Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Bioquímica Clínica Práctica: GGT y ALP Presentan: Hernández Rosas Iván Arturo 9QM1 Profesor encargado: Carreño Duran Luis Ramón CDMX Sección: 1 Noviembre 2022 PRÁCTICA No. 1 GGT y ALP INTRODUCCIÓN Las fosfatasas alcalinas son un grupo de isoenzimas, ubicadas en la capa externa de la membrana celular que catalizan la hidrólisis de ésteres de fosfatos orgánicos presentes en el espacio extracelular. Aunque las fosfatasas alcalinas están presentes en diferentes tejidos corporales y tienen diferentes propiedades fisicoquímicas, son verdaderas isoenzimas porque catalizan la misma reacción. En el hígado, la fosfatasa alcalina es citosólica y está presente en la membrana canalicular del hepatocito. Asimismo, está presente en concentraciones decrecientes en la placenta, la mucosa del íleon, los riñones, los huesos y el hígado. La mayor parte de la fosfatasa alcalina en el suero (más del 80 %) se libera del hígado y los huesos, y en pequeñas cantidades del intestino. Los niveles de fosfatasa alcalina sérica variarán con la edad en individuos normales. Los niveles son altos durante la niñez y la pubertad debido al crecimiento y desarrollo óseo, posteriormente disminuyen en el grupo de edad de 15 a 50 años, donde es ligeramente mayor en los hombres que en las mujeres y finalmente vuelven a subir en la vejez. Por otra parte, los niveles de fosfatasa alcalina sérica pueden permanecer elevados hasta 1 semana después de la resolución de la obstrucción biliar, siendo el hígado la fuente en la mayoría de los pacientes con niveles elevados de enzimas, seguido del aumento de la actividad de los osteoblastos que se observa en los trastornos del hueso o normalmente durante los períodos de crecimiento. Cabe mencionar que la afluencia de fosfatasa alcalina placentaria a fines del tercer trimestre contribuye al aumento de mujeres embarazadas. La glicoproteína gamma-glutamiltransferasa (GGT) se encuentra en las membranas de las células con alta actividad secretora o de absorción. Su función principal es catalizar la transferencia de un grupo gammaglutamil de péptidos a otros aminoácidos. También es abundante en muchas otras fuentes del cuerpo (riñón, páncreas, intestino, próstata, testículos, bazo, corazón y cerebro), pero es más específico para la enfermedad biliar en comparación con la fosfatasa alcalina porque no está presente en el hueso. El nivel de actividad de la GGT en los niños puede ser un índice fiable de daño en las vías biliares. Es un indicador útil para separar las dos formas de colestasis idiopática, con o sin afectación de las vías biliares. En los bebés diagnosticados con atresia biliar y tratados quirúrgicamente, los niveles de GGT permanecen altos en la sangre si el bebé es amamantado. Esto se debe al alto nivel de GGT en la leche materna humana durante al menos cuatro semanas después del parto. La colestasis se define como la disminución o la ausencia del flujo normal de la bilis desde el hígado hasta el duodeno. Puede dividirse en intra- y extrahepática, según donde se encuentre el trastorno. En las colestasis intrahepáticas existe dificultad en el flujo biliar en el hígado, mientras que en la extrahepática existe una obstrucción mecánica a nivel del colédoco. OBJETIVOS • • Determinar la actividad de la GGT en una muestra problema por un método de monitoreo continuo Cuantificar la fosfatasa alcalina presente en la muestra problema FUNDAMENTO La GGT cataliza la transferencia del grupo glutamil de la γ-glutamil-3-carboxi-p-nitroanilida a la glicilglicina, formando la γ-glutamilglicilglicina y p-nitroanilina. La cantidad formada de p-nitroanilina, que presenta una elevada absorbancia a 405 nm, es directamente proporcional a la actividad