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Desarrollo y Evaluación de un Biofertilizante Microbiano para el Cultivo de Alfalfa
Laura Sofia Torres Vásquez- 20231180034
Universidad Distrital Francisco José de Caldas – Facultad de Medio ambiente y Recursos
Naturales
Microbiología- Grupo 545
Doc. Lena Carolina Echeverry
04 de junio de 2024
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INDICE
Resumen ............................................................................................................................................. 3
Introducción....................................................................................................................................... 4
Objetivos e hipótesis .......................................................................................................................... 6
Objetivo General ........................................................................................................................... 6
Objetivos Específicos .................................................................................................................... 6
Hipótesis ......................................................................................................................................... 6
Marco teórico ..................................................................................................................................... 7
Cultivo de alfalfa ........................................................................................................................... 7
Sustratos en cultivo de alfalfa ...................................................................................................... 7
Acción biológica ............................................................................................................................. 8
Bioinsumos ..................................................................................................................................... 9
Agricultura Ecológica ................................................................................................................. 10
Metodología ..................................................................................................................................... 11
Diseño experimental .................................................................................................................... 11
Variables experimentales ........................................................................................................ 11
Grupos experimentales y de control ...................................................................................... 12
Procedimiento .............................................................................................................................. 12
Resultados y Discusión .................................................................................................................... 15
Procesos de purificación y mantenimiento................................................................................ 15
Identificación de género y especie .............................................................................................. 17
Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes obligados en
un modelo biológico..................................................................................................................... 17
Conclusiones .................................................................................................................................... 18
Referencias ....................................................................................................................................... 19
3
3
Resumen
En el siguiente proyecto se evalúa la efectividad del biofertilizante hecho a partir del
microrganismo Bacillus Sutilus en los cultivos alfalfa, biofertilizantes que han demostrado
ser útiles en el crecimiento de las plantas, mediante sustratos como la arena gruesa que
favorece a la aeración y el compostaje que es de bajo costo y mejora la fertilidad del suelo.
El estudio utilizó como variable modificadora el biofertilizante y como variables sin
modificar aquellas que pertenecen al ambiente, además se incluyeron dos grupos controles;
uno con compostaje y otro con arena gruesa. Durante el semestre académico se realizaron
diferentes procesos como la obtención, desinfección, purificación y caracterización del
microorganismo para evaluar su efectividad como significativa entre el grupo control y el
grupo de tratamiento.
Abstract
The following project evaluates the effectiveness of the biofertilizer made from the
microorganism Bacillus Sutilus in alfalfa crops, biofertilizers that have proven to be useful
in plant growth, using substrates such as coarse sand, which favors aeration, and compost,
which is low cost and improves soil fertility. The study used as modifying variable the
biofertilizer and as unmodified variables those that belong to the environment, in addition,
two control groups were included; one with compost and the other with coarse sand. During
the academic semester, different processes were carried out such as obtaining, disinfection,
purification and characterization of the microorganism to evaluate its effectiveness as
significant between the control group and the treatment group.
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Introducción
La sostenibilidad y sustentabilidad son metas que rigen el mundo actual,
especialmente en el cultivo y siembra, donde se busca mantener la producción sin agotar
los recursos naturales y producir productos que satisfagan las necesidades humanas y del
medio ambiente sin dañar su equilibrio; para ello el ser humano trabaja constantemente en
técnicas que incluyen estas metas, un ejemplo de que se está logrando este objetivo es
mediante lo que se busca el cultivo de alimentos sostenibles sin mayores efectos negativos.
En el presente documento se utilizan los conceptos previamente mencionados para
demostrar la efectividad de los biofertilizantes aplicados en el cultivo alfalfa el cual cuenta
con adaptabilidad ecológica y alto valor nutricional además de fijación biológica de
nitrógeno. Para su optimización se usará el compostaje y la arena gruesa. Ahora bien,
¿Como será la construcción del biofertilizante?, esta se obtendrá a partir del
microorganismo Bacillus Subtilis es cual cuenta con características como la gran
adaptabilidad a condiciones del ambiente adversas y la facilidad del estudio de la división
celular y la secreción de proteínas (Kovács, 2019).
