Rev. Protección Veg. Vol. 21 No. 3 (2006): 186-190 Comunicación corta DETECCIÓN DE PROTEASAS PRODUCIDAS POR Pochonia chlamydosporia EN MEDIO SÓLIDO Belkis Peteira *, Ivania Esteves** y L. Hidalgo-Díaz*** Grupos de Fitopatología* y Plagas Agrícolas***, Dirección de Protección de Plantas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas,La Habana, Cuba. Correo electrónico: [email protected].**Nematode Interactions Unit, Rothamsted Research, Harpenden, Herts AL5 2JQ, UK. RESUMEN: La detección de producción de proteasas constituye un aspecto importante para la selección de algunos agentes de control biológico debido a la función que desempeñan estas enzimas en el proceso infeccioso. El objetivo del trabajo es la modificación de un método rápido para la detección de proteasas en medio sólido suplementado con gelatina, con el empleo de diferentes colorantes, midiendo el halo de degradación de la gelatina, el crecimiento del hongo y el indicador Actividad Proteasa (AP). De los colorantes empleados, el azul de tripano en concentración de 0.03% fue la alternativa más eficiente con una adecuada visualización del halo de degradación y con la menor afectación del crecimiento de la colonia del hongo estudiado. (Palabras clave: proteasas; medio sólido; Pochonia chlamydosporia) DETECTION OF PROTEASES PRODUCED BY Pochonia chlamydosporia IN SOLID MEDIUM ABSTRACT: The detection of protease production is an important aspect for selecting some biological control agents, because of the role these enzymes play in the infectious process. The aim of this work was to modify a method for detecting proteases in solid medium supplemented with gelatine, using different dyes and measuring the gelatine degradation halo, the colony growth and the protease activity (PA) indicator. Trypan blue at 0.03% was the most efficient alternative with a good visualization of the degradation halo and the least effect on the fungal colony growth. (Key words: proteases; solid medium; Pochonia chlamydosporia) En las fases iniciales del ciclo infeccioso de muchos agentes de control biológico (ACB), se encuentran involucrados procesos bioquímicos y la acción de diferentes enzimas hidrolíticas. Por ejemplo, para acceder a su fuente de alimentación en el interior del huevo del nematodo y de forma general por el modo de nutrición de los hongos, Pochonia chlamydosporia (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y Gams, precisa secretar enzimas extracelulares que le permitan degradar los sustratos complejos a formas más simples que puedan ser metabolizadas (4). Para ello, este hongo nematófago, debe ser capaz de romper, pri- meramente, las barreras naturales del hospedante, las cuales en ocasiones son extremadamente resistentes y solo pueden ser sobrepasadas por la acción de enzimas específicas que las degraden y posibiliten finalmente que el parasitismo tenga lugar. Una de las enzimas más estudiadas son las proteasas. La proteasa más importante identificada en hongos entomopatógenos y nematófagos pertenece a la familia de las subtilisinas de la proteinasa K. Proteasas similares a la Pr1 de Metharhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin fueron purificadas 187 y caracterizadas a partir de Arthrobotrys oligospora Fresenius Gams (14), P. chlamydosporia (11) y Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson (1). En algunos de estos casos, las proteasas han sido asociadas con la virulencia y se les ha dado el papel de factores de patogenicidad (2). Se ha demostrado que los aislamientos de P. chlamydosporia, difieren marcadamente en su crecimiento, esporulación in vitro, virulencia, competitividad saprofítica y competencia en la rizosfera (3, 6). Tales diferencias entre aislamientos de la misma especie son comunes. Por estas razones, el estudio de las enzimas extracelulares y otros metabolitos ha atraído la atención de numerosos autores (6, 7, 8, 12), debido a la posible utilización de estas enzimas en la selección de aislamientos promisorios, así como en ensayos de laboratorio para el control de la calidad del inóculo empleado en la producción masiva del ACB. Ambos fines promueven el procesamiento de gran número de aislamientos o de muestras, por lo que se requiere de ensayos sencillos, rápidos y baratos. La determinación de actividad proteasa es un método rápido pero más costoso, debido a la necesidad de sustratos sobre los cuales las proteasas deben actuar. Existe otro método más sencillo basado en la observación del halo de degradación de una proteína producido por la acción de las enzimas y su escreción al medio sólido donde esta se encuentra. Sin embargo, a menudo este halo es difícil de observar. El objetivo de este trabajo es la modificación del método de detección de proteasas en medio sólido, con la adición de diferentes colorantes, para lograr una mejor visualización del halo de degradación producido por la acción de estas enzimas. Para la observación del halo de degradación producido por la acción de las proteasas, se evaluaron diferentes colorantes con el objetivo de seleccionar finalmente el mejor para la visualización del halo, sin afectación del crecimiento de la colonia. Los colorantes evaluados fueron: Violeta Cristal, Naranja G, Safranina, Azo Black, Azul Tripano, Rojo Congo, Rojo Ruthenium, Colorante de alimentos, Colorante indicador de pH rango completo. El medio empleado en este experimento fue: Medio basal (constituído por: 0.03% NaCl; 0.03% MgSO4. 