Detección de Proteasas en Pochonia chlamydosporia

Rev. Protección Veg. Vol. 21 No. 3 (2006): 186-190
Comunicación corta
DETECCIÓN DE PROTEASAS PRODUCIDAS POR Pochonia chlamydosporia
EN MEDIO SÓLIDO
Belkis Peteira *, Ivania Esteves** y L. Hidalgo-Díaz***
Grupos de Fitopatología* y Plagas Agrícolas***, Dirección de Protección de Plantas, Centro Nacional
de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas,La Habana, Cuba.
Correo electrónico: [email protected].**Nematode Interactions Unit, Rothamsted Research,
Harpenden, Herts AL5 2JQ, UK.
RESUMEN: La detección de producción de proteasas constituye un aspecto importante para la selección
de algunos agentes de control biológico debido a la función que desempeñan estas enzimas en el proceso
infeccioso. El objetivo del trabajo es la modificación de un método rápido para la detección de proteasas
en medio sólido suplementado con gelatina, con el empleo de diferentes colorantes, midiendo el halo de
degradación de la gelatina, el crecimiento del hongo y el indicador Actividad Proteasa (AP). De los
colorantes empleados, el azul de tripano en concentración de 0.03% fue la alternativa más eficiente con
una adecuada visualización del halo de degradación y con la menor afectación del crecimiento de la
colonia del hongo estudiado.
(Palabras clave: proteasas; medio sólido; Pochonia chlamydosporia)
DETECTION OF PROTEASES PRODUCED BY Pochonia chlamydosporia IN SOLID
MEDIUM
ABSTRACT: The detection of protease production is an important aspect for selecting some biological
control agents, because of the role these enzymes play in the infectious process. The aim of this work
was to modify a method for detecting proteases in solid medium supplemented with gelatine, using
different dyes and measuring the gelatine degradation halo, the colony growth and the protease activity
(PA) indicator. Trypan blue at 0.03% was the most efficient alternative with a good visualization of the
degradation halo and the least effect on the fungal colony growth.
(Key words: proteases; solid medium; Pochonia chlamydosporia)
En las fases iniciales del ciclo infeccioso de muchos agentes de control biológico (ACB), se encuentran involucrados procesos bioquímicos y la acción
de diferentes enzimas hidrolíticas. Por ejemplo, para
acceder a su fuente de alimentación en el interior del
huevo del nematodo y de forma general por el modo
de nutrición de los hongos, Pochonia chlamydosporia
(Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y Gams, precisa secretar enzimas extracelulares que le permitan
degradar los sustratos complejos a formas más simples que puedan ser metabolizadas (4). Para ello, este
hongo nematófago, debe ser capaz de romper, pri-
meramente, las barreras naturales del hospedante,
las cuales en ocasiones son extremadamente resistentes y solo pueden ser sobrepasadas por la acción
de enzimas específicas que las degraden y posibiliten finalmente que el parasitismo tenga lugar.
Una de las enzimas más estudiadas son las
proteasas. La proteasa más importante identificada
en hongos entomopatógenos y nematófagos pertenece a la familia de las subtilisinas de la proteinasa K.
Proteasas similares a la Pr1 de Metharhizium
anisopliae (Metschnikoff) Sorokin fueron purificadas
187
y caracterizadas a partir de Arthrobotrys oligospora
Fresenius Gams (14), P. chlamydosporia (11) y
Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson (1). En algunos de estos casos, las proteasas han sido asociadas con la virulencia y se les ha dado el papel de factores de patogenicidad (2).
Se ha demostrado que los aislamientos de P.
chlamydosporia, difieren marcadamente en su crecimiento, esporulación in vitro, virulencia, competitividad
saprofítica y competencia en la rizosfera (3, 6). Tales
diferencias entre aislamientos de la misma especie
son comunes.
Por estas razones, el estudio de las enzimas
extracelulares y otros metabolitos ha atraído la atención de numerosos autores (6, 7, 8, 12), debido a la
posible utilización de estas enzimas en la selección
de aislamientos promisorios, así como en ensayos
de laboratorio para el control de la calidad del inóculo
empleado en la producción masiva del ACB. Ambos
fines promueven el procesamiento de gran número
de aislamientos o de muestras, por lo que se requiere
de ensayos sencillos, rápidos y baratos. La determinación de actividad proteasa es un método rápido pero
más costoso, debido a la necesidad de sustratos sobre los cuales las proteasas deben actuar. Existe otro
método más sencillo basado en la observación del
halo de degradación de una proteína producido por la
acción de las enzimas y su escreción al medio sólido
donde esta se encuentra. Sin embargo, a menudo este
halo es difícil de observar. El objetivo de este trabajo
es la modificación del método de detección de
proteasas en medio sólido, con la adición de diferentes colorantes, para lograr una mejor visualización del
halo de degradación producido por la acción de estas
enzimas.