de la GGT. Figura 1. Fundamento de la determinación de GGT por el método de monitoreo continuo La fosfatasa alcalina (ALP) cataliza la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato a pH 10,4 liberando p-nitrofenol y fosfato inorgánico. La cantidad formada de p-nitrofenol, que presenta una elevada absorbancia a 405 nm, es directamente proporcional con la actividad de la ALP. Figura 2. Fundamento de la determinación de fosfatasa alcalina por el método de Bessey, Lowry y Brock RESULTADOS Tabla 1. Resultados de la determinación de la actividad de la ALT y GGT en UI/L ALP Equipo Karina e Iván Carlota y Diego Mariana y Paola Israel y Luna Valores esperados Rojo (UI/L) 196 GGT Azul (UI/L) 127 218 190 116 104 205 110 Rojo (UI/L) Azul (UI/L) 65 20 60 20 Tabla 2. Cálculos desarrollados para la determinación de ALP por el equipo de Karina e Iván ALP Rojo Azul ΔAbsorbancias ΔAbsorbancias Karina e Iván A405 nm A1 0.612 A2 0.684 0.072 0.596 0.049 A3 0.754 0.070 0.640 0.044 A4 0.825 0.071 0.685 0.045 Promedio 0.071 Promedio 0.046 Resultado (UI/L) 196 Resultado (UI/L) 127 Resultados esperados (UI/L) 205 Resultados esperados (UI/L) 110 Porcentaje de veracidad (%) 4.3 Porcentaje de veracidad (%) 15.4 A405 nm 0.547 Cálculos ALP (rojo) 1) ΔAbsorbancia ΔAbs4-ΔAbs3= 0.825-0.754= 0.071 ΔAbs3-ΔAbs2= 0.754-0.684= 0.070 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 0.071 + 0.070 + 0.072 = 0.071 3 ΔAbs2-ΔAbs1= 0.684-0.612= 0.072 2) Concentración de ALP Azul--[ALP]= 0.046*2760=127 UI/L Factor para ALP= 2760 Rojo--[ALP]= 0.071*2760=196 UI/L 3) Porcentaje de error – Ejemplo para Azul %𝑉 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑥100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 %𝑉 = 127 − 110 𝑥100 = 15.4% 110 Tabla 3. Cálculos desarrollados para la determinación de GGT por el equipo de Diego y Carlota GGT (Carlota y Diego) Rojo A405nm Azul ΔA A405nm ΔA A1 1.549 1.303 A2 1.605 0.056 1.321 0.018 A3 1.662 0.057 1.338 0.017 A4 1.719 0.057 1.355 0.017 Promedio 0.0566 Promedio 0.0173 Resultado (UI/L) 65 Resultado (UI/L) 20 Resultados esperados (UI/L) 60 Resultados esperados (UI/L) 20 Porcentaje de veracidad (%) 8.3 Porcentaje de veracidad (%) 0 Cálculos GGT (rojo) 1) ΔAbsorbancia ΔAbs4-ΔAbs3= 1.719-1.662= 0.057 ΔAbs3-ΔAbs2= 1.662-1.605= 0.057 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 0.057+0.057+0056 3 = 0.0566 ΔAbs2-ΔAbs1= 1.605 -1.549 = 0.056 2) Concentración de ALP Rojo--[ [GGT]=0.0566*1158=65 UI/L Factor para GGT= 1158 Azul--[ [GGT]=0.0173*1158=20 UI/L 3) Porcentaje de error – Ejemplo para Azul %𝑉 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑥100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 %𝑉 = 65 − 60 𝑥100 = 15.4% 60 Tabla 4. Cálculos desarrollados para la determinación de ALP por el equipo de Mariana y Paola ALP (Mariana y Paola ) Rojo A405nm Azul ΔA A405nm ΔA A1 0.281 0.372 A2 0.361 0.080 0.414 0.040 A3 0.439 0.078 0.457 0.042 Promedio 0.079 Promedio 0.042 Resultado (UI/L) 218 Resultado (UI/L) 116 Resultados esperados (UI/L) 205 Resultados esperados (UI/L) 110 Porcentaje de veracidad (%) 6.34 Porcentaje de veracidad (%) 5.45 Cálculos ALP (rojo) 1) ΔAbsorbancia ΔAbs3-ΔAbs2= 0.457-0.414= 0.042 ΔAbs2-ΔAbs1= 0.414-0.372= 0.040 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 0.042 + 0.040 = 0.042 2 2) Concentración de ALP Azul--[ALP]=0.042*2760=116 UI/L Factor para ALP= 2760 Rojo--[ALP]=0.079*2760=218 UI/L 3) Porcentaje de error – Ejemplo para Azul %𝑉 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑥100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 116 − 110 𝑥100 = 5.45 % 110 %𝑉 = Tabla 4. Cálculos desarrollados para la determinación de ALP por el equipo de Israel ALP (Israel y Luna) Rojo A405nm Azul ΔA A405nm ΔA A1 0.400 