrófilos (Yao, 1995b). La IL17 también induce la expresión de ICAM-1 sobre los fibroblastos in vitro
(Fossiez, 1996).
;
Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la protección frente a la
infección bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la producción de
altos niveles de citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede servir para regular el proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recientes sugieren la posibilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los
tumores de cuello uterino en humanos (Tartour, 1999).
lnterleucina-18
Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una
proleina de aproximadamente 18 kDa producida por los macrólagos activados, las células de Kupffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Torigoe, 1997). La formación de la IL-18 biológicamente activa requiere el procesamiento del precursor de 24 kDa por la caspasa-1 (ICE) en las células
de Kuplfer.
El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idéntico a la proteína relacionada con el
IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando se une a su ligando el IL-18R induce la unión del ADN NF-vp. Se han identificado IL-18Rs de alta y baja afinidad, pero sus papeles en la transducción de señal no están claros.
La función primaria de la IL-18 parece ser la inducción del IFN-y en las
células Th1 activadas y en las células B anti-CD40 activadas (en presencia de
IL-12). La IL-18 también induce la síntesis por las células T de CM-CSF e IL6. y promueve la cilotoxicidad sobre las células NK permitiendo la exocilosis
de perforinas y granzima A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un
papel para la IL-18 fuera del sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997;
Conti. 1997).
Los papeles fisiológicos de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la
infección, y un papel en el rechazo de tumores. A través de la supresión de la
producción de IgE. la IL-18 puede abortar la respuesta alérgica (Yoshimoto,
1997), pero la producción no regulada de IL-18 está asociada con el daño del
parénquima hepático en modelos animales. La IL-18 puede participar en la
patogénesis de la linlohistiocitosis hemolagocítica (HL) a través de la inducción de células Th1. La medición de los niveles de IL-18 en la sangre perilérica de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorización
de la actividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).
Factor transformante del crecimiento [i
El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capacidad para mantener la formación de colonias por los fibroblastos del riñon de
ralas normales (NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidérmico (Clark,
1998). En mamíferos, son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11.
TGF-|12 y TGF-P3) (McCartney-Francis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un homo- o heterodimero del péptido TGF-p de 12.5 kDa degradado por endopeptidasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secreción, el dimero TGF-p de 25 kDa
se une al péptido de unión latente del TGF-p de 75 kDa (TGF-(3-lpb), y juntos
se unen al péptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa (TGF-(i-lap) formando el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc).
El TGF-p-lc se encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las
plaquetas. Una vez liberado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de
superficie celulares para el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM
y permanecer latente. Alternativamente, puede degradarse a su forma activa
una vez secretado a través de las serín proteasas liberadas ya sea por la
misma célula o por células vecinas. EL péptido de degradación bioactivo se
921
asocia después con los componentes o transportadores de ECM como la
a -macroglobulma. la albúmina o la IgG. lo que facilita la captación y el metabolismo del TGF-p.
El TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y diferenciación de células epiteliales: en la carcinogénesis. y en la inflamación, la
reparación y la angiogénesis. Sus efectos biológicos son transducidos a través de cualquiera de los seis receptores descritos incluyendo las tres clases
de receptores transmembrana y muchos receptores solubles. De estos, los
receptores del TGF-p" tipo I y tipo II son capaces de transducir señales biológicas, mientras que los receptores tipo III carecen de residuos de señalización
y sirven sobre todo para almacenar y presentar el TGF-|5 a los receptores de
señalización. La señal biológica es transducida al núcleo añadiendo proteínas
Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermediarios
(Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996).
El TGF-jJ es producido por cualquier linaje de linfocitos desde linfocitos
hasta macrófagos y células dendríticas. y actúa tanto en la respuesta autocnna como paracrina. Sus actividades biológicas son muchas y bien equilibradas, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la insuficiencia
(McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoutóe TGF-p, el 30% al 60% de
los embriones demostraron fallo en la angiogénesis y en la hematopoyesis, y
abortos espontáneos, mientras que en ratones transgénicos con sobreexpresión de TGF-p. la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la pérdida de la
diferenciación epitelial respiratoria originando la muerte perinatal.
El TGF-|i funciona tanto como laclor de proliferación como inhibidor del
crecimiento. Inhibe el producto del gen del retmoblastoma (Rb) e inhibe la
expresión del protooncogén c-myc, provocando una alteración del equilibrio
de las proteínas reguladoras positivas y negativas que controlan el ciclo
celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresión de TGF-|4
origina hipo o hiperproliferación de células epiteliales, en donde la hiperproliferación está asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la
agresividad de las líneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon
aumenta con el aumento de la pérdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|!
también puede servir como supresor de tumores, ya que los anticuerpos
contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de las células del carcinoma de
colon in vitro.
En el compartimento hematopoyético (McCarteny-Francis, 1998), el TGF-p
controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la supervivencia de las células dendríticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TGF-J5 mantiene el proceso inflamatorio a través del aumento de la adhesión de las células inflamatorias a través de la regulación a la alta de las integrinas. y quimiotácticamente
reclutando y activando linfocítos nativos. Interesantemente, los ratones knockout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las células B parecida
a la autoinmunidad, con infiltración por un número considerable de macrólagos y linfocítos de órganos incluyendo el corazón, el pulmón y el hígado (Kulkarni, 1993). El TGF-p puede promover normalmente la tolerancia a lo propio
regulando la maduración de los limocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones
aulorreactivos sufren apoptosis. En la periferia, una población de TGF-|i producidos por las células Th2 mantienen la tolerancia periférica promoviendo la
anergia clonal.
El TGF-p suprime la respuesta inflamatoria y promueve la curación a través de la inhibición de la proliferación de células T y B. la inhibición de la función de las células NK, la inducción de los antagonistas de citocinas, la regulación a la baja de la expresión de integrinas, y la inhibición de la liberación
de IgG. Sin embargo, la sobreproducción de TGF-p no solo acaba con la respuesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curación, provocando
una fibrosis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994).
Se ha propuesto un papel para el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el
TGF-ji insuficiente puede permitir la formación de la placa arteriosclerólica.
En esta via, la formación de la placa en algunos ratones seleccionados es
inhibida por la administración de tamoxifeno, que aumenta el TGF-p circulante.
Factor de necrosis tumoral
El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que
puede existir como forma transmembrana de 26 kDa, o como péptido soluble que se homotrimenza para formar la citocina fisiológicamente activa de
922
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGIA
52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar células tumorales y
para inducir la necrosis hemorrágica en tumores trasplantados a ratones. Es
un miembro de la familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos
por tres cadenas polipeptídicas y capaces lodos de unirse a miembros de
una lamilia de receptores de TNF relacionados estructuralmente (Beutler,
1994).
La mayoría de los efectos del TNF están mediados a través de dos receptores de superficie celular de alta afinidad: el TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el
TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando son ligados, estos
receptores median señales para la proliferación y muerte celular programada (apoptosis), con evidencias que muestran que esto último está mediado
a través de la inducción de la pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la liberación de proteínas del especio intermembrana. En relación
con esto, el TNFR-I tiene en su dominio mtracelular un residuo denominado
"dominio mortal" que es necesario para la transducción de la señal apoptótica.
Principalmente, producen TNF los macrófagos y los monocitos. pero otras
células incluyendo los linfocitos, los mastocitos, los neutrófilos, los queratinocitos. los astrocitos, las células microgliales, las células del músculo liso y las
células tumorales también lo producen. El TNF puede actuar localmente en
una función paracrina, pero también actúa en lugares distantes a modo de
hormona.
Los efectos biológicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e incluyen
un efecto citotóxico directo, la modulación del crecimiento y diferenciación
tisular, y un papel en las situaciones de inflamación e infección crónica. Además, el TNF-a es responsable del síndrome de caquexia tumoral y de la
mayoría de las infecciones parasitarias. A través de la estimulación de los
neutrófilos. el TNF-a aumenta la fagocitosis, la degranulación y la actividad
de la cadena respiratoria. Los efectos proinflamatorios adicionales incluyen la
inducción del aumento de la formación del factor activador de plaquetas (PAF)
en los neutrófilos, la estimulación de la secreción de ácido araquidónico, el
aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada por células, y el
aumento de la adherencia de los neutrófilos al endotelio activado por TNF a
través de la regulación a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el
papel proinflamatorio del TNF.
Los modelos animales implican al TNF en la AF¡ y en la enfermedad inflamatoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflamatorio a través de la
activación de las células endoteliales y de la inducción de las quimiocinas quimíotácticas de neutrófilos. Además, se ha propuesto un papel para el TNF en
las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de
múltiples estudios de esclerosis múltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999).
En pacientes que sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infección por Borrelia recurrenlis), la administración de anticuerpos bloqueantes
anli-TNF ha demostrado suprimir la reacción de Jarisch-Hexheimer (hipotensión persistente) que acompaña a la administración del antibiótico (Fekade,
1996).
MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR
El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multicelulares está compuesto en parte de moléculas de adhesión que se describen
a continuación. Estas compleías glicoproteinas permiten la migración celular
durante la embriogénesis y cicatrización de heridas, y gobiernan el tráfico de
leucocitos, que es de importancia clave en la linfopoyesis y en la respuesta
inmune. Las moléculas de adhesión se dividen convencionalmente en cinco
grupos basados en su homología estructural: cadherinas, mucinas, integrinas,
selectinas y moléculas de la superfamilia de inmunoglobulmas. Las cadherinas son expresadas en su mayoría en las células epiteliales e interaccionan
con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son proteínas muy
glicosiladas que interactúan principalmente con las selectinas. Los miembros
de la superfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las mmunoglobulínas e interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con
la otra. Las integrinas y las selectinas se discuten ahora.
Integrinas
La familia de moléculas de adhesión de las integrinas (revisadas en Gonzalez-Amaro. 1999) proporciona una unión física crítica entre los elementos
externos a la célula (otras células y el ECM) y los elementos del interior de la
célula (el citoesqueleto, las moléculas intracitosólicas y el núcleo). Cada miembro de la familia de las integrinas está compuesto de un heterodimero de
subunidades a y p unidas no covalentemente (Tabla 39-1). Actualmente,
están completamente descritas las 16 subunidades a y las ocho |1 pudiendo
originar más de 22 combinaciones de heterodímeros. Las 14 principales integrinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de expresión y en la especificidad de ligando.
Las integrinas (i, (las integrinas de la activación final [VLAsJ) se crean por
la asociación de una subunidad de cadena |i, (CD29) con cualquiera de las
subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son expresadas en todas las
células que requieren un firme anclaje al ECM, y en los leucocitos, plaquetas
y algunas células tumorales circulantes.
Las integrinas p , que tienden a ser expresadas principalmente por los leucocitos y las células mieloides, resultan de la asociación de la subunidad de
la cadena p (CD18) con cualquiera de las múltiples subunidades rx Cuando
se combinan con la subunidad a, (CD11a), se forma la integrina p LFA-1
(CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la adhesión leucocitana
al endotelio vascular durante la migración transendotelial. La subunidad de
?
2
Tabla 39-1
Principales integrinas: estructura molecular
e interacción
Interferón-y
El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143
aminoácidos, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las
células T de la replicación viral en cultivos de fibroblastos. Está codificado por
una gen simple que está mapeado en el cromosoma 12. La células T y las
células NK son las únicas fuentes conocidas de IFN. Las células T lo producen en respuesta a la estimulación antigénica o mitogénica, y las células NK
lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16, o en presencia de
macrófagos activados (Carson, 1995).
In vilro, el IFN es un potente estimulador de los macrófagos y aumenta
fuertemente su actividad tumoricida. Origina una regulación a la alta de las
moléculas MHC en muchos tipos celulares incluyendo las APCs. Además,
regula la producción de anticuerpos por las células B (Snapper, 1987). y estimula a las células Thl. En respuesta a la infección, el IFN induce a los macrófagos a matar a los microorganismos intracelulares a través de la producción de metabolitos oxidativos y proteasas. Clínicamente, el IFN se ha
empleado para aumentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que
tienen enfermedades granulomatosas crónicas (Bolinger, 1992). Se ha mostrado poco prometedor como agente antitumoral.
LMN = laminina FBN = tibronectma FBGN • librinogeno. VN = vitronectina.
vWF = factor de von Willebrand. VCAM = molécula de adhesión celular, LFA =
antigeno linfocitico funcional: ICAM= molécula de adhesión mtracelular
CAPÍTULO 39
•
la cadena p en asociación con la subunidad « (CD11b) forma el Mac-1
(CD11b/CD18), una integrina expresada en las células mieloides y en los
fagocitos mononucleares.
Las subunidades a. de las integrinas son proteínas de membrana con 120 a
180 kDa con dominios intracitoplasmáticos cortos, un fragmento extracelular
largo con siete dominios homólogos, y muchos residuos de unión para iones
metales (lugares de adhesión dependientes de iones metales [MIDAS]) que
se cree que funcionan convirtiendo la integrina de una conformación inactiva
a una activa. Tanto la subunidad a como la |i se unen a un ligando, pero se
cree que generalmente la subunidad a proporciona especificidad de ligando.
?
M
Los tallos intracitoplasmáticos de las subunidades de las integrinas a y p
se asocian con los componentes del citoesqueleto para transducir señales
mtracitoplásmicas. En el proceso de transducción de la señal, las integrinas
se asocian e interaccionan con las otras proteínas asociadas a la membrana,
con los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplásmicos
no citoesqueléticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) designada como CD47, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de
las proteínas asociadas a la membrana que a través, sobre todo, de su asociación con las integrinas (5-, puede funcionar como un transductor de señal.
Otras proteínas asociadas a la membrana implicadas en la señalización de
integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que están implicados en la formación de picnosomas de la membrana celular y en la agregación plaquetaria. respectivamente. Las moléculas citosólicas incluyendo la proteína asociada a dominios citoplasmáticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la
compleja actividad de la migración de célula mediada por integrina p,.
Quizás las asociaciones intracítoplasmáticas de las moléculas de integrinas mejor estudiadas son aquellas asociadas con las proteínas del citoesqueleto rx-actinina, talina filamina, vinculina, tensina y paxilina. Estas proteínas del citoesqueleto a través de su asociación con las subunidades de las
integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesqueleto y dirigen la migración
celular, la fagocitosis, la formación de fibras de estrés en los lugares de contacto, la transducción de señal intracelular, y unen las proteínas del citoesqueleto separadas.
2
923
CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
3
El patrón de distribución de las integrinas es amplio, especialmente entre
aquellas integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las células a
los componentes del ECM general como el colágeno y la laminina. Para estas
integrinas que median la unión a los componentes menos ampliamente distribuidos, la distribución tisular está más restringida.
La expresión de las moléculas de integrina depende de la activación celular, y puede estar regulada a la alta o a la baja en respuesta a estímulos específicos del ambiente externo, incluyendo la estimulación local por citocinas o
la interacción inmune. La interacción de las integrinas leucocitarias con las
células endoteliales es crítica para la evolución de las respuestas inflamatoria
e inmune. Además, el trasporte de las células linfoides a sus lugares de residencia y la diseminación intravascular de las metástasis implican similares
interacciones endoteliales mediadas a través de las integrinas de superficie y
otras poblaciones de moléculas de adhesión, las selectinas y sus ligandos.
La extravasación de leucocitos ocurre durante el transporte celular como el
tráfico de las células T y/6 a las placas de Peyer, y como parte de la respuesta
inflamatoria. Ambos procesos implican etapas similares, empleando diferentes moléculas de adhesión. En la inflamación el proceso comienza con la liberación local de citocinas proinflamatorias como el TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y,
que activan el endotelio local para aumentar la expresión en su superficie de
moléculas de adhesión incluyendo miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Además, las células endoteliales liberan
agentes quimiotácticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unión
y un gradiente quimiotáctico soluble reconocible por la transmigración de
células inflamatorias, que las localiza en los focos inflamatorios.
Este proceso para los linfocitos y los eosinófilos (Fig. 39-1) implica: (1) unión
de los leucocitos circulantes a la superficie endotelial principalmente por
las selectinas endoteliles (selectinas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y
(2) movimiento leucocitario {rolling), en donde a través de la expresión rápida secuencial, principalmente de la integrina leucocitaria VLA-4 y u p , la
fuerza de cizallamiento (shean forcé) proporcionada por el torrente sanguíneo
mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endotelial, permitiendo poner
estas integrinas en contacto con sus ligandos endoteliales, el VCAM-1 y el
MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrófilos, el movimiento o
rodamiento está mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, las
moléculas de adhesión celular leucocitarias desencadenan acontecimientos
bioquímicos conduciendo a (3) la activación leucocitaria y a la conversión de
sus integrinas en estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad
de, principalmente, LFA-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesión celular
4
5. M i g r a c i ó n
quimiotáctica
Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del torrente sanguíneo hacia los tejidos está regulado por la interacción de la adhesina de la
superficie del leucocito y de la superficie de la célula endotelial a través de un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, laminación, aplanamiento y transmigración (o diapédesis) cuya dirección la proporciona el gradiente quimiotáctico.
?
924
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario, y
(5) la transmigración leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gradiente quimiotáclico. Es todavía tema de debate si los leucocitos pasan directamente a través de las células endoteliales individuales, o simplemente
pasan entre las células endoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endotelio, la migración celular mediada por integnnas a través de la matriz extracelular por medio de un gradiente quimiotáctico completa el viaje de los leucocitos a los focos de inflamación.
Los estados de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesión
leucocita tipo I) y los defectos congénitos en la expresión de las selectmas
y de los ligandos demuestra el papel indispensable que juegan estos receptores en producir la respuesta inflamatoria y en el tráfico linfocita. En estos
pacientes los neutrófilos son incapaces de salir del torrente sanguíneo y de
migrar a los lugares de inflamación o infección, creando en efecto un estado
de supresión inmune con aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y un neutrofilia periférica paradójica (Bullard, 1996). Los eventos que
acontecen en el choque séptico, en la trombosis, en la lesión de reperfusión
y en las metástasis también requieren la actividad de las integrinas y las
selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo terapéutico de anticuerpos
monoclonales, ligandos de moléculas de adhesión solubles y otras intervenciones, incluyendo los oligonucleóticos antisensibilizantes para superar la
enfermedad mediada por las moléculas de adhesión (Gonzalez-Amaro. 1998:
Buckley. 1997).
Selectinas
La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres proteínas homologas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayoría de los
leucocitos y se cree que juega un importante papel en el transporte o tráfico
de los linfocitos nativos y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacenada en los granulos </ y en los cuerpos de Weibel-Palade de las plaquetas y
de las células endoteliales. respectivamente, y es expresada en la superficie
celular Iras la activación celular. La E-selectina (CD62E) se encuentra en la
superficie de las células endoteliales activadas. Las selectinas interaccionan
con los grupos carbohidrato como el sialil-Lewis" y el sialil-Lewis* y posiblemente con otros ligandos incluyendo las integrinas y los glicolípídos. No se ha
determinado la total extensión de ligandos fisiológicos de las selectinas, pero
se espera que la lista incluya moléculas expresadas en los leucocitos y el
endotelio, ya que las selectinas son importantes para las interacciones leucocito-leucocito y leucocito-endotelio.
El papel de las selectinas es doble: mediar la interacción célula-célula y
contribuir a la activación celular a través de la señalización intracitoplasmática. Al igual que las integrinas, las selectinas son críticas en el contacto y movimiento (rolling) inicial de los leucocitos sobre el endotelio activado
antes de la extravasación. Tras la unión a la forma soluble de la glicoproteina similar a la mucina GlyCAM-1 (un produelo de alta expresión endotelial), la L-selectina es capaz de mediar la activación de las integrinas B, y
su adhesión a la fibronectina. La P y la E selectina también pueden servir
como moléculas receptoras de transducción de señal, ya que producen un
aumento del Ca2+ mtracelular libre en los leucocitos que se adhieren a las
células endoteliales (Huang, 1993).
PERSPECTIVAS
Claramente, muchas de las citoemas y moléculas de adhesión presentadas aquí juegan un papel en los estados de enfermedad. Los médicos esperan que un día se estimule la remisión de las lesiones patológicas mediadas
por citocinas a través de la manipulación tn vivo de los niveles y proporciones de las citocinas pro y antiinflamatorias. Antes de que esto se pueda considerar seriamente, los investigadores y los laboratorios deben continuar
descifrando el lenguaje de las citocinas en las células, y desanoliando y retinando los ensayos significativos de éstas. De momento es posible monitorizar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo para
la sepsis (IL-6). predecir la progresión de la enfermedad (IL-10) y disminuir
los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a través de la monitorización
de los niveles de citocinas seleccionadas y administrando las citocinas apropiadas. En la actualidad, mientras no esté claro, los ensayos clínicos continuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarán finalmente
qué intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente útiles en la
práctica clínica.
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DE HISTOCOMPATIBILIDAD
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936
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO
NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC
936
MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR
936
NOMENCLATURA HLA
937
Localización de los genes del MHC
Herencia
Desequilibrio de unión
Variación étnica
MOLÉCULAS DE CLASE I:
SUBREGIONES HLA-A. -B. -C
Especificidades serológicas y celulares
930
Designaciones alélicas basadas en el ADN
Estructura de las moléculas de clase I
TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
Organización de los genes de clase I
DEL POLIMORFISMO DEL HLA
Regulación de la expresión de los genes de clase I
Tipificación basada en el ADN de los alelos
Función de las moléculas de clase I
de clase I y clase II
Otros genes de clase I
MOLÉCULAS DE CLASE II: SUBREGIONES HLA-DR.
-DQ, -DP
Detección serológica de las moléculas
de clase I y clase II
934
Estructura de las moléculas de clase II
Detección celular de las moléculas de clase II
TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS
Organización de los genes de clase II
Bases genéticas del trasplante
Desequilibrio de unión de los genes en la
Concordancia de histocompatibilidad
región de la clase II
941
Trasplante renal
Regulación de la expresión de los genes de clase II
Trasplante de órganos no renales
Función de las moléculas de clase II
Trasplante alogénico de células
Otros genes de clase II
CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS
ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS
MHC DE CLASE I Y CLASE II
938
progenitoras hematopoyélicas
936
La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de reconocer y responder a una multitud de sustancias extrañas (antígenos). Aunque
este mecanismo de defensa es básico para la supervivencia en un mundo de
microorganismos hostiles, este mismo sistema de defensa tiene un impacto
negativo cuando se trasplantan tejidos de uno a otro individuo o cuando su
mal funcionamiento dispara las reacciones autoagresivas. Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codifican proteínas esenciales en
el reconocimiento inmune: las moléculas de clase I y clase II (Fig 40-1). En
el hombre, las moléculas de clase I incluyen el antigeno leucocitario común
(HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las moléculas de clase II incluyen el HLADR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas moléculas son los clásicos antigenos del trasplante. Otras moléculas codificadas en el MHC son las moléculas de clase III
(véase Cap. 41). Estas incluyen los componentes del complemento ligados al
MHC (C2, C4 y Bl), la 21-hidroxilasa (CYP21), la proteína 70 del golpe de
calor (Hsp70) y el factor de necrosis tumoral (TNF).
RESUMEN
946
BIBLIOGRAFÍA
946
Durante una infección, los microorganismos invasores pueden tanto infectar
como ser ingeridos por las células y entonces ser degradados a fragmentos peptidicos. Dentro de la célula, las moléculas del MHC de clase I o de clase II se
unen a los fragmentos antigénicos derivados de los microorganismos. Una vez
que los fragmentos antigénicos se han unido a las moléculas del MHC y han sido
translocados a la superficie celular, los receptores de los linfocitos T interaccionan con el complejo fragmento antigenico-molécula de MHC, disparando tanto
la respuesta inmune humoral como la celular (Fig. 40-2). Las moléculas de
superficie celular específicas de las células T, CD4 y CD8. actúan para potenciar
esta interacción celular y para transmitir las señales de activación. Otras moléculas de superficie celular actúan para aumentar la afinidad de las interacciones
celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J
y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir las señales coestimuladoras (p.
ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y el CD40 y su ligando, el CD154)
(véase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que especifican las moléculas
928
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Región HLA clase II
Figura 40-1. Mapa del compiejo de genes del MHC en el cromosoma 6. El
HLA-DPB2 en la región HLA clase II
está localizado cerca del centrómero.
El HLA-F es el más leioménco. La región entre el HLA-DRA y el HLA-B no
se muestra. (De The Anthony Nolan
Bone Marrow Trust: www.anthonynolanorg.uk/HlG. con permiso.)
MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unión al antigeno de las
moléculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miembros de las especies. El mismo patrón de interacciones entre el exterior celular y
el complejo MHC clase I o clase ll-antígeno y un linfocito T ocurre no solo en el
reconocimiento de los patógenos invasores, sino también en el reconocimiento
de las moléculas extrañas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconocimiento de los antigenos propios (autoantígenos) (véase Cap. 41).
Ya que las moléculas MHC extrañas de clase I y clase II son reconocidas
como antigenos "de trasplante", es beneficioso garantizar que el donante y el
receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles (es decir. HLA emparejado).
Las moléculas de clase I y clase II tienen múltiples alelos posibles en la población. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo una tarea difícil, que
requiere la colaboración del personal médico, del personal clínico que tipifica
el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes de donantes de
órganos y registros o bancos de donantes de células hematopoyéticas).
cromosomas (es decir, un número haploide) se transmite por cualquiera de
los gametos dados. El doble, o número diploide de cromosomas, se restablece cuando se fusionan los gametos masculino y femenino para formar el cigoto. De este modo, para un rasgo determinado por un gen, siempre habrá cuatro combinaciones genéticas posibles en la descendencia, cada una con una
probabilidad de incidencia igual. Estas leyes de la segregación y de división
aleatoria se aplican a los genes del sistema MHC. Las definiciones para términos genéticos que serán empleados este capítulo se dan a continuación
(Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).
En este capítulo se trata la genética, estructura, lunción, nomenclatura y
las técnicas de detección de los productos génicos del MHC humano, el HLAA, -B y -C (clase I) y el HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). También se discute la
importancia de la concordancia del HLA en el trasplante. Además de las listas
de referencia del final del capitulo, en la Tabla 40-1 se nombran páginas web
útiles que proporcionan tanto material de referencia como actualizaciones de
resúmenes clínicos.
GENÉTICA DEL COMPLEJO MAYOR
DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Genética básica
La primera ley de Mendel, la ley de la segregación, eslá basada en el principio de que los rasgos hereditarios están determinados por factores que
están distribuidos en la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o
genes como ahora se llaman, están presentes en los cromosomas (véase
Cap. 62). Cada gen tiene múltiples formas (esto es. alelos). Como los humanos son diploides. hay dos genes por cada par de cromosomas homólogos.
En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante la formación de los
gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cada par de
Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconocimiento antigénico.
CAPÍTULO 40
Tabla 40-1
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...
929
Sitios web sobre HLA y trasplante
Dirección
Información
www swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm
www wbi.ac.uk/imgi/hla/
Sociedad Amencada para la Histocompatibilidad e inmunogenética. tipificación estándar del HLA
Base de datos de la secuencia HLA, herramientas para la presentación de alelos y para la
manipulación de secuencias
Información de nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud
Taller Internacional de Histocompatibilidad
Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea
Información para el Trasplante de Médula Ósea
Banco de Donantes de Médula Ósea
Asociación Mundial de Donantes de Médula
Registro Internacional de Trasplante de Medula Ósea
Estudio Colaborador de Trasplante
United Network lor Organ Sharing
Instituto de Investigación Nacional del Genoma Humano
www anlhonynolan org uk/hig
www ihwc org o ww ihwg.org
www marrow.org
www.bml.org
wwwbmdw.org
www worldmarrow org
www.ibmtr.org
www.ctstransplant.org
wwwunos.org
www nhgn.nih.gov
Gen El factor unitario de la herencia.
Cromosoma Transportador de los factores unitarios de la herencia.
Locus Posición de un gen en un cromosoma.
Alelo Forma alternativa de un gen en un locus único.
Homocigoto Tener idénticos alelos en un locus, uno en cada cromosoma.
decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por técnicas de biología
molecular incluyendo la clonación génica. la secuenciación de ADN y elecIroforesis en gel con campo pulsátil. La última técnica detecta la presencia
de genes en grandes fragmentos simples de ADN El orden de mapeo de los
genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. -DO. -DP. siendo el HLA-A distal al
centrómero (Fig. 40-1).
Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en cada cromosoma.
Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su efecto
característico igualmente en el heterocigoto.
Genotipo Composición genética de un organismo o individuo.
Fenotipo Características observables producidas por los genes.
Polimórfico Tener dos o más genotipos frecuentes distintos mantenidos en la
población.
Cromosomas homólogos Los dos miembros de un par de cromosomas que
tienen su correspondiente locus génico, uno derivado de cada progenitor.
Entrecruzamiento Cambio de segmentos entre cromosomas homólogos. Este proceso también puede llamarse recombinación.
Alo- (antígeno. injerto) Se refiere a diferencias antigénicas entre individuos
de la misma especie.
