NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 1997-05-28 MICROBIOLOGÍA. GUÍA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MOHOS Y LEVA LEVADUR DURAS. AS. TÉCN TÉCNICA ICA DE RECUENT RECUENTO O DE COLONIAS A 25 °C E: MICROBIOLOGY. GENERAL GUIDANCE FOR ENUMERATION OF YEASTS AND MOULDS. COLONY COUNT TECHNIQUE AT 25 DEGREES C. CORRESPONDENCIA: esta norma es equivalente a la norma ISO 7954, con desviaciones técnicas menores DESCRIPTORES: análisis microbiológico, análisis bacteriológico, producto alimenticio, ensayo biológico. I.C.S.: 07.100.30 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá Apartado Bogotá,, D.C. - Tel. (571) 6078888 6078888 - Fax (571) 2221435 2221435 Prohibida su reproducción PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4132 fue ratificada por el Consejo Directivo de 1997-05-28. 1997-05-28. Esta momento norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo a las necesidades y exigencias actuales. A continuació continuación n se relaciona relacionan n las empresas empresas que que colaboraro colaboraron n en el estudio estudio de esta esta norma a tr través avés de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología. A.D. CONTR CONTROL OL ACEGRASA ACEG RASAS S ALPINA ALPIN A S.A. S.A. AQUALAB AQUA LAB L LTDA. TDA. ASINAL ASINA L LTD LTDA. A. BIOQUILAB CALIDAD MICROBIOLÓGICA CARULLA Y CÍA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS CENTRO S.A. GASEOSAS LUX INDUSTRIAL DE GASEOSAS S.A. INGENIO RIOPAILA INVIMA LLOREDA GRASAS S.A. MANANTIAL S.A. MEALS DE COLOMBIA CASA LUCKER CICOLAC COLSUBSIDIO COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES CONGELAGRO CREPES Y WAFFLES DISA-MAIZENA EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTAR ALCA NTARILLAD ILLADO O DE BOGOT BOGOTÁ Á FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS EL REY NESTLÉ DE COLOMBIA NULAB LTDA. POSTOBÓN PROLECHE SUIZO - NOEL - ZENÚ UNIVERSIDAD DE LA SALLE UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Además de las anteriore Además anteriores, s, en Consulta Consulta Pública Pública el Proyecto Proyecto se puso a considera consideración ción de las siguientes empresas: CERVECERÍA LEONA CERVUNIÓN COLOMBIANA S.A. COLSUBSIDIO INGENIO PROVIDENCIA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO INSTITUTO NACIONAL DE SALUD MERCK (L-PRO) SUCROMILES S.A. ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 MICROBIOLOGÍA. GUÍA GENERAL PARA EL RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS. TÉCNICA DEL RECUENTO DE COLONIAS A 25 °C 0. INTRODUCCIÓN Esta norma proporciona una guía general para el análisis microbiológico de productos alimenticios no incluidos en otras normas y para ser tomada en cuenta en la preparación de métodos de ensayo microbiológicos aplicados en alimentos y en alimentos para animales. Debido a la gran variedad de productos dentro de este campo de aplicación, esta guía puede no ser apropiada para algunos productos en algunos detalles y para otros productos puede ser necesario usar métodos diferentes. Sin embargo, se espera que en todos los casos se intentará aplicar la presente guía hasta donde sea posible y aquellas desviaciones que se presenten serán únicamente hechas, si es absolutamente necesario, por razones técnicas. La armonización de métodos de ensayo no puede ser inmediata, y para ciertos grupos de productos pueden existir Normas Internacionales y/o Normas Nacionales que no estén de acuerdo con esta norma. En el caso en que la Norma Internacional ya exista para el producto que se va a analizar, ésta debe seguirse, pero se espera que cuando esa norma se revise, sea modificada para que cumpla con la presente norma, de modo que cualquier desviación que permanezca sea la necesaria y por razones técnicas t écnicas bien establecidas. 1. ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta norma establece una guía general para el recuento de mohos y levaduras viables en productos elaborados para consumo humano o animal por medio de la técnica de recuento de colonias a 25 °C. Nota. Debido a la naturaleza de los mohos y levaduras , el recuento está sujeto a ciertas imprecisiones. 2. REFERENCIAS NORMATIVAS Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante su referencia en este texto constituyen disposiciones del mismo. En el momento de la publicación eran válidas las indicadas. Todas las están Se recomienda a las realizan acuerdos connormas base en estasujetas norma,a aactualización. que investiguen la posibilidad de partes aplicar que las ediciones más recientes de las siguientes normas: 1 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos para animales. Reglas generales para los análisis microbiológicos. ISO 6887, Microbiology. General Guidance for the Preparation of Dilutions for Microbiological Examination. 3. DEFINICIÓN Para el propósito de esta norma se aplica la siguiente definición: Mohos y levaduras: microorganismos que a 25 °C forman colonias en un medio selectivo, de acuerdo con el método especificado en esta norma. 4. PRINCIPIO 4.1 Se preparan placas usando un medio selectivo y una cantidad especificada especifica da de la muestra a analizar, si el producto es líquido, ó de una suspensión inicial en el caso de otros productos. Se preparan otras placas, bajo las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la misma muestra o de la suspensión inicial. 