Microscopios - Fundamentos, propiedades ópticas y elementos - Tipos de microscopía: campo luminoso, campo oscuro, luz ultravioleta, fluorescencia, contraste de fase y de transmisión electrónica Raffaella Onori, PhD Historia del microscopio - Etimologia → micro- (griego μικρός «pequeño") y -scopio (griego σκοπέω, «observar") - Lente de Nimrud → primer (posible) microscopio simple (a una sola lente) → imperio asirio (año 750 a.C.) → aumentar tamaño objetos. - Evidencias escritas sobre las lentes de aumento → comedias de Aristófanes (siglo V a.C.); obras de Séneca (enciclopedia Naturales Quaestiones, año 65 d.C.) - Siglo XI → estudio en detalle de las lentes simples en “Libro de Óptica” (Ibn al-Haytham, matemático, físico y astrónomo) - Siglo XII → estudios de Roger Bacon → fraile franciscano y primeros personajes históricos en estudiar sistemáticamente las propiedades de las lentes - Siglo XIII → Invención de las gafas en Italia (Alessandro della Spina) → estudio de lentes compuestas (microscopio y telescopio) Historia del microscopio - No es posible afirmar con absoluta certeza quién fue el verdadero inventor del microscopio compuesto → inventado en algún momento entre los años 1590 y 1620. - Algunos históricos señalan a Zacharias Janssen (1590) y otros Hans Lippershey. - Galileo Galilei presentó su microscopio óptico en 1609 → diseño basado en la combinación de una lente cóncava junto con una lente convexa. - Microscopio utilizado con fines científicos → Robert Hooke que publicó Micrographia (1665) → ilustraciones de insectos y plantas utilizando microscopio compuesto y primera definición de “célula” - Antonie van Leeuwenhoek trabajaba inicialmente como comerciante de telas → interés por la microscopía con el objetivo de fabricar mejores lentes para analizar la calidad de las telas con las que comerciaba → eran microscopios simples a gran resolución (x200) → observaciones de las fibras musculares, distintos tipos de bacterias y los glóbulos rojos de la sangre → todavía hoy se le conoce como el padre de la microbiología Objetivo de la microscopía → poder observar elementos fuera del rango de resolución del ojo humano (0,2 mm) Definiciones 1. Poder de resolución → capacidad de una lente de crear imágenes separadas de puntos muy cercanos → poder de resolución del ojo humano es 0,2 mm 2. Limite de resolución → distancia mínima a partir de la cual NO es posible diferenciar dos puntos 3. Apertura numérica → capacidad intrínseca de la lente para capturar la luz → inversamente proporcional al limite de resolución y directamente proporcional al poder de resolución δ= limite de resolución λ = longitud de onda AN = apertura numérica 0,2 mm 0,2 µm Microscopía óptica - Microscopía óptica o fotónica - Utiliza luz visible o ultravioleta que haya sido difractada, reflejada o refractada sobre la muestra - Máximo poder de resolución de 0,2 µm Componentes del microscopio - Base/soporte → se encuentra fuente de iluminación - Platina → superficie sobre la cual se pone el portaobjetos con la preparación - Revolver → contiene objetivos (10X, 40X, 100X-aceite) - Tornillos → macrométrico (enfoque grosero → primera observación de la muestra con objetivo más pequeño) y micrométrico (enfoque fino, para objetivos de mayor aumento) - Condensador → sistema de lentes convergentes que capta la luz y los concentra sobre la muestra - Foco → lampara alógena Microscopía óptica Objetivos del microscopio - Tubo cilíndrico en cuyo interior se disponen las lentes centradas y alineadas y un revestimiento antirreflejos. - En el exterior → especificaciones y características (aumento del objetivo, apertura numérica, longitud del tubo y espesor del cubreobjetos) - Los más frecuentes son de 10X, 20X, 40X, y 100X - Aceite de inmersión (100X) → aumenta la captación de la luz y la apertura numérica → reduce la refracción de la luz y aumenta la resolución de la imagen Microscopía óptica Fuentes de iluminación - Elementos que producen, captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz. - Emisión fotones recogidos por el condensador y el diafragma. - Tipos: 1. Bombillas de tungsteno y bombillas halógenas (mayoría) 2. Lámparas de arco eléctrico → luz monocromática (microfotografía y microscopía de fluorescencia) 3. Diodos LED → larga duración y no produce calor Tipos de microscopio óptico - Simple o “lupa”→ única lente convergente - Compuesto → más de una lente → ej. estereomicroscopios (dos objetivos y dos oculares) Embrión de gallina observado con estereomicroscopio. Premio Nikon Smart World 2008. Microscopía óptica Tipo de microscopía óptica: 1. Convencional o de campo claro 4. De interferencia 2. Campo oscuro 