CUADERNO DE PRACTICAS INMUNOLOGIA CLINICA

LIBRO DE PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA
MOLECULAR III E INMUNOLOGÍA
INDICE
Práctica 1: CITOMETRÍA DE FLUJO. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES LEUCOCITARIAS
Práctica 2: CITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO: TIPAJE HLA DE CLASE I
SEROLÓGICO.
Práctica 3: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA. DETERMINACIÓN DE LOS
ANTICUERPOS CONTRA EL TOXOIDE TETÁNICO MEDIANTE
INMUNOENSAYO (ELISA)
Práctica 4: DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR INMUNOFLUORESCENCIA
2
Inmunología
Práctica 1
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 1
CITOMETRÍA DE FLUJO
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
APLICADOS A LA IDENTIFICACIÓN DE
SUBPOBLACIONES LEUCOCITARIAS
3
Inmunología
Práctica 1
OBJETIVOS GENERALES DE LA PRÁCTICA:
•
Los alumnos aprenderán el fundamento del citómetro de flujo y sus aplicaciones más
importantes.
•
Conocerán la información que nos da el citómetro sobre las distintas poblaciones celulares,
fundamentalmente aplicado a poblaciones sanguíneas.
•
Aprenderán como se pueden identificar distintas moléculas en la superficie de una célula; y
como de esta forma se pueden diferenciar células que bajo microscopia rutinaria es muy difícil
o imposible.
•
Aprenderán una de las utilidades más importantes de los anticuerpos monoclonales, y como
con ellos se pueden identificar esas moléculas de la superficie de la célula.
•
Reforzaran el conocimiento de los marcadores más importantes de utilidad clínica y usados en
la caracterización de las distintas subpoblaciones linfocitarias
•
Asimilarán la diferencia entre inmunofluorescencia directa e indirecta.
•
Comprenderán, con ejemplos, su aplicación al estudio de inmunodeficiencias (ej. SIDA) y al
estudio de las leucemias.
4
Inmunología
Práctica 1
La Citometría de flujo consiste en el análisis rápido de células en suspensión dentro de un sistema
de flujo laminar, sobre el que incide un haz de luz que proporciona información acerca de sus
características físico-químicas.
En 1969 se aplicó el láser como fuente luminosa y quedaron establecidas las bases de la
citometría de flujo moderna.
1. ELEMENTOS DE UN CITÓMETRO:
Un citómetro de flujo se compone de tres sistemas instrumentales:
• Sistema de inyección o fluidos
• Sistema óptico
• Sistema informático
1.1. Sistema de inyección y manejo de la muestra:
Consiste en un mecanismo hidráulico presurizado compuesto por jeringas o bombas peristálticas
de inyección, conductos y electroválvulas. Este sistema tiene como misión recoger la muestra y, a
través de una corriente de solución salina (fluido envolvente), conducirla hasta el canal de flujo,
comúnmente formado por un elemento de cuarzo en su centro.
De este modo, al quedar sometida la muestra de células en suspensión a una presión envolvente
por el tampón salino, se genera su flujo hacia el canal capilar de contaje en forma de elementos
alineados sobre los que incidirá la luz del sistema óptico.
La inyección se realiza habitualmente por un sistema volumétrico compuesto de bomba y/o
jeringa, capaz de inyectar un volumen exacto de la suspensión celular. Además, el sistema consta de
un contador volumétrico para el recuento de las unidades celulares que fluyen por el capilar.
1.2. Sistema óptico:
Según el carácter del haz luminoso, los primeros sistemas de citometría empleaban lámparas de
mercurio y redes de difracción. Estos sistemas actualmente no se utilizan y han sido sustituidos por los
sistemas multiparamétricos o de luz láser debido principalmente a sus propiedades de intensidad,
estabilidad y monocromaticidad. Existen diferentes tipos de láser:

Láseres en estado gaseoso. El utilizado con más frecuencia es el de ion argón, que emite a una
longitud de onda (λ) de 488 nm correspondiente con la zona azul del espectro visible. También
se usan con frecuencia el de ion kriptón para excitación violeta y UV (λ= 407nm, 350nm) y el
de helio-neón (HeNe) para excitación en el rojo lejano (λ= 633 nm). El principal inconveniente
de estos sistemas es que son muy voluminosos, requieren de refrigeración y del agotamiento
del gas empleado, que requiere su recarga periódica.

Láseres en estado sólido, o láseres de diodo (DPSS). El medio activo es un material cristalino
dopado con elementos denominados “tierras raras” en la tabla periódica. Entre los más
comunes están el de nitruro de galio (GaN), el granate de aluminio-itrio dopado con neodimio
(Nd:YAG), el ortovanadato de itrio dopado con neodimio (Nd:YVO), o los de rubí o zafiro. Se
5
Inmunología
Práctica 1
consigue emisiones de luz discretas típicamente a λ= 405 nm, 488 nm y 642 nm. Presentan más
ventajas que los anteriores ya que son mucho más pequeños, tienen menores requisitos de
potencia y no requieren de un calentamiento previo al análisis.
Otros elementos de importancia dentro del sistema óptico son las lentes colectoras, los filtros
ópticos, los espejos dicroicos y los detectores o fotomultiplicadores (fig. 1).
Figura 1: Representación esquemática de un citómetro de flujo.
1.3. Unidad informática
En general consta de:

Diversos amplificadores de señal.Un transformador analógico-digital, que convierte los pulsos
electrónicos que llegan a los fotomultiplicadores en información digital.