4.2 Incubación aeróbica de las placas a 25 °C por 3 d, 4 d o 5 d. 4.3 Cálculo del número de mohos y de levaduras por gramo o por mililitro de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas, a los niveles de dilución que den resultados significativos. 5. DILUYENTE Y MEDIO DE CULTIVO 5.1 MATERIALES BÁSICOS Para mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que se use para la preparación del medio de cultivo, los componentes básicos del medio o un medio completamente deshidratado. deshidratado. Se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante. Los productos químicos usados deben ser de calidad analítica reconocida reconocida.. El agua utilizada debe ser agua destilada o agua desionizada libre de sustancias que puedan inhibir el crecimiento de mohos y levaduras bajo las condiciones de ensayo. La medida de pH debe hacerse usando un medidor de pH con compensación de temperatura (véase el numeral 6.4). Si no se usan inmediatamente el diluyente y el medio preparados, deben almacenarse, a no ser que se disponga algo diferente, en un lugar oscuro a una temperatura entre 0 °C y 5 °C y por un tiempo no mayor a un mes, en condiciones bajo las cuales no haya cambios en su composición. 5.2 DILUYENTE Véase la norma ISO 6887 y cualquier otra Norma Internacional que trate del producto que se va a examinar. 2 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 5.3 NTC 4132 MEDIO AGAR-EXTRACTO DE LEVADURA-DEXTROSA-CLORANFENICOL LEVADURA-DEXTROSA-CLORANFENICOL Nota. Puede utilizarse cualquier otro medio similar siguiendo las instrucciones del fabricante. Tabla 1. Composición del medio Componente Cantidad Extracto de levadura Dextrosa (C6 H12 O6) Cloranfenicol (C11 H12 Cl2 N2 O5 ) Agar Agua 5g 20 g 0,1 g 1 12 g a 15 g 2 1 000 ml Nota 1. Para obtener una concentración final de 100 μg/ml del medio. Nota 2. De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se disuelven los componente componentess en agua, mediante ebullición. Si es necesario se ajusta el pH después de la esterilización a 6,6. Se distribuye el medio agar en recipientes adecuados (véase el numeral 6.5). Se esteriliza el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante ó a 121 °C ± 1 °C (245 kPa) por 15 min. Nota. El cloranfenicol se puede reeemplazar por oxitetraciclina ( C 22 H30 N2 O11 ). En este caso, se prepara el medio básico como se describió anteriormente omitiendo el cloranfenicol, se distribuye en cantidades de 100 ml y se esteriliza. Se prepara también una solución de hidrocloruro de oxitetraciclina al 0,1 %, en agua y se esteriliza por filtración. Sólo antes del uso, se adicionan asépticamente 10 ml de esta solución a 100 ml del medio básico, el cual se ha fundido previamente y se mantiene a 45 °C. 6. APARATOS Y MATERIAL DE LABORATORIO Nota. Los materiales desechables son una alternativa al material de vidrio reutilizable si tienen las especificaciones adecuadas. El equipo usual de laboratorio y en particular: 6.1 Aparatos para la esterilización por calor seco (horno) o la esterilización por calor húmedo (autoclave) (el autoclave puede ser un equipo que se opera separadamente o como parte de un equipo general para la preparación y distribución de medios de cultivo). Se esteriliza el material que estuvo en contacto con el diluyente, el medio de cultivo o la muestra, particularmente los materiales plásticos y excepto los materiales que se suministran estériles, mediante uno de los siguientes métodos: 3 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 a) en el horno (véase el numeral 6.1) manteniendo la temperatura de 170 °C a 175 °C por no menos de una hora. b) en un autoclave (véase el numeral 6.1) manteniéndol manteniéndolo o a 121 °C ± 1 °C por no menos de 20 min. 6.2 Incubadora, capaz de mantener una temperatura a 25 °C ± 1 °C. 6.3 Baño de María, capaz de mantener una temperatura temperatur a de 45 °C ± 1 °C. 6.4 Medidor de pH con compensación de temperatura, con una precisión de calibración de ± 0,1 unidades de pH a 25 °C. 6.5 Frascos o Erlenmeyer Nota. Se pueden usar frascos o Erlenmeyer con tapa rosca metálica no tóxica. 6.6 Pipetas graduadas, calibradas, para uso bacteriológico únicamente, de capacidades nominales de 10 ml y 1 ml, graduadas en divisiones de 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente y con una abertura de salida de 2 mm a 3 mm. 6.7 Cajas de Petri, de 90 mm a 100 mm de diámetro. 7. MUESTREO El muestreo se debe llevar a cabo con la norma específica para el producto que se va a analizar. Si no existe una norma específica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes. 8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO Para la preparación de la muestra de ensayo debe verse la norma específica del producto que se va a analizar. Si no hay una norma específica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes. 9. PROCEDIMIENTO 9.1 PORCIÓN DE ANÁLISIS, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES Se deben seguir la norma ISO 6887 y la norma específica de producto que se va a analizar. Si no hay una norma específica se recomienda llegar a un acuerdo sobre esta materia, entre las partes. 