Auto- (antígeno, injerto) Se refiere a tejidos o antigenos del mismo individuo
(es decir, propios).
Composición del MHC
El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos está localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb
(kilobases) e incluye 224 locus génicos identificados, de los que 128 está
previsto que se expresen. Se estima que aproximadamente el 40% de los genes expresados tienen una función en el sistema inmune (Aguado. 1999).
Los genes HLA del MHC están localizados en seis subregiones: HLA-A.
HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada subregíón codifica un mínimo de una glucoproteína de superficie celular. Con una única
excepción, los genes del HLA son altamente polimórficos. esto es, cada uno
de los genes del HLA tiene múltiples alelos en la población humana. De
hecho, los genes del HLA son los locus más polimórficos conocidos en el
hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.anthonynolan.org/uk/hig). Debido a
que los genes del HLA especifican moléculas que tienen un papel importante en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo es esencial para la
supervivencia de las especies y para mantenerse en la población por la selección.
Localización de los genes del MHC
Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p)
sobre la base de estudios citogenéticos de cromosomas aberrantes (esto es,
cromosomas que han sufrido una traslocación). El orden y la posición de mapeo de los genes del MHC fue determinada por análisis de unión meiótica (es
Herencia
Los genes del MHC están muy ligados, esto es, se segregan en bloque a
la descendencia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de
cromosomas homólogos y que se segrega en bloque a la descendencia se
denomina "haplotipo". Cada individuo hereda dos haplotipos MHC (uno de
cada progenitor) y por ello tiene dos alelos para cada uno de los genes. Esos
alelos se expresan codominantemente. La herencia de los genes del MHC
sigue las reglas de la segregación definidas por Mendel. En una familia, cada
niño hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro del padre. Por convención, los haplotipos paternos se designan como a y ó y los haplotipos maternos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el descendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo
determinado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los
cuatro genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una familia con cinco hijos, al menos dos de los niños tendrán un HLA idéntico (asumiendo que no hay entrecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de
emparejamiento y de los cuatro posibles genotipos. Aunque los genes del MHC
están muy ligados, hay casos de familias en las que se ha producido un entrecruzamiento (Fig. 40-4). Se pensó en la frecuencia de entrecruzamiento entre
dos genes ligados como medida de la distancia de separación entre los genes;
sin embargo, los datos moleculares han sugerido la existencia de puntos calientes de recombinación en el ADN implicado que puede aumenlar o disminuir la
probabilidad de recombinación durante la meiosis (Uematsu, 1988)
Desequilibrio de unión
La observación de que alelos en diferentes locus genéticos ocurren en la
población en el mismo haplotipo significativamente más frecuentemente de lo
que cabria esperar sobre la base de la posibilidad aislada se denomina desequilibrio de unión. La frecuencia esperada de que ocurran a la vez dos alelos (f 1. f2) es el producto de la frecuencia génica de cada alelo en dicha población ([Lj—u, = f1 x f2]). La frecuencia observada se determina por estudios
familiares en la misma población. El desequilibrio de unión es una caraclerís-
930
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El
ejemplo mejor conocido de desequilibrio de unión es el haplotipo A1, Cw7. B8,
DR17(3), DR52, DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente
cuatro veces más frecuentemente de lo esperado. El significado del desequilibrio de unión como aplicación a la competencia inmune y a la enfermedad se
discute posteriormente en el Capítulo 41 en el apartado Haplotipos extendidos.
Variación étnica
Los datos acumulados del estudio de los grupos de población mundial
(Dausset. 1973; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran
que las frecuencias de los alelos del HLA difieren significativamente entre los
grupos de población étnica. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de
unión de los alelos también difieren. Estas observaciones deben tenerse en
cuenta cuando se desarrollan alotrasplantes de células progenitoras hematopoyéticas de registros y bancos de donantes no relacionados como en el Programa Nacional de Donantes de Médula de los Estados Unidos (NMDP) (Perkins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos dictan el
número de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idéntico no
emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con
tipos raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idénticos no emparentados de entre más de 6 millones de voluntarios listados en todos los registros de donantes mundiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los métodos para el injerto de células progenitoras de donantes parcialmente
HLA-idénticos puede permitir el trasplante en pacientes para los que no se
pueden encontrar combinaciones cercanas (véase Cap. 33).
cación de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series
alélicas. Estas dos series alélicas fueron llamadas la primera o LA (ahora
HLA-A) y la segunda, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres derivaban de la descripción de las series alélicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en
1967 y de las series alélicas 4a, 4b de van Rood en 1969. Un tercer locus fue
propuesto por primera vez en 1970; sin embargo, no se confirmó hasta 1975,
cuando se identificó una familia con recombinación entre el HLA-B y el nuevo
locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el Taller Internacional de
Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibió el Premio Nobel de Medicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA humano.
Estructura de las moléculas de clase I
Las moléculas clásicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en
el hombre, son heterodímeros formados de un polipéptido glicosilado transmembrana (cadena pesada, 44 kDa) asociado no covalentemente con la |3microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5) (Bjorkman, 1990). La cadena pesada de
la molécula de clase I se ancla a la membrana celular y está orientada con
sus aminos terminales en el exterior celular. La p^microglobulina está asociada con la región extracelular de la cadena pesada y es necesaria para la
expresión de la superficie celular.
;
MOLÉCULAS DE CLASE I:
SUBREGIONES HLA-A, -B, -C
Las moléculas HLA-A y -B fueron las primeras moléculas del MHC descritas
en humanos (Dausset, 1981; van Rood, 1993). Ya que estas moléculas fueron
definidas por respuestas de anticuerpos frente a los glóbulos blancos (WBCs),
son denominadas "antígenos" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocitarios fueron observados en humanos muy pronto, en los años 20, pero no fue
hasta los años 50 cuando comenzó el estudio sistemático. En 1952, Dausset
demostró convincentemente la existencia de los anticuerpos leucocitarios (leucoaglutininas). Ya que estas leucoaglutíninas no reaccionan con los leucocitos del
anticuerpo productor pero reaccionan con un porcentaje de leucocitos del grupo
de O de los eritrocitos de individuos no emparentados, sugirió que estas leucoaglutíninas eran aloantjcuerpos. Poco después, Payne (1964) informó de que el
suero de pacientes que tenían reacciones febriles no hemolíticas a la transfusión
de sangre contenia frecuentemente leucoaglutíninas que demostraban la aloespecificidad. En 1958, Dausset describió el primer aloantígeno HLA "MAC* (ahora
HLA-A2+HLA-28) y mostró que estaba genéticamente determinado.
Originalmente, se pensó que las especificidades de leucocito eran producto de un locus simple. Se estableció un modelo de dos locus, cada locus con
múltiples alelos, a través de los estudios HLA en familias mediante la identifi-
Figura 40-5. Modelo esquemático de la estructura de las moléculas de clase I y
clase II.
CAPÍTULO 40
Tabla 40-2
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...
931
Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades) definidos por tipificación serológlca y alelos HLA
definidos por secuenciación d e A D N ' '
A n t í g e n o s HLA-A
A n t í g e n o s HLA-DQ
Alelos' HLA-A
Alelos* HLA-DQ A1
Alelos HLA-DBQI
A1
A2
A203'
A2I0
A3
A9
A10
A11
A19
A23(9)'
A24(9)
A2403
A25(10)
A26(10)
A28
A29(19)
A30(19)
A31(19)
A32(19)
A33(19)
A34(10)
A36
A43
A66(I0)
AG8(?8)
A69(28)
A74(19)
A80
DOI
DQ2
DQ3
DQ4
DQ5(1)
DQ6(I)
DQ7(3)
DQ8(3)
DQ9(3)
A0101-0I04N
A
02011-0230
A
03011-0304
A1101-1105
A2301
A2402101-2420
A2501-2502
A2601-2612
A
2901-2904
A
3001-3007
A
31012-3104
A3201-3203
A3301-3304
A3401-3402
A3601
A4301
AGG01--6603
A68011-'6809
A6901
A7401-7403
A 8001
DOA1
DOB
10501-0504
DOB 1 06011-0615
DQB1
0201-0203
DOB 1 03011-0309
DOB
1'0401-0402
0101-0105
DOA 10201
DOAI03011-0303
DQA 10401
DQA1 05011 - 0505
DOAI06011-06012
Adoptado de www anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh
Cada columna de la tabla es independiente.
Lósatelos HLA-A especilican los antígenos HLA-A. El antigeno A1 se especilica por lósatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfOíNesun alelo nulo o no expresado
• Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLA-DQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por múltiples combinaciones diferentes del DOAI y el
DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y DOB10502
En el pasado las designaciones de la división seroiógica eran dadas a especificidades que parecían identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simple
(p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B3901 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros átelos pueden también codificar anli
genos que llevan estas especificidades serctógicas y Comité de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que se desechen estas divisiones
Los números entre paréntesis indican la vieía especificidad seroiógica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja especificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como
A23 son designaciones correctas
!
1
La región extracelular de la cadena pesada de clase I está dividida en tres
dominios llamados (/.,, u¡ y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos
de aminoácidos. El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosilación en el residuo asparragina en la posición 86. El segmento transmembrana (TM) de aproximadamente 24 aminoácidos es el más hidrofóbico. mientras
que el segmento intracelular carboxiterminal de la molécula está formado
principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de residuos básicos
adyacentes a la superficie citoplásmica (CY) de la membrana celular.
El polimorfismo de las moléculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997.
1999) se define por el empleo de (1) anticuerpos específicos de clase I (anticuerpos aloantisuero y monoclonales) que se unen a las moléculas del HLA: (2)
línfocitos T citotóxícos (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la estimulación in vitro por moléculas de clase I extrañas o alogenicas; (3) imagen isoeléctrica de las moléculas de clase I aisladas: (4) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la tipificación del ADN de los alelos de clase I; y (5)
secuenciación de los nucleótidos de los alelos de clase I. La mayor parte del
polimorfismo de la clase I proviene de las diferencias en las secuencias de aminoácidos encontradas en los dominios ot, y ce, de la cadena pesada. El dominio
(«,es altamente conservado entre las moléculas HLA de clase I.
3
otro a través de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desenta para el dominio de la región constante de la inmunoglobulina. Los dominios a,
y a¡ están unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detiene por dos hélices ct formando una ranura en la parte alta de la molécula. Esta
ranura es el sito para la unión de los fragmentos peptidicos antigénicos por la
molécula de clase I (Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura están formados por cadenas laterales de aminoácidos que componen las hélices y las hojas
plegadas |i Muchos de los aminoácidos que alinean esta ranura son polimórficos. creando diferencias alelo-específicas en la especificidad de unión al antígeno entre los diferentes productos alélicos de clase I (Stern, 1994). Otros residuos
en las regiones helicoidales de la ranura interaccionan con el receptor de células T durante el reconocimiento del complejo clase l-fragmento antigénico por el
linfocito T (véase Fig. 40-2).
Organización de los genes de clase I
Las cadenas pesadas del HLA están codificadas en el MHC en el cromosoma 6 (Fig. 40-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimórficas. mientras que
la IVmicroglobulina está codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que
sea polimórfica en humanos. El gen típico de clase I está codificado por ocho
Nuevas perspectivas en la estructura de la molécula del HLA llegan cuando
exones que corresponden a los segmentos de la molécula recién descrita
se define la estructura tridimensional de la molécula de clase I utilizando crista(Fig. 40-7). El primer exón codifica la región 5 no traducida y el péptido hidrolografía con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porción extracelular se
fóbico líder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelulares: el
muestra en la Figura 40-6A La molécula está formada por dos pares de domiexón 5 codifica la región transmembrana. Los exones sexto y séptimo codifinios estructuralmente similares: el u, tienen la misma conformación terciaria que
can la región citoplasmálica y el exón octavo codifica la región 3' no traduciel it¡, mientras que el u- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones
da incluyendo el lugar de adición poly(A). Las secuencias intermedias (llamaterciarias. Los dominios a, y [5,-microglobulina están formados cada uno por dos
hojas 3 plegadas antiparalelas. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones son transcritas a ácido ribonucleico (ARN) pero
son eliminadas durante el corte y empalme del mensajero (ARNm).
conectadas por un puente disulfuro. Los dominios (t, y ix¡ interaocionan uno con
932
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porción extracelular de la molécula de clase I. B. Vista superior de la misma molécula mostrando
la ranura de unión al péptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class I histocompatibility antigen, HLAA2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)
antigénicos en los linlocilos T (véase Cap. 36). La presentación del antígeno por las moléculas de clase I permite a las células T detectar y crear una
Las moléculas HLA de clase I son expresadas como glucoproteínas transrespuesta citotóxica contra el material extraño (p. ej., un virus o proteínas
membrana en la superficie de muchos tipos celulares. Sin embrago, el nivel de
anormales de células malignas). En el citosol. los antigenos mtracelulares
expresión de superficie puede variar importantemente (Singer, 1990). El nivel
(incluyendo las proteínas propias y las proteínas virales o anormales) son
basal de moléculas de clase I es mayor en las células linfoides; las moléculas
degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptídide clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las
cos son transportados al retículo endoplasmático donde se unen a la ranura
células del cerebro, las células musculares y los espermatozoides. La secuende la parle alta de las recientemente sintetizadas moléculas de clase I y
cia de elementos localizados por encima de los genes de clase I se unen a facentonces son transportadas a la superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen,
tores reguladores que controlan la expresión en la superficie celular de las
1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localizados en la región de clase II del MHC
moléculas de clase I. Durante una respuesta inmune, la expresión en la super(Figs. 40-1 y 40-8), están implicados en este proceso. Dos de estos genes
ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al alza por las citocinas
(LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del proteosoma. una
(p. ej., el interferón-Y y el TNF) uniéndose a los elementos reguladores supeestructura macromolecular que degrada las proteínas en el cilosol (Tanaka,
riores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana
1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los
[VIH]) pueden suprimir la expresión de clase I (Brodsky, 1999).
transportadores peptidicos que mueven los péptidos del citosol al retículo
endoplasmático (Momburg, 1998).
Regulación de la expresión de los genes de clase I
Función de las moléculas de clase I
Las moléculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmune. Primero, en la respuesta inmune adaptaliva, las moléculas de clase I se
unen a péptidos derivados de proteínas sintetizadas en el citosol y las presenta en la superficie celular para que sean reconocidas por los receptores
Los LTC CD8+ reconocen el péptido procesado en conjunto con la molécula de clase I (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para
determinar este mecanismo, los LTCs fueron generados por la estimulación in
vitro con células autólogas infectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de
la célula diana fue específica para cada cepa de virus preparada. El recono-
CAPÍTULO 40
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...
933
Figura 40-8. Mapa de la región de clase II del MHC humano. Los producios génicos codificados por cada región se nombran debajo No están
incluidos lodos los genes.
cimiento también estaba afectado por el polimorfismo alélico de las moléculas
de clase I. ya que sólo las células diana infectadas viralmente que compartían
el producto(s) alélico de clase I apropiado con el que respondía fueron Usadas
(Zmkemagel. 1997a. 1997b). El último requerimiento se denomina "restricción
MHC". Znkernagel y su colaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de
Medicina en 1996 en reconocimiento a la importancia del concepto de la restricción MHC en la inmunología.
Segundo, la molécula de clase I tiene una función protectora en la respuesta inmune innata previniendo la lisis de la célula diana efectuada por las
células asesinas naturales (NK). A diferencia de los LTC. las células NK no
requieren la activación a través del reconocimiento de péptidos unidos a la
molécula de clase I sino que pueden lisar y destruir las células diana que han
perdido la expresión de la molécula del HLA clase I clásica en la superficie
celular. A través de este mecanismo innato, las células NK juegan un importante papel en la supervivencia frente a los virus y a las células tumorales quo
regulan a la baja la expresión de la molécula de clase I para evitar el reconocimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).
taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homólogos a los
genes de la clase I clásica en estructura y los polipéplidos codificados por
estos locus también se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual
que un nivel alto de polimorfismo alélico es un marcador de los locus del HLAA, HLA-B y HLA-C, un nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F
y HLA-G es una característica definitoria de estos genes. Además, en comparación con las moléculas de clase I clásicas, la expresión en la superficie celular de moléculas de clase I no clásicas es baja y la distribución de estas moléculas de clase Ib en los tipos celulares especilicos varia.
HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las células extravellositarias del citotrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega
un papel en la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como
ligando para al menos tres NK y otros receptores de inhibición celular, protege
el tejido placentano de la acción citolitica de las células NK. Aunque el HLA-G
tiene la capacidad de unirse y presentar el antígeno procesado (es decir, péptidos) a las células T, la diversidad de péptidos unidos parece ser menor que
la diversidad de péptidos unidos por las moléculas de clase I clásica. La reguHay dos grupos de receptores de NK: (1) el receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lación de la expresión del HLA-G también difiere de la de los genes de clase I
cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los receptores de célula aseclasicos, ya que el gen no contiene una señal de respuesta al interierón; por
sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del cromosoma
ello, no es interierón mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA-G son
19. La función de las células NK parece ser regulada por un equilibrio entre los
unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unión a la
receptores de señal positivos que inician y los receptores inhibidores que
membrana y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las forsuprimen la activación celular. Ambos grupos de receptores reconocen los
mas solubles pueden actuar como inmunosupresores específicos durante el
ligandos HLA de clase I. Por ejemplo, los receptores KIR2D diferencian entre
embarazo (Le Bouteiller, 1999).
los ligandos del HLA-C basándose en la presencia de residuos de aminoácidos específicos en los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80).
HLA-E. El HLA-E puede jugar un papel en la protección de la célula diana
Otro receptor de NK. el KIR3D. reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6
de la lisis mediada por la célula NK. Las moléculas de HLA-E se unen a un
(Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2. reconoce la molécula de
grupo de péptidos hidrolóbicos bastante idénticos derivados de las secuencias
HLA-E en complejo con el péptido líder HLA de algunos de los productos alélider de las cadenas pesadas de la clase I clásica y del HLA-G. El HLA-E prelieos de las moléculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999).
Las células NK pueden reconocer específicamente y lisar células alogénicas que no expresan las moléculas específicas de clase I expresadas por la
célula efeclora (i.e.. "pérdida de lo propio") (Valíante, 1997). Esto puede ocurrir potencialmente incluso en pares de trasplantes aparentemente HLA idénticos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es heterocigótico (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las células NK Bw4
específicas del donante pueden lisar las células sin Bw4 del receptor en un
injerto de progenitor celular hematopoyético. Esta respuesta puede ser unidireccional en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna
molécula HLA presente en el receptor, por ello, las células NK del receptor no
detectan ninguna pérdida de lo propio. Ya que las células NK son relativamente radiorresistentes y comprenden una subpoblación de alrededor del
10% al 15% de los lintocitos de sangre periférica, la respuesta NK puede ser
sustancial: sin embargo, no se conoce hasta el momento el papel absoluto de
la actividad NK en la alectación al trasplante (Ruggeri, 1999).
A2 + B17
A2 - A69
Otros genes de clase I
Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clásicos o de clase Ib
en la región de clase I del cromosoma 6p por clonación de genes (Aguado.
1999) Muchos de estos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y
expresan ARNm de tipo clase I y/o moléculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas
moléculas pueden ser mediadores clave tanto en la respues'a inmune adap-
Figura 40-9. Vista superior de la molécula de clase I con sus residuos aminoácidos
polimórticos indicados por las especificidades Bw4 y Bw6 y las especificidades de
reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 + B17. (Modificado de Parham P. y
col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m peplide-bindmg. proteins. En Dupont
B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 New York. Springer-Verag. 1989, pág. 17.
con permiso.)
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SeccióN V
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INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
senta estos péptidos de unión a la superficie celular para el reconocimiento
por las células NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la vía de
presentación antígénica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos
cutáneos en modelos de ratones transgénicos sugieren que el HLA-E puede
ser reconocido como un antígeno de trasplante (Pacasova. 1999).
HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelos por ordenador
predicen que ciertos residuos de aminoácidos del HLA-F pueden contribuir a
una unión del péptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en la presentación antigénica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresión del HLA-F
en la superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.
MOLÉCULAS DE CLASE il:
SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP
Las moléculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez
por su capacidad para estimular a las células T alogénicas en los cultivos
mixtos de leucocitos (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975, los CML fueron empleados para definir las series alélicas del
HLA-D (Thorsby, 1975). Ya que los cullivos mixtos de leucocitos requieren
siete días antes de que se puedan obtener los resultados, se buscó una
detección serológica rápida del HLA-D. En 1975, se determinó que el aloantisuero contenía anticuerpos reactivos con las moléculas muy asociadas con
las especificidades previamente identificadas como HLA-D por técnicas
celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1977, estas especificidades serológicas fueron denominadas DR,
de especificidades D relacionadas, ya que se observó que el HLA-D y el
HLA-DR estaban asociados pero no eran idénticos el uno al otro. Los test
serológicos desarrollados con estudios genéticos e inmunoquimicos identificaron moléculas adicionales de clase II. el DR52, el DR53, el DR51 y el DQ.
Las técnicas celulares identificaron aún otra molécula de clase II a finales de
los años 70 (Shaw, 1981). Esta molécula (ahora llamada HLA-DP) fue descrita inicialmente como un antígeno secundario de la célula B (SB) ya que
normalmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requería una
segunda fase de estimulación en el cultivo para la detección. Posteriormente, se siguió con la caracterización de las secuencias codificantes del ADN y
las localizaciones de estos genes en el MHC empleando técnicas de biología molecular (Beck, 1999).
Estructura de las moléculas de clase II
Las moléculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodímeros formados por dos glicoproteínas transmembrana no asociadas covalentemente, la cadena a (33 a 35 kDa) y la cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5)
(Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptídicas atraviesan la membrana
celular y están orientadas con sus amino-terminales hacia el exterior celular. Las regiones extracelulares de los polipéptidos u y |3 están divididas
cada una en dos dominios, denominados a, y a¡ y P, y P , y cada dominio
contiene aproximadamente 90 residuos aminoácidos. La cadena a tiene
dos grupos carbohidrato, uno rico en mañosa y un complejo tipo glicano,
en los aminoácidos 78 y 118, respectivamente. Las cadenas p tienen un
complejo tipo oligosacárido en el aminoácido 19. Los dominios amino-terminales (/., y p, de las cadenas a y p contienen los residuos polimórficos,
mientras que los dominios de membrana proximales a¡ y p son altamente conservados y son homólogos a los dominios de la región constante de
la inmunoglobulina. Una región de aproximadamente 12 aminoácidos de
tamaño conecta el segundo dominio extracelular a la región hidrofóbica
transmembrana (23 aminoácidos) y al pequeño dominio intracitoplasmático
(8 a 15 aminoácidos).
2
2
Basándose en la cristalografía, la molécula de clase II es similar en estructura a la molécula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molécula de
clase II, los dominios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 plegada de ocho filamentos unida a dos hélices u para formar la ranura de unión
al antígeno en la parte alta de la molécula. Los dominios a? y p forman cada
uno dos cadenas p plegadas antiparalelas que soportan la ranura en la parte
?
alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminoácidos que alinean la
ranura de unión al péptido antigénico son polimórficos, creando diferentes
especificidades de unión al péptido para los diferentes productos alélicos de
clase II.
Al igual que las moléculas de clase I, las moléculas de clase II son altamente polimórficas (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de
clase II está definido por 1) anticuerpos especificos de clase II (anticuerpos
aloantisuero y monoclonales), que se unen a las moléculas de clase II; 2)
células T aloproliferativas que reconocen y proliferan in vitro en respuesta a
moléculas extrañas de clase II; 3) electroforesis en gel bidimensional de
moléculas de clase II aisladas; 4) hibridación por endonucleasa que difiere el
ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas especificas de
locus (una técnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos de
restricción [RFLPIJ; 5) tipificación del ADN basada en PCR de los alelos de
clase II: y 6) secuenciación de nucleótidos de los genes de clase II. La mayor
parte del polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de aminoácidos localizados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptídicas.
Organización de los genes de clase II
En contraste con las moléculas de clase I, tanto la cadena u como la P de
las moléculas de clase II están codificadas en una sección de 1100-kb de la
región MHC (Figs. 40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La región de clase II incluye tres
subregiones -DR, DQ y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen
expresado A (codificando una cadena «) y uno B (codificando una cadena [}).
Las comparaciones de secuencias sugieren que ambos genes de clase I y de
clase II surgen de sucesivas seríes de duplicaciones génicas durante la evolución de este complejo génico. La duplicación original en la región de clase
II origina con mayor probabilidad los genes A y B primordiales. Duplicaciones
génicas más recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que contienen
múltiples genes.
Un gen A típico contiene cinco exones codificando: 1) la región 5' aminoterminal no traducida y la secuencia líder; 2) el dominio a,; 3) el dominio tt¿
4) el péptido de conexión, la región transmembrana, el residuo citoplasmático, y una porción de la región 3' no traducida; y 5) el resto de la región 3' no
traducida incluyendo la señal de adición poly(A). Un gen típico de cadena |3
es similar al gen de la cadena a pero tiene un exón extra para el residuo citoplasmático.
Subregión DR La subregión DR codifica una o dos moléculas DR. dependiendo del haplotipo (Bodmer. 1997. 1999). La subregión contiene un gen
simple expresado DRA que es similar en diferentes haplotipos difiriendo solo
en la sustitución de un aminoácido simple conservativo en el dominio citoplasmático.
El gen más centromérico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), codifica una cadena p altamente polimórfica que, cuando se asocia con la cadena a, exhibe especificidades serológicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molécula es la
molécula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al
menos más de la mitad de la superficie celular total de las moléculas de clase
II. Hay múltiples ácidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de
aminoácidos entre los alelos DRB1.
El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplotipos de
clase II, está localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8). En
CAPÍTULO 40
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ANTÍGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..
935
Desequilibrio de unión de los genes
de la región de clase II
Las combinaciones específicas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4.
DRB1/DRB5y DOA1/DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas
del DQA1/DQB1 pueden controlarse en parte por la capacidad de las cadenas
a y |i de aparearse (Kwok. 1993). Además, ciertos alelos DR y DQ son heredados conjuntamente más frecuentemente de lo esperado, originando un desequilibrio de unión en la población. La frecuencia de estas combinaciones difiere importantemente entre los diferentes grupos étnicos de la población. Por
ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1¡yel
DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las
poblaciones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combinaciones DR-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de
caucásicos. El entrecruzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente.
Por ello, hay un mínimo desequilibrio de unión entre los alelos DR/DO y los
DP. Se han publicado las listas de los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuentes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)
Regulación de la expresión
de los genes de clase II
Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\
las células que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el
segundo gen DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a
continuación). El gen DRB3 es polimórfico, aunque hasta el momento el
número de alelos identificados es aproximadamente 10 veces menor que el
número de alelos DRB1. El producto del DRB3 se combina con el producto DRA para formar la molécula DR, que transporta la especificidad serológica del DR52 (Tabla 40-3). En las células que expresan los alelos DRB1
•4, 7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4
combinado con el producto DRA forma la molécula que trasporta la especificidad serológica del Df?53 (Tabla 40-3). Finalmente, en las células que
expresan los alelos DRBV15 y '16. el segundo gen DRB es denominado
DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto DRA transporta la
especificidad serológica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos que expresan los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segundo locus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por
ejemplo, se ha descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus
DRB5 (Wade. 1993).
Subregión DO. Un grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el
heterodímero DO que transporta la especificidad serológica DQ1-9 (Tablas
40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodmer, 1997, 1999). Las moléculas DO representan aproximadamente del 15% al 20% del total de moléculas de clase II
expresadas en la superficie celular. Los locus del DOAJ y del DQB1 son
polimórficos y debido a que sus productos proteicos pueden asociarse tanto
en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente cuatro moléculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oíros
genes A y B tipo DQ en la subregión DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy
similares a los genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna proteína funcional.
Subregión DP. La subregión DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla
40-3 y Fig. 40-8). Un grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico
DP; el otro grupo está constituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como
el DPB1 son altamente polimórficos (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresión
del DP en la superficie celular es muy pequeño.
Las moléculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutivamente en las células presentadoras de antígenos (APCs) del sistema inmune incluyendo los monocitos, los macrófagos, las células dendrilicas y los
linlocitos B. Las secuencias de ADN encontradas por encima de las secuencias codificantes de los genes de clase II son criticas para la expresión. La
unión de las proteínas a estas regiones regula la expresión de los genes de
clase II. Las alteraciones en la capacidad de las proteínas de unión al ADN
de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que eliminan la
expresión de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denominada "síndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes
de clase II son inducibles por el interferón-y (IFN-y) en muchos tipos de células (Mach, 1996; Glimcher, 1992) y la expresión puede afectarse por otras
citocinas (véase Cap. 39) (Guardiola, 1993). La expresión de moléculas de
clase II en las APCs puede modularse, particularmente en las células dendríticas, tras el depósito antigénico y la inflamación. El nivel de expresión del
complejo antígeno peptídico-clase II asi como la presencia de una señal
coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel en el
trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau.