Un ordenador de gran capacidad que almacena y analiza los datos, proporcionando estudios
estadísticos y representación gráfica de los mismos
A
B
Figura 2. Ejemplos de citómetros de flujo. A. Sistema convencional con sistema óptico láser en estado gaseoso.
B. Sistema compacto con láseres en estado sólido.
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Inmunología
Práctica 1
2. FUNCIONAMIENTO DE UN CITÓMETRO
Tras la introducción del tubo de ensayo con la muestra problema a analizar, ésta es succionada
por la jeringa conectada a una bomba hidráulica y es conducida mediante canalizaciones hasta la
cámara de contaje, donde es envuelta por un fluido salino que rodea a las células alineándolas en su
centro. De esta forma se consigue que las células pasen alineadas de una en una. A continuación, el
haz de luz del láser atraviesa este flujo de células en lo que se denomina enfoque hidrodinámico.
La interacción del láser con las células es recogida por los detectores correspondientes y
convertida a pulsos electrónicos, que son transformados en números por el ADC (convertidor
analógico-digital). Esos datos son interpretados y almacenados por el sistema informático. Por lo tanto,
el archivo de almacenamiento de datos incluye una descripción de la muestra adquirida, además de la
información sobre el citómetro en el que se recogieron los datos, el conjunto de éstos y los resultados.
Una vez que un archivo de datos se ha guardado, la información recogida de las células se puede
mostrar en formatos diferentes.
En ausencia de fluorocromos unidos a las células, la incidencia del láser sobre éstas
proporciona 2 tipos de señales ópticas en función del ángulo de recolección de la luz dispersada por
parte de 2 fotodetectores diferentes (figura 3). Los ángulos de medida utilizados son:
•
Forward scatter (FSC): Configuración frontal, entre 1°-20°. Nos da información del tamaño
de la célula.
•
Side scatter (SSC): Configuración lateral a 90°. Nos da información de la granularidad o
complejidad intracelular.
Figura 3. Se representa la dispersión de luz frontal (FSC, tamaño) y lateral (SSC, complejidad)
Mediante el análisis de la información proporcionada por la configuración frontal y lateral de los
elementos que fluyen por el citómetro, es posible agruparlos en distintas clases por tamaño y
granularidad, de forma que el instrumento discrimina entre ellas y es capaz de mostrarlas en diferentes
zonas. A mayor valor de FSC mayor tamaño, mientras que a mayor valor SSC, mayor complejidad.
Esta información respecto a la morfología celular se representa en forma de ventanas, que serán
diferentes según la información que le pidamos al citómetro.
7
Inmunología
Práctica 1
Información proporcionada por la configuración frontal y lateral de los elementos
A
B
)r
e
tt
a
c
s
e
d
i
S
(
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
(Forward scatter)
)r
e
tt
a
c
s
e
d
i
S
(
Granulocitos
R1
Monocitos
Linfocitos
(Forward scatter)
Figura 4. Esta ventana es con la que trabajamos de base para ver si la distribución celular es la
correcta y analizar posteriormente toda la muestra (A) o bien seleccionar una población determinada
(B) atendiendo a los parámetros FSC y SSC.
En paralelo, si las células van marcadas con un fluorocromo, la señal producida como
consecuencia de la excitación de éste por el láser, nos permitirá por ejemplo conocer el porcentaje de
esas células marcadas respecto al total. Generalmente, el fluorocromo está incorporado a un anticuerpo
que reconoce específicamente un antígeno de la superficie celular.
El análisis estadístico de las poblaciones celulares (la total por un lado y la seleccionada en
regiones por otro) proporciona el canal medio de fluorescencia (Mode Channel) en el que se
distribuyen FSC y SSC, su desviación típica y el coeficiente de variación.
Actualmente, cuando realizamos estudios con poblaciones leucocitarias, dado la pequeña
proporción de muchas de ellas y el tamaño, a veces coincidente con el que se establece en la ventana
FSC/SSC, se recurre a hacer la combinación SSC/CD45 (Figura 5).
Figura 5. La representación SSC/CD45 es una estrategia que nos permite trabajar solo con células
CD45+ (antígeno panleucocitario), por lo que los detritus, agregados plaquetarios y los posibles
eritrocitos presentes en la muestra quedan a la izquierda en la ventana.
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Inmunología
Práctica 1
3. REPRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN
Las poblaciones de células según su morfología o bien si están marcadas con algún fluorocromo,
se pueden mostrar en varios formatos diferentes. Entre ellos los más usados son los 2 siguientes:
3.1. Histograma:
Se emplea para representar en el eje horizontal (abscisas) las variaciones de un parámetro como
la morfología celular o la intensidad de fluorescencia de un determinado marcaje en función del
número de eventos (células) que el citómetro analiza. Dentro del histograma podemos definir una o
varias regiones acotadas en un intervalo que nosotros definamos. Veamos el ejemplo de la figura 6.
Figura 6. Histogramas que representan la intensidad de fluorescencia emitida por el fluorocromo FITC
(isotiocianato de fluoresceína) acoplado a un anticuerpo concreto.
Partimos de la ventana previa FSC/SCC en la que hemos definido la región R1 correspondiente
a los linfocitos, por lo que los histogramas representados en la figura 6 corresponden exclusivamente
a la señal que proviene de dicha región y no del total de la población.
•
En el primer histograma, el anticuerpo marcado con FITC ha sido anti-CD3, por lo que la
fluorescencia detectada por el citómetro solo vendrá de los linfocitos que expresen CD3 en su
superficie y se corresponde con el pico mayoritario de la derecha (linfocitos T, CD3+). Las
células que no lo expresen quedarán a la izquierda y representan la población minoritaria,
correspondiente al resto de linfocitos (CD3-).
•
En el histograma central aparecen 2 poblaciones más o menos similares en número pero con
distinta intensidad de fluorescencia que proviene del marcaje con un anti-CD4. Este histograma
nos indica que una de ellas no expresa CD4 (izquierda) y la otra sí (derecha)
•
En el último histograma, el anticuerpo empleado en el marcaje ha sido un anti-CD8. Como
resultado también obtenemos una población CD8- (izquierda) y otra CD8+ (derecha) que
corresponderá en este caso con la subpoblación de linfocitos T citotóxicos.
En comparación podemos concluir que la expresión de CD8 es mayor que la de CD4, debido a
que detectamos una mayor intensidad de fluorescencia (escala del eje X).
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Inmunología
Práctica 1
3.2. Dlot plot
Son los más utilizados en citometría, ya que al representar 2 parámetros simultáneamente
muestran más información (análisis multiparamétrico). Este tipo de representación es la que hemos
visto anteriormente de tamaño y complejidad (FSC/SSC) o bien complejidad y expresión de CD45
(SSC/CD45). Sin embargo, normalmente este tipo de representaciones se emplea para mostrar 2
señales de fluorescencia distintas, correspondientes cada una de ellas a un anticuerpo marcado con un
fluorocromo distinto (figura 7).
DOT PLOT
103
104
100
101
102
CD3 PE
103
104
102
100
102
Fluorocromo 1
100
101
CD3-/CD830%
CD3+/CD850%
101
CD3+/CD420%
CD8 FITC
102
CD3-/CD430%
101
CD4 FITC
103
102
100
104
(+,-)
CD3+/CD8+
20%
103
(-,-)
CD3+/CD4+
50%
103
(+,+)
101
100
Fluorocromo 2
(-,+)
C
104
B
104
A
100
101
102
CD3 PE
103
104
Figura 7. Dot-plots que representan la intensidad de fluorescencia de 2 fluorocromos distintos (FITC,
isotiocianato de fluoresceína; PE, Ficoeritrina) acoplados cada uno a un anticuerpo específico.
Al representar 2 señales de fluorescencia distintas, las células se pueden catalogar según se
distribuyan en cada uno de los 4 cuadrantes:
•
En el dot-plot izquierdo se reflejan los cuatro cuadrantes, y las células se ordenarán según se
cumpla una condición u otra. Es decir, en el cuadrante (-/-) se localizarán aquellas células que
no sean reconocidas con ninguno de los anticuerpos marcados con fluorescencia. En el
cuadrante (+/-) se encontrarán aquellas células que solo hayan sido reconocidas por el
anticuerpo marcado con el fluorocromo 1. Del mismo modo, en el cuadrante (-/+) estarán las
que solo expresen el antígeno reconocido por el anticuerpo marcado con el fluorocromo 2. Por
último, en el cuadrante (+/+) se recogerán solo las células que sean reconocidas por ambos
anticuerpos simultáneamente.
•
El dot-plot central esquematiza el marcaje simultáneo de leucocitos con un anticuerpo antiCD4 marcado con FITC y un anticuerpo anti-CD3 marcado con PE. Se ha restringido el análisis
a la región de los linfocitos (R1). Observamos que existe una población que no emite señal
para ninguno de los marcajes y que se corresponde con el 30% del total de linfocitos en R1.
Vemos otra población que solo ha sido reconocida por el anticuerpo anti-CD3PE y que
corresponde al 20% de R1. Finalmente, existe otra población en la que las células que la
integran expresan ambos antígenos simultáneamente, por lo que son reconocidas por ambos
anticuerpos y emiten ambas fluorescencias. Es la población doble positiva CD3/CD4 y
representan el 50% de R1, que se correspondería con linfocitos T colaboradores.
•
Del mismo modo, el dot-plot de la derecha muestra un doble marcaje con anticuerpos antiCD3PE y anti-CD8FITC. Encontramos 3 poblaciones distintas dentro de la región R1
(linfocitos) según hayan sido marcados. Así, observamos una población que solo expresa CD3
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Inmunología
Práctica 1
(50%), otra que no expresa ninguno de estos 2 marcadores (doble negativa CD3/CD8, 30%) y
otra de células que expresan ambos marcadores simultáneamente (doble positiva CD3/CD8,
20%), que representarían los linfocitos T citotóxicos.
En la siguiente figura 8 se muestran ejemplos reales del citómetro. Normalmente, la ordenación
en cuadrantes no es tan evidente, puesto que muchas moléculas de la superficie celular tienen un nivel
de expresión gradual. Además, en los citómetros modernos se suelen representar las distintas
poblaciones no tanto por cuadrantes sino por colores.
En este estudio, las células sanguíneas se han incubado con 5 anticuerpos distintos, cada uno
acoplado a un fluorocromo diferente. Estos han sido: anti-CD3APC, anti-CD4V450, anti-CD8FITC,
anti-CD19PE-Cy7, y anti-CD56PE. Una vez seleccionada la población que por tamaño y complejidad
(FSC/SSC) corresponde con los linfocitos (región R1), analizamos la señal de fluorescencia que
proviene de cada marcaje exclusivamente en dicha región R1.
Figura 8. Se muestra un análisis de las distintas poblaciones linfocitarias. A. Población azul, cuadrante
inferior izquierda, corresponde con linfocitos que no expresan ni CD3 ni CD19. La población
mayoritaria verde expresa solamente CD3. No hay células que expresen CD3 y CD19
simultáneamente. B. Se observan las poblaciones que expresan las moléculas CD3 y/o CD56,
caracterizando las poblaciones linfocitarias T (verde) y NK (púrpura). C. Se distinguen los linfocitos
que expresan CD4 (azul oscuro) y CD8 (rojo). Existe una tercera población doble negativa para ambos
marcadores (azul claro). D. En la tabla se recogen los marcadores que se emplean para identificar una
población de linfocitos determinada.
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Inmunología
Práctica 1
4. TÉCNICAS DE MARCAJE CON FLUORESCENCIA
La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas, denominadas fluorocromos o
fluoróforos, que al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada emiten
radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación. Así, las moléculas de un
fluorocromo absorben luz de una determinada longitud de onda λ1 y energía E1 y emiten luz de una
mayor longitud de onda λ2 pero de menor energía E2 (figura 9).
Figura 9. Espectros de excitación y emisión de FITC. Se muestra la longitud de onda a la que emite el láser
azul (488 nm) y el ancho de banda del canal de detección (fotomultiplicador, canal verde, 530/30 nm).
Cada fluorocromo tiene un espectro de excitación y emisión característico, de modo que si
utilizamos 2 de forma simultánea con un espectro de excitación similar pero distinto espectro de
emisión se pueden medir 2 características distintas al mismo tiempo (fluorescencia de 2 colores o a
veces de 3 o más) (figura 10).
Figura 10. Los fluorocromos FITC y PE suelen utilizarse simultáneamente debido a que se excitan a la misma
longitud de onda (láser azul) pero sus espectros de emisión son lo suficientemente diferentes como para poder
detectarlos cada uno en un canal distinto (fotodetector) del citómetro de flujo.
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Inmunología
Práctica 1
El fluorocromo más frecuentemente utilizado en citometría de flujo es el isotiocianato de
fluoresceína (FITC), con una absorción máxima a 495 nm y emisión a 520 nm (emite luz color verde).
El segundo más utilizado es la ficoeritrina (PE, phycoerythrin), con una excitación máxima a los 495
nm y emisión a 576 nm (emite luz color amarillo-naranja). Ambos fluorocromos son especialmente
útiles en estudios de doble fluorescencia (figura 10). Por último, destacaremos los conjugados
covalentes de ficoeritrina y cianinas, entre ellos la cianoficoeritrina (tabla 1).
FLUOROCROMO
LÁSER
UV
Alexa Fluor 405
DAPI
Pacific Blue
Alexa Fluor 488
FITC
Ioduro de
propidio
PerCP
PerCP-Cy5.5
PE
PE-Cy5
PE-Cy7
TRITC
APC
APC-Cy5.5
APC-Cy7
Alexa Fluor 647
O
O
VIOLETA
405 nm
EMISIÓN (nm)
AZUL
488 nm
ROJO
633/635
O
O
442
470
421
519
520
O
617
O
O
O
O
O
O
678
695
575
694
767
576
660
694
767
668
O
O
O
O
O
O
Tabla 1. Fluorocromos más frecuentes empleados en citometría de flujo. Se indica el láser con
el que se excitan y la longitud de onda a la que emiten.
Los fluorocromos pueden ligarse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la capacidad
de éstos para unirse a sus correspondientes antígenos. Por ello, los fluorocromos vinculados a
anticuerpos específicos constituyen un medio útil de visualizar los lugares donde ocurre la reacción
antígeno-anticuerpo.
El modo de unión a los anticuerpos depende del tipo de fluorocromo. Así por ejemplo, el FITC
se liga mediante enlace covalente con los grupos amino libres de las proteínas a pH alcalino.
La técnica que emplea anticuerpos acoplados a fluorocromos se denomina inmunofluorescencia,
y se emplea para la detección de antígenos celulares. Por lo tanto, la base molecular de esta técnica es
la reacción antígeno-anticuerpo, y cuando mayor sea la especificidad de un anticuerpo por su antígeno
mejor será la detección y el análisis (figura 11).
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Inmunología
Práctica 1
Existen 2 procedimientos:
•
Inmunofluorescencia directa. Cuando los anticuerpos necesarios para detectar los
antígenos objeto de estudio se marcan directamente con el fluorocromo. Tiene el
inconveniente de que hay que marcar con fluorocromos cada uno de los anticuerpos
necesarios. Se utiliza fundamentalmente en clínica, donde normalmente se manejan
siempre los mismos anticuerpos, ya que hay establecida una rutina y las casas
comerciales los venden ya preparados.
•
Inmunofluorescencia indirecta. No se marca directamente el anticuerpo específico de la
molécula a estudiar, sino que se utiliza secundariamente una anti-inmunoglobulina
marcada con fluorocromo que reconocerá el anticuerpo específico.
La inmunofluorescencia directa se utiliza fundamentalmente en clínica, donde normalmente se
manejan siempre los mismos anticuerpos, ya que hay establecida una rutina y las casas comerciales
los venden ya preparados. Por su parte, la indirecta es normalmente el procedimiento a utilizar en
investigación, donde se utilizan muchos y diferentes anticuerpos cada vez (anticuerpos primarios) y
no interesa marcar cada uno.
Figura 11. Técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta. Tanto en la técnica directa como el
anticuerpo primario de la indirecta deben ser anticuerpos monoclonales para asegurarnos la
especificidad del marcaje. En la indirecta, además, se debe analizar en paralelo siempre un control de
isotipo del anticuerpo primario utilizado para determinar posibles interacciones inespecíficas del
anticuerpo secundario.
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Inmunología
Práctica 1
5. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
La posibilidad de estudiar células de forma individualizada y multiparamétrica hace de la
citometría de flujo una herramienta de gran utilidad en citología, inmunología, hematología y anatomía
patológica, tanto a nivel clínico como en investigación.
El desarrollo progresivo de las técnicas y su simplificación ha traído como consecuencia un auge
de la citometría en los últimos años y su incorporación al laboratorio de forma rutinaria.
Las aplicaciones más frecuentes son:

