Protocolo para la determinación de carbohidratos totales (Dubois et al., 1956) UTILIZAR SIEMPRE MATERIAL DE CRISTAL PORQUE SE VA A USAR H2SO4 A 100ºC Y CUBETRAS DE CUARZO Mediante este ensayo se cuantifican las hexosas, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y derivados metilados que tienen un grupo reductor libre o potencialmente libre. El método no mide glucosamina y galactosamina, pero incluye pentosas y metil-pentosas (Kochert, 1978). Antes de proceder a la determinación de los carbohidratos, es importante que todo el material a utilizar esté lavado con ácido clorhídrico al 10%, enjuagado con suficiente agua destilada y secado en estufa. Posteriormente proceder con el siguiente protocolo: a.- Pesar 5mg de biomasa liofilizada y colocarla en un tubo de ensayo con tapón de rosca, añadirle 5 ml de H2SO4 1M (5.6 ml de H2SO4 concentrado (96%) + 94.4 ml agua destilada (el ácido, poco a poco dejándolo resbalar por las paredes del recipiente, sobre el agua) =100 ml se cierran los tubos de ensayo (Hasta que no estén todos los tubos con ácido no se continua)→ Vortex → baño de María o estufa a 100ºC durante 1 hora → sacar y dejar enfriar un poco → vortex (así se rompen las estructuras) b.- Retirar los tubos el baño y dejarlos en reposo hasta que alcancen la temperatura ambiente c.- Centrifugar a temperatura ambiente a 4000 rpm durante 15 minutos (poner algodón en el fondo de los compartimentos del rotor antes de meter los tubos para que no se rompan d.- Separa el extracto ácido con una pipeta Pasteur de vidrio limpia, teniendo cuidado de no Re suspender la pastilla celular adherida al fondo del tubo. Medir el volumen total y pasarlo a un tubo limpio. Desechar el pellet e.- Montar el blanco y hacer las mismas operaciones que con las muestras f.- Poner 1 ml del extracto ácido con una punta de 1ml de plástico (si da un color muy oscuro hay que diluir y por tanto cogeremos 500 µl de H2SO4 1M y añadirle 500 µl del extracto ácido. En este caso el factor de dilución (Fd) =2). g.- Agregar 1 ml de fenol al 5% y mezclar NOTA: Está en la nevera es un compuesto que tenemos líquido en saturación, por tanto para prepararlo al 5% tomo 5 ml de fenol y añado 95 ml de agua destilada h.- Seguidamente se prepara el blanco tomando 1 ml de H2SO4 1M + 1 ml fenol al 5% i.- Dejar reposar 40 minutos j.- Agregar lentamente 5 ml de H2SO4 concentrado (96%) (Elias et al., 1992) tanto a las muestras como al blanco. NOTA: realizar esta operación en una campana de extracción. El tubo debe estar inclinado al agregar el ácido concentrado y añadirlo lentamente y con cuidado. Cerrar el tubo y voltear con cuidado para que se mezcle todo bien. k.- Enfriar a temperatura ambiente (tardará unos 20 min aproximadamente). 1 l.- leer a 485 nm, calibrando el espectrofotómetro con el blanco que se ha preparado. USAR CUBERTA DE CUARZO Curva de calibración La curva de calibración se obtiene usando un gradiente de concentración de glucosa anhidra a partir de una solución de 120 µg/mL. Todas las diluciones se preparan por triplicado y, una vez que se tienen las diferentes concentraciones de glucosa, se hace la curva de calibración usando los reactivos y siguiendo los pasos indicados anteriormente. Para los patrones pongo: 1 ml de la solución patrón (a las diferentes concentraciones) + 5 ml H2SO4 concentrado+ 1 ml fenol 5% TUBO Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SOL. GLUCOSA (120 µG/Ml) (µl) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 H2O DESTILADA (µl) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA (µG/mL) 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 ABSORBANCIA 485 nm 0 0.160 0.245 0.322 0.466 0.579 0.671 0.739 0.848 1.000 1.231 Los datos anteriores se grafican y se ajustan por mínimos cuadrados a una ecuación de segundo grado, obteniendo la R2, el valor de la pendiente (m) y usando la ordenada en el origen igual a cero. El valor de R2 debe ser superior a 0.98. Si se obtiene un valor inferior se repite la recta de calibrado con una serie nueva de diluciones y si el resultado es similar se recomienda preparar soluciones nuevas. Dado que en el momento de realizar la cuantificación de carbohidratos en las muestras de hongos solo conocemos el valor de la absorbancia, los datos a 485 nm obtenidos en la curva de calibración, se utilizarán como variable independiente y como variable dependiente la concentración de glucosa (Fig. 1). A partir de la ecuación del ajuste realizado en la recta de calibración, la concentración de carbohidratos en las muestras se calculará de este modo Carbohidratos en la muestra= m. Ab 485 nm 2 [Glucosa] µg/mL Recta calibración carbobidratosy = 105,3x + 0,065 R² = 0,9862 140 120 100 80 60 40 20 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Absorbancia 485 nm Ecuaciones para determinar el porcentaje de carbohidratos (CHO) en una muestra Los cálculos para obtener el contenido total absoluto (µg/mL) o relativo (% de peso seco) se realizan considerando los datos de peso de la muestra liofilizada puesta para obtener el volumen total de extracto ácido, el volumen de extracto ácido para la cuantificación de los carbohidratos y la ecuación de la recta de calibración. A continuación se da un ejemplo de estos cálculos usando datos reales obtenidos por López Hernández (2003) a partir de un cultivo del dinoflagenado Prorocentrum lima cultivado en laboratorio en medio F2 (Guillard Ryther, 1962). El dato que se usa a continuación como ejemplo corresponde a la fase de aceleramiento que ocurrió a los 24 días de cultivo. La biomasa se cosechó por centrifugación a 3000 rpm/10 min. Y se liofilizó. Del total de la biomasa liofilizada se pesaron 5 mg que se utilizaron para la extracción y cuantificación de carbohidratos de acuerdo al protocolo mencionado anteriormente. Datos importantes para el cálculo: a.- Peso seco (biomasa liofilizada) (Ps)= 5 mg b.- Volumen de extracto ácido (VE)= 5 ml c.- Volumen de muestra (Vm) = 100 µL (0.1 ml) d.- “m” = 108.85 e.- A 485 nm = 0.195 La ecuación para a cuantificación de carbohidratos es la siguiente Carbohidratos = 108.85 * 0.195= 21.22575 µg/mL Carbohidratos = (21.22575 µg/mL/0.1 mL)*5 mL= 1061.2875 µg Carbohidratos =1061.2875 µg /1000 =1.0612875 mg Carbohidratos = 1.0612875 mg / 5 mg (de Ps de biomasa puesta en la muestra) = 0.2122575 % Carbohidratos = 0.2122575 * 100 =21.22575 % 3 Aparatos: Baño de María Centrífuga (con algodón en el fondo de los tubos) Campana extractor Espectrofotómetro Vortex Reactivos: H2SO4 1M Fenol 5% H2SO4 concentrado (96%) Glucosa Material: Tubos de cristal con rosca Cubetas de cuarzo Piètas Pasteur de vidrio Puntas de pipeta 1, 5 ml Pipetas 1, 5 ml 4