1998) (véase Cap. 41).
Función de las moléculas de clase II
Las moléculas de clase II actúan como receptores antigénicos en la respuesta inmune (Fig. 40-2), uniéndose a fragmentos peptidicos antigénicos
procesados de antígenos exógenos como las bacterias. Los antígenos exógenos entran en la células a través de la vía de endocitosis y son degradados en fragmentos peptidicos en los últimos endosomas donde se encuentran y se unen a las nuevas moléculas de clase II ensambladas (Watts, 1997).
La unión de los fragmentos proteicos procesados a las moléculas de clase II
se facilita por dos proteínas codificadas en la región de clase II del MHC. la
DM y la DO (Fig. 40-8). El péptido de unión está afectado por residuos polimórficos localizados en la ranura de la molécula de clase II. El complejo del
fragmento antigénico unido a la molécula de clase II es transportado entonces a la superficie celular para su presentación y reconocimiento por las células T circulantes.
Los receptores antigénicos de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el
complejo clase ll-fragmento antigénico disparando la activación de la células
(Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para dilucidar este
mecanismo, los linlocitos T electores fueron estimulados in vitro con APCs
autólogas previamente incubadas con el antígeno. Como se observó para la
clase I, el reconocimiento del fragmento antigénico por las células T electoras
está influenciado por el polimorfismo alélico del MHC. La célula T efectora es
especifica para el péptido antigénico promotor en conjunción con el producto
alélico particular de clase II que originalmente presentó el antigeno (restricción
MHC) (Rosenthal. 1973).
936
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
Cada célula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento
antigénico unido a la molécula de clase II puede desenpeñar una o varias funciones (Paul, 1994), La célula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a diferenciarse a células plasmáticas productoras de anticuerpo, o puede ayudar a
otros linfocitos T a diferenciarse a células citotóxicas o células con función
supresora. Además, la célula T puede por sí misma funcionar como célula citotóxica, matando directamente células con la diana apropiada (p.ej.. células que
expresan complejos de moléculas de MHC de clase II con el antígeno específico), o como célula con función supresora, originando un debilitamiento de la
respuesta inmune. Las células T también producen un número de moléculas
biológicamente importantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmune e incrementan la expresión de moléculas de MHC en las células diana. Además, las células T producen factores de crecimiento como la interleucina-2 (IL2). Estos factores de crecimiento afectan a un amplio rango de células de las
células progenitoras hematopoyéticas para madurar a linfocitos.
Otros genes de clase II
motivo peptídico se unen a la molécula de MHC en los bolsillos que se encuentran en la ranura de unión al antígeno (Stern. 1994). Los aminoácidos
polimórficos de las moléculas de MHC rodean esta ranura y crean asi diferencias en las especificidades de unión a los péptidos para las diferentes moléculas del MHC.
Los péptidos unidos a las moléculas de clase I tienen una longitud de 9 a
10 aminoácidos. Tanto los extremos carboxi- como aminoterminal del péptidos son atrapados en la ranura de unión de clase I formando un complejo
péptido-MHC "cerrado". Los péptidos unidos a las moléculas de clase II varían en longitud de 12 a 30 aminoácidos. A la vez que mantienen requerimiento para los residuos específicos que se encuentran la porción central del
péptido. tanto los extremos carboxi- como amino-terminal del péptido se extienden fuera de la ranura de unión de clase II formando un complejo péptidoMHC "abierto" (Stern, 1994).
RECONOCIMIENTO DE LAS MOLÉCULAS
MHC EXTRAÑAS
Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB.
DMA y DMB. que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las proteínas
codificadas por los genes DMA y DMB forman el heterodímero DM. Las proteínas codificada por los genes DOA y DOB forman el heterodímero DO. Estos productos génicos no son detectados en la superficie celular pero son
expresados posteriormente dentro de la célula, localizados en compartimentos intracelulares especializados donde las nuevas moléculas de clase II sintetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus péptidos antigénicos. La molécula
DM regula la unión al péptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una lunción de
tipo acompañante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentación de
los péptidos estables unidos. La molécula DO regula negativamente la función del DM (van Ham, 1997).
CARACTERÍSTICAS DE LOS FRAGMENTOS
ANTIGÉNICOS UNIDOS POR LAS MOLÉCULAS MHC
DE CLASE I Y CLASE II
La función de las moléculas de clase I y clase II como receptores de
unión a antigenos es similar; sin embargo, los péptidos que unen tienen
diferentes caracteristicas (Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los péptidos
derivados de las proteínas sintetizadas de novo en la célula (antigenos
endógenos como los antígenos virales), se asocian con las moléculas de
clase I en el retículo endoplasmático. En contraste, los péptidos de los antígenos solubles y particulados captados por la célula por la vía de la endocitosis (antigenos exógenos) se unen con las moléculas de clase II en el
compartimento endosomal. Tanto las moléculas de clase I como las de clase
II pueden unirse alternativamente a péptidos propios encontrados en estos
compartimentos. Los péptidos surgen de la degradación normal de las proteínas celulares. Algunos de estos péptidos propios son fragmentos de las
propias moléculas de histocompatibilidad. Normalmente, los péptidos propios unidos a las moléculas del MHC no activan a los linfocitos T. ya que son
moléculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Esos péptidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando
un proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 )
(véanse Caps. 43-45).
La unión del péptido a las moléculas del MHC ocurre solo cuando el fragmento peptídico es de un tamaño adecuado y contiene una secuencia particular de aminoácidos o un motivo que le permite unirse a una o más moléculas del MHC expresadas en dicho individuo. Un ejemplo de un motivo para un
péptido que se une a la molécula del HLA codificada por el A'0201 es la leucina (o metionina o isoleucina) en el residuo 2 del péptido. un aminoácido
hidrofílico en el residuo 3, y una valina (o leucina o isoleucina o alanina) en el
residuo 9. Los aminoácidos que forman el motivo se denominan residuos de
"anclaje" del péptido. Las diferentes moléculas del HLA. ya sean las moléculas codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '0211. o
'0301) o las moléculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406)
se unen a péptidos con diferentes motivos. Los aminoácidos que forman el
El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una
molécula de MHC extraña en una célula por un segundo individuo (alogénico). Una vez reconocido, la interacción dispara una serie de acontecimientos
originando la activación de la células T y la iniciación de una respuesta inmune no muy diferente al reconocimiento de los patógenos (véase Cap. 36).
Basándose en los datos de los modelos de trasplante de órganos vascularizados, se han propuesto dos vías de alo-reconocimiento (Sayegh. 1996). La
vía directa para el alo-reconocimiento implica la estimulación de las células T
receptoras por un complejo MHC-péptido del donante (es decir, reconocimiento directo de las moléculas MHC extrañas intactas). La segunda ruta de
alo-reconocimiento, la vía indirecta, implica la estimulación de las células T
receptoras por las moléculas de MHC propias a través de la presentación de
los fragmentos peptídicos de las células donante. La presentación indirecta
ocurre cuando las células presentadoras de antigenos del receptor ingieren
material celular del tejido injertado, degradan el material intracelularmente. y
presentan el péptido(s) alogénico en complejo con las moléculas de MHC propias. Los péptidos derivados de las regiones polimórficas de las moléculas
MHC del donante son los principales candidatos para la estimulación de la
respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).
REPETICIÓN EN TÁNDEM Y POLIMORFISMO
NUCLEÓTIDO SIMPLE EN EL MHC
Más de 300 repeticiones en tándem cortas (STRs) han sido identificadas
en la región MHC humana (Foissac, 1997). También están presentes múltiples polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs). Un estudio de Abbal
(1997) examinó seis locus STR en el MHC en una población de individuos no
relacionados y encontró un fuerte desequilibrio de unión entre los haplotipos
HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcadores cubren
una región del MHC mayor que los marcadores del HLA clásico empleados
ahora, pueden proporcionar una aproximación más amplia para identificar a
los individuos MHC idénticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser
utilizados para identificar un haplotipo MHC recombinante en una familia
(Carrington, 1996) y aumentar la probabilidad de encontrar genes de histocompatibilidad del MHC apareados. Se han desarrollado métodos moleculares seguros y reproducibles para identificar tanto las STR como las SNP
(Carrington, 1998).
MOLÉCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR
Los antígenos de histocompatibilidad menor (mHag) son péptidos inmunogenéticos que se unen a las moléculas de MHC y pueden ser reconocidos por
las células T. En las células progenitoras de injertos MHC idénticos, se puede
inducir una enfermedad injerto contra huésped (EICH) por las diferencias
CAPÍTULO 40
Tabla 40-4
•
937
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
G e n e s H menores y sus epítopos e n las células T
M o l é c u l a s de r e s t r i c c i ó n
mHag
Secuencia p e p t í d i c a
HLA-B7
HLA-A2.1
HLA-A1
HLA-B60
HLA-A2.1
HLA-A2.1
H-Y
H-Y
H-Y
H-Y
H-A-2
H-A-1"
H-A-1"
SPSVDKAPAEL"
FIDSYICQV
IVDCLTEMY
Desconocido
YIGEVSVSV
VLHDDLEA
VLRDDLLEA
" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el
cromosoma Y
• Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fila
mentos
Tres ag menores están en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero esta
tabla completa nos la proporcionó Els Goulmy No esta publicada y fue usada
por la autora en su charla en el ASHI. Comunicación personal de Goulmy
(2000)
entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser
cualquier producto génico polimórfico codificado fuera del MHC que difiriera
entre el donante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy,
1997; Simpson, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como
otras proteínas antigénicas, las proteínas polimórficas deben ser procesadas
en fragmentos antigénicos y el fragmento(s) peptidico polimórfico debe unirse con la ranura de las moléculas del MHC. Debido al requerimiento para la
presentación antigémca por las moléculas del MHC, cualquier péptido polimódico debe transportar un motivo apropiado de unión específica al MHC.
Por ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las
mHag incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor.
Muchas mHag son presentadas a las células T CD8+ por las moléculas MHC
de clase I. Las respuestas de las células T son iniciadas cuando el receptor
de célula T reconoce los complejos formados por los péptidos polímórticos de
las mHag unidos a las moléculas de MHC expresadas en las APC.
Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de injerto cutáneo
y por ensayos citotóxícos con clones de células T. Estos péptidos polimórficos
tienen una unión restringida a las moléculas MHC de clase I, de modo que la
definición bioquímica de los componentes del péptido antigénico de histocompatibilidad menor fue determinada por la elución, purificación y secuenciación del péptido del mHag unido a una molécula del MHC especifica (den
Haan 1995). Estudios recientes han demostrado el significado potencial de
las mHag en el trasplante clínico (Goulmy, 1997.1996; Martin. 1997: Dupont.
1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad específica para las
mHag en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del receptor para
una mHag (HA-1) se asoció con un aumento del riesgo de EICH tras el trasplante de médula ósea empleando donantes hermanos genotípicamenle HLA
idénticos La importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3.
HA-4, HA-5, H- Y) está menos clara. Se han desarrollado técnicas basadas
en el ADN para detectar diferencias en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998)
y se han empleado en estudios para medir el impacto de estas disparidades
en los resultados del trasplante.
NOMENCLATURA HLA
Especificidades serológicas y celulares
La terminología HLA está designada por el Comité de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999.
1997). Históricamente, las especificidades serológicas y celulares definidas
localizadas en las moléculas proteicas del HLA fueron asignadas en base a
los resultados de los talleres internacionales durante los cuales los reactivos
de tipificación fueron intercambiados entre los laboratorios participantes (sitio
web del Taller Internacional de Histocompatibilidad. 13 edición, Tabla 40-1).
Las asignaciones incluyen el nombre de la molécula de HLA y una designación numérica basada en el orden en que su especificidad serológica fue definida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especificidad HLA-A
asignada y el HLA-A80 fue la más reciente. A lo largo del tiempo las especificidades definidas serológicamente lueron "divididas" a medida que la defini4
ción se hizo más discriminatoria. La definición más corta de la especificidad
es llamada la especificidad subtípica o privada. Las especificidades extensas
y compartidas se denominan especificidades supertípicas. Por ejemplo, el
B44 y el B45 son especificidades subtipicas de la especificidad supertipica
B12 Por ello, una célula que es tanto B44+ como B45+ también debería ser
positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera ejemplos de los equivalentes
supertipicos para las "divisiones"
En los tests serológicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un producto alélico del HLA. un fenómeno denominado reactividad cruzada. Esta
reactividad cruzada serológica entre los productos alélicos de los locus HLA-A
y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se ha empleado para agrupar
moléculas en grupos antigénicos de reactividad cruzada (CREG) (Rodey,
1987). Las moléculas de clase I en un CREG comparten uno o más determinantes que no son compartidos por moléculas de otro CREG En la Tabla 40-6
se enumeran ejemplos de CREG. Un determinante antigénico (epítopo) compartido entre los miembros de un CREG se denomina especificidad pública.
Parte de la reactividad del CREG puede explicarse porque se comparten
secuencias de aminoácidos entre las moléculas HLA en un CREG (Terasaki.
1992) La inclusión de especificidades HLA en un CREG no está estandarizada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un único patrón de
reacción y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes
pueden identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los
grupos CREG se solapan considerablemente (Ellison. 1994).
Las especificidades HLA-Bw4 y Bw6 son epitopos amplios, públicos, que
residen en la misma molécula como las especificidades subtipicas del locus
HLA-B. pero están en lugares diferentes. Por ello el Bw4 y el Bw6 son un sistema dialélico. y todas las moléculas del locus В (y algunas del locus A) trans­
portan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La región de la molécula del
HLA que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en la
hélice (/.. entre los residuos aminoácidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Parham. 1991).
Las especificidades serológicas designadas por la OMS. localizadas en las
moléculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas como se describió
para las moléculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Originalmente se definieron por técnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las moléculas HLA-DP de clase II no se delinen adecuadamente por serologia.
Hay 26 especificidades del HLA-D que fueron identificadas en cultivos mixtos de leucocitos. Todas las especificidades HLA-D mantienen la designación
Tabla 40-5
Ejemplos de divisiones* serológicas
Especificidades originales amplias
Divisiones
A9
A10
A19
A28
B5
B12
B14
B15
B16
B17
B21
B22
B40
B70
DR2
DR3
DR5
DR6
DQ1
DQ3
A23.A24
A25.A26,A34,A66
A29.A30.A31. A32. A33. A74
A68.A69
B51.B52
B44.B45
B64.B65
B62.B63.B75.B76.B77
B38.B39
B57.B58
B49.B50.B4005
B54.B55.B56
B60.B61
B71.B72
DR15.DR16
DR17.DR18
DR11.DR12
DR13.DR14
DQ5.DQ6
D07.D08.D09
• En el pasado, las designaciones de divisiones serológicas eran dadas a especilicidades que parecían idcnlilicar el antígeno especilico por un alelo HLA simple (p ei. A2 se dividía en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en
B390I y B3902) Ahora se reconoce que otros alelos también pueden codilicar
antigenos que llevan estas especificidades serológicas y el Comité de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que no se hagan estas divisiones
Datos de Bodmer (1997)
938
SECCIÓN V
Tabla 40-6
B5C
B07C
B08C
B12C
B21C
Bw4
Bw6
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
C R E G y antígenos a s o c i a d o s
Antígenos asociados
Creg
A01C
A10C
A02C
•
Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80
A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A43, A66, A74
A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403,
B17, B57. B58
B5. B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103
B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42. B47, B48, B54,
B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703
B8, B14. BI6, B18, B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901.
B3902
B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45, B47, B49. B50.
B60. B61. B400b
B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52. B53.
B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77.
B78, B4005, B5102. B5103
A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38.
B44, B47, B49, B51. B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77
A2403. B5102, B5103
B7. B8. B14, B18. B22. B35 B39. B40, B41. B42, B45.
B48. B50,
B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B70, B71,
B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902.
B4005
Datos de Ellison (1994).
V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medición de la estimulación de la célula que responde. La estimulación se genera
por diferencias en las moléculas DR expresadas en las células estimuladoras
y. en menor medida, por estimulación adicional por las moléculas DQ y DP.
tificó una única especificidad serológica, al antígeno DR determinado por el
DRBV10103 se le dio la designación serológica DR103. El tercer y cuarto
número en la designación alélica se refieren al orden en que el alelo fue descrito. Por ejemplo, el A'0201 fue el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203
fue el tercero.
Algunos alelos pueden diferir en la secuencia de ADN de sus regiones
codificantes pero su secuencia de aminoácidos predecida no difiere (a menudo llamada sustitución imperceptible o sinonímica). Estas combinaciones de
alelos son identificadas por designaciones de cinco dígitos. Los primeros
cuatro números son compartidos, mientras que el quinto dígito se utiliza para
distinguir las secuencias de ácido nucleico únicas de los alelos (p. ej.,
B'27051 y B'27052). Además, dos o más alelos pueden tener un nombre de
siete dígitos en el que se comparten los primeros cuatro dígitos (p. ej.,
DRB4'0103101 y DRB4'0103102). Los dígitos cinco a siete indican que los
dos alelos difieren sólo fuera de la región codificante de la proteina. En el
ejemplo nombrado aquí, la diferencia afecta al lugar del empalme del ARN
del DRB4'0103102 originando la pérdida de la expresión del alelo (Sutton,
1989). Finalmente, los alelos que no son expresados como proteínas en la
superficie celular pueden tener añadida una Na sus nombres (p. ej„ A'0215N,
DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Ya que cada alelo tiene una única
designación numérica, la designación N no se escribe siempre (i.e., A'0215
y A'0215N son el mismo alelo).
Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituales del Comité de
Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/
nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucleótidos de todos los
alelos están depositadas en un banco de datos computerizado (bases de datos GenBank. EMBL, IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, más de 140
alelos HLA-A designados. Continuamente se están identificando nuevos alelos y puede accederse a ellos a través del sitio web.
Designaciones alélicas basadas en el ADN
Se ha utilizado la secuenciación de nucleótidos para identificar los muchos
alelos diferentes que codifican las moléculas HLA. Actualmente, la especificidad simple serológicamente definida puede residir en dos o más de 25 productos alélicos diferentes (Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el
nombre del locus génico seguido por un asterisco y un número de cuatro a
siete dígitos que indica el alelo. Por ejemplo, el A"0221 es un alelo del gen
HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el DPBV0101 es un alelo del
gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA1.
Los primeros dos números en la designación numérica de cada alelo se
basan frecuentemente en el tipo serológico de la molécula resultante y/o de
la secuencia nucleotídíca similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la
molécula de HLA-A expresada por el alelo A'0201 porta la especificidad serológica A2 definiendo el antígeno HLA-A2. Sin embargo, la molécula de HLA-B
expresada por el alelo B'1510 no tiene la especificidad serológica asociada al
B15 pero porta la especificidad serológica que define al antígeno B71. Se
designó B'1510 por su secuencia de aminoácidos prevista similar a los antigenos B15. Las células que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serológicamente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciación de nucleótidos identificó un alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan
la especificidad serológica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de
este alelo se basó en su similitud estructural. Cuando posteriormente se ¡den-
/"
——————
—
——
-
:
*
Tabla 40-7 Secuencias d e aminoácidos q u e definen los epítopos
Bw4 y Bw6 y ejemplos de alelos q u e especifican estas
secuencias
Bw4
Secuencia*
NLARIALR
NLRTALR
DLRTLLR
SLRTLLR
SLRIALR
Bw6
Alelo'
Secuencia'
Alelo'
B'5301
B'2701
B-2705
B"2704
A'2501
SLRNLRG
GLRNLRG
В-3501
B'7301
' Codones 77-83. véase Figura 40-9.
Solo se da un ejemplo de cada alelo
TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN
DEL POLIMORFISMO DEL HLA
Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificación del HLA o la tipificación tisular se desarrolla en un número limitado de laboratorios ya que utiliza técnicas y reactantes especializados. Existen disponibles en el mercado
equipos para las pruebas basadas en ADN y serológicas; sin embargo, la
interpretación de los resultados de la prueba requiere una considerable
experiencia y conocimiento. Los laboratorios de histocompatibilidad normalmente se encuentran en centros médicos que tienen programas de trasplantes de órganos y/o de células progenituras hematopoyéticas. En esta
sección las técnicas de identificación del HLA se tratan de forma general.
Para técnicas detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogenética (ASHI) (en la
Tabla 40-1 se incluye la página web de la ASHI). Los laboratorios de identificación del HLA están acreditados por la ASHI, por la Fundación Europea
de Inmunogenética (EFI) y por otras organizaciones.
Tipificación basada en el ADN de los alelos
de clase I y clase II
Aunque la tipificación serológica y celular de los antígenos HLA ha sido
muy útil, hay un número de inconvenientes en estas técnicas. Con la llegada de los métodos rápidos y fiables del aislamiento y caracterización de los
genes de clase I y II y la determinación de las secuencias de nucleótidos de
los alelos de clase I y II, ha surgido la posibilidad de utilizar métodos basados en el ADN para la tipificación del HLA. La tipificación basada en el ADN
de los alelos HLA es ahora una técnica utilizada Irecuentemente en los laboratorios de tipificación del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 1997a).
1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN
(p. ej.. sondas y cebadores de oligonucleótídos sintéticos) se define claramente y está basada en una secuencia de nucleótidos específica
conocida. Como los oligonucleótídos empleados como reactantes en la
tipificación del ADN son sintéticos, los reactantes no están limitados y
no debería existir variación entre lotes en la especificidad.
CAPÍTULO 40
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se
descubran los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucleótidos únicas. Las pruebas pueden llevarse a cabo en muchos niveles
de resolución dependiendo de los requerimientos de tipificación y del
tiempo disponible para hacer las pruebas.
3. Es más robusta que otras técnicas. La tipificación del ADN no requiere
linfocitos viables y no está influenciada por la salud del paciente. Además, las pruebas basadas en el ADN son altamente reproducibles cuando se usan metodologías estandarizadas como el test con una secuencia específica de una sonda oligonucleotídica (SSOP) usan en conjunto
un protocolo de test estándar (Ng, 1996; Hurley. 2000a).
4. Puede utilizarse para grandes escalas de tipificación. La cantidad de
muestras facilitada por las metodologías automáticas y computerizadas
reduce el coste y los errores. Los métodos basados en el ADN son particularmente aplicables a la tipificación HLA de grandes números de
voluntarios para los registros de donantes.
5. Puede ser discriminativa detectando toda la diversidad del HLA. Los
alelos del HLA pueden especificar proteínas HLA que son indistinguibles empleando tipificación serológica. Por ejemplo, un individuo que
transporte el alelo DRBV0401 tendrá el mismo tipo serológico (DR4)
que un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello,
DRBt'0401 y DRBV0402 son divisiones de la amplia especificidad
DR4. Estas divisiones son identificadas por la tipificación del ADN. No
están disponibles reactantes serológicos suficientemente específicos
para definir esta división. Hasta ahora, se han definido 30 subdivisiones del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utilizando tipificación del ADN que no pueden identificarse empleando tipificación serológica; algunas se enumeran en la Tabla 40-2.
Los problemas de la tipificación serológica son particularmente agudos
cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones. Por ejemplo, las poblaciones de origen directamente africano pueden expresar antígenos de
clase I y clase II que son difíciles de identificar con los reactantes serológicos
disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La tipificación del HLA basada en el ADN ha mejora muchísimo la capacidad de definir los tipos de HLA en estas poblaciones.
Preparación y amplificación del ADN. Cualquier célula con núcleo
puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos (RBC) no
tienen núcleo, otras células de la sangre como los linfocitos son bunas fuentes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el
virus de Epstein Barr también son buenas fuentes de ADN. A medida que
las células transformadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, proporcionan un suplemento de ADN que se puede reponer y son empleadas
para proporcionar un ADN de referencia para el control de calidad de las
técnicas de tipificación,
El ADN normalmente se prepara de una pequeña cantidad (0,2 mi a 1 mi)
de sangre total. Se puede emplear muchos protocolos diferentes para aislar el ADN de las células, y también hay equipos disponibles en el mercado
para la preparación del ADN. La sensibilidad de la detección de los tipos del
HLA aumenta considerablemente con la amplificación del ADN que codifica
los genes HLA utilizando la técnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe complementar con un par de oligonucleótidos sintéticos (cebadores) a las secuencias alrededor de un gen específico HLA para generar millones de
copias de dicho gen para su uso en la reacción de tipificación del ADN. Algunas reacciones de tipificación emplean secuencias promotoras que son
compartidas por todos los alelos de un locus HLA: otras técnicas de tipificación emplean grupos de promotores que son compartidos sólo por un
grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra de ADN
durante la reacción PCR usa las condiciones de la reacción que garantizan
que los promotores se unirán a las secuencias perfectamente apareadas
(secuencias diana) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que
no están apareadas. Ajustando la temperatura del componente de fijado de
la reacción PCR, el laboratorio de tipificación puede controlar la especificidad de la amplificación.
Promotor específico de secuencia. Un método de identificación de los
alelos HLA utiliza promotores específicos de secuencia (SSP) en la reacción
PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los promotores se añaden para desnatu-
939
ralizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuencias promotoras. En ia subsiguiente reacción PCR. solo estos alelos seleccionados son amplitícados. El ADN amplificado por los promotores es identificado por electroforesis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante
durante la amplificación, por fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad
en la tipificación de un pequeño número de muestras en un corto periodo de
tiempo. Hay equipos disponibles en el mercado.
Hibridación oligonucleotídica específica de secuencia. Ha sido posible el empleo de la hibridación de SSOPs con ADN amplificado para identificar alelos (Gao, 1991; Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el
empleo de múltiples sondas de oligonucleótidos diferentes para definir un
alelo HLA específico o el empleo de un promotor especifico de secuencia
unido con hibridación con paneles de sondas. Un grupo de oligonucleótidos
capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificado desnaturalizado por PCR unido a un soporte sólido. Las condiciones de hibridación se
ajustan de modo que las sondas se añadan al ADN desnaturalizado que
contenga los alelos HLA de los que derivó la secuencia del oligonucleótido.
Los oligonucleótidos se encuentran marcados con una terminación para
detectar la hibridación. Por ejemplo, el oligonucleótido puede asociarse a
una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras la adición de un sustrato, la losfatasa alcalina degrada el sustrato para producir un componente coloreado
o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la visualización. puede leerse el patrón de hibridación para determinar los alelos presentes. La Figura
40-11 ilustra la aproximación con el empleo de una sonda de oligonucleótido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabetes dependiente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El método
SSOP es muy exacto, específico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A menudo es utilizado en situaciones donde se tipifican muchas muestras en
grandes grupos. Están disponibles kits comerciales que utilizan este método.
En una técnica relacionada, llamada el formato reverso, las sondas de oligonucleótidos se unen a un soporte sólido (Bugawan, 1994). El ADN de las
muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciadores marcados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se híbrida a
sondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los alelos presentes en el ADN. Tras la visualización (empleando un sistema de
detección unido a la avidína), se puede leer el patrón de hibridación para determinar los alelos presentes. Esta técnica es útil para la tipificación tanto de
un número de muestras pequeño como grande. Hay equipos disponibles en
el mercado que utilizan este método.
Polimorfismo conformacional de secuencia específica (SSCP) o
análisis heterodoble. Otro método, aunque poco usado, de identificación
de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN amplificado, ya sea desnaturalizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (análisis heterodoble), tras
la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN es comparada con la
movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir un alelo HLA.
Esta técnica es útil en la tipificación de un pequeño número de muestras y
particularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una
familia.
Secuenciacíón del ácido nucleico. Un método final de identificación
de alelos HLA implica la determinación directa de las secuencias de ADN de
los alelos HLA transportados por un individuo (tipificación basada en la secuencia [SBT]). Los alelos son identificados ya sea tras la amplificación PCR
para separar los alelos basados en SSP o como una mezcla de dos alelos.
La secuenciacíón es una labor intensa y altamente compleja pero puede
usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en un nivel alélico entre los pacientes de trasplantes de células progenituras hematopoyéticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltinga. 1997).
Resolución de la tipificación basada en el ADN. El nivel de resolución
(i.e., la capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los métodos de tipificación de ADN eslá controlado por la elección y el número de iniciadores y/o
sondas empleados en el ensayo y por el método de tipificación. Esta elección
puede depender del tiempo disponible para el desarrollo de la tipificación, del
coste de la tipificación, de la experiencia del personal de laboratorio y del pro-
940
B
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Figura 40-11. 4, Secuencias de nucleólidos de múltiples aletas D0B1. Las secuencias presentadas cubren los codones
para los aminoácidos 50 a 60. Una raya indica que el nucleó2
3
4
5
7
9 10 tido es idéntico a la secuencia de la pade superior. En un rectángulo está un oligonucleotide que es especifico para la se• U I I H I I I I M B M W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U
cuencia DQBI'0302. B. Análisis de transferencia en mancha
(oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DMI19) y un control. BML. El ADN amplificado que contiene secuencias DQBf de clase II de los pacientes lúe unido a la
membrana e hibridado para el oligonucleotide específico
marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamente). Las señales de hibridación positiva indican los pacientes
que tienen esta secuencia génica DQB! (pacientes DM1. 2.