Análisis fenotípico de células sanguíneas, mediante la detección de marcadores de la superficie
celular. Ejemplos, CD3, CD19, CD4, etc.

Identificación de antígenos intracelulares. requiere la previa permeabilización de la membrana
plasmática y fijación de las estructuras celulares. Ejemplos, α-actina de músculo liso (αSMA),
factores de transcripción como FoxP3, ki-67, HIF, etc.

Cuantificación de DNA y ciclo celular, mediante el uso de compuestos que aumentan su
emisión de fluorescencia al intercalarse generalmente en el surco menor de las moléculas de
DNA del núcleo celular. Ejemplos, ioduro de propidio, DAPI, Hoescht, etc.

Determinación de la viabilidad celular, para discriminar células vivas de células muertas en
ensayos de toxicidad. Ejemplo, similar al anterior ya que sólo las células muertas captarán estos
compuestos al tener sus membranas celulares dañadas.

Evaluación de la activación y proliferación celular, determinando metabolitos fluorescentes de
ciertos compuestos que se añaden o bien la incorporación directa o previa acción de esterasas
de colorantes fluorescentes en los componentes celulares. Ejemplo, vibrant DiO, bromodesoxiuridina (BrdU), carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE), etc.

Análisis de reticulocitos, mediante la detección del RNA residual ya que son formas inmaduras.
Ejemplo, ReticONE, cianina CD4K530, etc.

Apoptosis, detectándose la fosfatidilserina que desde la cara interna de la membrana plasmática
se relocaliza en la cara externa. Ejemplos, anexina V acoplada a un fluorocromo, técnica
TUNEL, etc.

Detección de autoanticuerpos y citoquinas en suero, mediante el uso de microesferas donde
estas moléculas son captadas y posteriormente detectadas por los correspondientes anticuerpos
marcados.

Cuantificación del potencial de membrana, gracias al uso de compuestos permeables a los que
las alteraciones en el potencial de membrana cambian su estructura electrónica y pueden emitir
fluorescencia. Ejemplos, ANEP, sondas RH, carbocianinas, MitoProbe JC-1, etc.

Medida del calcio intracelular, se emplean compuestos que al captar el calcio que se libera en
un momento dado emiten fluorescencia. Ejemplos, Fluo-3, Fura red, etc.

Determinación del pH intracelular, de modo similar al anterior, cambios en el pH afectan a la
estructura de ciertos compuestos y los hacen fluorescentes. Ejemplos, pHrodo, BCECF, etc.

Determinación del estrés oxidativo, gracias a sondas que reaccionan con radicales libres del
oxígeno (ROS, reactive oxygen species) y emiten fluorescencia. Ejemplos, CellROX, Diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), etc.
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Inmunología
Práctica 1
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: APLICACIÓN DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO AL
ESTUDIO CUANTITATIVO DE SUBPOBLACIONES LEUCOCITARIAS
1. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Identificar y cuantificar las principales poblaciones leucocitarias en porcentaje usando la
aplicación informática del citómetro.

Definir y trabajar con regiones (gates).

Cálculo del porcentaje y número absoluto de las principales poblaciones linfocitarias mediante
análisis multiparamétrico.

Interpretación del recuento de la población linfocitaria (linfocitosis, linfopenia, infecciones
virales, leucemias y síndromes linfoproliferativos crónicos.
Marcador
Ac. (isotipo)
Origen
Reconoce
Población
Significado
CD45
mAb (IgG1)
Ratón
Humano
Leucocitos
Panleucocitario
CD3
mAb (IgG1)
Ratón
Humano
CD4
mAb (IgG1)
Ratón
Humano
CD8
mAb (IgG1)
Ratón
Humano
CD19
mAb (IgG1)
Ratón
Humano
CD14
mAb (IgG1)
Ratón
CD56
mAb (IgG1)
Ratón
Rango (%)
Totales
61-84
T helper
32-60
T citotóxicos
13-40
Linfocitos B
Totales
10-31
Humano
Monocitos
Monocitos
2-10
Humano
Linfocitos NK
Linfocitos NK
5-27
Linfocitos T
Tabla 2. Se recogen los anticuerpos monoclonales que se emplearán en la práctica.
El anticuerpo anti-CD3 reconoce una molécula de la superficie celular que forma parte del
complejo del receptor de células T (TCR). Los anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 reconocen moléculas
de superficie de una subpoblación de células T-CD3+ que modulan la respuesta inmunológica:
linfocitos T helper (colaboradores) y citotóxicos, respectivamente. El anticuerpo anti-CD19 reconoce
una molécula de la superficie de las células B. El anticuerpo CD56 se utiliza para la caracterización de
células NK.
16
Inmunología
Práctica 1
2. PROTOCOLO
Reactivos necesarios:

Lanceta, alcohol y gasa (para la obtención de la muestra de sangre).

Tubos eppendorf vacíos y tubos con EDTA como anticuagulante.