5. De fluorescencia 3. Contraste de fase 1. Microscopio convencional - Más utilizados en laboratorios de rutina - Dos sistemas de lentes → ocular y objetivo - La muestra se ilumina con un haz de luz enfocado con el condensador → muestra en tono oscuro/fondo claro - Preparación de la muestra → tinciones (aumentan contraste) o sin tinciones Microscopía óptica 2. Microscopio de campo oscuro - Sistema diafragma-condensador crean cono de luz hueco - Muestra clara en fondo oscuro (negro) - Visualización de microorganismos de diámetro muy fino (espiroquetas) o formas móviles sin teñir o microorganismos vivos - Mejora resolución respecto al campo claro 3. Microscopio de contraste de fases - Sistema de aumento de contraste entre partes claras y oscuras de las células → sin necesidad de tinción - Permite observar los detalles internos - Visualización de microorganismos vivos sin teñir, endosporas o cuerpos de inclusión (ej. Polihidroxibutirato) Microscopía óptica 4. Microscopio de interferencia (Nomarski) - Se divide la luz en dos haces de luz polarizada con trayectos e índices de refracción diferentes - Uno de los haces pasa a través de la muestra y el otro, usado como referencia, la atraviesa de forma lateral → el haz que atraviesa la muestra sufre un retraso respecto al otro → cambia de fase y aumenta el contraste → la imagen es similar a la producida en los microscopios de contraste de fases, añadiendo aspecto de relieve - Las muestras aparecen en tonos oscuros o claros sobre un fondo gris - Los haces vuelven a cruzarse → interfirieren mutuamente - Se utiliza para observar células vivas no coloreadas, preparaciones con cierto grosor cuando no se puede usar la microscopía de contraste de fases y en la fertilización in vitro Vorticella sp Bacillus sp https://www.youtube.com/watch?v=i_b84DA2QvU Microscopía óptica 5. Microscopio de fluorescencia - Fluorescencia → capacidad de algunas sustancias de emitir radiaciones estimuladas por radiaciones de longitud de onda más corta - Fluorocromos → sustancias que emiten fluorescencia → luz dentro del espectro del visible si están expuestas a una fuente de luz UV hasta el infrarrojo - Microscopio incorporan una lampara de luz ultravioleta - Las muestras se tiñen con : → elementos que adhieren a componentes microbianos como naranja de acridina o DAPI (ácidos nucleico), blanco calcofluor (hongos) o rodamina (ácidos micólicos) → elementos que se unen a anticuerpos como la fluoresceína Microscopía electrónica - Utiliza como fuente un haz de electrones en vez de fotones → longitud de onda menor que el óptico → mayor resolución (0,2 nm) - Se trabaja siempre en vacío → evitar desvío de haz de electrones - Dos tipos principales: 1. Microscopio electrónico a transmisión (MET) → muestra fijada con tetróxido de osmio → los electrones atraviesan directamente la muestra → imagen aumentada en pantalla fluorescente → imágenes en blanco y negro 2. Microscopio electrónico de barrido (MEB) → muestra deshidratada y cubierta con película de oro-carbono → los electrones van barriendo la muestra → imagen tridimensional → estudio de superficies celulares y organización espacial Sistemas de microscopía Técnicas de microscopía avanzada 1. Microscopía multifotónica - Fluorocromo excitado simultáneamente por dos o más fotones → energía sumada → se estimula el fluorocromo con energía doble en frecuencia - Se utiliza con fluorocromos excitados con luz ultravioleta 2. Minflux - Sistema de microscopía óptica de super resolución → hasta 10nm (vs 0,2 µm convencionales) - Método por fluorescencia con uso de un flujo mínimo de fotones (nombre MINFLUX) → resolución alta con una cantidad baja de fotones https://www.youtube.com/watch?v=J2_wdNT4KyM&feature=youtu.be Técnicas de microscopía avanzada 3. Microscopía de campo cercano - Llamada también SPM (Scanning Probe Microscospy) - Punta (técnicamente “sonda”) se acerca a la superficie de la muestra → se mide la interacción sonda-superficie → se recorre la superficie → mapa → imagen https://www.youtube.com/watch?v=fu8Xhx9CYuY 4. Microscopía confocal con disco de Nipkow - Se utiliza una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y reconstruir imágenes tridimensionales - El campo de visualización se obtiene escaneando simultáneamente múltiples puntos de la muestra - Disco de Nipkow → disco plano con una serie de orificios dispuestos en espiral desde el centro al exterior → permite de observar una “escena” de forma ordenada → el disco gira → cada orificio recorre una circunferencia de distinto radio (línea de exploración = resolución) → a mayor número de perforaciones, mayor resolución Microscopía de campo cercano Minflux