La adaptabilidad de este microorganismo se basa en que es predilecto para suprimir
enfermedades causadas por patógenos y sintetizan antioxidantes que ayudan a la planta en
su defensa, de igual manera mejora la fijación del nitrógeno y la producción de sideróforos
que promuevan el crecimiento óptimo de la planta. Los efectos del biofertilizante se notarán
a partir de la coloración de las hojas y el tamaño en comparación con el grupo control.
Las variables del estudio determinarán los resultados a obtener, para ello se dividió
el grupo control y de tratamiento en dos, teniendo en cuenta el uso de dos sustratos
determinantes, el compostaje y la arena gruesa. Para llevar a cabo el estudio primero realizó
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la obtención del material y su respectiva desinfección con alcohol, el siguiente paso resultó
clave en la investigación pues fue el uso del medio de cultivo conocido como YMA-RC el
cual fue divido en 4 secciones (correspondiendo a los grupos mencionados), el proceso tuvo
una duración de 4 semanas.
Posteriormente se caracterizó el microorganismo a partir de una lectura para
determinar sus características morfológicas por medio de tinciones como la tinción de
Gram o la tinción de tinta china. Para identificar el género y la especie la investigación se
basó en el manual de Bergey, teniendo en cuenta los resultados que arrojaron las diferentes
pruebas realizadas al microrganismo como lo fueros pruebas bioquímicas, enzimáticas y
evaluación en diferentes tipos de medios. Posterior a ello mediante un caldo de YMA que
contuviera colonias identificadas posiblemente como el microorganismo Bacillus Subtilis
en las plantas utilizadas como tratamiento en el diseño experimental mediante la técnica de
riego. Durante el estudio se identificaron errores técnicos que afectaron el procedimiento y
el resultado final, pero a pesar de eso el biofertilizante logro aportar significativamente a las
plantas de alfalfa de tratamiento.
Para concluir se define la relación que pueda llegar a establecerse entre las variables
que conforman el diseño experimental de la investigación, si en esta se alcanzó el objetivo
planteado y un análisis de la hipótesis con las posibles situaciones que pudieran llegar a
impedir la realización de esta.
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Objetivos e hipótesis
Objetivo General
Evaluar la efectividad del biofertilizante desarrollado a lo largo del semestre
académico en el cultivo de alfalfa, su capacidad de fijar nitrógeno y las variables que
pueden influir en el resultado final.
Objetivos Específicos
•
Recopilar y seleccionar información conceptual de alta calidad que abarque
lo fundamental acerca de conceptos básicos del proyecto, como bioinsumos,
bacterias fijadoras de nitrógeno y cultivo de alfalfa, que le den al proyecto
una base teórica sólida.
•
Organizar toda la información recolectada a lo largo del desarrollo del
biofertilizante, para facilitar su acceso y comprensión.
•
Contrastar la información teórica con los resultados experimentales
obtenidos durante la evaluación del biofertilizante para llegar a conclusiones
fundamentadas.
Hipótesis
El biofertilizante mejorará significativamente la fijación de nitrógeno y el
crecimiento del cultivo de alfalfa en comparación a cultivos que no hacen uso de este u otro
método tradicional.
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Marco teórico
Cultivo de alfalfa
La alfalfa es una planta leguminosa, las cuales se caracterizan por su capacidad de
establecer una interacción simbiótica con los rizobios y formar nódulos fijadores de
nitrógeno puesto que dentro de los nódulos las bacterias pueden convertir el gas nitrógeno
(N2) a iones de amoniaco que son utilizados por el huésped para sintetizar y liberar muchas
moléculas y enzimas promotoras que estimulan directa o indirectamente el crecimiento de
las plantas en diferentes condiciones ambientales. Se considera que la alfalfa es
moderadamente tolerante a la salinidad, sin embargo, su crecimiento y productividad se ven
muy reducidos bajo el estrés salino severo (Wang et al., 2022). La alfalfa se considera un
excelente forraje para plantas leguminosas perennes por su amplia adaptabilidad ecológica,
alto valor nutricional, palatabilidad, fijación biológica de nitrógeno y producción de
biomasa. Se cultiva en todos los continentes pues juega un papel muy importante en la
construcción ecológica, la ganadería y la agricultura (D. Wang et al., 2016).