Tampón de lisis de eritrocitos (BD FACSTM Lysing Solution).
Procedimiento:
1.
Lavamos las manos.
2.
Masajeamos la zona de punción para producir vasodilatación, esterilizamos y punzamos
con la lanceta estéril: Seleccionamos la posición más larga de la lanceta, quitamos el
protector, posicionamos sobre la yema del dedo y presionamos el botón.
3.
Mientras que el donante presiona la zona, el otro miembro de la pareja recoge la sangre con una
pipeta con punta amarilla. Para que haya un número adecuado de células se debe recoger unos 50100 μl de sangre (unas 5 gotas), que pondremos en un tubo eppendorf de 1,5 ml junto con 1 μl de
EDTA-2K 500 mM.
4.
Mientras que el donante tapona el pinchazo, el compañero mezcla bien la muestra con la pipeta
para que no coagule.
5.
Ponemos 1,5 μl del anticuerpo con el que vamos a marcar la muestra en el fondo de cada tubo
eppendorf de 1,5 ml.
Importante: rotular el tubo con el marcador en el lateral del tubo, no en la tapa.
6.
Repartimos la muestra de sangre en alícuotas de 15 μl sobre el anticuerpo correspondiente y
resuspendemos bien asegurándonos que no queda sangre por la pared del tubo.
7.
Incubamos 30 minutos a 4°C en oscuridad
8.
Añadimos 500 μl de solución de lisis y agitamos bien golpeando el tubo con los dedos.
9.
Dejamos actuar 10 minutos a temperatura ambiente.
10. Analizamos en el citómetro de flujo.
Como alternativa, y según la disponibilidad, la práctica se podrá realizar con una muestra de
sangre anónima, por lo que el protocolo comenzaría en el punto 5.
3. CÁLCULO CUANTITATIVO DE LAS POBLACIONES LEUCOCITARIAS
El método que hemos descrito anteriormente parte del conocimiento previo de la fórmula
sanguínea y de los leucocitos del donante en sangre periférica. El citómetro de flujo que se empleará
es un Guava EasyCyte 8. Su particular sistema de inyección de fluidos nos permite establecer un
número fijo de células a analizar, calcular el volumen exacto de muestra analizada y por lo tanto
determinar la concentración de células. Respecto a la parte óptica, en este citómetro la integran 3
láseres en estado sólido que emiten luz a 405 nm (láser violeta), 488 (láser azul) y 640 (láser rojo);
además de 8 detectores de recogida de señal: FSC, SCC y 6 canales de fluorescencia.
17
Inmunología
Práctica 1
Control negativo (sin marcaje fluorescente).
A
B
Plot P01, ungated
Plot P02, ungated
Monocytes
0
Gr.57.28%
Gr.65.28%
Mo.8.34%
Mo.8.34%
LymphocytesLf.25.30%
Lf.25.30%
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
Granulocytes
R4
0
0
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
0.30%
100
101
102 103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
20000
50000
80000
Forward Scatter (FSC-HLin)
Figura 12. A. Se identifican las 3 poblaciones mayoritarias. B. Las 3 poblaciones, granulocitos
(amarillo), monocitos (verde), linfocitos (azul), se alinean en la zona del dot-plot que definimos como
negativa al no estar marcadas con ningún anticuerpo acoplado a fluorocromo.
Marcaje CD45-FITC/CD14-PE
A
B
Plot P02, ungated
Plot P06, ungated
8.40%
0
100
101
102
103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
CD45-FITC
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
R4
R5
0
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
95.72%
100
101
102
103
104
105
Yellow-B Fluor…e (YEL-B-HLog)
CD14-PE
Figura 13. A. Todas las células CD45+ (leucocitos, 95.72%) se sitúan en la zona positiva del dot-plot.
Por lo tanto, las células que quedan a la izquierda son CD45-, que por su baja complejidad
corresponderían con eritrocitos no lisados. B. El marcaje con CD14 identifica a los monocitos, que son
aquellas células de la zona positiva. Nótese que el porcentaje de células CD14+ corresponde con el de
monocitos de la figura 12.A.
18
Inmunología
Práctica 1
Marcaje CD3- FITC/CD19-PE
A
B
Plot P02, ungated
Plot P03, gated on P01.Lymphocy
58.37%
65.37%
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
14.10%
R4
0
0
R4
100
101
102
103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
100
101
102
103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
CD3-FITC
CD3-FITC
Figura 14. A. Células CD3+, linfocitos T totales, son el 14.10% de los leucocitos. B. Al analizar
exclusivamente la población de linfocitos (gate) obtenemos que los linfocitos T totales son el 65.37%.
C. Células CD19+, linfocitos B, son el 3.42% de los leucocitos. D. Al hacer un gate de linfocitos
obtenemos que los linfocitos B son el 15.84%.
Marcaje CD4-FITC/CD8-PE
B
C
0
100
101
102
103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
CD4-FITC
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
R4
Plot P07, gated on P01.Lymphocy
22.94%
R5
Plot P10, gated on P01.Lymphocy
21.50%
0.96%
R6
E
P
8
D
C
0
Side Scatter (SSC-HLin)
20000 40000 60000 80000
Plot P03, gated on P01.Lymphocy
37.89%
Yellow-B Fluorescence (YEL-B-HLog)
100
101
102
103
104
105
A
100
101
102
103
104
105
Yellow-B Fluor…e (YEL-B-HLog)
CD8-PE
40.61%
%36.93
100
101
102
103
104
105
Green-B Fluor… (GRN-B-HLog)
CD4-FITC
Figura 15. A. Se analiza la subpoblación de células CD4+ (T helper) sobre el gate de linfocitos totales.
B. Sobre el gate de linfocitos se detectan los CD8+ (citotóxicos). C. Las 2 subpoblaciones anteriores
se muestran simultáneamente representando en el dot-plot los 2 canales de fluorescencia
correspondientes a los marcajes CD4-FITC y CD8-PE. La población doble negativa (CD4-/CD8-)
correspondería con el resto de linfocitos, mientras que la doble positiva (CD4+/CD8+) apenas es
representativa en condiciones normales.
19
Inmunología
Práctica 1
Resultados y valores normales de referencia para adultos.
Resultados
Rango
Granulocitos
65.28%
60 - 70%
Monocitos
8.34%
5 - 10%
Linfocitos
25.30%
25 - 40%
Marcador
Resultados
Rango
Linf. T totales
CD3+
65.37%
61 - 84%
Linf. T helper
CD4+
37.89%
32 - 60%
Linf. T citotóxicos
CD8+
22.94%
13 - 40%
Linf. B
CD19+
15.84%
10 - 31%
Linf. NK
CD56+ (CD3-)
~18%
5 - 27%
Índice CD4/CD8
1.72
1 – 2.5
20
Inmunología
Práctica 2
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 2
CITOTOXICIDAD MEDIADA POR
COMPLEMENTO: TIPAJE HLA DE CLASE I
SEROLÓGICO
21
Inmunología
Práctica 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS DE LA PRÁCTICA:
1. Observarán otra forma de visualizar la reacción antígeno-anticuerpo.
2. Experimentarán como el complemento produce la lisis celular tras su activación por la
unión antígeno-anticuerpo.
3. Los alumnos experimentarán como se realiza un tipaje HLA de clase I serológico.
4. Reforzarán el concepto de polimorfismo y especificidad (alelo).
5. Comprenderán mejor el concepto de determinante antigénico compartido: aprendiendo a
distinguir entre especificidades públicas y privadas.
6. Comprenderán que los anticuerpos policlonales (sueros) no son muy específicos.
7. Comprenderán las aplicaciones clínicas de un tipaje HLA
22
Inmunología
Práctica 2
CITOTOXICIDAD MEDIADA POR COMPLEMENTO: TIPAJE
HLA DE CLASE I SEROLÓGICO
COMPLEMENTO
El sistema del complemento está compuesto de un gran número de proteínas plasmáticas, que
se activa por una reacción en cascada, que puede ser activada por 3 vías: la clásica, la alternativa y
la de las lectinas. La unión antígeno-anticuerpo activa principalmente la vía clásica. Algunos
componentes del sistema del complemento tienen funciones como la opsonización, favoreciendo la