0.140 A2 0.469 0.069 0.178 0.037 A3 0.538 0.069 0.215 0.038 Promedio 0.069 Promedio 0.0375 Resultado (UI/L) 190 Resultado (UI/L) 104 Resultados esperados (UI/L) 205 Resultados esperados (UI/L) 110 Porcentaje de veracidad (%) 7.31 Porcentaje de veracidad (%) 5.45 Cálculos ALP (rojo) 1) ΔAbsorbancia ΔAbs3-ΔAbs2= 0.538-0.469= 0.069 ΔAbs2-ΔAbs1= 0.469-0.400= 0.069 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 0.069 + 0 − 0.069 = 0.069 2 2) Concentración de ALP Rojo--[ALP]=0.069*2760=190 UI/L Factor para ALP= 2760 Azul--[ALP]=0.0375*2760=104 UI/L 3) Porcentaje de error – Ejemplo para Azul %𝑉 = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑥100 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙 %𝑉 = 104 − 110 𝑥100 = 5.45 % 110 PREGUNTA EXTRA Fundamento de la 5′NT, valores de referencia e interferencias La 5'NT también se encuentra en el intestino, el cerebro, el corazón, los vasos sanguíneos y el páncreas endocrino. Los niveles séricos de 5'NT no se ven afectados por el sexo o la raza, pero la edad sí afecta el nivel; los valores son más bajos en los niños y aumentan gradualmente, alcanzando una meseta aproximadamente a la edad de 50 años. Al igual que con la GGT, la función principal del nivel sérico de 5′NT es identificar el origen orgánico de una elevación aislada de la fosfatasa alcalina sérica. El nivel de 5′NT no aumenta en la enfermedad ósea sino principalmente en la enfermedad hepatobiliar. Valores de referencia: 2-17 UI/L DISCUSIÓN De acuerdo con McIntyre et al (1999), el término colestasis proviene de las palabras griegas chole, que significa bilis, y stasis, que traduce quieto. Esta definición involucra el síndrome generado por la alteración en la síntesis, la secreción o el flujo de la bilis, a través del tracto biliar. Se manifiesta a partir de la elevación de forma inicial de los niveles de la fosfatasa alcalina sérica y la gammaglutamil transferasa , así como con la presencia de prurito generalizado sin lesiones en la piel y fatiga. Aunque la ictericia es un signo importante en la colestasis, puede estar ausente, particularmente en adultos con enfermedades crónicas colestásicas que pueden ser asintomáticos. La colestasis intrahepática es aquella que resulta de alteraciones a nivel hepatocelular, en los canalículos biliares o en los pequeños conductillos microscópicos (colestasis hepatocelular y colangiocelular), mientras que la colestasis extrahepática es la originada por alteraciones de los conductos biliares macroscópicos. Heathcote (2007) destaca que en algunas etiologías específicas existe solapamiento con colestasis intra y extrahepática, como es el caso de la Colangitis Esclerosante Primaria o la Colangiopatía Isquémica. Heathcote (2007) menciona que el examen más sensible para la identificación de la colestasis es la medición de ácidos biliares séricos. Sin embargo, este estudio no está disponible con frecuencia. Por tanto, es necesario acudir a los marcadores bioquímicos de colestasis crónica, que son la ALP y la gamma-glutamil transferasa. Como se mencionó en la introducción, la fosfatasa puede elevarse por causas fisiológicas asociadas a un ascenso de dicha enzima. Esta elevación ocurre en los 3 primeros meses de vida y la pubertad, y se incrementa de forma gradual entre los 40 y 65 años, especialmente en mujeres y durante el embarazo. Mientras tanto, los adolescentes hombres pueden alcanzar entre 2 y 5 veces el valor normal de los adultos, lo que se correlaciona con el crecimiento óseo, de ahí que los valores de referencia para esta enzima sean tan amplios. Asimismo se ha observado que los afroamericanos, tienen entre un 10 y un 15 % más de niveles séricos de ALP, así como los fumadores, que pueden alcanzar hasta un 10 % más, en comparación