Suscríbete a DeepL Pro para poder traducir archivos de mayor tamaño. Más información disponible en www.DeepL.com/pro. Breve ComuniCaCión https://doi.org/10.1038/s41587-020-0500-9 Plantas con autoluminiscencia codificada genéticamente Tatiana Mitiouchkina1,2,10, Alexander S. Mishin1 ,2,10, Louisa González Somermeyer3 ,10, Nadezhda M. Markina1,2,10, Tatiana V. Chepurnyh1,2, Elena B. Guglya2,4, Tatiana A. Karataeva1,2, Kseniia A. Palkina1,2, Ekaterina S. Shakhova1,2, Liliia I. Fakhranurova1,2, Sofia V. Chekova1, Aleksandra S. Tsarkova1,2,5, Yaroslav V. Golubev4, Vadim V. Negrebetsky4, Sergey A. Dolgushin6, Pavel V. Shalaev6, Dmitry Shlykov2, Olesya A. Melnik1,2, Victoria O. Shipunova2, Sergey M. Deyev2, ,2,4,10 ✉ Ilia V. Yampolsky1 y Karen S. Sarkisyan 1,2,8,9,10 ✉ Andrey I. Bubyrev2, Alexander S. Pushin1,2, Vladimir V. Choob7, Sergey V. Dolgov2, Fyodor A. Kondrashov3, Las plantas autoluminiscentes diseñadas para expresar un grupo de genes de bioluminiscencia bacteriana en los plástidos no se han adoptado de forma generalizada debido a su escasa producción de luz. Hemos diseñado plantas de tabaco con un sistema de bioluminiscencia fúngica que convierte el ácido cafeico (presente en todas las plantas) en luciferina y produce una luminiscencia autosostenida visible a simple vista. Nuestros hallazgos podrían apuntalar el desarrollo de un conjunto de herramientas de imagen para plantas. Los reporteros bioluminiscentes no se han aplicado ampliamente en plantas porque la adición exógena de luciferina es cara y puede ser tóxica. Aunque los genes de bioluminiscencia bacteriana pueden dirigirse a los plástidos para crear autoluminiscencia, es técnicamente complicado y no produce suficiente luz1. Recientemente se ha caracterizado el ciclo del ácido cafeico, una vía metabólica responsable de la luminiscencia en hongos2. Hemos descrito la emisión de luz en plantas Nicotiana tabacum y Nicotiana benthamiana sin la adición de ningún sustrato exógeno mediante la ingeniería de genes de bioluminiscencia fúngica en el genoma nuclear de la planta. El ácido cafeico es un intermediario en la vía fenilpropanoide, que produce lignina y otros metabolitos en las plantas vasculares. Pensamos que podría ser factible integrar el ciclo del ácido cafeico fúngico en el metabolismo de las plantas. Además, la luminiscencia verde producida por el ciclo del ácido cafeico encaja bien con la ventana de transparencia óptica de los tejidos vegetales pigmentados (Fig. 1a). Aunque el ácido cafeico no es nativo de los animales, la luminiscencia autónoma también podría ser habilitada en los animales mediante la inclusión de dos enzimas adicionales necesarias para su biosíntesis a partir de la tirosinatirosina amoníaco liasa y el cou- marato 3-hidroxilasa-o sus equivalentes funcionales (Fig. 1b y Fig. Suplementaria 1)3 . Hemos diseñado plantas N. tabacum que brillan de forma autónoma mediante la integración del genoma en sitios aleatorios utilizando la transformación mediada por Agrobacterium de casetes de ADN que comprenden versiones optimizadas de BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology codones de cuatro genes de bioluminiscencia de Neonothopanus nambi2 : nnluz (luciferasa), nnhisps (hispidina sintasa), nnh3h (hispidina-3-hidroxilasa) y nncph (cafeoil piruvato hidrolasa) (Fig. 1, Métodos, Fig. suplementaria 2 y Nota suplementaria 1). Quince líneas de plantas obtenidas de forma independiente presentaban eventos de integración genómica confirmados. El fenotipo general, el contenido en clorofila y carotenoides, el tiempo de floración y la germinación de semillas no difirieron del tabaco de tipo silvestre en el invernadero, con la excepción de un aumento del 12% en la altura media de las plantas transgénicas (Fig. suplementaria 3 y Nota suplementaria 2). Esto sugiere que, a diferencia de la expresión del sistema de bioluminiscencia bacteriana1, la expresión del ciclo del ácido cafeico no es tóxica para las plantas y no impone una carga obvia sobre el crecimiento de la planta, al menos en el