fagocitosis, y la quimiotaxis, pero el fin último de la activación del sistema del complemento es
producir la lisis de la célula o bacteria a la que está unido el anticuerpo, produciendo poros en la
membrana celular.
La unión antígeno-anticuerpo activa el complemento a través de la fracción Fc de la
inmunoglobulina, y este una vez activado produce la lisis de la célula a cuyo antígeno se había
unido el anticuerpo (citotoxicidad mediada por complemento).
En el laboratorio esta propiedad del complemento se utiliza principalmente para realizar el
tipaje HLA serológico.
MOLÉCULAS HLA
La mayoría de los linfocitos T reconocen, a través de su receptor específico (TCR), sólo los
péptidos antigénicos que le son presentados por unas moléculas presentes en la superficie de las
células presentadoras de antígeno. Estas moléculas van a formar parte de lo que llamamos Sistema
Principal de Histocompatibilidad (Mayor Histocompatibility Complex, MHC). El MHC se
descubrió por su intervención en el rechazo de los trasplantes. Los individuos que recibían
trasplantes de otros individuos con el mismo MHC no los rechazaban o lo hacían mucho más tarde,
mientras que si sus moléculas del MHC eran diferentes se producía el rechazo del órgano
trasplantado. Pero el rechazo de trasplantes no es un fenómeno biológico natural, y por tanto estas
moléculas debían tener otra función fisiológica. Hoy sabemos que esta función es presentar péptidos
antigénicos a los linfocitos T.
El Complejo Principal de Histocompatibilidad está formado por un conjunto de genes que se
encuentran en todos los mamíferos. Las moléculas codificadas por este conjunto de genes reciben
diferentes nombres según las especies animales, en humanos a estas moléculas se las denomina
HLA (Human Leucocyte Antigens). Este complejo genético contiene 2 grupos de genes altamente
polimórficos (variables), llamados genes HLA de clase I y genes HLA de clase II. Estos genes
codifican para 2 grupos de moléculas, HLA de clase I y HLA de clase II, que se expresan en la
superficie de la célula y le presentan péptidos antigénicos a los linfocitos T.
Los genes del MHC son codominantes, es decir tanto los alelos maternos y como los paternos
se expresan. En humanos hay 3 loci polimórficos de clase I denominados: HLA-A, HLA-B y HLAC, y cada persona hereda un grupo de genes paterno y otro materno, así cada célula puede expresar
6 moléculas HLA de clase I diferentes. También tenemos otros 3 grupos de genes de clase II,
denominados HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP, y también cada célula puede expresar 6 moléculas
diferentes (clase II es un poco más compleja).
23
Inmunología
Práctica 2
A su vez la mayoría de los genes del MHC son altamente polimórficos, es decir que existen
muchos alelos diferentes para cada gen, lo que hace que los individuos de una determinada especie
sean muy diferentes entre si (ver lista de especificidades HLA que se adjunta). Las moléculas HLA
de clase I se expresan en la mayoría de las células del organismo, mientras que las moléculas HLA
de clase II se expresan fundamentalmente en las células presentadoras de antígeno profesionales.
Como hemos comentado anteriormente estas moléculas, junto con las moléculas de los grupos
sanguíneos, son las responsables de los rechazos de los trasplantes, y dado el polimorfismo
(variabilidad) de estas moléculas la probabilidad de que 2 personas no emparentadas tengan las
mismas moléculas HLA es muy baja. Hoy sabemos que cuanto más parecidas son las moléculas
HLA de receptor y donante menos probabilidad de rechazo (siempre que los grupos sanguíneos
sean compatibles). Por tanto, es importante conocer las moléculas HLA de receptor y donante antes
de realizar el trasplante.
TIPAJE O TIPIFICACIÓN HLA
Por tipaje HLA, entendemos, la asignación de los alelos que un individuo porta, en cada uno
de los locus del "Sistema Principal de Histocompatibilidad (HLA)". Estos locus se agrupan según
su estructura y función biológica en locus de Clase I y Clase II que serán tipados separada e
independientemente.
Existen dos formas de determinar el tipaje HLA:
a. Tipaje Serológico
b. Tipaje Genómico
a. El tipaje serológico, es aquel que para la definición de las especificidades (formas alélicas
a nivel genético) HLA, presentes en un individuo, usa sueros (anticuerpos policlonales) o
anticuerpos monoclonales, de especificidad conocida. Es decir estudia las moléculas en la
superficie de la célula.
b. El tipaje genómico, es aquel que recurre, directamente al estudio del ADN, presente en
cada individuo, para la determinación de los distintos alelos para cada uno de los locus
del Sistema Principal de Histocompatibilidad.
TIPAJE HLA SEROLÓGICO DE CLASE I
La técnica que nosotros vamos a utilizar para este tipaje es la "Citotoxicidad mediada por
Complemento", realizada en microplacas Terasaki de sesenta pocillos.
Las placas Terasaki contienen los sueros (anticuerpos policlonales) o anticuerpos
monoclonales que definen las especificidades HLA, se garantiza que las placas contengan las
especificidades HLA-A, HLA-B y HLA-C más frecuentes en nuestra población. En cada pocillo de
la placa se pone 1µl de anticuerpo específico contra una especificidad HLA. Cada especificidad será
definida, si ello es posible, por al menos tres anticuerpos diferentes, introduciéndose en cada placa
24
Inmunología
Práctica 2
un control negativo y otro positivo. Estas placas se realizan en base a una plantilla (ver plantilla,
al final) que nos servirá de referencia para la posterior lectura. Se preparan con anterioridad a la
realización de la técnica, y se mantienen congeladas a -20º C, hasta su utilización.
Las dianas serán, células mononucleares, obtenidas por gradiente de Ficoll. Una vez obtenidas
las células, se ajustan a una concentración entre 2-3 x 106 cel/ml. Las placas de tipaje para Clase I,
se habrán sacado, desde el arcón congelador, diez minutos antes, dejándolas descongelarse y
atemperarse (el ensayo se realiza a Tª ambiente).
25
Inmunología
Práctica 2
PROCEDIMIENTO A SEGUIR:
1. Se siembra 1µl de la suspensión celular por cada pocillo de la placa Terasaki, previamente
descongelada y atemperada.
2. Dejamos incubar durante 30 minutos a Tª ambiente.
3. Añadiéndole, posteriormente, 6µl de complemento de conejo (suero de conejo), a la dilución
de trabajo (que se determinará con cada lote). Si ha existido unión Ag (célula) - Ac (suero),
se fijara el complemento que lisará la célula, sino la célula continuará viva.
4. Se deja incubar una hora con el complemento.
5. Para determinar la viabilidad celular se pueden usar distintos métodos: método de Bromuro
de Etidio-Naranja de Acridina, tinción azul Tripán y método de Eosina-Formol (cuando se
desee mantener durante un tiempo). En esta práctica utilizaremos la tinción de azul Tripán.
26
Inmunología
Práctica 2
Tinción con Azul Tripán
6.
Se incuba una hora con el complemento, añadiéndose posteriormente 6 µl de la solución de
azul Tripán.
7.
Dejamos incubar todo ello unos 10-15 minutos,
8.
El azul Tripán es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas para ensayos de
viabilidad que permiten diferenciar células vivas de células muertas. Las células vivas o
tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que no puede atravesar la
membrana celular. Por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas, se tiñe