Sustratos en cultivo de alfalfa
El compostaje es un método de biorremediación de suelos de bajo costo, efectivo y
sencillo, mejora la fertilidad del suelo, las propiedades físicas y biológicas del suelo, y el
rendimiento de cultivos, su utilización promueve a la disponibilidad de nutrientes, el
crecimiento de las plantas estimula su respiración, fotosíntesis y el contenido de clorofila,
además puede recuperar suelos afectados por la salinidad (Mbarki et al., 2018)
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La arena gruesa es un sustrato que se puede encontrar en todos los ambientes La
arena tiene partículas de diferente tamaño considerándose como un sustrato deseable, pues
tiene propiedades físicas óptimas para el desarrollo de cultivos, tales como son porosidad y
gran capacidad de retención de humedad, drenaje rápido y buena aireación, evitando que
las plantes por exceso de agua promoviendo el crecimiento saludable de las raíces y
previniendo enfermedades relacionadas con el encharcamiento (Ángel et al., s. f.)
Acción biológica
Bacillus subtilis es una especie del genero Bacillus que se caracteriza por su
competencia natural para la captación de ADN extracelular y facilita la absorción de este.
Las esporas latentes de esta bacteria pueden sobrevivir a sustancias adversas como altas
temperaturas, desecación, radiación UV o γ, depredación por microorganismos o
macroorganismos. B. subtilis puede aislarse en diversos ambientes, desde el suelo hasta
habitad marinos y es utilizado en diversas aplicaciones desde el biocontrol de plantas hasta
la producción de enzimas y fermentación de alimentos. Es un microorganismo modelo para
estudiar la división celular, la secreción de proteínas, la motilidad superficial (nadar,
enjambre y deslizarse), el desarrollo de biopelículas y adhesión a la raíz de la planta o hifas
fúngicas (Kovács, 2019).
Las especies Bacillus son un tipo importante de rizobacterias que forman esporas
que pueden sobrevivir en el suelo durante un largo periodo de tiempo bajo condiciones
adversas y además exhibe un mecanismo de biocontrol directo e indirecto. En el
mecanismo directo se encarga de suprimir enfermedades causadas por patógenos al
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sintetizar muchos metabolitos secundarios, hormonas, enzimas que degradan la pared
celular y antioxidantes que ayudan a la planta en su defensa y en el mecanismo indirecto
incluye la estimulación del crecimiento de las plantas y la inducción de la resistencia
sistémica adquirida. Solubiliza el P del suelo, mejora la fijación del nitrógeno, produce
sideróforos que promueven su crecimiento, mejora la tolerancia al estrés a sus plantas
hospederas, al inducir la expresión de genes de respuesta al estrés, fitohormonas y
metabolitos relacionados con el estrés (Hashem et al., 2019).
Todos estos factores se identifican en la planta con detalles a simple vista como el color de
las hojas, las que cuenten con un verde oscuro cuentan con suficiente nitrógeno, un color
verde más intenso indica una buena disponibilidad de nitrógeno mientras que hojas
amarillentas indican una deficiencia de este. Mayor altura y robustez en comparación con
aquellas que no cuenten con suficiente nitrógeno, densidad de las hojas y presencia de
nódulos en las raíces.
Bioinsumos
Son productos de origen biológico que hacen parte de las opciones más atractivas
vinculadas a las soluciones sustentables en las industrias del sector agro-biotecnológico
pues incorporan las buenas prácticas agrícolas ligadas a acciones amigables con el
ambiente. La fertilización biológica en la que intervienen diferentes microorganismos es
utilizada en la agricultura para mejorar la eficiencia en el uso de nutrientes con distintos
efectos favorables como la promoción de su crecimiento vegetal, fijación de nitrógeno,
solubilización de nutrientes, efectos de biocontrol y mejora de la tolerancia a patógenos
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entre otros. La producción de estos influye en los diversos tipos de agricultura sostenible y
ecológicamente más limpia para la evolución de la larga preocupación mundial con
respecto a la conservación de los recursos naturales del ambiente (Lagler, 2017).
Agricultura Ecológica
El concepto de agricultura ecológica nace a partir de la conciencia que se toma de la
importancia de consumir alimentos sostenibles y naturales, es un método de producción
agrícola que se basa en el cultivo de alimentos a partir de elementos orgánicos sin utilizar
productos químicos que dañen el medioambiente. Estas practicas de cultivo mantienen e
incrementan la materia orgánica del suelo, refuerzan la estabilidad y biodiversidad edáficas
para prevenir la compactación, la erosión del suelo, daños por plagas y/o malas hierbas con
métodos naturales (Capital, 2022).