invernadero. La emisión de luz en todas las fases de desarrollo era visible a simple vista, con una intensidad en las flores que alcanzaba los 1010 fotones por minuto (Tabla suplementaria 1). Este nivel de brillo nos permitió capturar imágenes detalladas con cámaras de consumo con tiempos de exposición de 0,5-30 s, proporcionando una calidad similar a la de equipos de imagen de luminiscencia más caros (Fig. 2 y Figs. suplementarias 3-8). Para identificar los metabolitos que podrían limitar la emisión de luz, infundimos luciferina o sus precursores en las hojas de plantas brillantes. Descubrimos que la luminiscencia brillante se desarrollaba instantáneamente tras inyectar luciferina o hispidina, mientras que se producía una menor intensidad más lentamente si las hojas se suplementaban con ácido cafeico (Vídeo suplementario 1). Dado que las líneas de N. tabacum manipuladas no retenían los precursores exógenos infundidos en el lugar de la inyección, creamos una línea brillante de N. benthamiana. En la evaluación de todas las mezclas de precursores de hispidina, el ácido cafeico produjo un aumento de la luminiscencia, mientras que el malonil-CoA, CoA o ATP, añadidos individualmente o como mezcla, no lo hicieron (Nota suplementaria 3 y Fig. suplementaria 9). En conjunto, estos experimentos sugieren que el ácido cafeico limita la biosíntesis de hispidina (Nota suplementaria 4 y Vídeo suplementario 1). En consonancia con la relación entre la disponibilidad de ácido cafeico y la intensidad de la luminiscencia, la distribución de la luminiscencia se asemejó a los patrones de expresión de las enzimas implicadas en la vía fenil-propanoide4. Durante la germinación de las semillas, se observó un aumento de la luminiscencia en las puntas de los cotiledones y las raíces (Fig. 2a y Vídeo suplementario 2). Las raíces también brillaron intensamente en los puntos de ramificación (Fig. 2d), a menudo horas antes de la aparición de la raíz lateral. 1Planta LLC, Moscú, Rusia. 2Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia Rusa de las Ciencias, Moscú, Rusia. 3Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria. 4Pirogov Russian National Research Medical University, Moscú, Rusia. 5Institute of Biophysics, Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Krasnoyarsk, Rusia. 6Aivok LLC, Zelenograd, Moscú, Rusia. 7Jardín Botánico de la Universidad Estatal Lomonosov de Moscú, Moscú, Rusia. 8Grupo de Biología Sintética, MRC London Institute of Medical Sciences, Londres, Reino Unido. 9Institute of Clinical Sciences, Faculty of Medicine and Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London, Londres, Reino Unido. ✉e-mail: [email protected]; [email protected] 10Estos autores han contribuido a partes iguales: Tatiana Mitiouchkina, Alexander Karen S. Sarkisyan. S. Mishin, Louisa Gonzalez Somermeyer, Nadezhda M. Markina, Ilia V. Yampolsky, BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Breve ComuniCaCión NAture BiOtechNOlOgy a Luminiscencia O O O Absorbancia O RCC H Coniferaldehído HO SCoA Feruloil-CoA HO Ligninas CCOMT 2 Mal-CoA HO AMP O b Ac cumárico id C4H ATP 4CL C3 H O PAL O ATP HO CoA HispS OH O Hispidina CPH OH OH H2 O Vía del shikimato OH Oxiluciferina HO OO HO Ácido cafeoilpirúvico Luciferina fúngica Luz Luz CO2 HO HO O Eriodictiol chalcona OH CHI HO HO OH O Eriodictyol NAD(P)H, H+ , O2 NAD(P)+ , H2 O O OH Ácido pirúvico OH O HO Ácido cafeico HO OO H3H OH HO HO OH HO Ciclo del ácido cafeico O NH2 Fenilalanina CHS OH CO2 2 CoA HO O HO O HO HispS OH Ácido cinámico O CHS AMP Mal-CoA S-X HispS S-X HO CoA-SH OH HO 2 CO2 2 CoA O 400 450 500 550 600 650 700 750 Longitud de onda, nm OH Flavonoides Antocianinas Taninos condensados OO 3-Hidroxihispidina O2 Fig. 1 | Sistema de bioluminiscencia fúngica. a, Espectro de bioluminiscencia fúngica (N. nambi, en verde) superpuesto al espectro de absorbancia de hojas de planta (N. tabacum, en gris oscuro). b, El ciclo del ácido cafeico comparte metabolitos con algunas de las principales vías biosintéticas vegetales. El origen fúngico o vegetal de las enzimas se indica con los símbolos del hongo y de la plántula, respectivamente. 