especialmente el citoplasma de las células de un color oscuro.
9.
Al visualizar en el microscopio veremos las células vivas que emiten luz (amarilla), y las
células muertas azul oscuro.
10. Y leemos la viabilidad en un microscopio de contraste de fases invertido. La citotoxicidad
(azul oscuro), con cada uno de los sueros, se cuantifica del 1 al 8:
0- Cuando no se puede evaluar
1- Menos de un 20% de las células muertas (azul oscuro) la mayoría células
vivas (luz amarilla)
2- Del 20% al 40% de las células muertas
4- Del 40% al 60% de las células muertas
6- Del 60% al 80% de las células muertas
8- Más del 80% de las células muertas
El tipaje se deducirá, según el patrón de reactividad obtenido, en base a la plantilla de la placa.
27
Inmunología
Práctica 2
LISTA DE ESPECIFICIDADES HLA EN EL RECONOCIMIENTO SEROLOGICO Y
CELULAR
A
B
C
DR
DQ
DP
DPw1
DQ1
DR1
Cw1
B5
B50(21)
A1
DQ2
DPw2
Cw2
DR103
B51(5)
B7
A2
DPw3
DQ3
DR2
B5102
Cw3
B703
A203
DQ4
DPw4
Cw4
DR3
B5103
B8
A210
DQ5(1)
DPw5
Cw5
DR4
B52(5)
B12
A3
DQ6(1)
DPw6
Cw6
DR5
B53
B13
A9
DQ7(3)
Cw7
DR6
B14
B54(22)
A10
DQ8(3)
Cw8
DR7
B15
B55(22)
A11
DQ(3)
Cw9(w3) DR8
B16
B56(22)
A19
Cw10(w3) DR9
B17
B57(17)
A23(9)
DR10
B18
B58(17)
A24(9)
DR11(5)
B21
B59
A2403
DR12(5)
B22
B60(40)
A25(10)
DR13(6)
B27
B61(40)
A26(10)
DR14(6)
B2708
B62(15)
A28
DR1403
B35
B63(15)
A29(19)
DR1404
B37
B64(14)
A30(19)
DR15(2)
B38(16) B65(14)
A31(19)
DR16(2)
B39(16) B67
A32(19)
DR17(3)
B3901
B70
A33(19)
DR18(3)
B3902
B71(70)
A34(10)
B72(70)
A36
B40
B73
A43
B4005
DR51
B41
B75(15)
A66(10)
DR52
B42
B76(15)
A68(28)
DR53
B44(12) B77(15)
A69(28)
A74(19)
B45(12) B78
B81
A80
B46
B47
B48
B49(21) Bw4
Bw6
WHO Nomenclature Committe for factors of the HLA System. Updated 31st March 2001
ESPECIFICIDADES ASOCIADAS A Bw4 y Bw6
Bw4: B5, B5102, B5103, B13, B17, B27, B37, B38(16), B44(12), B47, B49(21), B51(5),
B52(5), B53, B57(17), B58(17), B59, B63(15), B77(15) y A9, A23(9), A24(9), A2403, A25(10),
A32(19)
Bw6: B7, B703, B8, B14, B18, B22, B2708, B35, B39(16), B3901, B3902, B40, B4005,
B41, B42, B45(12), B46, B48, B50(21), B54(22), B55(22), B56(22), B60(40), B61(40),
B62(15), B64(14), B65(14), B67, B70, B71(70), B72(70), B73, B75(15), B76(15), B78, B81.
WHO Nomenclature Committe for factors of the HLA System. Updated 31st March 2001
28
Inmunología
Práctica 2
FECHA:
Tª
CLAVE:
PACIENTE:
CAUSA DE TIPAJE:
LECTOR:
TIPAJE:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
AB
(-)
FGR 592
A2
X1MoAb
A3
FGR 948
A24
CLB 118
A26
MT 8125
A29
CLB 224
A31+(33)
PF1339B
A33
NS4366
B52+62
W6/32
(+)
FGR 272
A1
FGR 351
A2+28
Za 62
A23+24
C0 122
A25+26
NS 4830
A26+68
Graffity S.
A29
Belmonte
A32
Fe 89
A33+31+29
Tivol
B52
AB
(-)
FGR 113
A1
CLB168
A28
FGR 304
A23+24
De Genova
A25+26
Breaux
A11
PF 1548A
A30+(31)
Fe 77
A32+25+62
FGR 324
B51+52
FGR 653
B7
FGR 568
B8
FGR 500
A1
OF901299
A28
FGR 1429
A23
Farnworth
A25
NS 4828
A11
Ma 768
A30
CATA-1
A32+25
CLB 030
B51+52
CTM 11
B7
SEB782704
B8
FGR 692
A2
SP 1255
A3
CC551.2
A23
Pail
A25
Colombani
A11
NS 4251
A30+31
FGR 263
A33+26+31
FGR 608
B51
FGR 303
B7
FGR 678
B44 +(50)
CO156
A2+57+63
CLB 229
A3
1BA
A24
TS232
A26+66
OHA-104
A29
Albinet
A31
Beringuer
A33+26
Y276/69
B51
Y700/69
B8
FGR 681
B44+45
AB
(-)
FGR 268
B13
FGR 543
B62+63
CLB 276
B38+39
S 1394.2
B57+58
Simpkins
B49
Sevi 670
B55
FGR 1020
B27
FGR 671
B35+B51
W6/32
(+)
FGR 434
B44
Hatcher
B13
Rickart
B62
T 4011
B38+67
PF 1598
B18
Price
B49+52
Guimard
B55
FGR 451
B27+(47)
TS 174 II
B37
AB
(-)
Primoc123
B44
FGR 1013
B14
Matherne
B62
Ma 763
B38
CLB 292
B18
Scott
B50
9151
B55
CLB 310
B35
CLB 232
B37+44
Stroman
B40+41+48
Schu
B45
Hoffman
B14+(18)
Ma 1071
B63
Raff
B39
SEB900405
B18
Daubus
B50
Larock
B56
Za 103
B35
Pro
B37
Miller
B60+33+66
M. See.P
B45+(50)
RyC 37b
B14+(8)
CTM 30
B63+B57
Peters
B39
TS 190
B49+50
TS 214
B55+ 56
NS 2656
B27+47
FGR 432
B35+B51
FGR 654
B40+68
SEB921802
B60+48
FGR 657
B13
Nichols
B62+63
SEB950102
B38+39
S 583
B57+58
FGR 50
B49+B50
Dubo
B55+56
MET
B27
FGR 496
B35
VR 8612
B60+61
CLB 237
B41
AB
(-)
Neuville
B35+70+50..
Mahner
Cw2
Apple
Cw4
CLB 147
Cw7
FGR 408
Bw6
CLB 283
B41
Bark
Cw1
TS242
Cw3
Her
Cw5
CLB 308
Cw7
CC 40.2
Bw6
Thi
B60+61+41
CLB 164
Cw1
Philphot
Cw3
FGR 371
Cw5
FGR 530
Bw4
AB
(-)
FGR 247
B7+42+22
CLB 090
Cw1
CLB 300
Cw3+Cw1
SEC 912405
Cw5+Cw8
Kurt
Bw4
W6/32
(+)
3711 DL
B42
Bouq
Cw2
Sevi 379
Cw4
Winzer
Cw6
116.5.28
Bw4
CLB 073
B27+13+47
CLB 123
Cw2
FGR 629
Cw4
Cooper
Cw4+Cw6
126.39
Bw6
A
B
C
D
E
F
7
Esta es la plantilla que utilizamos en el laboratorio del HOSPITAL VIRGEN DE LAS NIEVES, para
realizar un tipaje HLA.
29
Inmunología
Práctica 2
PACIENTE:
CAUSA DE TIPAJE:
LECTOR:
TIPAJE:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
AB
(-)
FGR 592
A2
X1MoAb
A3
FGR 948
A24
CLB 118
A26
MT 8125
A29
CLB 224
A31+(33)
PF1339B
A33
NS4366
B52+62
W6/32
(+)
FGR 272
A1
FGR 351
A2+28
Za 62
A23+24
C0 122
A25+26
NS 4830
A26+68
Graffity S.
A29
Belmonte
A32
Fe 89
A33+31+29
Tivol
B52
AB
(-)
FGR 113
A1
CLB168
A28
FGR 304
A23+24
De Genova
A25+26
Breaux
A11
PF 1548A
A30+(31)
Fe 77
A32+25+62
FGR 324
B51+52
FGR 653
B7
FGR 568
B8
AB
(-)
FGR 268
B13
FGR 543
B62+63
CLB 276
B38+39
S 1394.2
B57+58
Simpkins
B49
Sevi 670
B55
FGR 1020
B27
FGR 671
B35+B51
W6/32
(+)
FGR 434
B44
Hatcher
B13
Rickart
B62
T 4011
B38+67
PF 1598
B18
Price
B49+52
Guimard
B55
FGR 451
B27+(47)
TS 174 II
B37
AB
(-)
AB
(-)
Neuville
B35+70+50..
Mahner
Cw2
Apple
Cw4
CLB 147
Cw7
FGR 408
Bw6
CLB 283
B41
Bark
Cw1
TS242
Cw3
Her
Cw5
CLB 308
Cw7
CC 40.2
Bw6
A
B
FGR 500
FGR 692
A1
A2
OF901299
SP 1255
A28
A3
FGR 1429 CC551.2
A23
A23
Farnworth
Pail
A25
A25
NS 4828
Colombani
A11
A11
Ma 768
NS 4251
A30
A30+31
CATA-1
FGR 263
A32+25 A33+26+31
CLB 030
FGR 608
B51+52
B51
CTM 11
FGR 303
B7
B7
FGR 678
SEB782704
B44 +(50)
B8
CO156
A2+57+63
CLB 229
A3
1BA
A24
TS232
A26+66
OHA-104
A29
Albinet
A31
Beringuer
A33+26
Y276/69
B51
Y700/69
B8
FGR 681
B44+45
1
8
8
4
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
8
6
8
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6
8
6
1
8
1
1
1
8
4
Primoc123
B44
FGR 1013
B14
Matherne
B62
Ma 763
B38
CLB 292
B18
Scott
B50
9151
B55
CLB 310
B35
CLB 232
B37+44
Stroman
B40+41+48
Schu
B45
Hoffman
B14+(18)
Ma 1071
B63
Raff
B39
SEB900405
B18
Daubus
B50
Larock
B56
Za 103
B35
Pro
B37
Miller
B60+33+66
FGR 657
B13
Nichols
B62+63
SEB950102
B38+39
S 583
B57+58
FGR 50
B49+B50
Dubo
B55+56
MET
B27
FGR 496
B35
VR 8612
B60+61
CLB 237
B41
1
8
8
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
6
1
1
1
8
1
1
1
1
1
Thi
B60+61+41
CLB 164
Cw1
Philphot
Cw3
FGR 371
Cw5
FGR 530
Bw4
AB
(-)
FGR 247
3711 DL
B7+42+22
B42
CLB 090
Bouq
Cw1
Cw2
CLB 300
Sevi 379
Cw3+Cw1
Cw4
Winzer
SEC 912405
Cw5+Cw8
Cw6
116.5.28
Kurt
Bw4
Bw4
W6/32
(+)
CLB 073
B27+13+47
CLB 123
Cw2
FGR 629
Cw4
Cooper
Cw4+Cw6
126.39
Bw6
1
1
1
4
1
1
1
8
6
4
1
1
1
1
1
4
6
8
8
1
1
1
1
8
1
1
8
8
8
8
8
8
1
8
C
D
M. See.P
B45+(50)
RyC 37b
B14+(8)
CTM 30
B63+B57
Peters
B39
TS 190
B49+50
TS 214
B55+ 56
NS 2656
B27+47
FGR 432
B35+B51
FGR 654
B40+68
SEB921802
B60+48
E
F
Esta es la plantilla que utilizamos en el laboratorio del HOSPITAL VIRGEN DE LAS NIEVES,
para realizar un tipaje HLA.
30
Inmunología
Práctica 3
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 3
EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA.
DETERMINACIÓN DE LOS ANTICUERPOS
CONTRA EL TOXOIDE TETÁNICO MEDIANTE
INMUNOENSAYO (ELISA)
Inmunología
Práctica 3
OBJETIVOS PRINCIPALES DE LA PRÁCTICA