con las personas no fumadoras (Siddique, 2012). Por otra parte, las causas patológicas que generan un incremento de la ALP varían desde enfermedades óseas como fracturas, enfermedad de Paget, osteomalacia, deficiencia de vitamina D, falla cardíaca o renal, hipertiroidismo e hiperparatiroidismo, hasta neoplasias hematológicas como leucemia y linfoma, o de células renales. Por lo que ante la presencia de una ALP elevada, se debe considerar si este incremento tiene una fuente intrahepática o extrahepática (principalmente en los huesos, el intestino, los leucocitos y la placenta). De manera, que la determinación de gamma-glutamil transferasa o una medición de las isoenzimas de ALP que considere un origen óseo son requeridas. Lee et al (2007) remarca que la gamma-glutamil transferasa presenta una baja especificidad para enfermedades colestásicas, dado que puede elevarse hasta en un 50 % de los pacientes alcohólicos sin evidencia de enfermedad hepática. Esto también puede ocurrir en otras etiologías entre las que se incluyen enfermedades pancreáticas, infarto de miocardio, falla renal y enfisema, y en pacientes que consumen medicamentos como la fenitoína y los barbitúricos. En consecuencia, este no es un examen que deba ser usado para la tamización de enfermedades hepáticas subyacentes, en ausencia de anormalidad en las otras pruebas hepáticas. Referente a la gamma-glutamiltransferasa (GGT), esta es abundante en muchas fuentes del cuerpo como riñón, páncreas, intestino, próstata, testículos, bazo, corazón y cerebro, recalcando que al no encontrarse presente en hueso, es un marcador más específico para la enfermedad biliar en comparación con la fosfatasa alcalina. Whitfield et al (2001) define la GGT como una herramienta que permite identificar el origen orgánico de una elevación aislada de la fosfatasa alcalina sérica. Aunque es importante aclarar que la GGT también presenta sus propias desventajas, ya que existe una relación entre la actividad de esta enzima y el peso, siendo los valores un 50% superiores en individuos con un IMC >30, además de aumentar aisladamente en casos de lesión por alcohol o drogas. Por lo anterior, se pueden determinar los niveles séricos de 5'NT, la cual a pesar de no realizarse de manera rutinaria, no se ve afectada por el sexo o la raza, aunque si por la edad. Con respecto a los resultados obtenidos, los datos del paciente A correspondían a un hombre de 37 años que presentaba una ligera ictericia, indicando una posible afección hepatica mientras que el paciente R se trataba de una mujer de 23 años con una ictericia marcada y acolia, una clara sintomatología relacionada a afección hepática. Estos datos se pudieron comprobar desde la observación de la muestra, puesto que la ictericia marcada se reflejo de manera bastante notable en el color amarillo intenso de la muestra R. Como se puede observar en la tabla 2, el resultado de ALP para la muestra roja, correspondiente a 196 UI/L en el equipo de Karina e Iván fue cercano al valor esperado de 205 UI/L, presentándose un porcentaje de veracidad del 4.3%. Sin embargo, el problema recae sobre la muestra azul, donde del valor esperado de 110 UI/L, se presenta un resultado de 127 UI/L, representando un 15.4% de veracidad, que se considera bastante alto tomando en cuenta que el porcentaje máximo permitido para la determinación de actividad enzimática es del 17%. De manera que comparando con los resultados emitidos por los otros equipos, este es el que presenta el mayor porcentaje de veracidad, por lo que es necesario implementar una mejor técnica de pipeteo para reducir el error aleatorio. Por el contrario, el equipo de Diego y Carlota, que llevo a cabo la determinación de la actividad de GGT, es el que presenta los