4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB
gene contributes to susceptibility and resistance to insulindependent diabetes mellilus. Nature 1987; 329-599. con perII
12
13
14
15
16
17
IS
1')
UML
pósito de la tipificación. Normalmente la tipificación para registros de donantes
a gran escala se lleva a cabo con una resolución baja-intermedia, mientras que
la tipificación de un posible donante de células progenituras hematopoyéticas
para un paciente específico se realiza a un nivel de resolución alélica.
A menudo se utiliza un abordaje con múltiples pasos para identificar los alelos HLA por tipificación basada en el ADN. Por esta razón, los tipos de HLA
definidos por la tipificación basada en el ADN pueden mostrarse con diferentes niveles de resolución. El nivel de resolución bajo (o genérico o seroiógico)
de tipificación basada en el ADN produce un resultado similar en apariencia y
en detalle a un tipo seroiógico. Por ejemplo, un tipo definido por ADN. el
DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroiógico
DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolución,
no es posible determinar cuál de los más de 30 alelos DRBI'11 tiene el individuo que está siendo analizado. Aunque la tipificación serológica pues ser
tan informativa como la tipificación de baja resolución, los resultados son más
fiables con el análisis basado en el ADN. El nivel intermedio de resolución de
tipificación basada en el ADN puede reducir las opciones enumerando múltiples posibilidades diferentes para el tipo de un individuo, (p. ej., DRBV1101
o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de resolución alto (o a nivel alélico) de la
tipificación basada en el ADN identifica el alelo especifico que transporta un
individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identificación de los alelos HLA puede
basarse en la secuencia de información parcial, es posible que la interpretación de los resultados pase por alto alelos que eran desconocidos en el
momento de la tipificación (Hurley. 1997b). Por esta razón, los laboratorios tienen cuidado de mantener sus datos de tipificación brutos (p. ej., qué promotores y qué sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieotidos de los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a
mediada que se describan los nuevos alelos.
Detección serológica de las moléculas
de clase I y clase II
El análisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongínalmente se
utilizo en el sistema del ratón por Gorer y Amos y después fue modificado por
Terasaki y McClelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado
para la tipificación del HLA desde los años 60. El análisis seroiógico del HLAA, -B, puede reproducirse en condiciones controladas y estandarizadas; sin
embargo, los análisis a gran escala (p, ej., para registros), pueden aumentar
los índices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para especificidades determinadas serológicamente del HLA-C y clase II es mucho
menor. El HLA-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo seroiógico de microcitotoxicidad todavía se utiliza ampliamente para las especificidades de clase I (HLA-A, -B) pero ha sido sustituido por el análisis basado
en el ADN para las especificidades HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj
en muchos laboratorios de tipificación. El análisis basado en el ADN con su
mayor resolución se utiliza para determinar el tipo de HLA de individuos no
emparentados y de miembros de una familia especialmente si la segregación
del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (p ej.. familias
donde los padres no están disponibles o familias donde los padres comparten
un antígeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada
pariente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin
embargo, la tipificación del ADN de alta resolución puede identificar dos alelos distintos del antígeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigótico para el alelo DRBV04), proporcionando datos informativos para los análisis de segregación del haplotipo.
Preparación de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en
los ensayos de tipificación serológica del HLA se obtienen rápidamente de la
sangre total periférica sedimentándola con un gradiente de Ficoll-Hypaque
para separar los eritrocitos por densidad de centrifugación. Los linfocitos de
sangre periférica separados (PBLs) pueden emplearse para la tipificación del
HLA-A. -B. -C. Para analizar las especificidades serologicas del HLA-DR. DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B o utilizar una técnica de fluorescencia de dos colores especial para diferenciar simultáneamente las células B y las células T no separadas.
Ensayo de microcitotoxicidad linfocitica. El fenotipo HLA se determina analizando la preparación de linlocilos no separados (PBL) o los linfocitos
T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ)
frente a un panel de aloantisuero HLA bien caracterizado. El ensayo es un test
de dos etapas. Durante la etapa de de sensibilización, los linfocitos son incubados con el antisuero. Se añade suero de conejo en exceso preanalizado y
estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se incuba durante un
periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molécula de superficie celular
reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloantisuero,
los anticuerpos se unen a las células y las células son usadas subsiguientemente tras la adición del complemento. El ensayo termina con la adición diacetato de fluoresceina y de bromato de elidió para las técnicas de detección
CAPÍTULO 40
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y ácido acético etilendiamineter (EDTA) para las técnicas de visualización de colorantes.
Las reacciones se leen en porcentaje de lisis y se gradúan numéricamente.
Cubetas de suero para tipificación del HLA. Los reactantes de tipificación del HLA derivan del suero de individuos aloinmunizados (mujeres multíparas, receptores de trasplantes, pacientes multitransfundidos e inmunización planificada en humanos). Las placas con múltiples pocilios de
aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificación del HLA) están disponibles en el mercado. Debido a la complejidad antigénica de los anlígenos HLA.
deben utilizarse múltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos
de los laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o
pueden utilizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisueros no son verdaderamente monoespecílicos y muchos presentan alguna
reactividad cruzada, la reactividad de cada antisuero debe analizarse cuidadosamente y conocerse para la interpretación de los resultados. Esto requiere un estrecho control de calidad de cada nuevo lote de cubetas de tipificación con células de referencia bien caracterizadas. Como el titulo y la
especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibilizado puede no
ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son limitados. En
un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de reactantes,
algunas compañías han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactantes monoclonales no están disponibles para todas las especificidades HLA.
Reactividad cruzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con más de
un producto alélico HLA. Este fenómeno puede proceder de la poliespecificidad del antisuero y/o de la reactividad cruzada y es responsable de los complejos patrones de reactividad de algunos aloantisueros. El suero poliespecífico contiene dos o más anticuerpos, que pueden ser adsorbidos para retirar
uno, con pequeño efecto sobre la reactividad del otro(s). El antisuero con
reactividad cruzada contiene, más frecuentemente, un anticuerpo simple que
reacciona con un determinante antigénico compartido entre múltiples productos alélicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se
trató previamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren más frecuentemente entre los productos alélicos codificados por el mismo locus pero
pueden ocurrir entre productos alélicos codificados por locus diferentes (p. ej.,
A2 + B17). En la Figura 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la localización de los determinantes de la reactividad cruzada.
Detección celular de las moléculas de clase II
941
con los subsiguientes acontecimientos, como la extensión de la EICH. todavía son controvertidas.
TRASPLANTE DE ÓRGANOS/TEJIDOS
La supervivencia a largo plazo de órganos sólidos y de los injertos de células progenitoras hematopoyéticas representa uno de los retos más importantes de la ciencia médica. El trasplante renal es la terapia de elección para la
mayoría de los pacientes con enlermedad renal en fase terminal. El trasplante de progenitores celulares hematopoyétícos, de corazón, de pulmón, de
higado y de páncreas está ganando una amplia aceptación como técnicas
terapéuticas con resultados satisfactorios. El principal obstáculo al trasplante
de órganos sólidos y de progenitores de células hematopoyéticas es el rechazo mediado inmunológicamente al tejido extraño. Por lo tanto, el éxito de un
aloinjerto depende de la capacidad para detener la reacción inmune, lo cual
puede realizarse por: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor; 2) terapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996);
y 3) lograr que el receptor no responda al aloantígeno o aloantigenos del
donante (esto es, tolerancia) (Remuzzi, 1995).
Bases genéticas del trasplante
Las bases genéticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en
1916 como resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y
posteriormente se extendió a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se
demostró que los injertos cutáneos en linajes nativos que eran homocigotos
en el locus de histocompatibilidad (esto es, injertos singénicos) tenían éxito,
pero los injertos entre dos linajes nativos diferentes (alotrasplantes) eran
rechazados. Además, los aloinjertos de cualquier linaje nativo emparentado
(dos copias de los mismos genes MHC; homocigotos) o de la primera generación (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos grupos diferentes de
genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivían en animales; mientras
tanto, los injertos de descendientes F1 híbridos de cualquier progenitor (un
haplotipo no emparentado) no sobrevivían. Estas observaciones establecieron las leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delinió el locus de
histocompatibilidad mayor en el ratón, el H-2. Hay otros antigenos de histocompatibilidad o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados
menores, la discordancia para estos antígenos puede tener efectos importantes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).
A medida que existían evidencias convincentes en modelos animales experimentales de que las moléculas codificadas por el MHC representan la mayor
barrera genética del éxilo del aloinjerto. la tipificación del HLA fue utilizada en
humanos para determinar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto
del donante y el receptor. Inicialmente, la influencia de los antígenos HLA en
la supervivencia del injerto fue investigada injertando piel no vascularizada
entre miembros de una familia. Como en los estudios de ratones hijos, los
injertos cutáneos entre hermanos HLA idénticos sobrevivieron significativamente más que los injertos entre hermanos padres o donantes no relacionados con un haplotipo emparentado. Estas observaciones se extendieron al
trasplante renal durante los últimos años de la década de los 60 y los primeros de la de los 70. Los datos más recientes del Estudio Colaborador Internacional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ
Sharing (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confirEl empleo del CLM en los laboratorios clínicos para determinar la histoman que el MHC es la principal barrera genética en el trasplante de injertos
compatibilidad ha declinado debido a las limitaciones inherentes a la técnica.
El CLM puede estar influenciado por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1999) (Fig. 40-12; para datos actuales véanse
las páginas web señaladas en la Tabla 40-1). Los datos para el trasplante de
medad y por la historia de una transfusión previa (Mickelson, 1996). Por estas
células
progenitoras hematopoyéticas también reafirma el papel del MHC en
razones el ensayo CLM se ha reemplazado por métodos de tipificación basala evolución del trasplante determinado por la supervivencia del paciente y por
dos en el ADN, más precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplanla EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13).
tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea para identificar receptores de
aloinjerto renal con hiporreactividad especifica a las moléculas HLA del
donante tras el trasplante como una guia para reducir la inmunosupresión
Concordancia de histocompatibilidad
(Reinsmoen, 1993).
La respuesta de una célula en el cultivo tisular a los aloantígenos en la
superficie de una segunda célula se denomina cultivo mixto de leucocitos
(CML) o reacción linfocitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es considerado una medida in vitro de la disparidad de clase II entre individuos que
reconocen determinantes encontrados en las moléculas de clase II. que son
conocidos colectivamente como HLA-D. La respuesta de las células T se produce unidireccionalmente impidiendo que se dupliquen las células de uno de
los dos individuos tratando dichas células con radiación o mitomicina-C antes
de su adición al cultivo. El CLM representa una respuesta sumatoria de una
célula respondedora a las diferencias en los múltiples determinantes en las
moléculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de
células estimuladoras irradiadas. La respuesta a las moléculas DR parece
predominar.
Se ha utilizado el análisis de dilución limitada para definir la frecuencia de
los linfocitos T citotóxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la
extensión del alorreconocimiento en trasplantes de células progenitoras
hematopoyéticas (Madrigal, 1997). Las correlaciones de estas frecuencias
P
p
Concordancia de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un
elemento importante en el resultado del trasplante, la concordancia de la histocompatibilidad significa diferentes cosas en diferentes situaciones y las
estrategias para determinar esto varían. Los criterios difieren con variables
942
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
100,
Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA
y sus tipos serológicos
Alelos HLA
Antigenos HLA
A'0201
A '2603
A-660V
B'2702
B'2708'
B'1502
B-1503
B' 1536'
DRBV0301
DRB1V404
A2
A26
A26 о A66
B27
B7 о B27
B75(15)
B72 (70)
No definido
DR17(3)
DR4
' El laboratorio puede asignar A66. o más recuentemente. А26 a las células
que transportan este alelo.
' Muchos laboratorios tipan serologicamente una células con este alelo como
B7: sin embargo, la reactividad serológica sugiere que la tipificación difiere
levemente del B7 "estándar'
Las células que transportan este alelo no han sido carácter i/adas soioiogí
camenle
1
dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordancias. Las diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a
causa de la metodología de tipificación empleada para asignar los tipos de
HLA (p. ej„ tipificación serológica frente a basada en el ADN). Las nomenclaturas serológicas y ADN, aunque están relacionadas, pueden diferir. En la
Figura 40-12. Supervivencia a cinco años de aloinjerto renal (primer trasplante) de
Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas relaciones y se ha publicado una lista
tres categorías de histocompalibilidad: hermanos HLA idénticos; un haplolipo de
vida relacionado: donante de cadáver, llenos de hermanos donantes HLA idénticompleta (Schreuder. 1999). La definición de una concordancia también puede
cos (ambos con cromosomas HLA concordantes) tienen los mejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolución. Un paciente y un donante pueden
indica el numero de trasplantes estudiados (regresión p < 0.0001) (De Opelz G,
parecer ser concordantes en el nivel serológico (p. ej.. receptor: A2. A26:
Wujoak T, Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev
donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el nivel de
Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso)
alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201. A'260l: donante: A'0205. A'6601).
El nivel de concordancia alélico para las moléculas de HLA clásicas puede
optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de órganos vasculares como
de células progenituras hematopoyéticas (Opelz, 1999; Petersdori, 1998). Sin
que incluyen el tipo de injerto (p. ej., órgano sólido vascularizado frente a proembargo, debido al gran número de alelos HLA, el nivel de concordancia alégenitor de célula hematopoyética), la enfermedad (p. ej.. leucemia mieloíde
lico es difícil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que
crónica (rente a anemia aplásica), la edad del paciente y el protocolo clínico
garantice un buen resultado para el máximo número de pacientes de todas las
(p. ej., sangre de médula frente a sangre de cordón umbilical: depleción
poblaciones étnicas.
medular de células T frente a no depleción de células T) (véase Cap. 33).
La concordancia normalmente incluye la evaluación de al menos tres locus,
Tras el trasplante de células progenitoras hematopoyélicas, los determiel HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier
nantes subtipicos o las diferencias alélicas inician una importante respuesta
resolución, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 discorcitotóxica de células T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De
dancias. Cero discordancias (un término empleado en el trasplante de órganos
hecho, los estudios han mostrado que la concordancia de alta resolución para
sólidos) también puede referirse a pares de donante/receptor, donde el donanlos alelos de clase I y clase II del donanle y el receptor puede mejorar el resulte no tiene diferencias HLA detectables con el receptor, esto es, donde el
tado tras el trasplante de médula no emparentado. Los datos recientes sugiedonante es homocigoto para los alelos en uno o más de los locus (p. ej., donan- ren que múltiples discordancias son malas para el resultado; sin embargo, el
te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: receptor heterocigoto: A'0101:
impacto tanto de las discordancias simples como del locus especifico todavía
A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individuos concorno está bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999). Solo
HLA-ID III RMANO
n
4.343
1 -IIAPI. PARIATI-.se» n- 18.071
CADÁVER
n 105.360
Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a
IV en hermanos HLA idénticos (concordancia genotípica HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes
medulares haploidénticos emparentados con concordancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordancia HLA:
3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia
para el HLA-A, -B y -DR fue definida por seroiogia. y la
concordancia para el HLA-Dw fue definida por CML o
por tipificación de los alelos HLA-DRBl con SSOP.
Todos los pacientes recibieron médula no modificada
(sin depleción de células T) tras un régimen de preparación que incluyó la irradiación corporal total. Se dieron
ciclosporina y metotrexato para la profilaxis de la EICH
(De Hansen JA. Yamamoto K. Petersdori E. y col: The
role of HLA matching in hematopoietic cell transplantation. Rev Immunogenet 1999; 1:359, copyright © 1999
Munksgaard International Publishers Ltd. Copenhagen.
Denmark, con permiso.)
CAPÍTULO 40
•
ANTIGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD.
una minoría de pacientes que están esperando el trasplante recibirán injertos
de donantes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos
los pacientes beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificación
de los alelos no emparentados que son bien tolerados permitirá la selección
de donantes no emparentados estableciendo prioridades de acuerdo con el
riesgo biológico de los HLA específicos no concordantes.
La concordancia óptima para los injertos de órganos sólidos puede diferir
de los requerimientos de concordancia para el trasplante de células progenituras hematopoyélicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA
emparentado como el nivel de resolución del análisis del HLA contribuyen al
resultado del injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la comparación de ríñones de cadáveres basándose en las especificidades subtipicas. Ya que las concordancias subtipicas se identifican infrecuentemente, se
ha propuesto que las moléculas HLA de clase I sean emparentadas para los
amplios determinantes CREG. El CREG puede definir los determinantes
mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humoral. Rodey
(1994) mostró que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por
el receptor tras el trasplante de riñon están dirigidos contra los determinantes
CREG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes moléculas HLA de clase I y. en contraste con las especificidades subtípicas. tienen
una distribución similar entre los grupos de población étnica. En el CREG se
incluyen especificidades subtípicas raras. Ya que el número de CREGs es
menor que el número de especificidades subtípicas. la probabilidad de emparentar un nivel CREG es mayor que para un nivel subtípico o alélico de HLA
clase I. Por lo tanto, la distribución de órganos basándose en la concordancia
CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan equitativamente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones étnicas.
Un análisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas predicciones sobre la distribución (Ellison, 1994), aunque los estudios todavía están en
progreso. El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es
desconocido, pero se está evolucionando. En Europa, una estrategia para
eliminar el excesivo tiempo de espera de los receptores con fenotipos HLA
raros se implantó en 1996 mientras se mantenía la distribución de los injertos
bien emparentados (Opelz. 1999).
Otras estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biológicamente relevantes de las moléculas del MHC (p. e|„ concordancia de epítopo) (Suciu-Foca, 1998; Harris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento
directo de los aloantígenos se pensó que era la principal via de respuestas de
los injertos. Sin embargo, los estudios sugieren que la respuesta indirecta
juega un papel significativo en el rechazo del injerto, al menos en los injertos
de órganos sólidos (Sayegh, 1996). Si se activa la via indirecta, entonces los
epitopos peptidicos generados por la ruptura proteolitica de la molécula HLA y
no por la molécula HLA en si misma serán el estímulo inmunogénico. Por ello
pueden diseñarse nuevas estrategias innovadoras para la definición de las discordancias deducíbles basándose en el reconocimiento de los fragmentos peptidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las moléculas HLA del
donante no emparentado serán interpretadas como inmunogénicas en el
receptor (es decir, si las moléculas HLA del receptor se unirán y presentarán
estos epitopos). Teóricamente, uno puede identificar secuencias peptídicas de
HLA extraño no presentado por las moléculas HLA específicas del receptor y
por ello definir las discordancias deducíbles para las moléculas HLA dadas.
La complejidad inherente en la interpretación de los resultados de la tipificación del HLA y en la selección de un donante hace crítico incluir un experto en los análisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipificación del
HLA conocerán las ventajas y las limitaciones de cada método de tipificación
asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la población, información importante tanto en la búsqueda como en la selección de un donante
adecuado.
Detección de anticuerpos específicos del HLA en el suero del
receptor. Los pacientes pueden sensibilizarse a moléculas HLA extrañas
específicas a través de una transfusión, el embarazo, o trasplantes anteriores.
La evaluación de la compatibilidad entre el receptor y el posible donante incluye el análisis para esta sensibilización. El suero del receptor es analizado
antes del trasplante en un panel (linfocitos o moléculas de HLA solubles inmovilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad anticuerpo panel
(PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es analizado con
943
los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad específica para el donante potencial en la prueba cruzada específica de donante.
Aunque las técnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unión pueden
diferir entre los laboratorios, los propósitos siguen siendo obtener un perfil de
factores de riesgo inmunológico del receptor en la lista de espera, que será
de ayuda al equipo médico tanto en las decisiones pretrasplante como en las
postrasplante. La unión del anticuerpo en el suero actual del receptor a los linfocitos Tdel donante es una contraindicación para el trasplante renal
Análisis del suero (PRA). La caracterización cuidadosa del perfil de anticuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de ayuda en la interpretación de las concordancias cruzadas especificas de donante pretrasplante. Los objetivos del análisis PRA son:
1. Identificar el nivel de presensibilización del paciente a los antígenos
HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 60% (i.e., el suero del
paciente reacciona con especificidades encontradas en al menos el
60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada
donante-específica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un
trasplante no emparentado.
2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predecir el antigeno(s) HLA que serán evitados cuando se seleccionen los donantes.
3 Identificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanticuerpos) de modo que se puedan seleccionar las técnicas apropiadas
para evitar falsos positivos en la lectura en el momento de la concordancia cruzada donante-específica.
La caracterización del anticuerpo HLA específico presente en el suero del
receptor requiere un análisis en un panel seleccionado de especificidades
HLA bien definidas. Se deben incluir en el panel de control los linfocitos o los
antígenos solubles de un número suficiente de individuos para asegurarse de
que se detectarán todos los anticuerpos dirigidos contra el HLA salvo los más
raros. En la medida de lo posible, el panel de control debe permanecer igual
de modo que los resultados sean comparables en el tiempo. El receptor de un
trasplante renal forma frecuentemente anticuerpos frente a CREGs más que
frente a especificidades subtípicas (Rodey. 1994,1997) de modo que el análisis de la reactividad del panel debe considerar la identificación de CREG asi
como la de especificidades subtípicas. La identificación de especificidades de
anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la preselección
de un donante potencial del que el receptor tendrá una concordancia cruzada
final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la selección (Claas,
1999: Duquesnoy, 1999).
La frecuencia del control y la selección de los ensayos empleados para el
control son decisiones basadas en el perfil inmunológico del individuo receptor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguíneas ha hecho innecesaria la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos
los pacientes (página web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuerpos específicos HLA de clase I como de clase II es detectada por el análisis
del suero en un panel de linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependiente del complemento o por ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglobulina) o en un panel de moléculas HLA soluble inmovilizadas con placas (es
decir, ensayo con enzima unida mmunoabsorbente [ELISA]) o en gotas (es
decir citometría de flujo). (Los ensayos se describen con detalle en el manual
ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno soluble de fase sólida es
que puede ser diseñado para detectar solo IgG. anticuerpos especílicos frente al HLA de clase I.
Las muestras de suero de los receptores potenciales deben almacenarse a
-70 C y protegerse del dióxido de carbono y de la evaporación Las muestras de
suero caracterizadas almacenadas serán utilizadas en la prueba cruzada especifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante prospectivo.
Prueba cruzada específica de donante. La concordancia cruzada de
linfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un
receptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante específico.
En el test de reactividad cruzada, el linfocito es la célula diana de elección, ya
que expresa altos niveles de moléculas HLA y es fácil de aislar. Este test es
probablemente la contribución más importante de los laboratorios de tipificación de tejido HLA al trasplante renal. El propósito de la reactividad cruzada
es prevenir el rechazo hiperagudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-
944
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
lores de riesgo inmunológico en pacientes que esperan un trasplante. La aparición del rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reactividad cruzada de la citotoxicidad directa dependiente del complemento positiva (CDC) entre los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el
momento del trasplante. La reactividad del suero válido actual del receptor a
los linfocitos T del donante es una contraindicación para el trasplante de injerto renal. La detección de anticuerpos reactivos al donante en muestras anteriores de suero de receptores no es una contraindicación pero puede representar un nesgo para la pérdida del injerto distinto del rechazo hiperagudo
inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reactividad cruzada especifica
de donante también se utiliza en algunos centros para predecir el fallo del
injerto de células progenitoras hematopoyéticas (Hansen, 1997).
Los requerimientos u métodos para la reactividad cruzada especifica de
donante están determinados en los estándar de la Sociedad Americana de
Histocompatiblidad e Inmunogenética (Tabla 40-1) y en el manual de técnicas
ASHI (2000). Las técnicas aceptadas hasta el momento incluyen el Amos
modificado CDC, la extensión del tiempo de incubación de la CDC. la CDC
aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo.
Técnicas de detección de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden
utilizar diferentes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El
nivel de sensibilización detectado variará con el ensayo. El anticuerpo especifico detectado variará con la célula diana.
Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC
directa incluye todos los ensayos que utilizan la adición de complemento para
detectar la unión directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijación del complemento por los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las
células originará la muerte celular o la citotoxicidad. Los métodos de CDC
incluyen la técnica básica (no hay periodo de lavado antes de añadir el complemento), la técnica Amos modificada (etapa de lavado añadida antes de la
adición del complemento) y técnicas de aumento del tiempo de incubación La
etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustancias que dificultan la activación del complemento. Las ventajas de las técnicas de CDC directa son que son reproducibles y que la correlación con la incidencia de rechazo hiperagudo es excelente.
Técnicas de reactividad cruzada indirecta. Las técnicas indirectas
incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la citometria de
flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina humana
para aumentar la detección de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las técnicas indirectas detectan la presencia de anticuerpos específicos frente a antigenos de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados
en los ensayos CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen
la discriminación de las subclases de células unidas a las inmunoglobulinas
(IgG frente a IgM) y la caracterización de la célula diana que se une al aloanlicuerpo (linfocito T frente a linfocito B frente a monocito).
Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de autoanticuerpos circulantes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a cabo una autorreactividad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye en la lista de
espera del trasplante. Si están presentes autoanticuerpos. el suero utilizado
para la reacción cruzada con el donante debe tener la autorreactividad eliminada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA
específicos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivación con
calor a 63° ± 1° C o la reducción con los agentes químicos ditioeritrítol (DTE)
o ditiotreitol (DTT) de cualquiera de los anticuerpos IgM potencíales se utiliza
para diferenciar entre anticuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la
muestra de suero inactivada con calor o tratada con DTT es negativa, aun
cuando la muestra no tratada sea positiva, la mayoría de los centros seguirán
adelante con el trasplante. Sin embargo, el DTT o la inactivación con calor
deben emplearse con precaución, ya que no todos los anticuerpos HLA específicos son IgG y por ello, si no se controla correctamente, ambas técnicas
pueden eliminar la actividad IgG y la IgM.
Anticuerpos frente a las células B. En algunos centros puede llevarse a cabo una reactividad cruzada utilizando linfocitos B del donante (reactividad cruzada de célula B) en los pacientes sensibilizados. Una prueba de
reactividad cruzada positiva frente a células B específicas del donante no es
una contraindicación para el trasplante. El significado clínico todavía no se
ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particularmente en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anticuerpos detectados en la reactividad cruzada de célula B pueden ser (1)
específicos de clase II, HLA-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad
para el HLA-A. -B. -C (las células B tienen una alta densidad de moléculas
de clase l y son más sensibles a los ensayos dependientes del complemento que las células T). y/o (3) anticuerpos no específicos del HLA (p. ej., autoanticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada de célula B positiva,
puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaquetas antes de desarrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas expresan moléculas de clase I pero no de clase II.) Las dos técnicas de reactividad cruzada de célula B utilizadas más frecuentemente son el CDC y los ensayos de
citometria de flujo.
Selección de las muestras de suero del receptor para la reactividad
cruzada con el donante. En pacientes con sensibilización no detectable (es
decir. 0% PRA). puede usarse la muestra de suero disponible más reciente
para la reactividad cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anticuerpos preexistentes o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente,
debe recogerse una muestra de suero en el momento (Le., en las 48 horas
antes del trasplante). En receptores sensibilizados, las muestras representativas, incluyendo la más reactiva o muestra de suero "pico", son analizadas en
muchos centros ya que una muestra positiva de donante anterior puede ser
considerada un factor de riesgo particularmente en el paciente que rechazó
precozmente un injerto anterior en el periodo postrasplante (Mahoney, 1996).
Trasplante renal
La práctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO
compatibles, tienen reactividad cruzada específica de donante de células T
negativa con un suero receptor adecuado y la mejor concordancia HLA disponible. El hallazgo original de que los injertos de riñon entre hermanos HLA
idénticos sobrevivían significativamente más que los injertos transplantados
entre hermanos HLA no emparentados o combinaciones de hermanos-parientes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-12 muestra el análisis
más reciente de supervivencia a cinco años de aloinjertos renales del registro
internacional CTS entre tres categorías de donantes: (1) hermano HLA idéntico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de supervivencia; (3) todos de cadáver. 66% de supervivencia. El impacto de la concordancia para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa
claramente comparando las categorías 1 y 2. Resultados similares se observan en la base de datos de la UNOS (Cecka, 1999).
Aunque los resultados de los análisis sobre injertos de parientes vivos confirman el papel del MHC como la mayor barrera genética en el éxito del resultado del injerto, la demostración y la aceptación de la influencia positiva de la
concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadáver no
emparentados ha sido más controvertida. Sin embargo, los datos de la supervivencia a largo plazo de estudios multicéntncos colectivos son consistentes
a la hora de mostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del
HLA en la supervivencia del trasplante renal de cadáver (Fig. 40-14) (Opelz.