7 H2O; 0.03% K2HPO4; 0.02% de extracto de levadura (13) y suplementado con gelatina 0.2% (más 15g de agar/L). Los colorantes se prepararon en forma de soluciones madres acuosas, las cuales fueron esterilizadas por filtración a través de filtro millipores 0.2mm, antes de ser adicionadas a los medios, previamente esterilizados, quedando cada uno de ellos a una concentración de 0.03%. El mismo medio, sin colorantes fue empleado como control. Para la estandarización de la técnica se analizaron como cepas patrones, las cepas 280 y 400 de P. chlamydosoria, que habían demostrado previamente, cierta actividad proteasa, gentilmente donadas por la colección de Rothamsted Research Institute, Reino Unido. Las placas Petri de 9cm de diámetro, con cada uno de los medios sólidos, se inocularon con un disco de 5mm de diámetro tomados de la periferia de la colonia pura de P. chlamydosporia e incubadas a oscuridad a 28ºC. Se realizaron tres réplicas con tres repeticiones, para cada tratamiento. Las observaciones se realizaron a las 48 horas después de la inoculación y se evaluaron las posibilidades de observación del halo de degradación en el medio coloreado y el diámetro de la colonia (dc), así como el halo de degradación (dhg), para con ellos calcular el indicador AP (Actividad Proteasa) (9), donde: AP = dhg / dc. Todos los datos fueron comparados a través de un Análisis de Varianza Factorial y la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan, usando el programa SAS (SAS Institute 2001) (10), teniendo en cuenta las cepas como variable independiente y analizando los indicadores en el tiempo y en el medio específico. En los medios suplementados con gelatina se detectó la producción de proteasas por las dos cepas de Pochonia estudiadas, lo cual coincide con los resultados descritos por numerosos investigadores para este hongo nematófago (4, 5, 8, 12). En las Figuras 1 y 2 se pueden observar los resultados obtenidos para cada uno de los colorantes empleados en el medio suplementado con gelatina, en cuanto a crecimiento de la colonia y el halo producido por la acción de las proteasas liberadas al medio, en cada una de las cepas estudiadas. En algunos colorantes fue muy difícil observar el halo de degradación, por ejemplo el Rojo Ruthenium y la Safranina. Otros, produjeron cierta inhibición del crecimiento de la colonia, al ser comparados con el tratamiento control. En el caso del Violeta cristal, la inhibición fue total. Aún cuando para el colorante Azul tripano, se evidenciaron diferencias significativas para el parámetro de crecimiento de la colonia cuando se comparó con el control y los tratamientos suplementados con colorante de alimentos e indicador de pH, estos, en cambio, no mostraron de forma satisfactoria el halo de Rev. Protección Veg. Vol. 21 No. 3 (2006) 188 m m 70 b c 50 40 d c c b 20 7-Rojo Ruthenium 6- Rojo Congo* 5- Naranja G * 4- Azo black 3- Safranina 2- Azul Tripano D iámetro de colonia Diámetro de colonia 1- Violeta Cristal 0 d d 10 b 9-Indicador de pH * 30 a d b 8- Color. Alimento * c a b b 11- A/A + gelatina* 60 Tratam ientos D iámetro de halo FIGURA 1. Presencia del halo de degradación y crecimiento de la colonia en medio basal sólido suplementado con gelatina 0.2% y diferentes colorantes para la cepa 280 de P. chlamydosporia./ Presence of degradation halo and colony growth in solid medium supplemented with 0.2% gelatine and different dyes for P. chlamydosporia 280 strain. Medias con letras desiguales, difieren significativamente (p ≤ 0,05). * Halo difícil de observar. mm 70 60 a c b c 50 d 40 c 30 c c b d b 20 b d a b d 10 10- CONTROL 9-Indicador pH * 8- Colorante alim.