Para la observación del halo de degradación producido por la acción de las proteasas, se evaluaron
diferentes colorantes con el objetivo de seleccionar
finalmente el mejor para la visualización del halo, sin
afectación del crecimiento de la colonia. Los colorantes evaluados fueron: Violeta Cristal, Naranja G,
Safranina, Azo Black, Azul Tripano, Rojo Congo, Rojo
Ruthenium, Colorante de alimentos, Colorante indicador de pH rango completo.
El medio empleado en este experimento fue: Medio basal (constituído por: 0.03% NaCl; 0.03% MgSO4.
7 H2O; 0.03% K2HPO4; 0.02% de extracto de levadura (13) y suplementado con gelatina 0.2% (más 15g
de agar/L). Los colorantes se prepararon en forma de
soluciones madres acuosas, las cuales fueron esterilizadas por filtración a través de filtro millipores 0.2mm,
antes de ser adicionadas a los medios, previamente
esterilizados, quedando cada uno de ellos a una concentración de 0.03%. El mismo medio, sin colorantes
fue empleado como control.
Para la estandarización de la técnica se analizaron como cepas patrones, las cepas 280 y 400 de P.
chlamydosoria, que habían demostrado previamente, cierta actividad proteasa, gentilmente donadas por
la colección de Rothamsted Research Institute, Reino Unido.
Las placas Petri de 9cm de diámetro, con cada
uno de los medios sólidos, se inocularon con un disco de 5mm de diámetro tomados de la periferia de la
colonia pura de P. chlamydosporia e incubadas a oscuridad a 28ºC. Se realizaron tres réplicas con tres
repeticiones, para cada tratamiento.
Las observaciones se realizaron a las 48 horas después de la inoculación y se evaluaron las posibilidades
de observación del halo de degradación en el medio
coloreado y el diámetro de la colonia (dc), así como el
halo de degradación (dhg), para con ellos calcular el
indicador AP (Actividad Proteasa) (9), donde:
AP = dhg / dc.
Todos los datos fueron comparados a través de
un Análisis de Varianza Factorial y la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan, usando el programa SAS
(SAS Institute 2001) (10), teniendo en cuenta las cepas como variable independiente y analizando los
indicadores en el tiempo y en el medio específico.
En los medios suplementados con gelatina se detectó la producción de proteasas por las dos cepas
de Pochonia estudiadas, lo cual coincide con los resultados descritos por numerosos investigadores para
este hongo nematófago (4, 5, 8, 12).
En las Figuras 1 y 2 se pueden observar los resultados obtenidos para cada uno de los colorantes empleados en el medio suplementado con gelatina, en
cuanto a crecimiento de la colonia y el halo producido
por la acción de las proteasas liberadas al medio, en
cada una de las cepas estudiadas. En algunos colorantes fue muy difícil observar el halo de degradación,
por ejemplo el Rojo Ruthenium y la Safranina. Otros,
produjeron cierta inhibición del crecimiento de la colonia, al ser comparados con el tratamiento control. En el
caso del Violeta cristal, la inhibición fue total.
Aún cuando para el colorante Azul tripano, se evidenciaron diferencias significativas para el parámetro
de crecimiento de la colonia cuando se comparó con
el control y los tratamientos suplementados con colorante de alimentos e indicador de pH, estos, en cambio, no mostraron de forma satisfactoria el halo de
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188
m m 70
b
c
50
40
d
c
c
b
20
7-Rojo Ruthenium
6- Rojo Congo*
5- Naranja G *
4- Azo black
3- Safranina
2- Azul Tripano
D iámetro de colonia
Diámetro de colonia
1- Violeta Cristal
0
d
d
10
b
9-Indicador de pH *
30
a
d
b
8- Color. Alimento *
c
a
b
b
11- A/A + gelatina*
60
Tratam ientos
D iámetro de halo
FIGURA 1. Presencia del halo de degradación y crecimiento de la colonia en medio basal sólido suplementado con gelatina 0.2% y diferentes
colorantes para la cepa 280 de P.
chlamydosporia./ Presence of
degradation halo and colony growth
in solid medium supplemented with
0.2% gelatine and different dyes for
P. chlamydosporia 280 strain.
Medias con letras desiguales, difieren significativamente (p ≤ 0,05).