4 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 9.2 NTC 4132 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN 9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.7). Se transfiere a cada caja de Petri, con una pipeta estéril (véase el numeral 6.6) 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos. 9.2.2 Se toman otras dos cajas de Petri. Se transfiere por medio de otra pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-1 (producto líquido), o 1 ml de la dilución 10-2 (otro producto). Se repite el procedimiento anterior usando mayores diluciones si es necesario. 9.2.3 Se transfieren desde uno de los frascos frascos de cultivo cultivo (véase el el numeral 6.5), a cada caja de Petri, aproximadamente 20 ml del medio agar-extracto de levadura-dextrosa-cloranfenicol (véase el numeral 5.3), previamente fundido y mantenido a una temperatura de 45 °C ± 1 °C, en baño de María (véase el numeral 6.3). El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial (o de la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio se transfiere a las cajas de Petri no debe exceder los 20 min. Cuidadosamente, se mezcla el inóculo con el medio y se permite que la mezcla solidifique, dejando que las cajas de Petri permanezcan en una superficie horizontal fría. Se debe preparar una caja de Petri de control, con 15 ml del medio para verificar su esterilidad. 9.2.4 Se invierten las cajas de Petri y se llevan a la incubadora (véase el numeral 6.2) a una temperatura de 25 °C ± 1 °C. 9.3 INTERPRETACIÓN Se cuentan las colonias de cada caja después de 3 d, 4 d y 5 d de incubación. Después de 5 d, se cuentan las cajas que contengan menos de 150 colonias. Si en alguna parte de la caja hay sobrecrecimiento con mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, se emplean los conteos realizados a los 4 d o 3 d de incubación. En este caso se refiere el periodo de incubación como de 3 d o 4 d en el reporte de ensayo. Si es necesario, se llevan al microscopio para distinguir las colonias de mohos y levaduras de las bacterias, de acuerdo con su morfología. 10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 10.1 CÁLCULO 10.1.1 Se usan para el recuento, los pla platos tos que contengan meno menoss de 150 colonias. 10.1.2 El número de levadu levaduras ras y de mohos por gramo o por mililitr mililitro o es igual a : ∑C -----------------(n1 + 0,1 n2 ) d Donde: ∑C es la suma de colonias contadas en todas las cajas; n1 es el número de cajas contadas de la primera dilución; 5 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 n2 es el número de cajas contadas de la segunda dilución; d es el factor de dilución con que se obtuvo el primer recuento (por ejemplo, 102). 10.1.3 Se debe redondear el resultado obtenido en el numeral 10.1.2 a dos cifras significativas. Cuando el número que se redondea es 5 y no hay otras cifras significativas, se redondea el número para dar una cifra par inmediatamente a la izquierda, por ejemplo 28 500 se redondea a 28 000; 11 500 se redondea a 12 000. 10.1.4 El resultado se expresará como un número entre 1,0 y 9,9 multiplica multiplicado do por 10x , donde x es la potencia apropiada de 10. Si no hay colonias en las cajas de la suspensión inicial (véase el numeral 9.1), y si el producto inicial era sólido, el número de levaduras y mohos por gramo del producto se debe reportar como “< 10” (menor de 10). Si no hay colonias en las cajas de la muestra de ensayo y si el producto inicial es líquido (véase el numeral 9.1), el número de mohos y levaduras por mililitro de producto debe reportarse como “< 1” (menor de 1). 10.2 EJEMPLO DE CÁLCULO Un recuento de mohos y levaduras dio el siguiente resultado (se incubaron dos cajas de Petri por dilución): dilución 10-2 : 83 y 97 colonias dilución 10-3 : 33 y 28 colonias ∑C 83 + 97 + 33 + 28 241 -------------------- = --------------------------------------------------------------------------- = --------------- = 10 954 (n1 + 0,1 n2 ) d [ 2 + (0,1 x 2) ] x 10-2 0,022 Redondeando el resultado como se indicó en 10.1.3 da 11 000. El número estimado de mohos y levaduras es por lo tanto: 1,1 x 10 4 expresados /g o /ml. 10.3 PRECISIÓN Por razones estadísticas, en el 95 % de los casos los niveles de confianza por este método varían de ± 16 % a ± 52 %. En la práctica, se han observado variaciones mucho mayores, en particular entre los resultados obtenidos por diferentes microbiólogos. 11. REPORTE DEL ENSAYO En el reporte del ensayo se debe registrar el método usado, el tiempo de incubación y los resultados obtenidos, indicando claramente el método de expresión usado. También debe mencionarse cualquier detalle de operación no especificado en la presente norma, o considerado como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que haya influenciado influenciado los resultados. 6 NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4132 El reporte del ensayo incluirá toda la información necesaria para la identificación completa completa de la muestra. 12. DOCUMENTO DE REFERENCIA INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance for the Enumeration of Yeasts and Moulds. Colony Count Technique at 25 degrees C. Geneva, 1987. 3 p. (ISO 7954). 7