4CL, 4-cumarato:CoA ligasa; C3H, ácido p-cumárico 3-hidroxilasa; C4H, ácido cinámico 4-hidroxilasa; CCOMT, cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasa; CCR, cinamoil-CoA reductasa; CHI, chalcona isomerasa; CHS, chalcona sintasa; CPH, putativa cafeoil piruvato hidrolasa; H3H, hispidina-3-hidroxilasa; HispS, hispidina sintasa; Luz, luciferasa; PAL, fenilalanina amoniolilasa. El espectro de absorbancia de la hoja es representativo de un experimento realizado en tres hojas. El espectro de luminiscencia procede de un conjunto de datos publicado en la ref. 3. iniciación (Vídeos suplementarios 3 y 4). A medida que las plantas se desarrollaban, la luminiscencia aumentaba en la zona de transición entre la raíz y el tallo. Los brotes jóvenes eran más brillantes en las yemas terminales y axilares y en la parte superior del tallo; las partes más viejas del brote se atenuaban a medida que las plantas maduraban (Vídeo suplementario 5). Las flores produjeron la mayor luminiscencia (Fig. 2c,e, Fig. suplementaria 10 y Vídeo suplementario 6). Se observó un aumento de la emisión de luz en condiciones en las que se sabe que se activa la producción de fenilpropanoides utilizando imágenes luminiscentes de lapso de tiempo. Además, se caracterizaron los patrones espaciales y temporales de luminiscencia de las plantas de tabaco (Notas suplementarias 57). En las hojas lesionadas5,6, observamos un aumento sostenido de la emisión de luz en el lugar de la lesión. También discernimos que la luminiscencia se propagaba desde el lugar de la lesión a través de pequeñas venas a aproximadamente 2 µm s-1 (Fig. suplementaria 11 y vídeo suplementario 7). La eliminación apical de los brotes7 dio lugar a una luminiscencia brillante que se mantuvo en los brotes laterales proximales al lugar del corte (Fig. suplementaria 12 y vídeo suplementario 8). Las hojas envejecidas, cuyo contenido en ácido cafeico se reduce gradualmente hasta la senescencia tardía8 , mostraron en general una menor emisión de luz. Sin embargo, algunas hojas mostraron ondas de emisión de luz intensa durante las etapas finales de la senescencia (Vídeo BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Suplementario 5), posiblemente reflejando la removilización de nutrientes relacionada con la edad9,10 . Por último, las plantas tratadas con jasmonato de metilo11,12 o con piel de plátano maduro (que emite etileno, entre otros compuestos)13 Breve ComuniCaCión respondió con un aumento masivo de la luminiscencia en toda la NAture BiOtechNOlOgy planta (Fig. suplementaria 13a,b). Hemos establecido la viabilidad del uso de genes de bioluminiscencia fúngica para producir plantas brillantes que son al menos un orden de magnitud más brillantes de lo que se había logrado anteriormente utilizando un sistema de bioluminiscencia bacteriana (Tabla suplementaria 1 y Figs. suplementarias 6 y 7)1. Al permitir la emisión autónoma de luz, los procesos dinámicos en las plantas pueden ser monitorizados, incluyendo el desarrollo y la patogénesis, las respuestas a las condiciones ambientales y los efectos del tratamiento químico. Al permitir la emisión autónoma de luz, se pueden monitorizar los procesos dinámicos en las plantas, incluyendo el desarrollo y la patogénesis, las respuestas a las condiciones ambientales y los efectos del tratamiento químico. Los métodos de cribado también deberían verse facilitados por la simplicidad y eficiencia de la adquisición de datos luminiscentes. Al eliminar la necesidad de la adición exógena de luciferina u otros subestratos, estas capacidades luminiscentes deberían ser especialmente útiles para los experimentos con plantas cultivadas en el suelo. Contenidos en línea Todos los métodos, referencias adicionales, resúmenes de informes de Nature Research, datos fuente, datos ampliados, información suplementaria, agradecimientos, información sobre la revisión por pares; detalles de las contribuciones de los autores y los