* Halo difícil de observar.
mm
70
60
a
c
b
c
50
d
40
c
30
c c
b
d
b
20
b
d
a
b
d
10
10- CONTROL
9-Indicador pH *
8- Colorante alim.*
7-Rojo Rutenium
6- Rojo Congo*
5- Naranja G *
4- Azo black
3- Safranina
2- Azul Tripano
Diámetro de colonia
Diámetro de
colonia
1- Violeta Cristal
0
Tratamientos
Diámetro de halo
degradación producido por la acción de las proteasas.
Por estas razones, el Azul tripano fue, de todos los
colorantes estudiados el mejor en este parámetro.
Los resultados obtenidos muestran además, que
para las dos cepas analizadas, tanto al comparar el
diámetro de las colonias como para la formación del
halo de degradación de la gelatina, en los diferentes
colorantes, se obtuvo una respuesta similar.
Al analizar el Indicador AP (Fig. 3), se observa que
los mejores resultados fueron los obtenidos para el
colorante Rojo Congo con valores significativamente
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FIGURA 2. Presencia del halo de degradación y crecimiento de la colonia en
medio basal sólido suplementado con
gelatina 0.2% y diferentes colorantes
para la cepa 400 P. chlamydosporia./
Presence of degradation halo and
colony growth in solid medium
supplemented with 0.2% gelatine and
different dyes for P. chlamydosporia 400
strain.
Medias con letras desiguales, difieren
significativamente (p ≤ 0,05).
* Halo difícil de observar.
superiores, incluso, a los del tratamiento control. Esto
se debe a que en este caso el diámetro de la colonia
fue uno de los menores y al calcular el valor de AP, se
ve enmascarado el resultado real de la afectación del
crecimiento de la colonia por el efecto del halo formado. El Azul de tripano no muestra diferencias significativas con respecto al colorante de alimentos y el
indicador de pH y los valores alcanzados son
significativamente superiores al control. Este resultado indica nuevamente, que este colorante puede ser
empleado para la detección de este tipo de proteasas.
Es necesario señalar que aunque el indicador AP ha
189
mm
2,5
aa
bb
2
b
cc
b
bb
dd
1,5
cc
1
0,5
Cepa 280
Cepa 400
sido empleado para estos análisis por algunos autores (9), sus valores no deben tomarse de manera
absoluta como se ha observado en este trabajo.
El uso de aditivos para la detección de halos de
degradación producidos por proteasas o quitinasas
es de amplio uso. No obstante, en algunos de estos
métodos se incorporan también otros aditivos con el
objetivo de lograr una mejor visualización del halo. En
el caso de las proteasas, Lopez-Llorca (comunicación
personal, 2005), declara la adición de Azul de
Coomasie. Sin embargo, este paso va incorporado al
final de la evaluación, pues es un método destructivo.
Esta alternativa tiene el inconveniente de que no permite desarrollar un estudio de dinámica para evaluar el
comportamiento de la cepa que se analiza, factor importante para la selección y comparación entre cepas
diferentes y para los estudios de estabilidad, donde no
deben tomarse valores correspondientes a un solo
momento, teniendo en cuenta que el inóculo debe adaptarse al medio donde ha sido transferido para el estudio, aún cuando este sea el mismo de donde proviene.
10- CONTROL
9-Indicador pH *
8- Colorante alim.*
7-Rojo Ruthenium
6- Rojo Congo*
5- Naranja G 5 *
4- Azo black
3- Safranina
2- Azul Tripano
1- Violeta Cristal
0
Tratamientos
FIGURA 3. Indicador AP en medio
basal sólido suplementado con gelatina al 0.2% y diferentes colorantes
para las cepas 280 y 400 P.
chlamydosporia./ PA indicator in
solid medium supplemented with
0.2% gelatine and different dyes for
P. chlamydosporia 280 and 400
strains.
Medias con letras desiguales, difieren
significativamente (p ≤ 0,05).
* Halo difícil de observar.
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El Azul de tripano como se ha demostrado tiene
bajo efecto sobre el crecimiento de la colonia, lo cual
hace más factible el método descrito en este trabajo.
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