1999; Cecka. 1999). Más aún, dos estudios de centros independientes, uno
de Europa (Oslo) y otro del norte de América (Toronto) han informado de una
mejora significativa en la supervivencia del injerto como una función de la concordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad, 1999: Geddes, 1999). Un centro
aislado puede requerir la priorización basada en la concordancia HLA para
trasplantar a suficientes receptores con injertos bien emparentados para
mejorar la significación estadística en el resultado de los análisis. Aunque los
números son pequeños, se ha observado una influencia altamente significativa de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de riñon de
donantes vivos no emparentados (Opelz, 1999).
Los injertos con cero discordancias (0 MM) de donantes cadáver sobreviven significativamente mejor y aproximadamente tan bien como los injertos de hermanos HLA idénticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello, la UNOS
ordena compartir de 0 MM ríñones La supervivencia del injerto en pacientes tras los primeros trasplantes de riñon disminuye proporcionalmente a
medida que aumenta el número de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka,
1999; Opelz, 1999). Sin embargo, para asegurar la distribución equitativa de
CAPITULO 40
•
ANTÍGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.
945
órganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA
raros, se han adoptado por los programas de distribución de órganos nuevos algoritmos para la priorización de receptores en lista de espera (Opelz,
1999). Los resultados de los datos más recientes tanto de supervivencia de
injerto como de paciente pueden verse a través de página web de la CTS
(Tabla 40-1).
La concordancia del injerto inicial no solo aumenta el tiempo de supervivencia del injerto, sino que disminuye la probabilidad de sensibilización del receptor y facilita el retrasplante. La acumulación de pacientes altamente sensibilizados en la lista de espera es un problema significativo en muchos centros, ya
que los pacientes esperan durante largos períodos de tiempo y pueden presentar problemas clínicos de difícil tratamiento (Sanfilippo, 1992).
Trasplante de órganos no renales
La supervivencias de los injertos de corazón, hígado, pulmón y páncreas
es buena, con entre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injertos en cinco años (Fig. 40-16). Los donantes normalmente no tienen concordancia en el tipo de HLA. y no se hace rutinariamente una reactividad cruzada pretrasplante con el donante. Se recomiendan los controles de anticuerpos
séricos para identificar el estado de sensibilización como un factor de riesgo
inmunológico para el receptor. Si es posible, los receptores de injerto y los
donantes cadáveres de injertos vascularizados no renales deben ser clasificados para el HLA para permitir análisis retrospectivos. Los datos recientes
de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordancia HLA en el
resultado del trasplante de hígado: sin embargo, los datos de la CTS muestran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el
resultado de los primeros trasplantes de corazón (Opelz, 1999). El período
aceptable para la preservación de la isquemia fría puede limitar la extensión
de la posible concordancia HLA en el trasplante cardíaco.
Figura 40-15. Supervivencia a cinco años de injerto cadavérico como una (unción
del número de antigenos HLA discordantes. El análisis Kaplan-Meier de la supervivencia del injerto con respecto a los antigenos discordantes HLA no se muestra pero
fue estadísticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. Wade J. y col:
Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transplantation-importance
of functional renal mass versus avoid-ance of acute rejections- the Toronto Hospita
experience 1985-1997. En Cecka M, Terasaki P [eds]:Clinical Trasplants 1998.
Copyright © UCLA Tissue Typing Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. con permiso.)
Trasplante alogénico de células progenituras
hematopoyéticas
El trasplante de células progenituras hematopoyéticas alogénicas se lleva a
cabo en neoplasias malignas y trastornos hematológicos, en el fallo de la medula ósea, en ciertos trastornos metabólicos heredados, como las enfermedades
de depósitos de lípidos. y en el síndrome de inmunodeficiencia congènita. A partir de una histocompatibilidad inicial, el mejor donante es o uno mismo (trasplante autólogo) si la neoplasia maligna no implica a la médula ósea o si la
Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serológicas para el HLA-A.
HLA-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de riñon de cadáver.
(MM = discordante). La asociación de la concordancia con el resultado del injerto
fue estadísticamente signilicativa (regresión p < 0. 0001). El análisis fue restringido a los trasplantes para los que se informó la división de especificidades HLA-A y
HLA-B al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T.
Dohler B. y col: HLA compatibility and organ transplant survival. Rev Immunogenet
1999; 1:334. con permiso.)
Figura 40-16. Supervivencia a cinco años del injerto de los primeros trasplantes
para el trasplante de órganos vascularizados en injertos de corazón, riñon de cadáver, hígado, páncreas, pulmón y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant
Study, proporcionado por y con permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz,
1999.)
946
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
enfermedad no es genética, o un gemelo idéntico (trasplante smgénico). Las
células progenitoras de donantes hermanos HLA idénticos son una fuente frecuente. Estas células donantes normalmente serán genéticamente idénticas a
las del paciente a lo largo de toda la región MHC. El empleo de un hermano
donante también aumenta la probabilidad de que los genes no HLA que pueden
afectar el éxito del trasplante y que no están bien definidos (i.e., genes de histocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1997). Los miembros de
una familia haploidénticos también pueden ser elegidos como donantes (Aversa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los donantes
HLA no emparentados. Basándose en los datos del Registro Internacional de
Trasplantes de Médula Ósea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron
a cabo más de 16.000 trasplantes alogénicos de médula osea desde 1996
hasta 1997: el 75% utilizaron donantes emparentados.
Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concordantes y se
puede considerar el trasplante con células de un HLA concordante, de donante no emparentado. Para facilitar la búsqueda de un donante concordante, se
han desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrededor del mundo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de
estos registros y contiene más de 3,9 millones de donantes HLA tipados, siendo el mayor registro de donantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994;
véase Tabla 40-1; www.marrow.org). Aproximadamente, el NMDP ha facilitado 8.100 (en el año 2000) trasplantes de donantes no emparentados desde
que el registro comenzó en 1987.
Los injertos de células progenitoras hematopoyéticas están entre los más
difíciles de todas las técnicas clínicas por varias razones (Madrigal. 1997;
Hansen. 1997). Primero, en el momento del trasplante, los receptores están
casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a la deficiencia heredada
(inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del acondicionamiento pretrasplante (quimioterapia citotóxica y radiación). El acondicionamiento se requiere para eliminar las células malignas y para prevenir al sistema inmune del receptor del rechazo de las células progenitoras del donante
que son infundidas muchos días después del acondicionamiento. La cantidad
de pretratamiento citotóxico es suficiente para eliminar los leucocitos circulantes, casi eliminar las plaquetas, y abrogar la producción de nuevos eritrocitos. Por ello, el receptor es profundamente susceptible a todo tipo de infecciones y ciertamente morirá si no se le rescata con cuidados médicos
extraordinarios y con translusión de células progenitoras.
El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunológíco del receptor por
las células progenitoras alogénicas trasplantadas originando una EICH. La
EICH tiene muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algunos centros de trasplantes han obtenido un éxito excepcional. Los recientes
informes de instituciones determinadas y la IBMTR sugieren una supervivencia libre de leucemia del 40% al 60% a los cinco años tras el trasplante de
células progenitoras hematopoyéticas no emparentadas a pacientes con leucemia mieloide crónica en fase crónica (Tabla 40-1, www.ibmtr.org) (Hansen.
1998). La supervivencia de los pacientes con anemia aplásica severa trasplantados con células de donantes no emparentados varía de un 30% a un
50% a los cinco años dependiendo de la edad del paciente (véase Tabla 40-1,
NMDP en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos
centros de índices de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998).
Además de médula como fuente de células progenitoras hematopoyéticas. la obtención de células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de células
progenitoras de sangre de cordón umbilical (Cairo, 1997) aumenta la disponibilidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmunosupresión. incluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos
(p. ej., "minitrasplantes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad
del trasplante de células progenitoras como técnica terapéutica en pacientes
actualmente excluidos por su edad o por su disfunción orgánica. El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas puede usarse también para
generar respuestas inmunes dirigidas contra las células tumorales. La recaída de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han recibido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algún grado de discordancia puede ser beneficioso en la estimulación de la respuesta inmune
contra las células tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resolviendo los problemas de esta técnica tan difícil, el trasplante de células progenitoras hematopoyéticas puede convertirse en uno de los métodos más
ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades (véase Cap. 33).
Tipificación HLA para el trasplante de células progenitoras.
Muchos factores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado
del trasplante de células progenitoras hematopoyéticas (Madrigal. 1997). El
trabajo pretrasplante incluye la tipificación del HLA-A. -B y -DR de todos los
miembros disponibles de los familiares más cercanos para identificar un
donante concordante relacionado y para establecer la herencia de los haplolipos. También puede ser apropiada la tipificación basada en el ADN de los
genes de dase II. que se ha convertido en un estándar, y la tipificación basada en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado en muchos centros.
La tipificación de la familia completa, la tipificación del nivel alélico (i.e.. alta
resolución) de los locus específicos HLA de clase I y II. la tipificación de otros
locus en el MHC (repeticiones en tándem cortas o locus complementario), o
el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de precursores de células T citotóxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999)
también puede ser adecuado.
El nivel de resolución de la tipificación del HLA requerido difiere para el
trasplante de células progenitoras hematopoyéticas y renal. Parece que para
el trasplante de células progenitoras se necesita una alta resolución de tipificación HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a
que el trasplante de células progenitoras incluye la transferencia de un sistema inmune completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en
definir los locus que deben considerarse en la selección del donante, el nivel
de resolución que debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de
las múltiples discordancias. El nivel de concordancia requerido puede variar
en cada enfermedad o protocolo. Las evidencias sugieren que la concordancia de un donante y un receptor no emparentados para los alelos HLA-A. -B
y -DRB1 está relacionada con una mejora del resultado. El impacto de la concordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C y HLA-DQ) está bajo estudio.
Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin embargo, las discordancias múltiples parecen tener un impacto negativo en el resultado (Sasazuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Además,
el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado
debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la
enfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervivencia tras el trasplante está reducida a medida que avanzan las lases de la
enfermedad (dalos en las páginas web señaladas en la Tabla 40-1).
RESUMEN
Las moléculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor
de histocompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el
carácter de las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas moléculas proporciona la diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en
un ambiente de patógenos hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta
capacidad del sistema inmune de distinguir lo propio de lo extraño se extiende al reconocimiento de las moléculas de HLA extrañas tras el trasplante tísular. La definición y la caracterización de los alelos y las moléculas del HLA se
han combinado con los protocolos clínicos para maximizar la compatibilidad y
minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejido extraño. Estos
avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una modalidad de
tratamiento con éxito en la sustitución del tejido enfermo.
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CAPÍTULO 40
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4 1
CAP
Complejo mayor de
histocompatibilidad y enfermedad
Julio C. Delgado, M.D.
Edmond J. Yunis, M.D.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III
949
Genes BF. C2y C4
Factor de necrosis tumoral
de linfotoxina
(y ) y genes
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O
CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS
MARCADORES GENÉTICOS
959
Polimorfismo genético
y
Fuerza de la asociación
Genes de la proteína 70 del golpe de calor
COMPLOTIPOS
952
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
952
TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO
953
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II
COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
954
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
955
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de
defectos en genes de MHC
Análisis del modelo de herencia basado
en parejas de hermanos
Análisis del modelo de herencia basado
en estudios de población
Método de cálculo de probabilidades
(Lod
Score
Method)
RESUMEN
964
BIBLIOGRAFÍA
961
Enfermedades de etiología y patogénesis desconocidas
Para comprender el papel del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) en las respuestas inmunes y en la patogénesis de la enfermedad se
requiere la definición de polimorfismo en la Clase I y Clase II, y los genes en
la región central del MHC. algunas veces llamada región no-HLA o región Clase III. Debe mencionarse desde el principio que existen regiones del ADN
donde aparecen recombmaciones con más frecuencia de lo esperado (esto
es, en el intervalo de HLA-DR a HLA-DP). Pero tiene particular importancia el
hecho de que hay zonas del ADN, o ADN fijado, donde raramente se observan recombinaciones. Las dos mayores constelaciones son la región del complemento en la región central, y HLA-DR. DO en la región Clase II Además,
el análisis de los haplotipos MHC en muchas poblaciones ha permitido reconocer que una proporción considerable de individuos tienen haplotipos específicos del grupo familiar que tienen un intervalo de HLA-B a HLA-DR. DQ
idéntico. Eslos haplotipos. llamados haplotipos extendidos se deberían considerar como unidades genéticas fijadas que. estudiadas junto con variantes
MHC que no forman parte de estos haplotipos. sirven para ayudar a comprender las respuestas inmunes y la asociación con la enfermedad. Las
variantes de los genes clase I y clase II se describen en el Capítulo 40. Aquí
se tratarán los genes y alelos de la región no-HLA, haplotipos extendidos,
asociaciones con la enfermedad y los métodos para detectar la asociación de
las enfermedades con los marcadores genéticos.
GENES EN LA REGIÓN NO-HLA O CLASE III
Existen alrededor de 1.100 kilobases (kb) de ADN entre la región clase I
y Clase II. generalmente llamada región no-HLA o clase III. Esta región
contiene genes que codifican proteínas de diversa función. Aunque las
moléculas clase I y clase II se distinguen por parecidos estructurales y funcionales compartidos con los miembros de cada clase, las moléculas de
clase III pueden definirse sólo como no-I y no-ll. porque sus genes y sus
productos no tienen rasgos comunes y no son reconocidos por las células
T. Incluye genes que codifican las proteínas del complemento C2 (C2). factor B {BF). C4 (C4A y C4S), el esteroide microsomal enzimático P-450 21hidroxilasa (CYP21). las citocinas como lactor de necrosis tumoral (TNF).
linfotoxina- (LT ). linfotoxina . (LF- ). tres miembros de la mayor familia de la proteína 70 del golpe de calor (HSP70-1. -2, -Hom) y varios genes
más (Trowsdale. 1995).
Se ha analizado toda la región clase III mediante electroforesis en gel con
campo pulsátil o clonando cromosomas artificiales de levaduras y vectores
cósmidos (Dunham, 1987; Kendall, 1990; Ragoussis, 1991; Sargent, 1989;
Spies. 1989). Se piensa que esta es una de las regiones con más genes del
genoma humano, con aproximadamente un gen por 15 kb (Fig. 41-1). Se
han secuenciado varios genes entre los genes C4A y HLA-B Algunos de
ellos se han llamado G, genes localizados en bandas Giemsa-negativas
(G1-G11) o BAT. trascripciones asociadas a HLA-B (BAT 1-9) (Sargenl,
1989; Spies. 1989). Gf codifica el factor 1 inflamatorio de alomjerto, y la
transcripción del interterón- (INF- ) (Utans. 1995) Los genes G6 a G7
codifican proteínas putativas que pertenecen a la superfamiha Ly-6. que se
sabe son importantes en la maduración de los leucocitos (Ribas, 1999). El
transcriptor-1 específico de leucocitos representa el homólogo humano del
transcriptor del ratón B144 y codifica un transcriptor inducible de IFN- . que
existe en los tejidos linfáticos, células T. macrólagos y lineas celulares histocitarias (Holzinger, 1995). IKBL codilica un miembro putativo de la familia
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
de proteínas ikB involucradas en la regulación de la expresión de los genes
de citocinas (Albertella. 1994). La secuencia completa de 1C7 ha revelado
que este gen codifica un nuevo miembro putativo de la superfamilia Ig (Neville, 1999). RD. SK12W, DOM3Zy RP1 son cuatro nuevos genes encontrados entre Bf y C4. Las proteínas RD y Ski2w pueden estar relacionadas a
empalmes del ARN, renovación del ARN y la regulación de la traducción.
Las funciones de Dom3z y RP1 están siendo investigadas (Yu. 1998).
La región entre los genes C4A y HLA-DR se ha estudiado con los mismos
métodos. Se han identificado vanos genes, incluyendo NOTCH-4, G18.
PBX-2 (G17), RAGE. G16, G15, G14. G13 (Creb-rp). GI2y TNX, en un segmento de 160 kb del ADN centromérico al gen C4A (Aguado, 1996). Alguno
de ellos (G13-G15). expresa proteínas involucradas en el metabolismo lipidico (Aguado, 1998. 1999). Un par de genes, TNXA y TNXB. organizados
en la orientación transcripcional opuesta a otros genes en esta agrupación,
codifican proteínas extracelulares similares a tenascina y restrictina, que
están presentes en el sistema nervioso central y periférico y en el músculo
liso (Yang, 1999).
Genes BF, C2 y C4
Los C2 y C4 de la via clásica y el factor B de la vía alternativa del complemento son codificados por una región 120 kb del ADN genómico de unos
300 kb de HLA-DR y 650 kb de HLA-B (Carrol. 1984). C2 y BF muestran una
semejanza considerable en la secuencia de aminoácidos y comparten un
número de características físico-químicas y funcionales, lo que sugiere que
ambos genes surgieron por duplicación en tándem de un gen ancestral similar al factor B. Ambos son serín-proteasas (de la familia SERPIN de proteínas del plasma) y median la escisión de C3 durante la activación de las respectivas rutas. C4, por otra parte, está relacionada estructural y
funcionalmente con C3 y C5 y como contiene un tioléster interno muy reactivo, se relaciona con C3 y el inhibidor de la proteasa « -macroglobulina.
Aunque el gen para C3 está ligado ligeramente al MHC en el ratón, en el
hombre está en un cromosoma completamente diferente. Junto a 3' en cada
locus C4 hay dos locus para el enzima adrenocorticoideo 21-hidroxilasa
(CYP21A y CYPB). (Carroll, 1985: Higashi. 1986: White. 1986). Los dos
genes tienen aproximadamente 3.4 kb de longitud y se dividen en 10 exones. En cierto modo son homólogos, pero tres mutaciones causan una terminación prematura de la transcripción del gen CYP21A. conviniéndolo en
unseudogen (White. 1988).
951
Hay un alelo no expresado (C2'QO) que se encuentra en el 2% de la
población caucásica europea.
C4 se sintetiza como un único gran polipéptido de unos 200 kDa que
sufre un proceso postsintético que incluye la proleólisis de una estructura
de tres cadenas unidas por enlace disulfuro. La cadena más larga, de unos
87 kDa. es la cadena a y transporta el tioléster interno. Durante la activación de la vía clásica del sistema de complemento. Cls activado escinde un
pequeño péptido con propiedades de analilotoxina por el extremo ammo de
la cadena (/. C4. Hay dos locus distintos C4A y C4B que codifican dos formas de C4. C4A y C4B se diferencian sólo por cuatro residuos aminoácidos
en la cadena a. entre las posiciones 1101 y 1106. Asombrosamente, C4A
acetila preferentemente grupos ammo, mientras que C4B acetila preferentemente grupos hidroxilo. Así, C4B es hemolíticamente más activo, pero
C4A es más activo que C4B inhibiendo la formación y disolviendo inmunocomplejos. Las variantes de C4 generalmente transportan determinantes
antigénicos Rodgers (un epitopo Val-Asp-Leu-Leu de la cadena C4A), y
variantes de C4B transportan determinantes Chido (un epitopo Ala-AspLeu-Arg de la cadena o. de C4B). Hay un polimorfismo genético amplio,
detectable por electroforesis de gel de agarosa en proteínas C4A y C4B en
todas las poblaciones examinadas (Awdeh, 1980). Se han reconocido al
menos 18 alelos C4A. 21 alelos C4B y un gen no expresado (C4'Q0) de
cada locus C4 (Mauff.1990). Se han identificado producios genéticos aberrantes o híbridos con características en parte C4Ay en parte C4B Más sorprendente es la variación en el número de genes C4 en algún haplotipo individual. Aunque es más habitual tener un C4A expresado y un C4B
expresado, la homoduplicación y la heteroduplicación son habituales, como
son los haplotipos con un solo gen C4 expresado. C4A'3y C4B'1 son los
alelos más comunes en casi todas las poblaciones. C4A'4. C4A'2. C4B'2y
C4B'5 muestran una distribución universal. C4A'6 también se observa en
muchas poblaciones excepto en algunos grupos mongoloides. C4B'3 se
identifica principalmente en grupos caucásicos y africanos.
¿
El factor B es sintetizado por el gen BF. Durante la activación de la vía
alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en un fragmento aminoterminal Ba de 30 kDa y un fragmento Bb de 60 kDa. Mediante electroforesis con gel de agarosa. la proteína muestra un moderado polimorfismo con dos alelos muy comunes, BF'F (rápido) y BF'S (lento), dos
alelos menos comunes, BF'F1 (más rápido) y BF'SÍ. también llamado
BF'S07. (más lento), y un huésped de alelos raros. Con electroforesis,
BF'F puede subdividirse en dos subtipos, BF'FA y BF'FB. BF'FB tiene dos
variantes, FB1 y FB2. Hay variantes de BF'S. llamados SSf, 2y 3. La sustitución del aminoácido responsable de las variantes comunes de BF'FA.
BF'FB y BF'S viene determinado por los residuos encontrados en el Iragmento Ba. mientras que los de BF'F1 y BF'Sí están localizados en el fragmento Bb. En las poblaciones caucásicas europeas, BF'F tiene una frecuencia de 0,2, BF'S 0,77. SF'Ff 0,01. BF'Sí 0,01, y un recuento de
alelos raros sólo un 0,002. BF'S es el más común en las poblaciones caucásicas, mongoloides y australoides, mientras que BF'F es la más común
en las poblaciones negroides. BF'F1 se observa en grupos africanos asi
como en algunas poblaciones caucásicas.
El gen C2 tiene 18 kb de longitud. Durante la activación de la vía alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en los aminoácidos
223 y 224, un enlace arginina-lisina, en dos fragmentos. C2a y C2b. C2a
es hemolíticamente activa. A nivel proteico, C2 muestra por electroforesis
un polimorfismo menor. Los alelos son C (común), un alelo 6 (básico)
menos común con tres variantes básicas raras y cuatro variantes A (acidícas) raras. La localización polimórfica para el alelo C2'B es transportada
por el fragmento C2A. C2'C supone más del 95% de los genes C2 en la
mayoria de las poblaciones. C2'B supone del 3% al 4% de los genes C2.
Factor de necrosis tumoral a (y |5) y genes
de linfotoxina a y p
Los genes TNF y LTA o TNFB codifican potentes citocinas inmunomoduladoras que son producidas en respuesta a varios estímulos inflamatorios. El TNF-rx se produce en una variedad de células hematopoyéticas y
no hematopoyéticas, y LT-a específicamente por linfocitos (Carroll. 1987).
TNFo. y LT-a forman trímeros biológicamente activos y ambos se unen a
los mismos receptores de 55 kDa y 75 kDa (Bazzoni. 1995).TNF-</ y TNFjj son codificados cada uno por genes separados y comparten aproximadamente el 34% de la identidad de aminoácidos (Carrol. 1987). Los genes
que codifican TNF y LTA están localizados en una región 7kb centromérica
250 kb del gen para HLA-B y telomérica 355 del gen para C2. TNF-a y LTa se mantienen como moléculas de superficie de las células o son liberadas de las células. LT-a se retiene en la superficie de la célula por una
región transmembrana. La superficie TNF-a no resulta de la presencia de
una región transmembrana sino más bien de una membrana glicoproteica
de 33 kDa conocida como linfotoxina-p" (LT-(i) (Browning, 1993). LT-js" tiene un 21% y 24% de identidad con TNF y LT-a. respectivamente El gen
para LTB contiene cuatro exones, giros de 2 kb y está localizado entre los
genes TNF y LST1.
Hasta la fecha, se han identificado nueve polimorfismos en los iniciadores TNF-a, localizados en los nucleótidos -1031,-863, -857, -575. -376, 308. -244. -238 y +70 relacionados con el lugar del comienzo de la transcripción (Brinkman. 1994,1995: D'Alfonso, 1994: Hamann. 1995: Higuchi.
1998: Uglialoro, 1998; Wilson. 1992: Zimmerman, 1996). Dos endonucleasas, EcoRI y Ncol, han mostrado modelos polimórficos con el gen LTA
(Messer, 1991; Partanen. 1998). La secuencia polimórfica para el enzima
EcoRI está localizada en el exón 4. mientras que la secuencia para Ncol se
ha localizado en el primer intrón del gen LTA. Se han identificado las
secuencias de ADN que constan de longitudes variables de repeticiones
TC.'GA o AC'GT o microsatélites dentro de la región de los genes TNF
usando secuenciación con gel de poliacrilamida. (Nedospasov, 1991) Hay
952
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
cinco microsatélites: los microsatélites TNFa y TNFb están localizados en
la región telomérica 3.5 kb al gen TNFB y se han identificado 7 y 13 alelos,
respectivamente. El microsatelite TNFc está localizado en el intrón 1 del
gen TNFB y tiene dos alelos. TNFdy TNFe, que tienen siete y tres alelos,
respectivamente (Jongeenel. 1991).
Genes de la proteína 70 del golpe de calor
Las proteínas de estrés o proteínas de goipe de calor se expresan en respuesta a una variedad de estímulos de estrés a las células. Esta respuesta se
ha observado en todas las especies examinadas hasta la fecha. La familia de
las proteínas de estrés de 70 kDa tiene una alta identidad de secuencia de
aminoácidos desde los primitivos eucanotas hasta los humanos. Varios estudios han demostrado el locus para la proteína 70 del golpe de calor (HSP70)
en los cromosomas 6. 14, 21 y al menos en otro cromosoma autosómico
(Hunt. 1985: Sargent, 1989). Tres genes que codifican a los miembros de la
familia HSP70 están localizados en la telomérica 92 kb al locus C2 {HSP701, HSP70-2 y HSP70- Hom).
Los análisis secuenciales de genes HSP70-1 y -2 han mostrado que hay
genes carentes de intrón que codifican un compuesto proteico idéntico de
641 aminoácidos. HSP70-Hom también es un gen carente de intrón que
codifica una proteina de 641 aminoácidos y tiene un 90% de identidad de secuencia con HSP70-1 (Milner. 1990). Debido al alto grado de similitud de
secuencias entre las regiones codificadoras de los genes HSP70. las sondas
de ADN que corresponden a las regiones codificadoras tienden a la hibridación cruzada. Sin embargo, hay suficiente diferencia de secuencias entre
las regiones no traducidas 5' y 3' del HSP70-1. -2 y -Hom para designar
cebadores de oligonucleótido y sondas que permitan la ampliación específica e hibridación de los tres genes (Milner. 1992). Se han detectado tres
sustituciones de nucleótidos en las regiones 5' flanqueadoras y no traducidas de HSP70-1: una transversión A-*C en la posición -110, una transición
T-»C en la posición +120, y una transversión G->C en la posición +190. Se
ha demostrado que variaciones en la posición -110 y +120 influyen en la
movilidad en la electroforesis en gel de políacrilamida. Se han reconocido
tres formas alélicas: HSP70-1 A (lenta), 8 (rápida) y C (intermedia). Las
sondas de oligonucleótidos que contienen variaciones de secuencia en la
posición -110 y +120 pueden también detectar los tres alelos. después de
una reacción de ampliación en cadena de la polimerasa específica (PCR)
del gen HSP70-1. En HPS70-2. una transición G->A en la posición 1267
provoca la pérdida de un lugar de restricción Psl-I. La hibridación de ADN
digerido genómico Psl-I con una sonda HSP70 provoca un fragmento polimórfico de ADN. de 8,5 kb o 9 kb de longitud. En el gen HSP70-Hom. hay
una transición T~*C en la posición 2437 que se encuentra dentro de un
lugar de restricción Nco-I y produce dos fragmentos alélicos de 1.5 kb y 0,5
kb, respectivamente.
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
Del estudio de la distribución de los complotipos según las especificidades
HLA-B y HLA-DR en haplotipos normales caucásicos determinados por estudios de familias, se hizo evidente que existia un notable desequilibrio de ligamiento que afectaba a toda la región. Se podía fácilmente reconocer el HLAB. complotipo, grupos de alelos DR que mostraban tres puntos de
desequilibrio de ligamiento estadísticamente significativos (Fig. 41-2) y que
definían los que se denominan haplotipos extendidos (Awdeh. 1983). Estos
haplotipos extendidos, que suponen al menos un 30% de los haplotipos normales caucásicos, tienen una estructura voluminosa y una secuencia de ADN
relativamente fija y transportan alelos si no idénticos, muy parecidos, incluso
cuando se encuentran en individuos sin relación aparente. Otro rasgo importante de los haplotipos extendidos es su asociación con ciertos grupos raciales. En su mayoría, son muy característicos de un subgrupo étnico y tienen
frecuencias más bajas o no existen en absoluto en otros grupos étnicos. Tienen presumiblemente su origen en el grupo donde su frecuencia como haplotipos intactos es la más alta. Hay más de una docena de haplotipos extendidos comunes en los caucásicos (Alper. 1992). Se han descrito diferentes
haplotipos extendidos para diferentes razas (p. ej. afroamericanos) (Fraser,
1990).
Estudios iniciales definieron los haplotipos extendidos como el intervalo
entre HLA-B y DR. Entonces se observó que otros alelos del MHC no caracterizados en el intervalo probablemente estaban incluidos. Al contrario, a
pesar de que los alelos HLA-A han mostrado una variación limitada para los
haplotipos extendidos, sólo la mitad de estos haplotipos muestran asociaciones únicas significativas de alelos HLA-A (Alper. 1982). El gen HLA-Olue el
último en ser determinado. Según la distancia genética y los datos de identificación previamente incompletos de los pares HLA-B/Cw. era evidente que
los haplotipos conservados también incluirían la región genética HLA-Cvt.