porcentajes de veracidad más bajos, ya que en la muestra rojo se presenta un valor del 8.3%, mientras que para azul esta fue de 0%, es decir que su resultado fue el mismo que el valor esperado. Lo anterior puede deberse principalmente a una buena técnica de pipeteo, disminuyendo ese error aleatorio. Finalmente los equipos de Israel-Luna y Mariana-Paola presentan una situación similar, donde los primeros mantienen un porcentaje de veracidad del 7.31% para rojo y 5.45% para azul, mientras los segundos presentan porcentajes de 6.34% y 5.45% respectivamente. Por lo que a pesar de mantener un considerable porcentaje de error, no es tan alto como en el equipo Karina e Iván. De manera general, todos los resultados emitidos representan correctamente la situación de los pacientes previamente descritos, ya que tomando en cuenta los valores de referencia de ALP para mujeres adultas a 25°C que van de 40-190 UI/L, así como de GGT a 25°C para mujeres, que corresponden a <15 UI/L, se observa una elevación de ambos parámetros en la muestra R, donde la GGT se encuentra hasta 4 veces más alta con respecto a los valores de referencia, mientras la ALP sobrepasa ese intervalo de referencia aunque no al grado de la GGT. En caso de solo estar alta ALP podría sospecharse de otras causas como enfermedades óseas, sin embargo ante la evidente elevación de GGT, nos orienta hacia una posible colestasis, que explicaría la ictericia marcada, aunque claro está que para tener el panorama completo y descartar otras causas debe realizarse el perfil hepático completo. Con respecto al paciente A, considerando los valores de referencia de ALP para hombres adultos a 25°C cuyo intervalo es de 50-190 UI/L, así como los valores de GGT para hombres a 25°C que corresponden a <22 UI/L, se puede observar que los resultados de ambos marcadores se encuentran dentro de los valores de referencia, por lo que no es indicativo de una colestasis y se tendrían que analizar el resto de los parámetros del perfil hepático para encontrar la causa de esa ligera ictericia. Cabe aclarar que en ambos casos, previo al análisis deben tomarse en cuenta los hábitos del paciente como lo son el alcohol, tabaco y drogas, además del IMC, raza, consumo de algún fármaco y en el caso de la mujer, el embarazo, con el fin de emitir un resultado adecuado y diferenciar las pruebas brindarían un diagnóstico certero de las que emitirían valores anormales por alguna situación personal o fisiológica del paciente. CONCLUSIONES ❖ A pesar de la información que brinda la determinación de ALP Y GGT, de ser posible debería incluirse la 5'NT para un diagnóstico más certero ❖ Aún indicando una posible colestasis es necesario realizar el perfil hepático completo para determinar la causa de la patología ❖ Para la obtención de resultados con mayor sensibilidad debe llevarse a cabo la medición de ácidos biliares séricos BIBLIOGRAFÍA • 10. Siddique A, Kowdley KV. Approach to a patient with elevated serum alkaline phosphatase. Clinical Liver Diseases. 2012;16(2):199-229. https://doi.org/10.1016/j.cld.2012.03.012 • • • • Heathcote EJ. (2007). Diagnosis and management of cholestatic liver disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology; 5: 776-782. Lee DH, Silventoinen K, Hu G, Jacobs DR, Jousilahti P, Sundvall J, et al. (2006). Serum gamma-glutamyltransferase predicts non-fatal myocardial infarction and fatal coronary heart disease among 28,838 middle-aged men and women. European Heart Journal McIntyre N. Cholestasis, Benhamou JP, McIntyre N, Rizzeto M, Rodés J. (1999). Oxford Textbook of Clinical Hepatology. Oxford: Oxford Medical Publications Whitfield JB.(2001). Gamma glutamil transferasa. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 38 (4):263-355.