Aprender el fundamento de la técnica de detección por ELISA
Manejar muestras biológicas y estimar diluciones según el rango de detección de la metodología
Monitorizar la detección de anticuerpos específicos anti-toxoide tetánico
Interpretar los resultados según la titulación de IgG específica presente en las muestras biológicas
(vacunación, inmunodeficiencia, etc)
INTRODUCCIÓN
La toxina tetánica
El tétanos es una enfermedad bacteriana infecciosa causada por el bacilo anaeróbico estricto
esporulante Clostridium tetani. El crecimiento de este bacilo, ubicuo en nuestro ambiente, se ve
favorecido en heridas sucias y zonas necróticas, donde puede producir una neurotoxina denominada
tetanoespasmina. Esta toxina bloquea los neurotransmisores inhibidores del sistema nervioso central
y provoca la rigidez muscular y espasmos característicos del tétanos generalizado.
La protección contra el tétanos es dependiente de anticuerpos y depende de la capacidad de las
inmunoglobulinas antitoxina para neutralizar la tetanoespasmina. Esta protección se puede lograr
mediante dos métodos:
Inmunización activa, gracias a la vacuna antitetánica,
Inmunización pasiva, mediante la administración de la inmunoglobulina antitetánica
específica.
Las vacunas contra el tétanos se basan en el toxoide tetánico, una neurotoxina modificada que induce
la formación de dichos anticuerpos antitoxina protectores. Sin embargo, al igual que ocurre con otras
vacunas, la respuesta inmunitaria al toxoide tetánico es deficiente en individuos inmunodeprimidos,
como sucede por ejemplo en los enfermos de SIDA, y pacientes con anormalidades del timo.
‐
‐
Actualmente, la vacuna antitetánica está disponible en el mercado internacional en forma monovalente
(TT), en vacunas combinadas que contienen además toxoide diftérico (DT o dT, dependiendo de la
cantidad de toxoide diftérico) y en vacunas combinadas con otros componentes como antidiftéricos,
antitosferínicos, antipoliomielítica inactivada, la vacuna contra la hepatitis B y la vacuna contra
Haemophilus influenzae de tipo B.
La concentración y avidez de los anticuerpos antitoxina, así como la duración de la protección,
dependen de varios factores, como la edad de los vacunados, el número de dosis de la vacuna y los
intervalos entre las dosis. La administración de tres dosis de toxoide tetánico durante el periodo de
lactancia proporcionará de 3 a 5 años de protección, una dosis adicional o de refuerzo (p. ej., en los
primeros años de la infancia) proporcionará protección hasta la adolescencia, y una o dos dosis de
refuerzo adicionales inducirán la inmunidad hasta bien entrada la edad adulta (se ha sugerido que la
duración puede ser de 20 a 30 años). Las dosis de refuerzo pueden provocar respuestas inmunitarias
incluso transcurridos de 25 a 30 años desde la dosis anterior, lo que demuestra la persistencia de la
memoria inmunitaria.
Inmunología
Práctica 3
Anticuerpos específicos y vacunas
La respuesta inmunitaria de una persona puede variar según el tipo de antígeno que provoque la
respuesta. Si no se produce una respuesta de anticuerpos específicos o si se producen anticuerpos
funcionalmente inactivos se pueden producir infecciones recurrentes o persistentes. Un sistema
inmunitario sano es capaz de reconocer los antígenos de naturaleza proteica correctamente desde el
primer año de vida. Los antígenos polisacáridos son más difíciles de reconocer para el sistema
inmunitario y es frecuente que los niños pequeños no puedan iniciar una respuesta ante ellos. La
capacidad de respuesta a los antígenos polisacáridos empieza a madurar a la edad de 2-3 años hasta la
edad adulta. Cuando el sistema inmunitario pierde la capacidad funcional de fabricar anticuerpos
específicos, es probable que la primera respuesta que disminuya sea la respuesta a estos antígenos. No
obstante, la hipogammaglobulinemia puede aparecer solo cuando disminuye la capacidad de respuesta
a los antígenos proteicos.
La vacunación se ha utilizado con frecuencia para medir la capacidad del sistema inmunitario para
producir anticuerpos específicos funcionalmente activos. Es importante investigar la respuesta tanto a
los antígenos proteicos como a los polisacáridos puros. La respuesta de anticuerpos frente a los
patógenos naturales también puede ser útil, sobre todo si se sabe que la persona ha estado expuesta a
un patógeno en concreto.
Tipo de antígeno
Vacunas recomendadas
Proteína
Toxoide tetánico
Polisacárido puro
Polisacárido +
Péptido
Patógenos naturales
Antineumocócica (23-valente, no conjugada)
Samonella typhi Vi
Haemophilus influenzae tipo B (Hib)
Antineumocócica (7-valente, conjugada)
Virus varicela-zóster (VVZ)
Antigripal
La respuesta vacunal se mide con una muestra sérica justo antes de la vacunación y una segunda
muestra 3-4 semanas después. Los niveles normales de anticuerpos específicos pueden variar
considerablemente en función de la población, edad, raza, historial de vacunación, etc. La diferencia
entre los niveles de anticuerpos específicos en las muestras anterior y posterior a la vacunación sirve
para valorar la respuesta del sistema inmunitario. Es significativo si el nivel de anticuerpos se
multiplica por 4 como respuesta a una proteína o si se duplica como respuesta a un polisacárido puro.
Las pruebas de respuesta a la vacunación también pueden ser útiles en la investigación y el control de
pacientes con inmunodeficiencias secundarias, es decir, las causadas por un factor externo como una
infección vírica (como el VIH) o tratamientos farmacológicos (como la quimioterapia).
Inmunología
Práctica 3
Inmunodeficiencias primarias (IDP)
Las inmunodeficiencias primarias (IDP) se deben a la pérdida física o funcional de una parte del
sistema inmunitario. Las IDP son enfermedades genéticas que surgen de manera predominante por un
mecanismo de herencia mendeliana. Se han descrito más de 200 entidades y se han identificado
mutaciones nocivas en unos 150 genes, aunque puede no manifestarse hasta la edad adulta. Los
individuos afectados por una IDP suelen presentar infecciones graves o recurrentes causadas por
patógenos habituales que, en circunstancias normales, no deberían causar una enfermedad grave. A su
vez, también pueden ser sensibles a patógenos menos habituales que no suelen provocar una infección
en personas con un sistema inmunitario sano.
Las IDP pueden afectar tanto al sistema inmunitario innato (neutropenia congénita grave, asplenia,
deficiencia de la adherencia leucocitaria, deficiencia del complemento, etc.) como al adaptativo
(deficiencias de linfocitos, deficiencias del metabolismo de purinas, agenesia del timo, etc.). En este
sentido, las IDP que afectan de manera predominante a los linfocitos B son las más frecuentes (6070% de los casos). Por este motivo, la cuantificación de las inmunoglobulinas y de sus isotipos en
suero es una prueba básica esencial para el diagnóstico y la investigación de las IDP.
‐
Análisis de IgG, IgA e IgM. Los resultados suelen ser la base de las pruebas posteriores sobre
otros aspectos, como el funcionamiento de los anticuerpos.
% IgG
total
Función
Patología típica
IgG1
60-65%
Ag proteicos (timo)
Fagocitosis
Activación del
complemento
Hipogammaglobulinemia
IgG2
20-25%
Ag polisacáridos
Infecciones respiratorias
recurrentes en niños
IgG3
5-10%
Ag proteicos
Se asocia a la deficiencia de
IgG1
IgG4
5%
% IgA
total
Ag no polisacáridos
Alergias, asma, dermatitis
atópica, algunos parásitos
Función
Patología típica
Reacciones anafilácticas por
cambios en la proporción
IgA1/IgA2
Pueden pasar
desapercibidas
IgA1
85%
Ag proteicos
Ag policáridos débil
IgA2
15%
Ag polisacáridos y
lipopolisacáridos
Inmunología
‐
‐
Práctica 3
Análisis de IgD. La deficiencia de fagocitosis y el síndrome febril recurrente se asocian a la
hiperinmunoglobulinemia D.
Proteínas monoclonales. Producidas por un único clon de células B y son características de
enfermedades neoplásicas.
Fundamento de la metodología
La detección de los anticuerpos específicos antitoxina tetánica se realiza en la clínica habitualmente
mediante un test de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) en placas de microtitulación de
96 pocillos. Esta metodología se basa en la alta especificidad de un anticuerpo monoclonal por su
antígeno. En estos pocillos el toxoide tetánico está inmovilizado al plástico tapizando la cara interna.
Todos los pocillos de la placa tienen la misma cantidad de toxoide adsorbido.
TMB
+
H2O2
Ac. anti‐IgG1 humana
(Detección)
HRP
(H3PO4)
Ac. anti‐toxoide (SUERO)
Toxoide (Ag de captura)
La técnica consiste en una primera incubación de los pocillos con las soluciones de calibración, los
controles y las muestras a analizar. Las inmunoglobulinas presentes en estas soluciones que detecten
el toxoide quedarán firmemente retenidas (interacción Ag-Ac). Tras el lavado de los pocillos para
eliminar todas las proteínas no fijadas, se añade IgG purificada producida en conejo que reconoce
específicamente la porción Fc de la inmunoglobulina humana que ha reconocido el toxoide. Esta IgG
de conejo está marcada con el enzima peroxidasa (IgGHRP). Es decir, el conjugado se fija al anticuerpo
humano capturado por el toxoide inmovilizado y el exceso se elimina mediante lavados. El conjugado
fijado se visualiza con el reactivo tetrametilobenzidina 3,3’,5,5’ (TMB) y peróxido de hidrógeno
(H2O2) dando un color azul. La intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos en la
muestra. Para parar la reacción de la HRP se acidifica la solución añadiendo a cada pocillo una solución
concentrada de ácido, en este caso ácido fosfórico 3M. Esto produce además un color amarillo a punto
final, cuya absorbancia es legible en un lector de placas a una longitud de onda de a 450 nm.
Inmunología
Práctica 3
MATERIAL
•
Kit comercial VaccZyme™ Anti-Tetanus Toxoid IgG Enzyme Immunoassay (Binding Site,
Birmingham, UK). Este kit contiene:
‐ 12 tiras de 8 columnas con pocillos tapizados con el toxoide tetánico
‐ Tampón diluyente de muestras
‐ Tampón de lavado
‐ Calibradores IgG anti-toxoide: 0,01; 0,03; 0,09; 0,26; 0,78; 2,33; 7 IU/ml
‐ Controles positivos de bajo y alto rango
‐ Conjugado IgGHRP anti-IgG humana
‐ Substrato TMB (NO EXPONER A LA LUZ)
‐ Solución de parada ácido fosfórico 3M (CUIDADO, IRRITANTE)