Recientemente, se han asociado diferentes alelos HLA-Cw con diferentes
haplotipos extendidos (Tabla 41-2) (Clavijo, 1998).
El autor ha desarrollado el concepto de que los haplotipos extendidos
poseen una fijación al ADN al menos en el intervalo HLA-B/DR y. por lo tanto, si transportan un gen de susceptibilidad para una enfermedad, implícitamente todos los eiemplos independientes de ese haplotipo mostrarán asociación con esa enfermedad. Y al contrario, si el haplotipo extendido no tiene
un gen de susceptibilidad para una enfermedad, entonces él y los alelos que
lo constituyen protegerán frente a la enfermedad. Es esencial conocer la distribución étnica de un haplotipo extendido para evaluar si el haplotipo extendido en pacientes está aumentado comparado con una población control
étnicamente equivalente o es realmente de hecho un marcador para la distribución étnica de la enfermedad.
COMPLOTIPOS
Tabla 41-1
En humanos, los genes C2 y BF están muy cercanos el uno al otro,
separados por menos de 2 kb. pero BF y C4A están separados por unos
30 kb. C4A y C4B están separados por unos 10 kb. Los cuatro genes complementarios muestran un notable desequilibrio de ligamiento en haplotipos determinados por estudios de familias. Es decir, aparecen en poblaciones juntas como grupos y en el mismo cromosoma con más frecuencia
de la esperada a la de sus alelos individuales más o menos de la misma
manera que los alelos en los sistemas de grupos sanguíneos Rh y MNS.
No se han documentado recombinaciones entre los genes complementarios. Por estas razones, se consideran de forma correcta como unidades
genéticas únicas, o complotipos. arbitrariamente designados por sus alelos
BF. C2. C4A y C4B. Asi, BFS. C2'C. C4A'00. C4B 1 es un complotipo
que en forma abreviada es SC01. Hay más de una docena de complotipos
en caucásicos que tienen frecuencias de casi un 0,01 o más (Tabla 41-1).
El complotipo SC31 es el más común en la mayoría de las poblaciones. En
las poblaciones negroides, FC31 es común, como lo es SC42 en los mongoloides asiáticos.
¡
Complotipos comunes e n cromosomas normales d e
poblaciones caucasoides*
Complotipo
Frecuencia
SC31
0,43
SC01
FC31
0.096
SC30
0.053
SC42
0,04
SC61
0.034
FC30
0,031
FC01
0.029
SC02
0.029
SC21
0.022
SB42
0.019
SC33
0,014
SC2(1, 2)0.013
SC32
0.011
"Los complotipos so dan como letras abreviadis y números, con cuatro alelos
en orden arbitrario: BF. C2. C4A. C4B
- El locus C4B esta heleroduplicado
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
953
Figura 41-2. La distribución de haplotipo de los complotipos (haplotipos de los alelos complementarios) SC01 {BF'S. C2'C. C4A'00. C4B'1)
y SC21 (BF'S. C2'C. C4A'2. C4B'/)en relación con los alelos HLA-B en ordenadas y los alelos HLA-DR en abcisas. Las alturas y anchuras
que representan cada especificidad HLA son proporcionales a las frecuencias de los alelos para las respectivas poblaciones. Los racimos
representan los desequilibrios de ligamiento y los círculos los haplotipos extendidos (HLA-B16(38). SC21. DR4) en los judíos asquenazies y
[HLA-B8. SC01. DR3) en los ingleses y. con un alcance mucho menor, en los judíos. (De Alper CA. Awdeh Z. Yunis EJ: Conserved. extended
MHC haplotypes. Exp Clin lmmunogen1992; 9:58; con permiso de S. Karger)
TIPIFICACIÓN DEL COMPLEMENTO
El sistema complemento está dividido en dos vías: la vía clásica que contiene nueve diferentes componentes totalizando al menos 12 proteínas, y la
vía alterna que contiene cuatro. Tres de las 16 proteínas están codificadas
dentro del MHC y manifiestan variantes estructurales heredadas que pueden estudiarse por técnicas que detectan diferencias en la carga superficial
neta debidas a diferencias en los aminoácidos. Se utilizan dos métodos
para separar las proteínas (1) electroforesis en gel de agarosa de alto voltaje para detectar variaciones de movilidad entre proteínas a un pH determinado y (2) electroforesis en geles de poliacrilamida de capa fina, que
demuestra diferencias en puntos isoeléctricos. Las proteínas pueden obser-
Tabla 41 -2 Distribución d e l alelo HLA-Cw e n relación c o n
haplotipos extendidos c o m u n e s *
Haplotipo extendido
[HIA-R8. SCOI. DR3¡
¡HLA-B7. SC31. DR2¡
[HLA- B44. FC31. DR7]
[HLA-B44. SC30. DR4]
(HLA-B57, SC6I. DR7¡
[HLA-B14. SC22. DR1]
[HLA-B35. SC31. DR5]
¡HLA-B38, SC21. DR4]
¡HLA-B 15. SC33. DR4)
[HLA-B 18. F1C30. DR3I
[HLA-B 18. S042. DR2]'
[HLA-B42. FC(1.90) 0. DR3f
Alelo HLA-Cw
0701
0702
1601
0501
0602
0802
0401
1203
0304
0501
1203
1701
'Dalos Oe cromosomas de población normal caucasoide de Boston.
•Datos de pacientes con deficiencia de C2 De Clavijo OP. Delgado JC. Awdeh
ZL. y col: Tissue Antigens 1998. 52 282
Datos de cromosomas de población normal negra que vive en Boston De ClaVIJO OP, Delgado JC. Yu N. y col Tissue Antigens 1999: 54 303
:
varse por electroforesis de inmunofijación usando la insolubilidad de los
complejos antígeno-anticuerpo o por la detección de actividad hemolítica
funcional con geles sobrepuestos donde los hematíes de oveja sensibilizados con anticuerpos se combinan con suero deficiente en complemento
(Awdeh. 1983) (véase Cap. 38).
Las proteínas de la vía clásica |C2. C4A y C4B) y una de la vía alterna (BF)
están codificadas dentro del MHC. son polimórficas. y por lo tanto útiles para
la misión de los haplotipos del MHC. Para la tipificación de C2. las proteínas
se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se visualizan por
hemolisis C2-inducida en geles superpuestos. El suero humano normal diluido puede reemplazar el suero deficiente en C2 como un reactivo porque C2
es el factor limitante en la vía clásica (Fig. 41-3).
La tipificación de C4 requiere tres técnicas diferentes:
1. Electroforesis de inmunofijación tras el tratamiento con neuramimdasa.
Los patrones producidos muestran tres bandas para cada variante con
alguna coincidencia entre ciertas variantes. Un tratamiento adicional de la
muestra con carboxipeptidasa reduce cada variante a una sola banda.
2. Detección de C4A frente a C4B mediante un ensayo funcional hemolitico.
Este método distingue C4A o patrones sobrepuestos de C4B porque las
variantes de C4B tienen de 5 a 10 veces la actividad hemolítica de las
variantes de C4A.
3. Reactividad serológica Rodgers (C4A) o Chido (C4B). El suero se incuba
bien con anti-Rodgers humanos o con anti-Chido humanos para probar la
inhibición de la aglutinación con eritrocitos positivos apropiados.
Alternativamente, las variantes de C4 pueden tipificarse por reactividad
Chido o Rodgers mediante inmunotransferencia. Hay dos formas de detectar
alelos nulos de heterocigotos C4. La electroforesis de muestras de C4 nulos
(C4AVO y C4B'QO) demuestra ausencia de bandas en homocigotos pero
en heterocigotos requiere la cuantificación por inspección visual, por inmunoelectroforesis cruzada o por barrido densitométnco de los patrones de inmunofijación. Un método alternativo consiste en determinar la presencia y las
relaciones de las cadenas (/ de C4A y C4B tras la electroforesis de inmunoprecipitados en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato sódico.
954
SECCIÓN V
Hl
1)2 B3 B4 »5
B6 1)7
Al
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
A7 A2 A3 A4 A3
A6
C4
Figura 41-3. Posiciones electroloréticas de vanantes de C4 relacionadas unas con otras (diagrama) Las variantes del locus C4B (Chido) se muestran a la izquierda, y las del locus C4A (Rodgers) se
muestran a la derecha Cada gen consta de tres Bandas. Se observará que alguna de las variantes de C4B corresponden exactamente a
la posición de las variantes de C4A (B7 y A2. por ejemplo) La distinción entre ellas se hace mediante un gel de agarosa superpuesto sensible a C4 donde sólo las variantes de C4B tienen una actividad
hemolítica activa C4 (Awdeh, 1980). El BQOy AQO (alelos nulos) no
muestran bandas. En la posición más baja (lado izquierdo) de la figura, se muestran ejemplos del tipo común C2 (C) y un heteroogoto
(BC) mediante electroloresis en gel de poliacrilamida con gel de agarosa superpuesto, conteniendo hematíes de oveja sensibilizados con
anticuerpos y una dilución 1/90 de suero humano normal. En la porción más baja (lado derecho) de la figura, se muestran ejemplos de
patrones electroloréticos de vanantes BF tras eleclroforesis con gel
de agarosa e inmunofi|ación con antisueros anti-lactor B Cada gen
consta de una banda mayor y otras dos menores. El ánodo estaba a
la derecha.
La tipificación del factor B se realiza después de una electroforesis prolongada en gel de agarosa e inmunofi|ación. Los modelos homocigóticos constan de una banda mayor y unas bandas menores rodeando, y los patrones
heterocigóticos son la suma de dos patrones homocigóticos.
PAPEL DE LAS MOLÉCULAS MHC CLASE I Y CLASE II
COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
Los genes que controlan la respuesta inmune a antígenos extraños fueron
descritos inicialmente en modelos animales. Se demostró que estaban localizados dentro de la región de la clase II del MHC. Se ha demostrado que las
células presentadoras de antigenos (APC) procesan fragmentos de antígeno
y presentan a estos péptídos como complejos con las moléculas clase I y clase II, iniciándose así la respuesta inmune.
En los últimos años, se han producido avances significativos en la comprensión de la base molecular de la presentación del antígeno MHC, básicamente como resultado de la determinación de la estructura tridimensional de
las moléculas de clase I (Bjorkman. 1987). y clase II (Brown. 1993). y la caracterización de la unión de los péptídos a las moléculas MHC (Jardetzky, 1991;
Stem. 1994). La estructura cristalina del péptido ligado a las moléculas Clase
II ha demostrado que las cadenas laterales del péptido están localizadas en
pequeñas cavidades, llamadas bolsillos, en el lugar de unión. Estos bolsillos
varían de acuerdo a los aminoácidos codificados por cada alelo HLA. Las
mutaciones puntuales en los genes clase II son criticas para la unión del péptido y la presentación y ocurre normalmente dentro o cerca de los bolsillos de
unión al péptido. Así, la diferenciación de los alelos HLA es crucial para la
interpretación de HLA y asociaciones con la enfermedad. Los métodos para
la caracterización de los alelos clase I y clase II se han descrito en el Capítulo 40. Parece que algunos bolsillos juegan un papel en algunas enfermedades. Por ejemplo, ciertos alelos que codifican el bolsillo de unión al péptido.
P4 o la cadena DRp\ están asociados con artritis reumatoide (Hammer. 1995)
y lepra tuberculoide (Zerva. 1996), mientras que otras que codifican el bolsillo P9 o la cadena DQ|i están relacionadas con la tuberculosis clínica (Goldfeld, 1998), pénfigo vulgar (Delgado, 1997) y protección frente a diabetes
insulino-dependiente (Todd, 1987).
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
Hay un número notable de enfermedades que muestran asociación con
HLA. La mayoría, aunque no todas, son autoinmunes y no muestran una
herencia mendeliana bien definida. El gran número de enfermedades asociadas con HLA se debe al hecho de que el MHC contiene muchos genes
importantes y porque los genes de la región, incluso los genes no-HLA, son
extraordinariamente polimórficos. En una región donde la densidad de genes
se muestra anormalmente alta, esto provoca un gran número de genes de
potencial susceptibilidad. Un problema importante con los genes de susceptibilidad de MHC es su penetrancia incompleta, haciendo muy difícil,
sino imposible, la segregación formal habitual y los estudios de ligamiento.
Además parece probable que muchas enfermedades asociadas a MHC
sean poligénicas. Debido a estos problemas, el autor comenzará su exposición con las alteraciones determinadas por MHC que muestran herencia
mendeliana y un 100% de penetrancia, al menos para el defecto bioquímico primario.
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de
defectos en genes de MHC
Las variaciones frecuentes de los componentes del complemento humano
y la cantidad de genes, junto al amplio polimorfismo de las proteínas, hace
que los genes de complemento sean excelentes marcadores de asociaciones
de enfermedad con el complejo de histocompatibilidad (Yang, 1999).
Deficiencia de C2
La deficiencia del segundo componente del complemento se ha descrito
sólo en caucásicos y es el estado deficitario de proteína del complemento
más común en esa población. Aproximadamente la mitad de los pacientes
son asintomáticos. Sin embargo, la deficiencia de C2 se ha asociado con
polimiositis, infecciones piogénicas recurrentes, púrpura Henoch-Schónlein
y vasculitis. El cuarenta por ciento de los casos descritos tienen una enfermedad sistémica tipo lupus; sin embargo, sólo el 16% de los hermanos
homocigóticos deficientes en C2 han tenido alteraciones tipo lupus. Esto
aconseja con firmeza la investigación de errores sistemáticos. No obstante, existe una clara tendencia aumentada de los sujetos homocigóticos
deficientes en C2 a tener alteraciones tipo lupus, quizá relacionado con
una depuración o desagregación defectuosas de los inmunocomplejos. La
deficiencia de C2 tipo I resulta de la homocigosidad del alelo nulo. C2"QO,
que tiene una frecuencia de gen de un poco menos de 0,01. Hay aproximadamente 1 homocigoto por cada 10.000 individuos. Casi todos los
pacientes tienen elementos de un haplotipo extendido [HLA-A25. Cw'1203,
B18. S042. DRBV1501. DQBI'0601. DQAV0102] que contiene un gen de
deficiencia en C2 (Awdeh, 1980; Clavijo, 1998; Truedsson, 1993). Las asociaciones de complotipo son más frecuentes, seguidas por las asociaciones del DR, HLA-B, HLA-CW y HLA-A, de acuerdo con el orden de gen
conocido. C2"Q0 resulta de la deleción de un gen de 28 pb que genera un
marco de lectura y un codón finalizador de 14 pb distal al final del exón 5.
La deficiencia de C2 tipo II (no asociada con ningún elemento de los haplotipos tipo I) es muy rara y produce un bloqueo selectivo de la secreción de
C2. El motivo del bloqueo de esta secreción no se conoce (Colten, 1992;
Zhu, 1998).
955
y otras mutaciones que producen fallos en la transcripción (Braun, 1990;
Lokki, 1999). El alelo C4A'O0. particularmente en individuos homocigóticos o
en aquellos con deficiencia completa de C4, se ha asociado con lupus eritematoso discoide y sistémico (Dunckley, 1987; Nousari, 1999). Esta susceptibilidad probablemente se relaciona también con un manejo defectuoso de
inmunocomplejos, como en la deficiencia de C2 y otras deficiencias del primer
componente del complemento (Fielder, 1983). Los homocigóticos C4B'Q0se
han asociado con nefropatia de inmunoglobulina A (IgA). Además, hay una
incidencia 3.5 veces mayor de homocigóticos C4B'Q0 en niños con meningitis bacteriana (Colten, 1992). El nivel de C4 en suero en pacientes con alelos
C4 nulos es extremadamente variable y no puede utilizarse con fiabilidad para
detectar heterocigotos para una deficiencia completa, incluso aunque haya
una correlación aproximada entre el nivel de C4 y el número de genes C4
expresados.
Hiperplasia suprarrenal congénita por deficiencia
de 21-Hidroxilasa
Esta alteración es clínicamente heterogénea, con una forma grave con
depleción salina, una forma más leve tardía manifestada en gran parte por
masculinización en las chicas, y una forma leve oculta. El vínculo con el
MHC de esta alteración lúe descubierto antes de que tuese detectada ninguna asociación de MHC y antes de que se supiera que los locus CYP21
estaban localizados en el MHC. Posteriormente se encontró que en los caucásicos europeos estudiados en el noreste de Estados Unidos y en Inglaterra, el 20% o más de los haplotipos en los pacientes con la forma con depleción de sales tenían el haplotipo extendido raro [HLA-A1. Cw6, B47, FC
(91)0. DRB1 '07. DRB4'0101. DQAV0201. DQBV0201] (Fleischnick,
1983). Se ha demostrado que este haplotipo tiene una deleción tanto de
C4B como de CYP21B. explicándose asi la gravedad de los síntomas y la
deficiencia completa del enzima en homocigotos para este haplotipo. Entre
los pacientes con la enfermedad más leve y oculta, es común un haplotipo
extendido diferente; [HLA-B65. SC2(1.2>, DR1] (Sinnot, 1991). Este haplotipo es común, particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia
en caucásicos de Boston por encima de 0,01. En todas las formas de deficiencia de 21-hidroxilasa, la mayoría de haplotipos de MHC no están extendidos y hay una gran variedad de complotipos, lo que sugiere que muchas
mutaciones independientes han provocado una deleción o una alteración
del gen CYP21B.
De estas observaciones, se pueden extraer algunos principios generales
para la posible aplicación a estas enfermedades de herencia y patogénesis
desconocidas que presentan asociación o ligamiento con MHC. Primero, si un
gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo
extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán asociaciones positivas
con la enfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarán una asociación negativa con
la enfermedad. Como los haplotipos extendidos tienen fijación al ADN en
eiemplos independientes de haplotipo extendido asociado a enfermedad, y
son comunes, las personas sanas deben transportar genes de susceptibilidad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC, y particularmente los
haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especificidad en la población, Es por tanto particularmente importante en estudios de marcadores de
MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los de
pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados étnicamente.
Idealmente, el apareamiento étnico debería incluir regiones específicas de origen o subgrupos étnicos.
Deficiencia de C4
Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la población general. El treinta y cinco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A
o C4B (esto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos
nulos, y menos del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de
haplotipos C4 (Irans C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden
detectarse en heterocigotos sólo con estudios de familia. En contraste con la
deficiencia de C2, la deficiencia de C4 se ha descrito en al menos nueve
haplotipos MHC diferentes, incluyendo aquellos con tipos BF diferentes, lo
que sugiere que la deficiencia surge de un número de mutaciones diferentes.
C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes, codones finalizadores
Enfermedades de etiología y patogénesis
desconocidas
Se han descrito un gran número de enfermedades que muestran asociaciones con MHC. Estas alteraciones son muy diferentes de unas a otras
y, aunque la mayoría tienen al menos algún aspecto inmunológico, otras
pocas no. Hay muchos problemas que impiden comprender los mecanismos por los que se producen estas enfermedades, y los análisis de marcadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panorama
sólo secundariamente. El origen más importante de confusión es un fenó-
956
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado más claramente en gemelos homocigóticos que presumiblemente tienen genes idénticos. Si uno de estos gemelos tiene una de estas enfermedades (p. ej.,
diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo no tiene necesariamente la enfermedad. Para la diabetes tipo I. la relación de concordancia no es superior
al 50°c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetrancia de una enfermedad en un huésped completamente susceptible es incompleta: aunque
hay una importante razón para considerar a los genes en el MHC como
determinantes de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. sólo el 15% de
los hermanos con MHC idéntico de los pacientes tienen diabetes insulinodependiente. La diferencia entre el 50% y el 15% muestra la influencia de
los genes en un segundo locus (o locu) no ligado a MHC, y también sugiere un factor o factores ambientales en la susceptibilidad determinante. La
penetrancia incompleta hace difícil la asignación de una forma especifica
de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar familias con más
de un miembro afectado en una o más generaciones sea ba]a. Normalmente se utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros
factores que complican la situación son la incapacidad para determinar si
se está estudiando un grupo de pacientes homogéneos en términos de
determinación genética. Casi el 5% al 6% de las familias seleccionadas al
azar con un miembro diabético tipo I tendrá un segundo niño afectado. De
estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendrá un MHC idéntico, el 35% serán haploidénticos, y un pequeño porcentaje no compartirá
haplotipos MHC. Este patrón sugiere una herencia recesiva de un gen de
susceptibilidad ligado a MHC para la enfermedad. Esta conclusión también
se basa en los resultados de los análisis de distribución de homocigotos y
heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabéticos tipo I (Raum. 1981). Sin
embargo, todavia se ha de explicar la desviación del 100% de identidad
MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan están
el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impenetrantes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia,
incluyendo penetrancia variable en homocigotos comparado con heterocigotos. Esto ha conducido a un vasto número de modelos de enfermedad
sin encontrar una manera de hacer distinción entre ellos. Al menos, sin
embargo, los estudios de familia proporcionan datos de haplotipos muy útiles y generalmente permiten la asignación de homocigosidad para un marcador HLA en los individuos de prueba. También se ha establecido que la
asociación MHC está basada en un ligamiento entre un gen de susceptibilidad y el MHC.
Se desconoce todavia el número de alelos de susceptibilidad diferentes
para una enfermedad en una población específica. Con respecto a esto, los
haplotipos extendidos pueden ser útiles porque, si están aumentados en los
pacientes, probablemente representan un alelo único de susceptibilidad que
pudiera estar en cualquier lugar en la región de fijación. Sin embargo, algunos pacientes presentan sólo porciones de esos haplotipos y esto proporciona indicios para localizar la participación de los alelos específicos. Otro indicio puede ser el reparto de alelos específicos por dos o más haplotipos
extendidos diferentes.
Enfermedades especificas sin evidencia de herencia
mendeliana y con asociaciones MHC
La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus
marcadores. Esta lista no es exhaustiva y sólo se tratarán algunas de ellas.
La aplicación de los métodos de análisis ya citados sólo ha permitido entender unas pocas de estas alteraciones.
Existe una asociación marcadamente potente entre HLA-S27 y espondilitis anquilosante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas
(Khan, 1992). Entre los pacientes con EA, artropatías reactivas y uveitis
aguda anterior, alrededor del 90% de los pacientes caucásicos, comparado
con un 5% o 10% de los controles sanos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La
asociación de B27 con estos síndromes en cuatro grupos raciales (caucásicos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B27 por sí mismo o
un gen estrechamente ligado a B27 está involucrado en la patogénesis de
estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se
relaciona también con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLAB27 positivos en la población en general, sólo el 2% desarrolla EA Si hay
una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes
HLA-B27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos
14 alelos de HLA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra más
comúnmente en los sujetos normales. Se ha propuesto que la presencia de
HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA. incrementa más la susceptibilidad a EA. lo que corrobora la hipótesis de que los alelos no-B27contribuyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las proteínas bactenanas
que muestran homología estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia
de seis aminoácidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los residuos 188 y 193 de una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y
entre las posiciones 71 y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una
secuencia de cinco aminoácidos de un plásmido de una cadena atrilogénica de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989).
De todas las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es
la que más se ha estudiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992;
Winler, 1993). La contribución de HLA a la diabetes tipo I no se ha explicada adecuadamente. Existen considerables aumentos en el HLA-DR3y DR4
en pacientes caucásicos. En muchas pero no en todas las poblaciones de
pacientes caucásicos con diabetes tipo I hay un exceso de heterocigotos
DR3/DR4 por encima del número de homocigotos DR3 o DR4 predecibles
por el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no están claras. Por
análisis del ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgrupo de DR4 en desequilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actualmente se considera que el último gen es un marcador principal y quizás un
determinante primario de la susceptibilidad a la diabetes tipo I, existe sólo
en el 70% de los pacientes caucásicos, e incluso en aquellos que lo transportan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para diabetes: DRBV0401.
DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 están asociados en gran medida
con la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o están menos.
Además, se ha observado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el
alelo DOBV0302 en el haplotipo DR4. Por lo tanto, parece probable que
haya múltiples contribuciones de la región clase II a la susceptibilidad a diabetes DQA 1'0301 esta presente en todos los haplotipos Dispositivos,
transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda contribuir al nesgo.
Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la diabetes tipo
I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que también transportan
un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no
sufren riesgo en absoluto para la enfermedad (prolección dominanle), como
se espera en una alteración recesiva. Un modelo recientemente propuesto
para la diabetes tipo I que asume que DOB1 es un determinante directo de
la susceptibilidad, sugiere una jerarquía de afinidades entre las diferentes
moléculas clase II que compiten por unirse al mismo péptido de diabetes
tipo I (no identificado). La susceptibilidad sucede si un producto del gen (por
ej., DQBV0302) se une y presenta el péptido. En presencia de un competidor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sinergismo (DR3/DR4)
podría explicarse por la unión de un péptido de alta almidad a un dímero clase II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes
haplotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afinidades de aquellas moléculas por el péptido. Otro modelo propone que un
ácido aspártico en el codón 57 de la cadena DOS protege (rente a la diabetes tipo I. La presencia excesiva en pacientes de un aminoácido dilerente. más frecuentemente valina o serina. en esa posición en haplotipos
transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios estudios han
confirmado este hallazgo en caucásicos pero no en diabéticos orientales.
Otros estudios proyectan la hipótesis de que la presencia de arginina en la
posición 52 del DQA1 es otro factor genético. Se ha propuesto que la combinación del ácido no aspártico en la posición 57 de DOB1 y arginina en la
posición 52 de DQA 1 es un importante determinante de susceptibilidad para
la diabetes tipo I mediada por genes DOB1.
Existe datos significativos respecto a la asociación entre marcadores
MHC y artritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992).
Para la mayoría de las poblaciones estudiadas, el marcador asociado primario es HLA-DR4. En los caucásicos, por ejemplo, los alelos DR4 más
comunes asociados con AR son DRBV0401, 0404 y 0408. y en pacientes
japoneses, israelíes y chinos, es DRBV0405. Otras especificidades HLADR también se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociación con AR
en pacientes caucásicos, japoneses, españoles, griegos e israelíes: DR3
CAPITULO 41
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
957
Tabla 41-3 Ejemplos de asociación entre HLA y enfermedad'
Enfermedad
Enlermedad de Behcet
Enfermedad celiaca
Etnia
Antígeno HLA
Riesgo relativo
Japoneses
Chinos
Caucásicos británicos
B51
B51
DRB1-0301
DQB1*0201
DQAV0501
DRB 1-0301
79
3.4
26.7
51 8
139
6.9
368
Caucásicos italianos
DQB1*0201
Caucásicos checos
Enfermedad de Graves
Caucásicos germanos
Japoneses
Caucásicos sardos
Chinos de Singapur
Tiroidilis de Hashimoto
Caucásicos húngaros
infección VIH
Caucásicos canadienses
Caucásicos británicos
Caucásicos europeos
Progresor rápido"
Progresor lento
Enfermedad de Hodgkin
Nefropatia membranosa idiopatica
Caucásicos (Europa/América)
Caucásicos británicos
Japoneses
Síndrome nelrótico
idiopatico
Caucásicos franceses
Caucásicos germanos
Esclerosis múltiple
Caucásicos franceses
Caucásicos europeos
Narcolepsia
Japoneses
Caucásicos canadienses
Artritis reumatoide
Caucásicos franceses
Indios asiáticos
Chinos
Japoneses
DQ Al'0501
10.9
DRB 1 "0701
4
DQA1-0201
67
DRB t '0301
12.2
11
DOAt-0501
DRB1-0701
3.1
DQA 1-0201
2.9
DR3. B8. Cw7
3.?-5.5
DOAt'0102
9.2
A2
2.9
DPB1-0501
5.3
DRBT1601
2,3
DRB 1 -0301
3,5
DR5?
7,3
DR52
3.4
DR53
4.1
DOA1-0301/0302 DQBV0201
3.6
DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301
9.7
Cw7
1.5
DQB 1 '0601
2,2
B7
3,4
B35
2.5
Cw7
2,1
DQB 1-0605
9,2
DPB 1'0301
1,95
DRB3-0101
5.5
DRB 1 "0301
9.8
DQB 1-0201
21.6
DQA 1'0501
6.7
DRB1M501
14,2
DQB 1-0602
16,8
DQAV0102
7,1
DR7
6,4
5,3
DQA 1-0201
DR7
2,8
DQA 1-0201
3.3
DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010?
3.0
Uno de DQAr010?/0103 o 0501 mas uno de DQB1 0602/
13.0
0603/0604/0302/ o 0303
DRB T1501
1 030
DRB5-0101
1 263
DR15
384
DQB 1 '0602
1 468
DQAT0102
537
DRBV1501
93.5
DR15
13.2
DQB 1-0602
85.4
DQA 1-010?