intereses en competencia; y declaraciones de disponibilidad de datos y códigos están disponibles en https://doi.org/10.1038/s41587- 020-0500-9. Recibido: 24 de julio de 2019; Aceptado: 26 de marzo de 2020; Publicado: xx xx xxxx BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Breve ComuniCaCión NAture BiOtechNOlOgy a b d e c Fig. 2 | Plantas bioluminiscentes durante el desarrollo. Emisión de luz de plantas de N. tabacum en las fases de germinación (a), vegetativa (b) y floración (c); emisión de luz de las raíces (d) y sección transversal de las flores (e). Las fotos se tomaron con una cámara Sony Alpha ILCE-7M3 (Métodos). Las 110 plántulas representadas en a son representativas de tres experimentos independientes. Las imágenes de plantas en estado vegetativo (b, 3 semanas) y de floración (c, 8 semanas), así como de flores individuales (e) son representativas de 100 plantas seguidas desde in vitro hasta la floración en cuatro experimentos independientes. La edad de las plantas se indica en relación con el traslado de in vitro al invernadero. La imagen de las raíces de una planta individual representada en d es representativa de tres experimentos independientes de obtención de imágenes en seis plantas. referencias 1. Krichevsky, A., Meyers, B., Vainstein, A., Maliga, P. & Citovsky, V. PLoS ONE 5, e15461 (2010). 2. Kotlobay, A. A. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12728-12732 (2018). 3. Yan, Y. & Lin, Y. Biosynthesis of caffeic acid and caffeic acid derivatives by recombinant microorganisms. Patente estadounidense 8809028B2 (2012). 4. Kawamata, S. et al. Plant Cell Physiol. 38, 792-803 (1997). 5. Gaquerel, E., Gulati, J. & Baldwin, I. T. Plant J. 79, 679-692 (2014). 6. Toyota, M. et al. Science 361, 1112-1115 (2018). 7. Singh, S. K. et al. Sci. Rep. 5, 18148 (2015). 8. Li, L. et al. Sci. Rep. 6, 37976 (2016). 9. Li, W. et al. Sci. Rep. 7, 12126 (2017). 10. Woo, H. R., Kim, H. J., Nam, H. G. & Lim, P. O. J. Cell Sci. 126, 4823-4833 (2013). 11. Pauwels, L. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 1380-1385 (2008). 12. Bernards, M. A. & Båstrup-Spohr, L. Resistencia inducida de las plantas a la herbivoría (Springer, 2008). 13. Singh, R., Rastogi, S. & Dwivedi, U. N. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 9, 398-416 (2010). Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales. © El autor(es), bajo licencia exclusiva de Springer Nature America, Inc. 2020 BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Breve ComuniCaCión Métodos Ensamblaje de plásmidos para la transformación de plantas. Las secuencias codificantes de los genes nnluz, nnhisps, nnh3h y nncph de N. nambi se optimizaron en codones para su expresión en N. tabacum y se encargaron sintéticamente a Evrogen. Los genes sintéticos estaban flanqueados por sitios de restricción BsaI diseñados para dejar salientes AATG-GCTT, compatibles con el estándar de clonación modular existente descrito en ref. 14. A continuación, cada gen se clonó en un vector de nivel 1, bajo el control del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor y el terminador ocs de Agrobacterium tumefaciens. A continuación, estos plásmidos de nivel 1 se digirieron con BpiI y se ensamblaron juntos en una columna vertebral de nivel 2 en el siguiente orden: nnhisps-nnh3h-nnluz-nncph o, en el caso de la versión sin cph, nnhisps-nnh3h-nnluz. Este grupo de genes iba precedido de un casete de resistencia a la kanamicina para su selección en plantas. La construcción completa, formada por el casete de kanamicina y los genes de luminiscencia, estaba flanqueada por secuencias de inserción de A. tumefaciens para facilitar la integración aleatoria de la construcción en los genomas de las plantas mediada por Agrobacterium (Fig. suplementaria 2). Todas las clonaciones descritas anteriormente se llevaron a cabo según los métodos de clonación Golden Gate establecidos, en los que la digestión y la ligación se realizan conjuntamente en un solo paso. Todas las reacciones se realizaron en tampón 1× T4 ligasa (Thermo Fisher) que contenía 10 U de T4 ligasa, 20 U de BsaI o BpiI (Thermo Fisher) y 100 ng de ADN de cada parte de ADN. Las reacciones Golden Gate se realizaron de acuerdo con las condiciones de ciclado de "resolución de problemas" descritas en la ref. 15: 25 ciclos entre 37 °C y 16 °C (90 s a 37 °C, 180 s a 16 °C) y luego 5 min a 50 °C y 10 min a 80 °C. Las secuencias correctas de todos los plásmidos se confirmaron mediante secuenciación Sanger e Illumina antes de su uso (Datos suplementarios). NAture BiOtechNOlOgy membrana Amersham Hybond-N+ (GE Healthcare) y se inmovilizaron. La sonda de ADN se construyó mediante PCR utilizando el gen sintético nnluz clonado como molde y los cebadores específicos de nnluz enumerados en la Tabla Suplementaria 2. El ADN de la sonda se marcó con un marcador de ADN. El ADN de la sonda se marcó con fosfatasa alcalina utilizando el AlkPhos Direct Labeling Kit (GE Healthcare). La prehibridación, la hibridación (toda la noche a 60 °C) con la sonda marcada con fosfatasa alcalina y los lavados posteriores de la membrana se realizaron según el protocolo del AlkPhos Direct Labeling Kit. Detección se realizó utilizando el reactivo de detección Amersham CDP-Star siguiendo las Montaje de plásmidos para células de mamífero. El ADN que codifica para RcTAL, HpaB, HpaC, nnHispS, NpgA, nnH3H, nnCPH y nnLuz se encargó sintéticamente (Evrogen) y se clonó en el vector pKatushka2S-C1 (Evrogen) en lugar de la secuencia codificante de Katushka2S, bajo el control del promotor CMV. Las secuencias del plásmido están disponibles en Genbank con los siguientes números de acceso: pHpaB-C1, MT233533; pHpaC-C1, MT233534; pnnCPH-C1, MT233535; pnnH3H-C1, MT233536; pnnHispSC1, MT233537; pnnLuz-C1, MT233538; pnpgA-C1, MT233539; pRcTAL-C1, MT233540; pX037, MT233541. Correcto Las secuencias de todos los plásmidos se confirmaron con secuenciación Sanger e Illumina antes de su uso (Datos suplementarios). Expresión en células de mamífero cultivadas e imágenes de luminiscencia. La línea celular HEK293T se transfectó con una mezcla de los ocho plásmidos mediante el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega). Las células transfectadas se cultivaron en DMEM (PanEco) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (HyClone) y 4 mM de L-glutamina, 10 U ml-1 de penicilina y 10 µg ml-1 de estreptomicina, a 37 °C y 5% de CO2. Veinticuatro horas después de la transfección, el medio se cambió a MEM suplementado con con 20 mM de HEPES, y la luminiscencia se analizó mediante IVIS Spectrum CT (PerkinElmer). Para el análisis, la señal de luminiscencia de fondo de los pocillos vacíos se restó de la señal de luminiscencia de los pocillos con células de control y autoluminiscentes. Transformación de plantas mediada por Agrobacterium. Los plásmidos ensamblados se transfirieron a la cepa AGL0 de A. tumefaciens (ref. 16). Las bacterias se cultivaron en matraces en un agitador durante la noche a 28 °C en medio LB suplementado con 25 mg l-1 de rifampicina y 50 mg l-1 de kanamicina. Los cultivos bacterianos se diluyeron en medio líquido Murashige y Skoog (MS) hasta una densidad óptica de 0,6 a 600 nm. Los explantes de hoja utilizados para los experimentos de transformación se cortaron de plantas de tabaco de 2 semanas de edad (N. tabacum cv. Petit Havana SR1, N. benthamiana) y se incubaron con cultivo bacteriano durante 20 min. A continuación, los explantes de hoja se colocaron en papel de filtro sobre medio MS (sales MS, vitamina MS, 30 g l-1 de sacarosa, 8 g l-1 de agar, pH 5,8) suplementado con 1 mg l-1 de 6-bencilaminopurina y 0,1 mg l-1 de ácido indolilacético. Dos días después de la inoculación, los explantes se transfirieron al mismo medio suplementado con 500 mg l-1 de cefotaxima y 75 mg l-1 de kanamicina. Se cortaron brotes de regeneración y se cultivaron en medio MS con antibióticos. Análisis molecular de las plantas transgénicas. El ADN genómico se extrajo de hojas jóvenes de plántulas cultivadas en invernadero utilizando el método del bromuro de cetiltrimetilamonio17. La