* 7-Rojo Rutenium 6- Rojo Congo* 5- Naranja G * 4- Azo black 3- Safranina 2- Azul Tripano Diámetro de colonia Diámetro de colonia 1- Violeta Cristal 0 Tratamientos Diámetro de halo degradación producido por la acción de las proteasas. Por estas razones, el Azul tripano fue, de todos los colorantes estudiados el mejor en este parámetro. Los resultados obtenidos muestran además, que para las dos cepas analizadas, tanto al comparar el diámetro de las colonias como para la formación del halo de degradación de la gelatina, en los diferentes colorantes, se obtuvo una respuesta similar. Al analizar el Indicador AP (Fig. 3), se observa que los mejores resultados fueron los obtenidos para el colorante Rojo Congo con valores significativamente Rev. Protección Veg. Vol. 21 No. 3 (2006) FIGURA 2. Presencia del halo de degradación y crecimiento de la colonia en medio basal sólido suplementado con gelatina 0.2% y diferentes colorantes para la cepa 400 P. chlamydosporia./ Presence of degradation halo and colony growth in solid medium supplemented with 0.2% gelatine and different dyes for P. chlamydosporia 400 strain. Medias con letras desiguales, difieren significativamente (p ≤ 0,05). * Halo difícil de observar. superiores, incluso, a los del tratamiento control. Esto se debe a que en este caso el diámetro de la colonia fue uno de los menores y al calcular el valor de AP, se ve enmascarado el resultado real de la afectación del crecimiento de la colonia por el efecto del halo formado. El Azul de tripano no muestra diferencias significativas con respecto al colorante de alimentos y el indicador de pH y los valores alcanzados son significativamente superiores al control. Este resultado indica nuevamente, que este colorante puede ser empleado para la detección de este tipo de proteasas. Es necesario señalar que aunque el indicador AP ha 189 mm 2,5 aa bb 2 b cc b bb dd 1,5 cc 1 0,5 Cepa 280 Cepa 400 sido empleado para estos análisis por algunos autores (9), sus valores no deben tomarse de manera absoluta como se ha observado en este trabajo. El uso de aditivos para la detección de halos de degradación producidos por proteasas o quitinasas es de amplio uso. No obstante, en algunos de estos métodos se incorporan también otros aditivos con el objetivo de lograr una mejor visualización del halo. En el caso de las proteasas, Lopez-Llorca (comunicación personal, 2005), declara la adición de Azul de Coomasie. Sin embargo, este paso va incorporado al final de la evaluación, pues es un método destructivo. Esta alternativa tiene el inconveniente de que no permite desarrollar un estudio de dinámica para evaluar el comportamiento de la cepa que se analiza, factor importante para la selección y comparación entre cepas diferentes y para los estudios de estabilidad, donde no deben tomarse valores correspondientes a un solo momento, teniendo en cuenta que el inóculo debe adaptarse al medio donde ha sido transferido para el estudio, aún cuando este sea el mismo de donde proviene. 10- CONTROL 9-Indicador pH * 8- Colorante alim.* 7-Rojo Ruthenium 6- Rojo Congo* 5- Naranja G 5 * 4- Azo black 3- Safranina 2- Azul Tripano 1- Violeta Cristal 0 Tratamientos FIGURA 3. Indicador AP en medio basal sólido suplementado con gelatina al 0.2% y diferentes colorantes para las cepas 280 y 400 P. chlamydosporia./ PA indicator in solid medium supplemented with 0.2% gelatine and different dyes for P. chlamydosporia 280 and 400 strains. Medias con letras desiguales, difieren significativamente (p ≤ 0,05). * Halo difícil de observar. 2. Huang, X.; Zhao, N. y Zhang, K. (2004): Extracellular enzymes serving as virulence factors in nematophagous fungi involved in infection of the host. Research in Microbiology. 155: 811-816. 3. Kerry, B. (2003): Recent progress in biological control of nematodes using Pochonia chlamydosporia. Advances in Nematology: A one day conference at The Linnean Society of London, Piccadilly. 4. Lopez-Llorca, L.V.; Olivares-Bernabeau, C.; Salinas, J.; Jansson, H.B. y Kolattukudy, P.E. (2002): Prepenetration events in fungal parasitism of nematode eggs. Mycol. Res. 106:499-506. 5. Mendoza de Gives, P.; Behnke, J.M. y Davies, K.G. (2003): Extracellular enzyme production by nematophagous fungi in the presence and absence of nematodes. Internat. J. Nematol. 13(1):27-36. REFERENCIAS 6. Morton, C.O.; Hirsch, P.R y Kerry, B.R. 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(2003): Cloning of a genetic variation in protease VCP1 from the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia. Mycol. Res. 107(1):3846. 9. Park. J.O.; Hargreaves, J.R.; McConville, E.J.; Stirling, G.R.; Ghisalberti. E.L. y Sivasithamparam. K. (2004): Production of leucinostatins and nematicidal activity of Australian isolates of Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson. Letters in Applied Microbiology (38):271-276. 10.SAS. 2001.Institute Statistical Analysis software SAS. Version 8.02. Cary, NC, USA. 11.Segers, R.; Butt, T.M.; Carder, J.H.; Keen, J.N.; Kerry, B.R. y Feberdy, J.F. (1999): The subtilisins of fungal pathogens of insects, nematodes and plants: distribution and variation. Mycol. Res. 103 (4): 395-402. 12.Segers, R.; Butt, T. M.; Kerry, B. R. y Perberdy. J.F. (1994): The nematophagous fungus Verticillium chlamydosporium produces a Rev. Protección Veg. Vol. 21 No. 3 (2006) chymoelastase like protease which hydrolyses host nematode proteins in situ. 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