28.6
DRB 1'01
3,5
DRB t-0401
4,1
DRB1'0404
107
DR1
34
DRBI-IOOt
3.8
DR1
6.8
FB-FS
3.1
3.6
DRB 1-0405
'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3] tienen un d(
(Véase Stool CM. Ludían CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3 as a risk for HIV re
Datos extraídos de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 1991 Proceedings of the 11'" Inter
1992
en kuwaitíes; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen
pacientes españoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro
de diferentes asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la
secuencia de un péptido DRB1 compartido está involucrada en conceder
ledad mas rapido
t 1988: 1:1185).
id Conference New York. Oxford University Press,
susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuencia de aminoácidos muy bien conservada en su tercera región hipervariable (aminoácidos 70 a 74). Estos residuos podrían afectar a la unión de
péptídos y a su presentación a las células T. Así. sí existe un péptido artri-
958
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPAIOLOGÍA
togénico. puede unirse preferentemente a moléculas con la secuencia
DRB1 de la AR. Por el momento, no se ha identificado tal péplido. Una
explicación alternativa puede involucrar un mimetismo molecular entre el
DRB1 de la AR compartido y secuencias antigénicas de un patógeno que
pueda inducir AR. Se ha encontrado una homología de secuencia entre la
secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia Coli.
Varios artículos han demostrado una relación entre la gravedad de la AR y
la frecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha
detectado que los pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolución grave de la enfermedad, y los pacientes homocigóticos HLA-DR4 tienen más probabilidad de sufrir una AR mas grave. También es posible que
la producción de factor reumatoide esté asociada con DR4 El riesgo asociado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o
DRBV10.
La AR se diferencia clínicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ). En
contraste con la asociación con DR4 en la artritis reumatoide. las asociaciones HLA con ARJ son bastante diferentes. Además, otras asociaciones HLADR varían con los subgrupos clínicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo,
se ha descrito que el haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402
está aumentado en todo el grupo pauciarticular y en pacientes con la forma
persistente pauciarticular. El haplotipo HLA-DRBV1301. DRB3'0101.
DOA1 '0103. DQB1 '0603 también se asoció con pacientes con ARJ pauciarticular persistente (Fernández-Vina, 1994). Otras especificidades asociadas
con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ
pauciarticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con:
DRBI'01. DRBV0801. DRBV1401.
DQBV0501, DQBV0503.
DQAV0101
y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con iritis crónica muestra una fuerte
asociación con DRBV1104. DR8y DR6. Además de las asociaciones Clase
II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacientes con
ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo después de los
ocho años tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En
pacientes con ARJ poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y
DPBI'0301 han mostrado asociación con la enfermedad. Teniendo en cuenta que la forma poliarticular de ARJ es un caso de AR en la juventud, el
DRBV0401 muestra una fuerte asociación.
En caucásicos, los dos haplotipos extendidos suponen más del 60% de los
haplotipos en pacientes con enteropatía sensible al gluten (ESG) (Goggins,
1994; Marsh, 1992): [HLA-B8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De
manera análoga a la diabetes, existe un aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLADR3 como DR7 están en desequilibrio de ligamiento con HLA-DQ2
(DQBV0201. DQAV0501). Esta combinación de genes DQB y DQA se
encuentra en el 98% de los pacientes con enfermedad celíaca (EC). El péptido gliadina, que previamente se ha visto que exacerba la lesión EC in vitro e
¡n vivo, parece que se unía a DQ2, aportando más credibilidad a su posible
papel en la patogénesis de EC (Shidrawi, 1998). Este hallazgo sugiere que
HLA-DQ2 podría presentar al péptido gliadma a las células T para su reconocimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la posibilidad de la existencia de alelos específicos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01 y
DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa.
El aumento en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica
que el haplotipo extendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a través de DP en EGS. Los determinantes de susceptibilidad DP y DQ comparten un residuo cargado positivamente alrededor del codón 71 de la cadena-(5.
pero su papel específico aún no está claro. Otro marcador MHC recientemente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP70-2. que se conoce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportadores de HLADR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten
algunos rasgos clínicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han
aumentado la frecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a
ESG. Sin embargo, comparando el halotipo. es evidente que las dos alteraciones son diferentes: los genes de susceptibilidad para ESG están dentro o
cerca de la región HLA-DR/DQ. mientras que los de DH parecen estar entre
el complemento y la región HLA-DR/DQ. más cercanos a la región del complemento (Ahmed. 1993a).
El pénligo vulgar (PV) se ha asociado a dos tipos de haplotipos HLADR4. DQ8 entre los pacientes judíos [HLA-B38. SC31. DR4. DQ8] y [HLA635, SC31. DR4. DQ8] y un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.
DR6. DQ5] en pacientes no judíos. Estos hallazgos indican que dos mutaciones dieron origen a genes de susceptibilidad MHC para el pénfigo vulgar.
Uno, quizá el más antiguo, surgió en un precursor de [HLA-B38/35.
SC2I/31. DR4. DQ8] en una población judia y se difundió a poblaciones no
judías. El otro, más reciente, parece haber surgido sobre [HLA-B55. SB45.
DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundió a otras poblaciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantícuerpos PV (desmogleina 3)
ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404,
DQB1 '0503. DQA V0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de
los parientes de los pacientes con PV que comparten los haplotipos de susceptibilidad tienen bajos niveles de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad parece producirse en individuos susceptibles con bajos niveles de anticuerpo
cuando un segundo factor, genético o ambiental, induce niveles altos, suficiente para producir vesículas (Ahmed, 1993b). La evidencia que establece
un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios que muestran
que un péptido de 15 residuos, idéntico a un segmento de la desmogleina
3. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995).
En el penfigoide cicatricial (PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han
asociado con la forma ocular de la enfermedad (Ahmed, 1991). La forma
oral de PC también está asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996). Estos
resultados indican que DQBV0301 es un marcador común para ambas formas, oral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola
enfermedad. Los análisis de la secuencia de aminoácidos presentes en los
alelos DQB1 en los pacientes con formas ocular y oral de PC mostraron
que comparten residuos comunes en las posiciones 57 y de la 71 a la 77,
y es posible que puedan ser también marcadores para esta enfermedad
(Yunis, 1994).
El MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas
En la malaria, ambas moléculas HLA clase I y clase II se han asociado con
la prolección de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un alelo
especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clínica
progresiva (Goldfeld, 1998) Esta asociación es particularmente intrigante,
ya que el alelo DQBV0503 codifica un cambio en la posición 57 del aminoácido de la cadena [i (|i57), que afecta a la carga existente en el bolsillo de la unión al péptido putativo. P9. de la molécula DQ. Se sabe que este
bolsillo contiene residuos hidrofóbicos. El alelo DOS V0503 codifica el ácido aspártico negativamente cargado en |557 en lugar del aminoácido valina más común, sin carga e hidrofóbico Es posible que la presentación de
péptidos restringida a MHC por los macrófagos infectados de tuberculosis
esté afectada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en particular. El bolsillo de unión a P9 cargado negativamente puede unirse a
antigenos de tuberculosis con menos efectividad o puede obtener una respuesta inmunogénica disminuida. HLA-DRBV0901 esta más representado
en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparación con pacientes TB
anérgicos. DfíBJ '0901 es el único alelo que codifica un cambio en la posición 9 del aminoácido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el
bolsillo de unión al péptido putativo. P9. de la molécula DR El alelo
DRBV0901 codifica el aminoácido lisina cargado positivamente en (59 en
lugar del ácido glutámico más común y cargado negativamente Es posible
que la respuesta restringida a MHC a los péptidos PPD esté aumentada en
el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El bolsillo de
unión a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con
más eficacia o puede obtener una respuesta inmunogénica aumentada
Los antígenos HLA-B. B-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de progresión del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) (Kaslow. 1996)
Las moléculas HLA-B pueden ser clasificadas por la presencia de un epitopo molecular Bw4 o Bw6 o especificidad pública, que está definida por
los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hélice a, (Salter,
1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresión de
la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en
ausencia de terapia antiviral con fármacos, está significativamente asociada con la homocigosidad para alelos HLA-B que comparten el epítopo
HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comunicación personal). Estos datos sugieren que los péptidos que se unen a los alelos HLA-Bw4 pueden mostrarse
útiles en el desarrollo de vacunas basadas en péptidos.
Los polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enfermedades. Se han estudiado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD
satélites en relación con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El polimorfismo en la región promotora TNF-ot, localizada en el nucleótido -308
afín al lugar de comienzo de la transcripción, se relacionó con una aumentada susceptibilidad a la malaria cerebral (McGuire, 1994), espondilitis
anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad por choque séptico (Mira, 1999)
y leishmaniasis mucoculánea (Cabrera, 1995). Los microsatélites del TNF
d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuencias más
altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por clozapma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatélites se han
asociado con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistémico
(Sturfelt. 1996).
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LA ASOCIACIÓN O
CORRELACIÓN DE LA ENFERMEDAD CON LOS
MARCADORES GENÉTICOS
Polimorfismo genético
El polimorfismo genético se define como la existencia en la misma población de dos o más alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importante. La frecuencia se ha determinado de forma arbitraria como mayor que el
1%. Hay dos grupos de polimorfismo genético; equilibrado o estable y transitorio. Un polimorfismo equilibrado se produce cuando dos o más alelos se
mantienen en una población por selección. La ventaja heterocigótica es el clásico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfismo transitorio representa una fase de cambios alélicos conducida por deriva genética o por selección. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una población y
transitorio en otra, dependiendo del efecto de la selección.
959
Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia
usando la fórmula:
¡7 = i-v7
Fuerza de la asociación
Se han ideado varios métodos para detectar el grado de asociación de los
marcadores genéticos con los hipotéticos genes para la susceptibilidad a la
enfermedad. Uno es calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que
transportan un alelo especifico de un sistema polimórfico. En este cálculo, el
riesgo relativo (RR) o relación de probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de
transportar un marcador en una población de individuos enfermos comparado con una población control. Más interesante, pero más dificil de estimar, es
el riesgo de tener una enfermedad en un individuo que transporta el marcador (Tabla 41-5, véase también Tabla 41-3).
Esta fuerza de asociación es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard.
1983), que es lo mismo que la fracción etiológica (FE) (Miettinen. 1976). Si.
en una población de pacientes, individuos a transportan el carácter especifico pero individuos ó no y. en la población normal (control), individuos c transportan el carácter, la información puede ser escrita convenientemente en la
tabla 2x2:
Paciente
Control
Carácter positivo
Carácter negativo
a
c
b
d
La frecuencia del carácter en esta población de pacientes (l\) es
Para determinar el polimorfismo genético es necesario encontrar una
muestra representativa de la población, valorar los individuos, contar los
genes y estimar el número de genes contenidos en la población total. Por
ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una población de 100 individuos
para un rasgo genético particular o alelo en un determinado gen, se puede
definir la frecuencia de fenotipo como el número de individuos que transportan el rasgo o la variante genética. Para calcular la frecuencia (/) de cada alelo, se suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el número
total de alelos analizados:
f(x)+t(<i)+f{z)
Tabla 41-4
Constelación de g e n e s TNF en relación c o n haplotipos e x t e n d i d o s c o m u n e s
Complotipo
C4A
BF
HLA-DR
C4B
3
2
7
4
1
1
1
0
3
s
s
c
3
6
3
2
2
3
I
3
s
s
7
5
i
•;
•i
2
3
1
1
1. 2
1
3
2
0
I
s
s
s
s
s
I1
C2
c
c
c
c
c
c
c
c
c
0
c
HSP70
2
8.5
9
g
9
9
9
9
9
'i
9
8,h
1
e
C
3
3
3
3
3
3
.A
A
M
•••
A
A
•
A
3
1
3
3
A
A
C
Marcadores en el locus TNF
d
862
-308
-856
I
3
3
3
4
3
4
3
4
3
4
2
1
1
1
l
1
1
1
1
l
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
1
1
u
b
2
11
7. 8
6. 7
2
S
2
10
2
10
1
3
4
4
5
5
5
1
4
1
A
5
HLA-B HLA-Cw
8
7
44
44
57
35
14
38
62
18
18
0701
070?
1601
0501
060?
0401
080?
1203
0304
1203
0501
hl numero de letras debajo de cada columna se refiere a una variante del alelo particular del complemento, proteína 70 del golpe de calor (HSP70). polimorfismo de
microsatélite TNF o promotor TNF-« están asociados con las especificidades HLA como se reseña Véase texto para explicación
En el caso de TNF-a -308 I y 2 representan las vanantes -307/G y 307/A. respectivamente
El alelo TNF-a -856/C se resena como 1 y el alelo -856/T como 2 El alelo 862/C TNF-a se resena como 1 y el -862/A como 2
Dalos extraídos y modificados de Clavijo OP Delgado JC. Awdeh ZL y col Tissue Antigens 1998. 54 303.
960
SECCIÓN V
Tabla 41-5
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Riesgo relativo (RR)* para alelos M H C e n varias e n f e r m e d a d e s
HLA-A
HLA-B
HLA-DR
BF
Enfermedad
Alelo
RR
Alelo
RR
Alelo
Diabetes melhtus tipo 1
A1
1.6
B8
2.5
2.5
2,5
0,2
3,5
8,0
3,0
2,3
2,3
1.9
4.9
3.5
DR3
DR4
4,5
DR2
DR2
DR3
DR3
DR3
0.1
4,2
17,0
2.2
4,4
B15
B18
B7
A3
A1
A1
Esclerosis múltiplo
Enteropalía gluten
Hepatitis crónica activa
Glomerulonefritis
membranosa idiopàtica
Hemocromatosis
idiopatica
1.8
i8
1,7
B7
B8
B8
B8
B18
A3
Al
4.8
2.0
B7
B14
B15
.
n
RR
Alelo
RR
BF'Fl
8
BF'Fl
BF'Fl
16,0
2,0
•\:
DRw6
3.1
2.9
DR4
„ pacientes con marcador controles sin marcador
H n = —
x
pactonte9 sin marcador controles con marcador
.
,
De manera similar, en riesgos disminuidos, para los cuales RR es menor
de 1, se puede usar el factor de prevención (FP).
FP
0-RRK
RR
(i-<v)
Las fracciones FE y FP pueden variar entre 0 (no asociación) y 1.0 (máxima asociación)
Aparte de facilitar estimaciones de tener un marcador si uno ya tiene la
enfermedad, estos cálculos ignoran el modo de determinación genética de la
enfermedad en cuestión, Esto es particularmente problemático para modos
recesivos o más complicados en los cuales ambos haplótipos son importantes para determinar la enfermedad pero se da el mismo peso a los heterocigotos y homocigotos para un marcador dado (esto es, ambos son positivos
para el marcador).
Análisis del modelo de herencia basado en parejas
proporción de individuos que son homocigotos para el marcador. La aplicación de este método al HLA-B27 y a la espondilitis anquilosante condujo, en
terrenos estadísticos, a la desestimación de un mecanismo recesivo. Asi, se
concluyó que la susceptibilidad a la espondilitis anquilosante es heredada
como un rasgo dominante.
De forma similar, el mismo método de análisis se aplicó a la distribución
de BF'Fl entre 1.107 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (Raum. 1981).
Para la herencia dominante, se pronosticaron 1,89 homocigotos y para la
herencia recesiva 6.2. Se encontraron siete homocigotos BF'Fl. un resultado consistente sólo con la herencia recesiva. Otros modos de herencia que
podrian ser desestimadas por estas observaciones incluyen la dominante
simple, epistática (enfermedad resultante de la presencia de genes no alélicos) o superdominante (enfermedad con mayor penetrancia cuando dos alelos específicos están presentes que cuando se producen otras combinaciones, incluyendo homocigosidad para cada alelo específico). Aunque un
modelo mixto con diferente penetrancia para homocigotos y heterocigotos no
podría ser excluido completamente, otras consideraciones podrían hacer
insatisfactorio a tal modelo.
de hermanos
El análisis de la forma de herencia basado en pareas de hermanos se
introdujo para ayudar a superar los problemas de penetrancia incompleta de
los genes de la enfermedad y las variaciones en edad al comienzo (Penrose.
1935). El método se basa en la suposición de que si el HLA y/o los genes
estrechamente ligados a HLA no influyen en el desarrollo de la enfermedad,
entonces las parejas de hermanos afectados compartirán haplótipos HLA con
una frecuencia normal: el 25% compartirán ambos haplótipos. el 50% compartirán uno y el 25% no compartirá ninguno. Así, se comparan distribuciones
observadas y esperadas de haplótipos compartidos. Si los genes de susceptibilidad o sus marcadores estrechamente ligado son raros y totalmente penetrantes, en una enfermedad determinada recesivamente, la distribución de los
hermanos que comparten 2.1 y ningún haplotipo seria 100, 0. 0. respectivamente. Para la determinación dominante, la relación sería 33, 66, 0. Lo que
se observa en diabetes, por ejemplo (Rubinstem. 1977), es 60, 35, 5. más
cercano a las predicciones recesivas que a las dominantes. Una vez que se
ha establecido la forma de herencia, se pueden establecer la frecuencia y la
penetrancia del gen de la enfermedad (Thomson, 1977).
Análisis del modelo de herencia basado en estudios
de población
Thomson y Bodmer (1977) han ideado un método de análisis de los datos
de la población para marcadores estrechamente ligados a locus de susceptibilidad para enfermedades con penetrancia incompleta. En esencia, este
método predice la proporción de homocigotos. heterocigotos y no portadores
para el marcador ligado esperado en casos de herencia dominante o recesiva. La diferencia principal entre los dos modos de herencia se obtiene por la
Método de cálculo de probabilidades
(Lod
Score
Method)
Este es un método estadístico de concordancia entre un locus marcador tal
como en el MHC y un gen de susceptibilidad a una enfermedad (Sutton,
1980): (1) el valor Zes la relación de la máxima probabilidad de encontrar o
no concordancia (P¡ F,/ 0]) en un valor de recombinación particular 0; y (2) el
valor o (q) de frecuencia de recombinación, que es una medida de la distancia desde un locus determinado a un valor Z máximo. El cálculo de probabilidades expresa la probabilidad de que alelos en dos locus se separen juntos,
en términos de la relación entre la frecuencia de recombinación observada
con la pronosticada si concuerdan independientemente. Varios valores de (q)
de 0 a 0.5 se sustituyen en la ecuación:
P(F,/e) = 1/2 [& (i -or' + e-'ii - « ) ]
Donde n = el número de niños en una familia determinada y r= el número de recombinantes. La probabilidad de obtener un estudio genealógico
para un valor determinado de 0 (frecuencia de recombinación de 0 a 0,5) se
expresa como la relación de P (FJ 0) en una familia en una fracción 0 (de 0
a 0,5) de recombinación dada a P (F./0.5) en la misma familia, asumiendo
que ninguna recombinación pueda ser expresada como el cálculo de probabilidades (Z):
z - log
P(F,/0.5)
CAPÍTULO 41
•
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
961
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entre y cerca de ellos ha incrementado la posibilidad de definir la base genéSci USA 1987. 84:8535.
tica de respuestas inmunes y enfermedades de etiología desconocida como
Clavijo OP, Delgado JC. Awdeh ZL. et al: HLA-Cw alleles associated with HLA
las enfermedades autoinmunes en el hombre. La asociación no fortuita de
extended haplotypes and C2 deficiency. Tissue Antigens 1998; 52:282.
marcadores para respuestas inmunes o asociaciones con enfermedades
Colten HR. Rosen FS: Complement deficiencies. Annu Rev Immunol 1992:10:809
autoinmunes debido a la presencia en la población de secuencias fijadas de
Corzo D. Yunis JJ, Salazar M. et al: The major histocompatibility complex region
marked by HSP70-1 and HSP70-2 variants is associated with clozapine induced
ADN MHC y haplotipos extendidos y sus fragmentos complica el estudio de
agranulocytosis in two different ethnic groups. Blood 1995. 86:3835
genes de susceptibilidad pero también proporciona las claves para su identiD'Alfonso S. Richiardi PM: A polymorphic variation in a puladve regulahon box of
ficación. Aun cuando el MHC humano es la región más investigada del genothe TNFA promoter region. Immunogenetics 1994; 39:150.
ma, no se han identificado todos los genes expresados Además, sólo se
Delgado JC. Hameed A. Yunis JJ. et al: Pemphigus vulgahs autoantibody response is
linked to HLA-DQBIfO503 in Pakistani patients Hum Immunol 1997 57:110.
conoce la función de los productos de relativamente pocos de estos genes.
Delgado JC. Turbay D. Yunis EJ. et al: A common major histocompalibility complex
Es probable que ciertos genes HLA no identificados antes que algunos genes
class II allele HLA-DQB1' 0301 is present in clinical variants ol pemphigoid. Proc
HLA ya conocidos, sean genes de susceptibilidad para algunas enfermedaNatl Acad Sci U S A 1996; 93:8569
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garis: A model for autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A 1995: 92:5239.
y Z= suma de lodos los valores z. Valores de Z mayores de cero están a favor
del ligamienlo y aquellos menores o igual a cero en contra del ligamiento. En
general, un valor de Z mayor de 3 (para algunos valores de 0<0,5) significa
que las probabilidades a favor del ligamiento son 1.000 a 1 (p = 0,05) en oposición al no ligamiento o independencia. Es más fácil calcular la concordancia
para rasgos codominantes (es decir. HLA y GLO) que para rasgos recesivos.
En estudios de concordancia de HLA y enfermedad, los padres pueden tener
genes de susceptibilidad impenetrantes dominantes o recesivos. Hay problemas básicos para usar el método de cálculo de probabilidades para detectar
concordancias de genes parcialmente penetrantes, aparte de hermanos susceptibles impenetrantes. Si los genes de susceptibilidad son comunes, como
parece ser en el caso de la diabetes tipo 1. por ejemplo, los cruzamientos
aparentes de hermanos no idénticos podrían sugerir genes de susceptibilidad
adicionales en un padre.
962
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOIOGÍA
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C A P Í T U L O
42
Trastornos ¡nmunodeficitarios
Charlotte Cunningham-Rundles, M.D., Ph.D.
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA
963
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO
964
Medidas enzimáticas
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL
964
Histología
Historia clínica y recuento sanguíneo inicial
Ensayos con células asesinas naturales
Inmunoglobulinas
Rayos X y tomografía computarizada
Análisis adicionales de leucocitos
polimorfonucleares
Funciones pulmonares
Citocinas y receptores de citocinas
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL
967
Marcadores adicionales de superficie celular
Producción de anticuerpos
Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA
Subclases de IgG
Utilización de nuevos inmunógenos para valorar
la producción de anticuerpos
Inmunidad de células T
Valoración funcional de las células T
969
Genética molecular y diagnóstico prenatal
Análisis de leucocitos polimorfonucleares
RESUMEN
972
Evaluación del complemento
BIBLIOGRAFÍA
972
La resistencia a la infección es una particularidad necesaria de la salud.
Las principales barreras a las infecciones son las barreras físicas naturales,
la piel, la producción de moco en las superficies mucosas expuestas, y la
función de las células ciliadas del tracto respiratorio, intestinal y genital que
tienen tendencia a eliminar los microbios invasivos. Además de estas barreras, un importante número de funciones inmunitarias ejercen una continua
vigilancia: estas funciones pueden ser no especificas no requiriendo ninguna sensibilización previa, y especificas, que requieren una previa exposición
para sensibilizarse (Tabla 42-1). Las funciones inmunitarias están compuestas por un conjunto interrelacionado de células inmunitarias y funciones
inmunitarias, siendo los principales elementos 1) los Imfocitos B produciendo
anticuerpos, 2) los linfocitos T proporcionando funciones celulares, 3) el sistema (agocitario conteniendo leucocitos polimorfonucleares (PMN) y monocitos / macrofagos 4) el sistema complemento y 5) las células asesinas (células NK). La enfermedad por inmunodeficiencia primaria surge debido a
anormalidades de uno o más componentes de este grupo interrelacionado
de funciones. Estas enfermedades fueron originariamente consideradas
como enfermedades bastante poco frecuentes, caracterizadas como enfermedades graves con un comienzo clínico en los primeros años de vida. Sin
embargo, como en los últimos años se ha esclarecido el espectro de estos
defectos, está claro que estas enfermedades son mucho más comunes de lo
que originariamente se creía, y la manifestación clínica puede ser benigna.
Lo más importante es que ahora está claro que estas enfermedades pueden
ser diagnosticadas en niños mayores, en adolescentes y en adultos de todas
las edades. La incidencia general de estas enfermedades de inmunodeficiencia se estima en aproximadamente 1 de cada 10.000, excluyendo la deficiencia selectiva de inmunoglobulina A (Ig A). Por razones desconocidas,
mas de la mitad de los defectos inmunes descritos incluyen defectos en la
producción de anticuerpos (Fig. 42-1). La Unión Internacional de Ciencias
Inmunologías ha catalogado los defectos conocidos del sistema inmunitano.
que periódicamente se actualizan {Primary Inmunodeliciency Diseases.
Report of an lUIS Scientific Committee, 1999). En la Tabla 42-2 se muestra
un enfoque general de los principales síndromes inmunodeficitarios, clasificados por tipo.
INDICADORES CLÍNICOS DE INMUNODEFICIENCIA
El indicador clínico más frecuente de un defecto inmune es la aparición de
"demasiadas infecciones". Esta es la principal manifestación en los bebés y
niños con deficiencias inmunitarias y representa un reto significativo para el
pediatra, ya que las infecciones son muy comunes en la infancia normal.
Cuando las infecciones frecuentes y prolongadas se acompañan de retraso
en el desarrollo o si aparecen infecciones poco habituales, debe realizarse
una evaluación del sistema inmunitano. La confirmación de una enfermedad
inmunodeficitaria en un hermano o pariente de primer grado debería implicar
una valoración clínica cuidadosa y una investigación de laboratorio, incluso
sin antecedentes de infecciones graves o inusuales.
Aprovechando las características comunes de infección que aparecen en
las enfermedades de inmunodeficiencia primaria, se han creado un grupo de
signos de alarma para ayudar a la identificación de individuos que tienen más
probabilidad de sufrir un defecto inmune (Tabla 42-3). Quizá los indicadores
más importantes para emprender una evaluación del sistema inmunitario surgen al realizar una historia inicial cuidadosa. Junto con las señales de alarma
reseñadas en la Tabla 42-3, el médico deberia preocuparse por elementos en
la historia que son inusuales, como antecedentes de enfermedad autoinmune. adenopatía significativa, la necesidad en un adulto de realizar una miringotomia. herpes zóster grave, o herpes zóster que aparece en niños pequeños, etc. Estas manifestaciones adicionales pueden también indicar que
deberia considerarse un defecto inmune (Tabla 42-4).
964
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Tabla 42-1 Mecanismos de defensa del huésped
No específicos
Barreras (piel, secreciones, moco, lágrimas, saliva)
Fagocitos (neutrofilos, macrófagos)
Células asesinas naturales
Complemento
Citocmas
Específicos
Anticuerpos
Funciones de células T
Por supuesto; no es práctico investigar todos los sistemas en todos los
pacientes; sin embargo; el cuadro clínico y la edad del paciente indicarán al
examinador qué parte del sistema inmunitario es con más probabilidad el
causante. Por regla general, la elaboración de una historia cuidadosa y el
examen físico completo puede reducir las posibilidades de problemas que
implican principalmente a células T. células B, granulocitos o el sistema complemento. La Tabla 42-5 enumera los síntomas y signos clínicos y sus correlaciones con los elementos de defensa del huésped. En muchos casos el tipo
concreto de ínfección(es) que el paciente ha padecido puede proporcionar un
indicador útil sobre el defecto inmunitario más probable (Fig. 42-2). Si predominan las infecciones por bacterias encapsuladas, se debería investigar la
célula B, el sistema de complemento o los sistemas fagocíticos: si hay predominio de infecciones fúngicas o víricas, puede estar defectuoso el sistema de
las células T. Las infecciones recurrentes por Neisseria deberían alertar al
médico sobre la posibilidad de una deficiencia genética de uno de los componentes del complemento. Las infecciones recurrentes por Candida, incluyendo las aftas orales, no suelen ser un problema alarmante si se han utilizado con frecuencia antibióticos. Sin embargo, la candidiasis oral adquiere
una mayor importancia cuando es resistente a una terapia local sencilla y
cuando persiste después de seis meses de edad. Las aftas orales no se consideran igual que la candidiasis mucocutánea, una enfermedad caracterizada
por diseminación de la infección desde las membranas mucosas a la piel contigua incluyendo generalmente las uñas de los dedos. Estas lesiones cutáneas pueden presentarse de forma granulomatosa. La candidiasis mucocutánea
siempre es anormal. También es importante observar las circunstancias clínicas y no fijarse exclusivamente en el número o la gravedad de los episodios
infecciosos. Por ejemplo, cuando un proceso infeccioso afecta a la misma
zona anatómica repetidamente, es más probable que la etiología sea estructural y no un defecto de una de las defensas del huésped. La osteomielitis crónica en una localización, o episodios recurrentes de neumonía que afectan
sólo a un lóbulo pulmonar, o infecciones recurrentes de una herida quirúrgica
son ejemplos de estas situaciones. Por razones desconocidas, las infecciones
recurrentes del tracto urinario no son características de deficiencia inmunitaria; el sistema inmune parece jugar un pequeño papel, si es que juega alguno, en la prevención de pielonefritis y cistitis.