La sustentabilidad puede ser entendida como la producción de bienes y servicios,
donde se satisfagan las necesidades humanas y se garantice una mejor calidad de vida a la
población en general, con tecnologías limpias no destructivas con la naturaleza,
fortaleciendo las condiciones del medio ambiente y aprovechando los recursos naturales,
dentro de los límites de la regeneración y el crecimiento natural (Ávila, 2018)
La sostenibilidad se define como la capacidad de mantener una actividad o proceso
sin agotar los recursos naturales o causar un impacto negativo en el medio ambiente. Se
centra en la conservación y el equilibrio a largo plazo, asegurando que las necesidades
actuales se satisfagan sin comprometer las necesidades futuras (Díaz, 2023)
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Metodología
La metodología utilizada es la explicativa, la cual se centra en identificar las
relaciones de causa y efecto, para explicar el como y el porque ocurren ciertos eventos al
comprender relaciones entre variables que no dependen ni pueden ser manipuladas por el
investigador directamente. La hipótesis a través de esta metodología puede ser probada
mediante la recopilación y el análisis de datos (Busayo.Longe, 2022).
Por lo que esta metodología permite analizar como los resultados experimentales recogidos
de experimentos controlados que buscaban evaluar la efectividad del biofertilizante, se
ajustan a la teoría sobre la fijación de nitrógeno y el uso de biofertilizantes. Además de
describir y correlacionar datos, permite profundizar en la compresión de las variables y
mecanismos que determinan la efectividad del biofertilizante en el cultivo de alfalfa.
Diseño experimental
Para la evaluación del biofertilizante desarrollado en el laboratorio en el cultivo de
alfalfa se consideraron variables modificadas y variables no modificadas y definidas las
variables a estudiar el experimento se diseñó de la siguiente manera:
Variables experimentales
•
Las variables modificadas fueron la aplicación del biofertilizante, pues se
definieron unas plantas de control a las cuales no se les rego con este y
plantas de tratamiento a las cuales sí. Y un sustrato que potenciara el
crecimiento de la planta, con presencia o ausencia de arena gruesa, por lo
cual plantas de control con sustrato de tierra y compost y plantas de
tratamiento con compost y arena gruesa mezcladas con tierra como sustrato.
12
•
Las variables no modificadas fueron las condiciones ambientales como la
luz, temperatura y humedad que las determinaba el invernadero de la sede
Vivero. Y de la frecuencia y cantidad de riego, todas las plantas utilizadas
en el experimento recibieron estas variables de la misma manera.
Grupos experimentales y de control
Grupos de control
•
Un cultivo de alfalfa sin biofertilizante en sustrato de tierra con
compost.
•
Un cultivo de alfalfa sin biofertilizante en sustrato de tierra con
compost mezclado con arena gruesa.
Grupos de tratamiento
•
Dos cultivos de alfalfa con biofertilizante en sustrato de tierra con
compost.
•
Dos cultivos de alfalfa con biofertilizante en sustrato de tierra con
compost mezclado con arena gruesa
Procedimiento
Obtención de material biológico vegetal. De tréboles o leguminosas con nódulos
activos de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico se seleccionó el material vegetal con
nodulaciones en la raíz, se lavó cuidadosamente las raíces para eliminar toda la tierra y
cortar los nódulos a nivel de la raíz con una cuchilla estéril sin arrancarlos o cortarlos, para
posteriormente desechar el resto del material vegetal.
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Desinfección del material biológico. Las raíces noduladas fueron colocadas en
alcohol al 70% durante cinco minutos, luego con pinzas se pasaron a un vaso de precipitado
con agua, para agitar suavemente y retirar. Seguidamente, las raíces se sumergieron en una
solución de hipoclorito de sodio al 2% por un minuto, y el proceso de transferencia y
agitación en agua se repitió cinco veces para eliminar residuos de alcohol e hipoclorito de
sodio.
Procesos de purificación y mantenimiento. En un medio de cultivo YMA-RC que
fue dividido en 4 secciones en las cuales a cada una se le colocaron dos nódulos
previamente cortados por mitad para realizar una siembra directa, se ingresó a encubar a
una temperatura de 37°C por 3 a 5 días. Semanalmente se fueron aislando las UFC
obtenidas para garantizar una purificación y aislamiento adecuado del microrganismo, este
proceso se realizó durante 4 semanas aproximadamente en el laboratorio, a partir de
resiembra en el medio YMA-RC con diferentes métodos como el de rejilla y francés.