Muestras de suero humano. Deben provenir de extracciones venosas, dejándolas coagular
naturalmente, separando después el suero.

Agua destilada

Pipeta multicanal y micropipetas. Tubos para hacer las diluciones.

Lector de placas
PROTOCOLO
Pasos previos al desarrollo de la práctica.
1. Atemperar todos los componentes del kit a temperatura ambiente (RT). Mezclar con cuidado
cada componente antes de usar.
2. Dilución del tampón de lavado 1/20: Añadir 25 ml del tampón de lavado concentrado a 475 ml
de agua destilada.
3. Dilución de las muestras 1/100 en el tampón diluyente.
4. Preparación de las tiras y diseño del experimento: Colocar el número necesario de tiras de
pocillos en el marco. Desde la posición del pocillo A1 rellenar las columnas de izquierda a
derecha. Mientras se manipula la placa, apretar los cantos largos del marco para evitar que los
pocillos se salgan. Las tiras no utilizadas se deben guardar inmediatamente en la bolsa de origen
para minimizar la exposición a la humedad.
Inmunología
Práctica 3
Procedimiento.
Es importante mantener la misma secuencia de dispensación durante todo el proceso para evitar
diferencias en los tiempos de incubación entre los primeros pocillos y los últimos, lo que se denomina
deriva del análisis. El tiempo de las incubaciones empieza a contar a partir de la adición de última
muestra.
1. Adición de la muestra. Añadir 100 µl de los calibradores, los controles y las muestras diluidas
a los pocillos correspondientes. Incubar 30 minutos a RT.
2. Lavado. Las muestras se eliminan por inversión de los pocillos sobre papel absorbente y se
añaden 300 µl de tampón de lavado por pocillo. Se repite esta operación 3 veces. Es
recomendable usar una pipeta multicanal.
3. Adición del conjugado. Pipetear 100 µl de conjugado por pocillo e incubar 30 minutos.
4. Lavado. De modo similar al punto 2. Secar las posibles salpicaduras con papel absorbente.
5. Adición del substrato (TMB + H2O2). Añadir 100 µl e incubar 30 minutos a RT protegiendo
los pocillos de la luz.
6. Parada de la reacción. Pipetear 100 µl de la solución de parada por pocillo. Observar el cambio
de color.
7. Medición de la densidad óptica. Leer la absorbancia de cada pocillo a 450 nm en un lector de
microplacas en los siguientes 30 minutos a la reacción.
RESULTADOS
Se debe calcular la dispersión de las lecturas (% CV). Para trabajar de forma precisa, los CV deben ser
<15%.
Trazar la curva de calibración, mediante regresión lineal del tipo y=ax+b y calcular el ajuste (valor r2).
Calcular los valores Control de Bajo (LR) y Alto (HR) rango y las Muestras problema.
Interpretar los resultados obtenidos de las muestras analizadas.
Aclaración: la representación de los valores de absorbancia respecto a la [IgG1 α-TTx] para la
calibración no sigue una distribución lineal y un ajuste multiparamétrico es más correcto. Este hecho
se debe tener en cuenta a la hora de discutir los resultados.
Inmunología
Práctica 3
ANEXO I. Ejemplo de curva de calibración e interpolación de muestras con el programa OPTIMA
2.20 R8 (Mars BMG LabTech).
Ajuste lineal de la recta patrón:
y = 0,342x + 0,249 (r2=0,9109)
La concentración de anticuerpos anti-toxoide presente en las muestras de suero se calcula en el ejemplo
de la siguiente tabla:
Abs.1
Muestra 1 0,328
Muestra 2 0,517
Muestra 3 1,651
Abs.2
0,314
0,816
1,429
Abs.3 CV Conc.1 Conc.2 Conc.3 Media SD
0,352 5,8%
0,23
0,19
0,30
0,24 0,06
0,732 22,4% 0,78
1,66
1,41
1,28 0,45
1,715 9,4%
4,10
3,45
4,29
3,95 0,44
Alternativamente, se puede realizar un ajuste multiparamétrico con OPTIMA, que nos dará un valor
de r2 perfecto para la curva de calibrado y nos permitirá la validación del ensayo mediante la
extrapolación de las lecturas de los controles positivos de bajo y alto rango de IgG1 humana antitoxoide tetánico.
ANEXO II. Substancias interferentes en la detección.
Substancia
Concentración (máx.)
Bilirrubina F (libre)
183 mg/ml
Bilirrubina C (conjugado)
190 mg/ml
Hemoglobina hemolizada
4900 mg/ml
Quilo
Factor reumatoide
19300 U
500 IU/ml
ANEXO III. Nivel de protección.
En una población normal, la literatura indica un nivel de anticuerpos de protección variable en función
de diversos factores, principalmente la edad. En general, se establece que un individuo es
inmunocompetente frente al tétanos si posee un valor de IgG1 anti-TTx en suero por encima de 0,15
IU/ml.
Inmunología
Práctica 4
INMUNOLOGÍA
PRÁCTICA 4
DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR
INMUNOFLUORESCENCIA
Inmunología
Práctica 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS DE LA PRÁCTICA:
1. Aprender a determinar ANA (anticuerpos antinucleares) en el suero de pacientes
sospechosos de padecer una determinada enfermedad autoinmune.
2. Realizar una técnica de screening, basada en la reacción antígeno-anticuerpo que se produce
entre un antígeno nuclear de la línea celular Hep-2 fijada a un porta y el anticuerpo presente
o no en el suero del paciente.
3. Realizar la técnica de inmunofluorescencia indirecta, para la visualización de la reacción
antígeno- anticuerpo.
4. Hacer una semi-cuantificación de la cantidad de anticuerpo presente en el suero (titulación
del suero) mediante el uso de diluciones seriadas.
5. Ver el tipo de reacción en el microscopio de fluorescencia. Observar ejemplos de distintos
patrones de tinción.
DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS
INTRODUCCIÓN A ENFERMEDADES AUTOINMUNES
El sistema inmune protege frente a los agentes infecciosos, sin embargo, en algunas
ocasiones puede ocasionar daño tisular y enfermedades. Esto puede ocurrir en dos situaciones:
- Cuando la respuesta inmune frente a antígenos extraños es incontrolada o excesiva
tienen lugar las reacciones de hipersensibilidad
- Cuando la respuesta inmunológica se desarrolla frente a antígenos propios por
fallos en la tolerancia central y periférica, tienen lugar las enfermedades autoinmunes.
Por lo tanto, las enfermedades autoinmunes se desencadenan por una respuesta inmune
anómala frente a antígenos propios. Los mecanismos efectores son los mismos que utiliza el
sistema inmune en la respuesta celular y humoral frente a antígenos extraños.
En las enfermedades autoinmunes el daño se produce por formación de
inmunocomplejos o por anticuerpos que se unen a antígenos celulares o extracelulares. Los
anticuerpos que originan las enfermedades autoinmunes van dirigidos frente a antígenos propios,
es decir son autoanticuerpos. Sólo en algunos casos son anticuerpos contra antígenos extraños que
tienen reacción cruzada con el propio tejido.
1. Formación de complejos antígeno-anticuerpo (inmunocomplejos) que se forman en la
circulación y se depositan en la pared vascular, dañando el tejido en el que se depositan, por
la activación que originan del sistema inmunológico. Por lo tanto, el daño no es específico
de una célula en particular, sino que pueden dañar diversos tejidos. Así las enfermedades
autoinmunes producidas por inmunocomplejos son sistémicas, sin especificidad frente un
antígeno celular específico de un órgano o tejido.
Inmunología
Práctica 4
Los inmunocomplejos se originan durante la respuesta inmune normalmente, pero sólo
ocasionan daño cuando se producen en grandes cantidades o no se depuran de forma
adecuada. El vaso en el que se depositan depende de las propias características de éste,
generalmente los capilares glomerulares y de la sinovial de las articulaciones son los más
afectados. El lugar de depósito también depende de las características fisicoquímicas del
antígeno y el anticuerpo (carga, valencia, isotipo, etc…).
El prototipo de enfermedad causada por inmunocomplejos es el Lupus Eritematoso
Sistémico (LES): enfermedad autoinmune en la que se producen muchos autoanticuerpos, lo
que conduce a diversas manifestaciones clínicas (glomerulonefritis, artritis, etc..).
2. Anticuerpos que se unen a antígenos celulares o extracelulares: estos anticuerpos
reconocen de forma específica a un antígeno, dañando específicamente la célula o el tejido
en el que se encuentra dicho antígeno. En este caso los mecanismos efectores que
intervienen son: la activación del Complemento, la liberación de enzimas por
desgranulación de células del sistema inmunológico y la interferencia de las funciones
celulares por unión a moléculas o receptores.
ANTICUERPOS CONTRA COMPONENTES DEL NÚCLEO
Los anticuerpos contra el núcleo (ANA-anti-nuclear-antibodies) son un conjunto
heterogéneo de autoanticuerpos que reaccionan contra antígenos del núcleo celular, aunque
algunos de ellos también se encuentran en el citoplasma. Los antígenos contra los que van
dirigidos los ANA con frecuencia forman parte de proteínas que intervienen en funciones
esenciales para las células, como la replicación o la trascripción del DNA y el procesamiento del
RNA. Con frecuencia, los epítopos reconocidos por los ANA son lugares activos o funcionales de
estas proteínas.
Los ANA se encuentran con mucha frecuencia elevados en enfermedades autoinmunes
sistémicas y, en general, cuando no se detectan debe reconsiderarse el diagnóstico. Por tanto, el análisis
de los ANA es un método de escrutinio poderoso y sensible en estos pacientes. Los Ac antinucleares
pueden detectarse en personas sanas, incrementándose con la edad (38% en ancianos). Habitualmente,
los ANA en personas sanas son de baja afinidad y títulos bajos (< 1/40-1/60). En nuestro hospital se
considera que empiezan a tener significación patológica a partir de la dilución 1/80. Recientemente se ha
descubierto que títulos elevados de ANA sin asociación con la positividad de algún ENA no son
debidos a enfermedades autoinmunes, sino a otras patologías (síndromes paraneoplásicos, tumores
hematológicos e infecciones).
En los estudios de autoinmunidad se utilizan varias técnicas analíticas para la detección
de los autoanticuerpos. En esta práctica vamos a utilizar la técnica de inmunofluorescencia.
Inmunología
Práctica 4
DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES MEDIANTE
INMUNOFLUORESCENCIA
Existen muchos tipos de anticuerpos antinucleares (ANA), dependiendo la especificidad de cada
uno de ellos son más característicos de una enfermedad u otra. En el Lupus Eritematoso Sistémico
los ANA son positivos en el 90-95% de los pacientes, siendo los más específicos los dirigidos frente
al ADN de doble cadena o nativo, y los que reconocen ribonucleoproteínas (RNP-Sm).
Para detectar si un suero posee ANA o no, normalmente, se utiliza la técnica de
inmunofluorescencia sobre tejidos animales o sobre células de una línea celular humana (línea
HEP-2 procedente de un carcinoma de laringe) fijadas en un porta. Esta técnica nos sirve de
screening, si aparecen ANA a títulos altos, y dependiendo del patrón de tinción: homogéneo,
moteado, nucleolar, etc.., podemos tener una orientación hacia determinados grupos de
enfermedades, pues nos sugiere el tipo de antígeno contra el que van dirigidos, pero no nos lo
identifica. Para poder identificar el antígeno concreto hay que utilizar otras técnicas, normalmente
técnicas en las que el antígeno (el especifico que queremos identificar) está fijado a una fase sólida, ej.
ELISA, inmunofijación, etc ..
FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
Se va a realizar una inmunofluorescencia indirecta. El antígeno presente en la célula va a
reaccionar con el anticuerpo presente en el suero del paciente, posteriormente se le añade un
anticuerpo que reconozca todas la inmunoglobulinas marcado con fluoresceína, que nos va a
permitir visualizar la reacción mediante un microscopio de fluorescencia. Es importante determinar el
título al que funcione el suero y el patrón de reacción (por ello no se realiza por citometría de flujo).
TÉCNICA
1. Se realizan las diluciones de los sueros: se empieza por 1/40 y se hacen seriadas al
1/2: 1/80, 1/160, 1/320 …etc …...
2. Se añade cada dilución a un pocillo del porta donde está fijada la línea HEP-2 (se conserva
en frio), se pone suficiente cantidad de suero para cubrir el pocillo (≈ 20 µl).
3. Se incuba en cámara humedad 30 minutos a Tª ambiente.
4. Se lava en PBS/TWEEN (2 ml de tween en un litro de PBS) 5 minutos.
5. Se le añade el anticuerpo marcado con fluoresceína (≈ 20 µl)
6. Se incuba otros 30 minutos.
7. Se lava en PBS/TWEEN 5 minutos.
8. Se escurre bien el porta y se deja secar un poco, sin que se sequen mucho las células.
9. Se monta el cubre con medio de montaje acuoso (a base de glicerina).
10. Se visualiza al microscopio.
En la lectura en el microscopio de fluorescencia hay que tener en cuenta el patrón de tinción
y la intensidad con las distintas diluciones. El patrón de tinción nos puede orientar sobre la
enfermedad que padece el paciente y las diluciones nos aproximan a la cantidad de autoanticuerpos
que tiene el paciente en el suero. La dilución mayor en la que se detecta positividad se considera el
título de anticuerpo que tiene ese paciente. Así, sí en un paciente la dilución 1/320 es negativa,
pero la 1/160 es positiva, este paciente tendría un título de autoanticuerpos de 1/160. Si la última
dilución que hemos realizado, en nuestro caso 1/320, fuera positiva, tendríamos que seguir
estudiando este suero hasta encontrar una negativa, ….1/640, 1/1280 ……
Inmunología
Práctica 4
El utiilizar dilucioones seriadaas empezanddo por 1/40 se
s hace para que haya un
una homogen
neidad
entre los disstintos laborratorios de lo
os distintos hhospitales.
Inmunología
Práctica 4
Inmunología
Práctica 4