EVALUACIÓN DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO
Basados en las consideraciones previas, cuando se sospecha un defecto
inmunitario hay que hacerse estas preguntas: qué parte del sistema inmunitario debería investigarse, qué pruebas se necesitan y hasta dónde deberían
llevarse estas investigaciones. La evaluación del sistema inmune se lleva a
cabo mejor por etapas, realizando primero las pruebas de delección básicas,
hasta llegar a las pruebas más complejas, según el caso. En la Tabla 42-6 se
ofrece una visión general de este abordaje por etapas.
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL
Historia clínica y recuento sanguíneo inicial
Aparte de realizar una historia inicial y exploración física, incluyendo medición de la altura y peso, la primera prueba inmune es el hemograma completo (CBC). Un recuento de glóbulos blancos (WBC) y diferencial proporcionará información sobre la morfología y número de linfocitos pequeños
(diámetro<10um). Se espera que haya más de 1.200 linfocitos por milímetro
cúbico. Puesto que menos (-10%) de los linfocitos son linfocitos B, una deficiencia absoluta de linfocitos indica sobre todo deficiencia de células T. Parte
de la primera visita debe también incluir la obtención de todos los expedientes médicos anteriores, incluyendo informes patológicos o diapositivas, y
resultados de cultivos previos y radiografías.
Inmunoglobulinas
Como las enfermedades por deficiencia de anticuerpos son más comunes
que otros defectos inmunes, se debe empezar investigando las inmunoglobulinas y producción de anticuerpos (Stiehm, 1996). Los análisis cuantitativos de
inmunoglobulinas se encuentran disponibles en todos los laboratorios comerciales y hospitalarios, y para realizarse necesitan de muy poco suero (véanse
Capítulos 13 y 35). Como los valores de inmunoglobulinas aumentan con la
edad, es necesario para la correcta interpretación que se compare con controles de edad (véase Tabla 37-7). Durante los primeros meses, la IgG de origen materno es la principal inmunoglobulina presente en el suero del niño. El
punto más bajo se ve aproximadamente a los tres meses. Sin embargo el niño
puede sintetizar IgA e IgM: asi. la presencia de estas dos inmunoglobulinas
(partícularmenle la IgM, que se sintetiza antes que la IgA) es una evidencia
Figura 42-1. Clasificando los defectos inmunes de una
amplia población de pacientes remitidos para análisis
inmunológicos y tratamiento, casi un 50% de todos ellos
presentaban defectos en la producción de anticuerpos,
incluyendo mmunodeficiencia variable común, deficiencia
selectiva de IgA, deficiencia de la subclase IgG, nipogammaglobulinemia transiloria del niño y agammaglobulinemia ligada al cromosoma X. Dalos tomados del Mount
Sinai Medical Center, Immunodeficiency Clinic.
CAPÍTULO 42
Tabla 42-2
•
TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
965
Clasificación d e las inmunodeficiencias primarias'
Enfermedad
Deficiencia combinada de células B y
células T
Disgenesia relicular
Inmunodeficiencia severa combinada
(IDSC)
Síndrome hiper IgM
Ataxia-telangiectasia
Timoma
Síndrome Wiskott-Aldrich
Deficiencia primaria de célula T
Anomalia de DiGeorge
Síndrome de Nezelof
Deficiencia de inosina fosforilasa (PNP)
Ausencia de expresión de CD3
Candidiasis mucocutánea crónica
Deficiencia primaria de células B
Agammaglobulinemia congenita ligada
al sexo (Bruton)
Defecto de p-cadena, cadena sustituida
lig. etc.
Hipogammagiobulinemia transitoria
de infancia
Síndrome hiper IgM
Deficiencia selectiva de IgA
Deficiencia selectiva de IgM
Inmunodelicioncia común variable
Deficiencia do subclase de IgG
Defectos de complemento
Deficiencia de complemento
Defectos estructurales
Dismotilidad de cilios
Defectos de origen desconocido
Síndrome hiper IgE
Candidiasis mucocutánea crónica
Comentarios
Hipoplasia hematopoyetica generalizada
Incluye: (1) La ligada al cromosoma X debido a un defecto en la cadena del receptor IL-2. (2)
herencia autosómica recesiva de naturaleza desconocida: (3) causada por deficiencia
de adenosma deammasa (ADA); (4) causada por enzima recombinasa (RAG 1.2) delecluosa,
(5) Síndrome de Omenn, en muchos casos debido a la mutación en el enzima RAG: (6)
asociada con defectos óseos (hipoplasia cartilago-pelo. enanismo de miembros cortos); (7)
síndrome del linfocito desnudo, baja expresión de la histocompalibilidad de los antigenos
HLA clase II; (8) causada por un defecto en la cinasa JAK; (9) causada por un defecto en
el receptor IL-7. (10) causada por un delecto en el enzima ZAP-70 de las células T
IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40. el
receptor de células B responsable del cambio del isotipo; neumonía por Pneumocystis, a
menudo coiangitis asociada con neutropenia cíclica, alta incidencia de esclerosis, normalmente
no se ve en las enfermedades de las células B frecuente
Deficiencia común de IgE lgG2 y/o IgA: alta incidencia de malignidad linforrelicular defecto
de la reparación del cromosoma
Detecto en células T variable; hipogammagiobulinemia en algunos
Trombocitopenia (plaquetas pequeñas); no respuesta a anticuerpos de carbohidratos: eczema:
herencia ligada al cromosoma x alta incidencia de malignidad linforeticular, células CD43+
no detectadas
Facies características: lesiones cardíacas (lo más tipico arco aórtico interrumpido); hipoparatiroidismo;
la deficiencia en células T puede ser lo suficientemente grave como para ir asociada con
deficiencia de anticuerpos, el defecto inmune por lo general mejora espontáneamente: el limo
está ausente en su forma completa, casi siempre fracaso del declive normal
Se produce inmunoglobulina, pero la respuesta al anticuerpo específico está marcadamente
deteriorada; delecto timico no caracterizado
A menudo asociado con aplasia de glóbulos rojos primaria
Las células T presentan pero no expresan CD3, necesario para la función del receplor de las
células T
Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo
u otras endoermopatias. con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos
Ausencia de células B
Clínicamente se presenta en el primer año de vida, varones para la forma ligada al cromosoma X
y varones y hembras para las otras
Aparece a los 2-4 meses de edad: dificultad para diferenciarlo del nadir normal de IgG que se
produce durante ese periodo
IgM normal-elevada; defecto en la expresión de gp 39. un ligando de las células T para CD40, el
receptor de células B responsable de la mutación del isotipo; la neumonía por PiieumcKystis,
no observada normalmente en las enfermedades de células B. es frecuente: a menudo asociada
con neutropenia cíclica
lgA<10mg/dl: IgG normal a aumentada; alrededor del 12% con deficiencia de lgG2. deficiencia
selectiva de IgA; la deficiencia más común (1/500 de los caucásicos): asociado con herencia
de antigenos de histocompatibilidad
Bastante rara asociada a infecciones por Neisseha
Importante defecto de anticuerpos células B presentes: puede presentarse deficiencia de células
T y aumentar con el tiempo
Dobido a la supresión de los genes de las cadenas pesadas do IgG. o producción deficiente de
isolipos de IgG seleccionados; asintomálica o asociada con infecciones, si la producción
de anticuerpos esta deteriorada
Puede imitar síndromes de deficiencia de anticuerpos: deficiencias de C3 clínicamente similares
a panhipogammaglobulinemia; deficiencias de componentes de complemento, particularmente
C6-C9, tienen inlecciones recurrentes con especies de Neissena
Imita a los síndromes de de
crónicas con bronquéela
encía de anticuerpos; otitis recurrentes e infecciones pulmonares
característica
Sindrome de Job-Buckley (hiper-lgE); abscesos en piel y órganos, anormalidades óseas.
anormalidades dentales
Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo
u otras endocrinopalías, con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos
Otros defectos
Deficiencia molecular de adhesión a la célula
Imita algo a los síndromes de deficiencias de anticuerpos: separación retrasada del cordón
(LFA-1/Mac-1)
umbilical: respuesta inflamatoria pobre periodontitis. episodios sépticos recurrentes
• Para mSs delates vGase el articulo IUIS Primary Inmunodeliciency Diseases Report of an IUIS Scientific Committee. Clin Exp Immunol 1999: 17 311-321. con perrraso
convincente de que no existe panhipogammaglobulinemia. La panhipogam- dades significativas hasta la edad de seis meses; si embargo, después de la
maglobulinemia es la forma habitual de presentación de la agammaglobulme- edad de un año. un nivel de IgA de 10 mg/dl o menos indica que la deficienmia ligada al cromosoma X. La IgA habitualmente no se encuentra en canti- cía de Ig A será un defecto permanente (Plebani. 1986). En el sindrome hiper-
966
Tabla 42-3
SECCIÓN V
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
Diez signos de alerta d e inmunodeficiencia*
Dos o más episodios de neumonía
Pérdida inexplicable de peso en adultos, fallo en el desarrollo
en lactantes
Abscesos recurrentes en órganos profundos o piel
Uno o más episodios de infecciones senas tales como meningitis.
sepsis, celulitis u osteomielitis
Historia familiar de deficiencia inmunitaria
Infecciones recurrentes de oídos, necesidad de sondas en adultos
Candidiasis orales o cutáneas después de la edad de un año
Dos o más meses con antibióticos orales con poco efecto
Necesidad de antibióticos intravenosos para curar infecciones
Dos o más infecciones de sinus en un año
'Dos o mas pueden indicar inmunodeficiencia.
inmunoglobulina M. se han visto niveles normales o elevados de IgM con
ausencia de IgA (Ramesh, 1998; Levy 1997). En general, las desviaciones de
otros ¡sotipos de inmunoglobulinas no se diagnostican como síndromes específicos. Sin embargo, los aumentos marcados de IgE forman casi siempre parte del síndrome de hiperinmunoglobulina E (Buckley, 1978), son comunes en
el síndrome de Wiskott-Aldrich, algunas deficiencias de células T aisladas y
se pueden encontrar en enfermedades crónicas granulomatosas. El síndrome
de Wiskott-Aldrich característicamente muestra también un marcado aumento de IgA en suero con bajo IgM (Ochs, 1998).
Radiografías y tomografía computarizada
Las radiografías y la tomografía computarizada (TC) y los estudios de resonancia magnética (RM) también pueden ser útiles para valorar las deficiencias inmunitarias. La neumonía crónica intersticial es frecuente en bebés,
niños o adultos con deficiencias en células T, y debería confirmarse con radiografías de tórax. Con el tiempo, muchos pacientes con deficiencia primaria de
células B (agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable común) pueden
desarrollar fibrosis pulmonar crónica o bronquiectasias (Sweínberg, 1991;
Cunningham-Rundles, 1999). La tomografía computarizada de tórax en un
paciente que presenta infecciones recurrentes del tracto respiratorio es la
mejor prueba para investigar una bronquiectasias; si estos cambios se han
desarrollado, se necesita seguir investigando.
Antes se realizaban proyecciones laterales del cuello para objetivar el tejido linfoide faríngeo en niños. Sin embargo, no se recomiendan las radiografías para la evaluación de tejido linfoide cervical porque la información que
éstas proporcionan se obtiene más fácilmente por otros métodos alternativos.
Las proyecciones anteriores del tórax pueden revelar una ausencia de la sombra timica en niños pequeños, pero como el timo puede disminuir fácilmente
debido al estrés, la evaluación del tamaño del timo por este método no es
fidedigna. Las anormalidades óseas, sin embargo, pueden alertar al radiólogo de un problema inmunológico presente en la infancia. Un subgrupo de
pacientes con inmunodeficiencias que implican anormalidades de células T o
B y T, sufren enanismo de extremidades cortas. Estos pacientes muestran
lesiones características, generalmente en las regiones metafisarias de los
huesos largos. Los pacientes con deficiencia de adenosina deaminasa muestran biselado de los extremos costales, cuadratura de los omóplatos y articulaciones inusuales de las apófisis transversales costales (Cederbaum, 1976).
Tabla 42-4
Hallazgos clínicos q u e sugieren u n a
inmunodeficiencia de defecto o localización inciertos
Defectos en el desarrollo
Eczema intratable
Dermatitis seborreica generalizada (inmunodeficiencia grave
combinada)
Adenopatia, esplenomegalia
Colitis ulcerosa manifestada antes del primer año de vida
Diarrea intratable
Enfermedad autoinmune (son habituales PTI o anemia hemolitica)
Deficiencia hematológica inexplicable (de cualquier serie: eritrocitos,
neutrólilos, plaquetas)
PTI = púrpura trombocitopenica inmune.
Tabla 42-5
Síntomas clínicos d e deficiencia correlacionados
c o n el tipo de defecto
Se piensa en una deficiencia de células T cuando
1. Vacunas de virus vivos o bacterias atenuadas producen
enfermedades sistémicas o resultados inesperados
(p ej., viruela generalizada, neumonía de células gigantes
con rubéola, infección generalizada por Mycobacterium)
2. Un virus habitualmenie benigno ocasiona una infección
contundente (a menudo neumonía) como varicela o
citomegalovirus.
3. Candida oral no responde a la quimioterapia, no va asociada a la
dermatitis de pañal o anlibioterapia excesiva, o persiste después de
seis meses de evolución.
4. Candida está presente en superficies mucosas y se traslada a
áreas cutáneas contiguas a modo de candidiasis mucocutánea.
5 El paciente sufre enanismo de miembros cortos (El pelo puede
ser muy fino y tejidos laxos con hiperexlensibilidad de
articulaciones y gran hernia umbilical)
6. Hay signos de enfermedad intrauterina de injerto contra
huésped (p. ej. descamación, eritrodermia, alopecia, defectos
en el desarrollo).
7. Enfermedad de injerto contra huésped se produce tras la
infusión de un hemoderivado
8. Se produce tetania neonatal. (Buscar mandíbula hipoplásica.
surco nasolabial corto, orejas de implantación baja con el
pabellón corto, hipertelonsmo de anomalía de DiGeorge.)
9. Lintocitos pequeños (< 10 en diámetro) con recuento
permanentemente menor de 1 200/mm .
10. Infecciones debidas a organismos oportunistas o se produce
un sarcoma de Kaposi generalizado Buscar factores de riesgo
asociados con sida.
Se piensa en una deficiencia de células B cuando
1. Infecciones recurrentes con piógenos exlracelulares,
Streptococcus,
Staphylococcus.
Haemophilus.
2. Hiperplasia linfoide nodular de intestino es persistente
3 Infección intestinal por Giardia
j Se piensa en un defecto combinado de células T y B cuando
1 Hay signos del síndrome de Wiskot-Aldnch (supuración de oídos,
trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, eczema en el varón).
2 Hay signos de ataxia-telangiectasia (La ataxia es el principal
signo de la enfermedad, especialmente cuando el niño crece
Una característica predominante es la telangiectasia de la
esclerótica y los oídos. La expresión facial es triste.)
3 Los síntomas antes mencionados de las enfermedades de
células T y B se producen juntos.
Se piensa en un defecto bioquímico cuando
1. Hay síntomas de defectos combinados T y B con cambios
característicos en las radiografías en costillas, omoplatos,
vértebras (deficiencia de adenosina deaminasa).
2. Hay aplasia medular primaria de glóbulos rojos y otros sintomas
del síndrome Blackfan-Diamond (deficiencia de nucleósidofosforilasa).
Se piensa en un defecto de leucocitos cuando
1. Hay abscesos estalilocócicos de piel recurrentes y graves; se
pueden observar abscesos prolundos de órganos internos,
pero menos habitualmente (síndrome hiperlgE o síndrome de
Buckley-Job). Más adelante aparecen abscesos en pulmón en
casi todos los pacientes con síndrome hiperlgE
2. Osteomielitis crónica o recurrente, nodulos linfáticos que
supuran, particularmente cuando son causados por especies
de Klebsiella o Serraba (enfermedad crónica granulomatosa).
Se piensa en una inmunodeficiencia secundaria cuando
1 Hay una infección viral concomitante o anterior (especialmente
virus de Epstein-Barr. VIH). La infección viral puede producirse en
el útero y producir una enfermedad inmunodeficitaria en el feto.
2. El paciente tiene determinadas enfermedades malignas
(p. ej.. leucemia linlocítica crónica, enfermedad de Hodgking.
mieloma múltiple).
3 Se produce acidosis, alopecia y convulsiones con candidiasis
mucocutánea crónica (deficiencia de botina) Deficiencias de
biolina, zinc y selenio pueden producirse en pacientes con
prolongada hiperalimentación.
3
4. El paciente está recibiendo inmunosupresores.
5. El paciente tiene una historia consecuente con posible
exposición a VIH.
6. El paciente tiene los sintomas clínicos de acrodermatitis
enteropática (deficiencia de zinc puede también ocurrir con
hiperalimentación prolongada).
I VIH = Virus de inmunodeficiencia humana
CAPITULO 42
•
TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
967
Subclases de IgG
La IgG consta de cuatro subclases, de la IgGl a la lgG4. que se distinguen por diferencias tanto estructurales como biológicas (véase Tabla 30-4
y Tabla 42-7) (Normansell, 1987; Schur, 1987). Aunque no se ha establecido
el papel individual de cada una de las subclases de la IgG para diferenciarse
del resto, los anticuerpos a los antigenos de los carbohidratos se concentran
en la subclase lgG2, y muchos antígenos de las paredes de las células bacterianas tienen naturaleza de carbohidrato (Scott, 1988). Asi. la ausencia de respuesta a lgG2 podría traducirse en un defecto para desarrollar protección (rente a infecciones bacterianas. Esta relación es más convincente en el paciente
ocasional con deficiencia de IgA que también tiene deficiencia de la subclase
lgG2 y que no responde con anticuerpos ante una vacuna como la del neumococo. En aquellos pacientes con deficiencia de IgA e lgG2, las pruebas de
función pulmonar pueden ser significativamente anormales comparadas con
aquellos sólo con deficiencia de IgA (Bjorkander, 1985). Una deficiencia en la
subclase IgG también se ha señalado como causa de infecciones recurrentes
en pacientes con niveles normales o casi normales de IgG (Oxelius. 1979:
Shackelford. 1990: Wedgwood, 1986: Gross, 1992; Popa. 1994).
Figura 42-2. El espectro de agentes infecciosos encontrado puede indicar el sistema mmunitario donde se encuentra el potencial detecto.
Pueden aparecer anormalidades óseas en pacientes con el síndrome de hiperinmunoglobulina IgE: estas anormalidades incluyen osteoporosis generalizada, fracturas ante un mínimo traumatismo, craniosinostosis y defectos en
huesos de la línea media (Grimbacher, 1999).
Funciones pulmonares
La inmunodeficiencia. especialmente si ha persistido durante algún tiempo,
a menudo afecta a las funciones pulmonares, a todos los volúmenes pulmonares, debiendo evaluarse los volúmenes espiratorios forzados, incluso si la
radiografía de tórax es normal. Los pacientes con defectos de células B y T son
propensos a infecciones pulmonares, que terminan en broncoespasmo, enfermedad restrictiva u obstructiva, o combinaciones de estas anormalidades.
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL
Producción de anticuerpos
Para reconocer el significado clínico de los niveles algo reducidos de mmunoglobulina en suero, se miden las respuestas especificas de los anticuerpos
a antígenos previamente administrados o que ya existen. Si el niño o el adulto recibieron previamente las inmunizaciones habituales, pueden cuantificarse
los títulos de anticuerpos para los antígenos de esas vacunas. Si el niño no ha
sido inmunizado o para los adultos donde ha transcurrido más tiempo desde la
vacunación, se debe producir una respuesta tras la administración de la vacuna de recuerdo (Moen, 1986)). Las mejores respuestas a vacunas suceden
con el tétanos, difteria, haemophilus y neumococos; muchos laboratorios
comerciales han desarrollado pruebas de sensibilidad que pueden utilizarse
para calcular la producción de anticuerpos. Lo que no está tan claro es cómo
interpretar cada respuesta; en general un aumento de dos a tres veces o más
por encima de los niveles de referencia, y la existencia de niveles protectores
de anticuerpos, significa una adecuada respuesta a estas vacunas. Es importante recalcar que no deben administrarse vacunas de virus vivos a los niños,
o a cualquier miembro de la lamilia si se cuestiona el estado inmunológico. Las
vacunas del sarampión, paperas, rubéola, polio, bacilo de Calmette-Guerin
(BCG) y varicela no pueden ser usadas en esta población. Si el paciente no
tiene el grupo sanguíneo AB, se pueden determinar los niveles de las isohemaglutininas A o B que convengan (Parker, 1997). Sin embargo, debido a la
relativa inmadurez, o quizá a la inadecuada exposición a edades menores de
dos o tres años, las isohemaglutininas pueden ser negativas o de títulos baios
en niños pequeños, incluso en aquellos que tienen la inmunidad normal.
A pesar de estos indicadores, la importancia biológica de la deficiencia de
la subclase IgG no está clara. De hecho, algunos individuos que carecen totalmente de genes para lgG2 IgA e IgE. están sanos (Lefranc. 1982: Migone,
1984). Además, los anticuerpos anticarbohidrato lgG2 no son la única fuente
de protección de anticuerpos para estos antigenos. En realidad, una deficiencia significativa de anticuerpos, limitada a reacciones frente a antigenos de
carbohidratos, o más defectos globales, se pueden encontrar en niños o adultos con niveles normales de inmunoglobulina total en suero (Ambrosmo.
1988). La IgGl es el primer tipo de subclase de respuesta frente a antígenos
de carbohidratos, produciéndose una conversión a respuesta lgG2 a medida
Tabla 42-6 Niveles de pruebas inmunológicas
Nivel*
Medida
Primer nivel
Historia y exploración física
CBC y diferencial
Número de linfocitos (mortologia de linfocitos)
Niveles cuantitativos do inmunoglobulina
Radiografías
Cultivos
Funciones pulmonares
| Segundo nivel Respuestas a anticuerpos específicos
Análisis de subclase IgG
Prueba de complemento
Pruebas cutáneas de hipersensibihdad retardada
Análisis de marcadores de superficie de linfocitos
Estudios de proliferación de células mononucleares
(usando células mitogémeas. alogénicas y
estimulación de antigenos)
Reducción de neutrófilos con tinción (equivalente
al citómetro de flujo NBT)
Tercer nivel Medidas de enzimas (adenosina deaminasa. PNP")
Estudios de citotoxicidad de células NK
Estudios de fagocitos (movilidad, glucoproteinas
de superficie, bioquímica)
Análisis de estructura e inmunohistológico de
órganos linfoides
Producción de citocínas
Estudios complejos de complemento; defectos
genéticos
Nuevos antigenos a pruebas de producción de
anticuerpos
Biología molecular, delección de portadores.
diagnostico prenatal
" El nivel de medida se refiere a la localización clínica en la que se realiza y se
interpreta la prueba Las pruebas de primer nivel se obtienen fácilmente en
hospitales locales o en laboratorios comerciales El médico de primaria dobe
ser capaz de interpretar estos valores. Las pruebas de segundo nivel se realizan si las condiciones clínicas lo justifican y algunas pueden necesilar médicos
con formación especializada para determinados análisis Las pruebas de tercer
nivel se realizan e interpretan en centros con un interés aelrvo de investigación
en el tema.
CBC • recuento completo de sangre NBT = nilroazul de tetrazolium; PNP =
purina nucleósido fosforilasa; NK = células asesinas naluraies
SECCIÓN V
968
,
—__
Tabla 42-7
.
•
INMUNOLOGÍA E INMUNOPATOLOGÍA
.
,
Propiedades d e las inmunoglobulinas h u m a n a s
IgM
IgG
IgA
IgD
A. Fisiológicas
Concentración normal en adultos, mg/ml
1.2-4,0
8.0-16.0
0,4-2.2
0,03
17-450 ng/ml
Unidades internacionales/ml
69-322
92-207
54-268
<10O
Porcentaje total de inmunoglobulina
13
80
6
1
0.002
Distribución intravascular, porcentaje
41
48
76
75
51
Ritmo de síntesis, mg/kg/dia
2,2
35
24
0,4
0.003
Ritmo de catabolismo en suero,
10.6
6
24
37
90
porcentaje/dia (o semivida. día)
(5-6)
(18-23)
(5-6,5)
(2.8)
(2.3)
B. Biológicas
i
±
Capacidad de aglulinación
+4
Capacidad de fijación de complemento por la ruta clásica
+4
+
—
—
Hipersensibilidad homologa anafiláctica
+4
—
—
Anafilaxis heteróloga de cobaya
+
±
Fijación a mastocitos y basófilos homólogos
+4
Unión citofílica a macrótagos
+
—
Transporte placentario al feto
+
—
—
Actividad de fijación al factor reumatoide
+
±
Presente en secreciones externas
+4
+2
+
Otras propiedades características:
IgM Producida rápidamente en respuesta inmune, primera defensa electiva contra la bacteriemia
IgG: Combate microorganismos y toxinas en fluidos extravasculares
IgA Deliende las superficies externas del cuerpo
IgD- Presente en superficie de linfocitos o células inmunocompetent.es, importante para la activación y/o mmunorregulación de células B
;
—
—
—
i
que el individuo madura (Scott, 1988). No hay evidencia de que los que se
limiten sólo a respuestas IgG 1 tengan ninguna desventaja. Es obligatorio
determinar la importancia biológica de una deficiencia en la subclase IgG, probando con una producción específica de anticuerpos, generalmente mediante la administración de vacunas como tétanos, difteria, haemophilus y neumococo. Solamente se debería considerar que tienen un defecto de
inmunidad significativo aquellos sujetos con una deficiencia clara de anticuerpos a un número de antígenos.
Inmunidad de células T
El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha permitido la rápida enumeración de células T y subgrupos de células T, usando sólo una pequeña cantidad de sangre. Estos marcadores de anticuerpos se han clasificado, con la
designación "CD". para "antígenos de diferenciación"("c/usfer ol differentiation"). lo que quiere decir que un grupo de anticuerpos monoclonales identifica una proteína característica determinada de un subgrupo de células mononucleares seleccionadas. La designación CD subdivide a las células T (como
un grupo, CD3-*-) en dos principales subgrupos, CD4+, algunas veces llamadas células "colaboradoras", células involucradas en el inicio de las reacciones inmunes, secreción de citocinas y aumento de respuestas de células B, y
células T CD8+. asociadas con funciones citolilicas (asesinas). Aunque estas
actividades funcionales definen alguna de las actividades inmunológicas de
las células T CD4+ y CD8+. ambas moléculas sirven como moléculas señalizadoras, que funcionan en unión con las principales clases I y II de histocompatibilidad de antigenos (MHC), y sirven para ampliar y estabilizar la
unión del receptor de la célula T (TCR) con el antígeno. Las enfermedades
con inmunodeficiencia que derivan de la generación defectuosa de células T
pueden dar lugar a un número bajo o nulo de células T CD3+, produciendo un
bajo número de células CD4+ y CD8+, o un número reducido de células CD4+
o CD8+. El síndrome de DiGeorge, por ejemplo, provoca un número bajo de
células CD3+ en general (Hong, 1998); una deficiencia de la clase II MHC
provoca un número bajo de células CD4+ (Klein,1993); y una anormalidad de
la célula iniciadora, Zap-70. esencial a la actividad del receptor de las células
T, provoca un número reducido de células T CD8+ (Eider. 1998). En general,
si se sospecha un defecto inmunitario, se examina este panel de marcadores
de células T y se determina el número absoluto de células en cada grupo,
comparándolo con los controles normales de edad similar establecidos por el
laboratorio.
—
— _
.—J
Valoración funcional de las células T
Las pruebas cutáneas de hipersensibilidad retardada se utilizan habitualmente como medidas de función de las células T. porque miden la capacidad
de reconocer y de presentar el antigeno, movilizar las células T y generar una
respuesta específica inflamatoria. Ya sean los números de células T normales, bajos o nulos, se debe comprobar la función de las células T si existe
cualquier sospecha de existencia de un defecto celular de esta naturaleza.
Sin embargo, el principal inconveniente cuando se realizan pruebas cutáneas
en lactantes es que no han tenido suficiente exposición para responder a los
antígenos (Kniker, 1985). Asi, en el momento en que la valoración de las células T es particularmente importante, estas pruebas son inservibles. Entre los
tres y los cinco años de edad, las pruebas cutáneas adquieren más fiabilidad.
Otro problema con las pruebas cutáneas es que el antígeno debe ser inyectado intradérmicamente con cuidado.
Una idea más definitiva sobre la capacidad funcional de las células T se
puede obtener mediante valoraciones funcionales. Junto con las pruebas
cutáneas utilizadas como métodos de detección, para valorar la función de