Caracterización de microorganismo con interés de bioproducto. Semanalmente a
cada una de las resiembras realizadas se les realizo una lectura macroscópica para
determinar su forma, elevación, margen, color y mate. También se realizaron diferentes
tinciones para caracterizarlo microscópicamente como lo fueron tinción de Gram para
registrar su morfología microbiana e identificar si era un gran-positivo o un Gramnegativo, tinción de verde malaquita para identificar endo y exoesporas, tinción de tinta
china para observar glicocálix y la tinción de Leifson para observar flagelos. Además, se
realizaron pruebas bioquímicas y enzimáticas con el microorganismo.
Identificación de género y especie. Con los resultados obtenidos a lo largo de la
caracterización del microorganismo, se realizó primero la observación morfológica que
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incluye la forma de las células, sus estructuras especiales y agrupaciones celulares; se
identificaron las condiciones óptimas de crecimiento temperatura, pH, oxigeno,etc.., la
apariencia de colonias, su capacidad para fermentar diferentes azucares, producción de
enzimas y reacciones metabólicas especificas .
Proceso de fermentación para obtener el cultivo microbiano. En un tubo con 10 ml
de agua peptonada, con un asa redonda bacteriológica se depositaron las colonias
identificadas de microorganismos fijadores de nitrógeno con capacidad de realizar
nodulación. Se resuspendió y homogenizó la muestra, luego se transfirió los 10 ml al
Erlenmeyer que contiene 90 ml de caldo YMA y finalmente se realizó el proceso de
fermentación durante 24 horas.
Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes
obligados en un modelo biológico. Para evaluar el proceso de nodulación con los
microorganismos aislados de los nódulos, se realizaron los controles de tratamiento y
control especificados en el diseño experimental, modificando la forma de inoculación. Los
montajes de tratamiento fueron inoculados mediante la técnica de riego.
Se marcaron las materas como Tratamiento, se llenaron con el sustrato especifico
luego se realizaron surcos de 2 cm de profundidad, fueron colocadas varias semillas de
alfalfa anteriormente desinfectadas y cubiertas con el suelo sin presionarlo. Se regaron
aproximadamente 20 ml de caldo fermentado a cada matera de tratamiento y 24 horas
después de la siembra, se inició el riego con agua cada 3 días, a cada plata se le agregaba
agua hasta que cubriera completamente la tierra y saliera por los orificios de la matera.
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Resultados y Discusión
Procesos de purificación y mantenimiento
Se realizaron resiembras durante aproximadamente 4 semanas las cuales fueros
registradas desde el 10/04/2024- 29/04/2024 como es evidente en los siguientes anexos:
•
Anexo 1. Siembra 10/04/2024
•
Anexo 2. Siembra 16/04/2024
•
Anexo 3. Siembra 24/04/2024
•
Anexo 4. Siembra 29/04/2024
Como es posible identificar en los anexos las dos primeras siembras registran pocas
UFC y biomasa escasa, situación que retraso e hizo mas complicado el proceso de
caracterización por posibles errores técnicos en la siembra que impidieron generar UFC
desde el inicio, esto también se le suma la poca práctica a la hora de realizar siembra, la
cual fue mejorando con el trabajo en laboratorio como se demuestra en los últimos
anexos
Caracterización de microorganismo con interés de bioproducto.
Lectura macroscópica de siembra final. Anexo.4
UFC
FORMA
BORDE
ELEVACIÓN COLOR
BRILLANTE MATE
1
Circular
Entera
Elevada
SI
Naranja
SI
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Pruebas bioquímicas
PRUEBA BIOQUÍMICA
RESULTADO
Citrato
Negativo
TSI
Positivo para producción de gas y ausencia
de fermentación de azúcares.
Gelatina licuefacción
Positivo, cambia a estado líquido
Rojo de metilo
Negativo, se mantiene el color amarillo
SIM
Motilidad
Voges‐ Proskaue
Negativo, se mantiene el color amarillo
Reducción de nitrato
Negativo
Urea
Negativo
Evaluación de condiciones extrínsecas.
EVALUACIÓN
Medio pH 3
Medio pH 7
Medio pH 10
NaCl 5%
NaCl 10%
Sacarosa 10%
Sacarosa 20%
Temperatura alta 15 min
Temperatura alta 30 min
Temperatura baja 60 min
RESULTADO
Sin crecimiento
Crecimiento
Crecimiento
Crecimiento
Sin crecimiento
Crecimiento
Crecimiento
Crecimiento
Sin crecimiento
Crecimiento
Pruebas enzimáticas
PRUEBAS
Medio Almidón
Medio Carboximetil celulosa
Medio Libre de nitrogeno
Medio de Fosfatos
Ácido- Indol- Acético
RESULTADOS
Positiva producción de amilasas
Negativo para producción de celulosas
Medio completamente incoloro
Negativo
Buena producción de indol
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Identificación de género y especie
Todas estas pruebas mencionadas anteriormente fueron utilizadas para identificar un
microorganismo desconocido y los resultados sugieren que probablemente el
microorganismo es Bacillus Subtilis.
En las pruebas bioquímicas como la prueba de citrato, TSI y la gelatina licuefacción
indican características típicas de este microorganismo. El cual no puede utilizar citrato
como única fuente de carbono (Levine, 1975) y tiene la capacidad de producir gas a partir
de la descomposición de azucares (Phillips, 1976) y produce enzimas capaces de
descomponer la gelatina (Cappuccino & Sherman, 2014).
El crecimiento en diferentes condiciones de pH, concentraciones de sal y sacarosa,
así como la tolerancia al calor y al frío, son consistentes con las características de Bacillus
subtilis (Berlanga, 2010b)
Las pruebas enzimáticas nos permitieron identificar que este microorganismo es
capaz de descomponer almidón y no produce celulosas características típicas de Bacillus
subtilis (Cappuccino & Sherman, 2014). Además, este microorganismo también es capaz de
producir indol en ciertas condiciones (Levine, 1975).
Evaluación del proceso de fijación biológica por microrganismos simbiontes obligados
en un modelo biológico
Es evidente como el sustrato y el biofertilizante influyeron positivamente en el
crecimiento de la alfalfa, las plantas de tratamiento tienen mayor altura, mejor color y
densidad de hojas y mayor cantidad de forraje de alfalfa, en comparación con las de control
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y las que solo tienen tierra con compost. Se esperaba un mayor crecimiento por parte de
esta, pero se intuye que en el proceso de siembra la cantidad se semillas excedió a la
recomendada por lo que impidió un mayor crecimiento. El proceso es evidente en los
anexos 5- 16.
Conclusiones
En definitiva, las variables seleccionadas no cuentan con una correlación directa, las
variables modificadas son acciones que se tomaron en conjunto para modificar el entorno
de crecimiento de las plantas, que fueron la aplicación del biofertilizante y la elección del
sustrato con presencia o ausencia de arena gruesa. Mientras que las variables no
modificadas como las condiciones ambientales y la cantidad/ frecuencia de riego no fueron
alteradas intencionalmente como parte del experimento, por lo que se mantuvieron
constantes para todas las plantas, tanto para las de control como las de tratamiento.
Por ello y todo lo encontrado en la investigación se concluye que, se logró evaluar
la efectividad del biofertilizante desarrollado y su capacidad de fijar nitrógeno, al mejorar
significativamente el crecimiento del cultivo de alfalfa y posiblemente su fijación de
nitrógeno en comparación a cultivos que no hacen uso de este, además de mencionar y
destacar situaciones específicas que dificultaron el cumplimiento del objetivo, como lo fue
el exceso de uso de semillas a la hora de sembrar y una mala obtención de UFC al inicio del
proyecto por falta de práctica en laboratorio.
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Referencias
•
Ángel, S. C. M., Pablo, P. R., Guillermo, G. C., Ernesto, F. R. J., Guillermo, G. L.,
Arnaldo, O. V. J., & Miguel, E. S. (s. f.). Adición de material pomáceo a sustratos
de arena para incrementar la capacidad de retención de humedad.
https://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0378-18442008001200012
•
Ávila, P. Z. (2018). LA SUSTENTABILIDAD o SOSTENIBILIDAD: UN
CONCEPTO PODEROSO PARA LA HUMANIDAD.
https://www.redalyc.org/journal/396/39656104017/html/
•
Berlanga, M. (2010a). Brock Biology of Microorganisms (11th edn). Michael T.
Madigan, John M. Martinko (eds). ResearchGate.
https://www.researchgate.net/publication/41584156_Brock_Biology_of_Microorga
nisms_11th_edn_Michael_T_Madigan_John_M_Martinko_eds
•
Busayo.Longe. (2022, 14 marzo). Explanatory Research: Types, Examples, Pros &
Cons. Formplus. https://www.formpl.us/blog/explanatory-research
•
Cappuccino, J. G., & Sherman, N. (2014). Microbiology: a laboratory manual.
•
Capital, C. (2022, 11 diciembre). Agricultura ecológica: sostenibilidad y
medioambiente. Crops Capital. https://cropscapital.com/agricultura-ecologicasostenibilidad-y-medioambiente/
•
Díaz, I. (2023, 20 julio). Sostenible vs Sustentable: Significado y Conceptos Clave.
Ecología Digital. https://ecologiadigital.bio/cual-es-la-diferencia-entre-sostenible-ysustentable-y-cual-es-su-significado/
20
•
Hashem, A., Tabassum, B., & Abd_Allah, E. F. (2019). Bacillus subtilis: A plantgrowth promoting rhizobacterium that also impacts biotic stress. ˜ Al-œ Mi’galaẗ Alsa’udiyaẗ Lī-ulum Al-ḥayaẗ, 26(6), 1291-1297.
https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2019.05.004
•
Lagler, J. C. (2017, 31 julio). BIOINSUMOS: DISTINTAS PERCEPCIONES
HACIENDO FOCO EN LA FERTILIZACION BIOLÓGICA. Lagler | Agronomía &
Ambiente.
http://agronomiayambiente.agro.uba.ar/index.php/AyA/article/view/65/64
•
Levine, N. D. (1975). Buchanan, R. E. & Gibbons, N. E., eds. 1974. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed. Williams & Wilkins Co., Baltimore,
Md. 21202. xxvi + 1246 pp. $45.00. ˜ The œ Journal Of Protozoology/˜ The
œ Journal Of Protozoology, 22(1), 7. https://doi.org/10.1111/j.15507408.1975.tb00935.x
•
Kovács, Á. T. (2019). Bacillus subtilis. Tendencias en microbiología, 27(8), 724–
725. https://doi.org/10.1016/j.tim.2019.03.008
•
Mbarki, S., Cerdà, A., Zivcak, M., Brestic, M., Rabhi, M., Mezni, M., Jedidi, N.,
Abdelly, C., & Pascual, J. A. (2018). Alfalfa crops amended with MSW compost
can compensate the effect of salty water irrigation depending on the soil texture.
Process Safety And Environmental Protection/Transactions Of The Institution Of
Chemical Engineers. Part B, Process Safety And Environmental
Protection/Chemical Engineering Research And Design/Chemical Engineering
Research & Design, 115, 8-16. https://doi.org/10.1016/j.psep.2017.09.001
21
•
Phillips, I. (1976). Medical microbiology. Volume two: the practice of medical
microbiology: Edited by R. CRUICKSHANK, J. P. DUGUID, B. P. MARMION
AND R. H. A. SWAIN. 12th ed., 1975. Edinburgh, London and New York:
Churchill Livingstone. Pp x and 587. Hard cover, 11; soft cover, 7{middle dot}50.
Journal Of Medical Microbiology/Journal Of Medical Microbiology, 9(3), 366-367.
https://doi.org/10.1099/00222615-9-3-366a
•
Wang, D., Khurshid, M., Sun, Z. M., Tang, Y. X., Zhou, M. L., & Wu, Y. M.
(2016). Genetic Engineering of Alfalfa (Medicago sativa L.). Protein & Peptide
Letters/Protein And Peptide Letters, 23(5), 495-502.
https://doi.org/10.2174/0929866523666160314152618
•
Wang, Y., Zhang, P., Li, L., Li, D., Liang, Z., Cao, Y., Hu, T., & Yang, P. (2022).
Proteomic Analysis of Alfalfa (Medicago sativa L.) Roots in Response to
Rhizobium Nodulation and Salt Stress. Genes, 13(11), 2004.
https://doi.org/10.3390/genes13112004