presencia de cada uno de los genes transferidos se confirmó mediante PCR con cebadores específicos para cada gen (Tabla suplementaria 2). Para los Southern blots, 30 μg de ADN genómico de la planta se digirieron durante la noche a 37 °C con 100 U de EcoRV, una enzima de restricción que corta las construcciones de ADN-T utilizadas en este estudio en una única posición dentro de la región codificante de nnHispS. Tras la electroforesis en gel, los productos de la digestión se transfirieron a una BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology NAture BiOtechNOlOgy protocolo del fabricante (GE Healthcare). La señal de la membrana se acumuló en una película de rayos X (XBE blue sensitive, Retina) en un casete de película a temperatura ambiente durante 24 h. Las películas de rayos X se escanearon en un Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences). Condiciones de crecimiento de las plantas. La transgénesis y el cultivo de plantas se llevaron a cabo en la estación de clima artificial Biotron N2-2.9 (sucursal del Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica de la Academia Rusa de Ciencias). Las plantas de tabaco se propagaron en medio MS suplementado con 30 g l-1 de sacarosa y 0,8 p/vol agar (Panreac). Los cultivos in vitro se incubaron a 24 ± 1 °C con un fotoperiodo de 12-16-d, con luz mixta blanca fría y roja (lámparas fluorescentes Cool White y Gro-Lux) a una intensidad luminosa de 40 s-1 m-2 . Después de que la raíz desarrollo, las plántulas se transfirieron a macetas de 9 cm con tierra esterilizada (mezcla 1:3 peso/peso de arena y turba). Las plantas en macetas se colocaron en el invernadero a 22 ± 2 °C bajo condiciones de día neutro (12 h luz/12 h oscuridad; 150 μmol s-1 m-2) y 75% de humedad relativa. Para obtener imágenes time-lapse de las semillas en germinación (vídeo suplementario 2), las semillas se esterilizaron en hipoclorito sódico (25%/15 min) y luego se propagaron en medio MS suplementado con 30 g l-1 de sacarosa y 0,3 wt/ vol Goma Gellan en polvo (MP Biomedicals). Se utilizó el mismo medio para obtener imágenes de luminiscencia de las raíces (Fig. 2d y vídeos suplementarios 3 y 4). Configuración de imágenes de plantas con cámaras fotográficas. Utilizamos una cámara Sony Alpha ILCE-7M3 para capturar todas las fotos y vídeos presentados en este artículo, excepto los tomados con un smartphone (Fig. suplementaria 8) y un lapso de tiempo a largo plazo filmado con una cámara Nikon D800 (Vídeo suplementario 5). Dependiendo del montaje experimental, la apertura del objetivo y otras consideraciones, se utilizó una gama de valores ISO de 3.200 a 40.000, con tiempos de exposición de 5 s (lesión foliar) a 20 min (microscopía radicular). La mayoría de las fotos se capturaron con un tiempo de exposición de 30 s. Se utilizó un objetivo SEL50M28 (Sony, f/2,8) o un objetivo 35-mm T1,5 ED AS UMC VDSLR (Samyang, ~f/1,4). Se capturó un lapso de tiempo a largo plazo de plantas de tabaco en crecimiento (Fig. 13c y Vídeo 5 suplementarios) con una cámara Nikon D800 y un Sigma AF 35-mm f/1.4 DG HSM Art a ISO 8063 y una velocidad de obturación de 30 segundos. La microscopía de raíces se realizó con una cámara Sony Alpha Cámara ILCE-7M3 con Meiji MA833 U. En la cámara se montó una lente objetivo Plan 20× mediante un adaptador hecho a medida. Para la comparación cuantitativa, se utilizó como referencia la fuente de luz calibrada XLS-4 (PerkinElmer) (emite 1,6 × 109 fotones por segundo a 525 nm). A continuación, las fotos se procesaron de la siguiente manera. En primer lugar, una foto en bruto obtenida en la oscuridad con los mismos ajustes se sustrajo por canal de una foto en bruto de plantas (LibRaw versión 0.19.2, herramienta 4channels) para eliminar los píxeles calientes y reducir el ruido. Opcionalmente, se aplicó un plugin de ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/ source/ij/plugin/filter/RankFilters.java) para eliminar los valores atípicos (píxeles calientes). En la mayoría de las fotos, sólo se conservaron en la imagen final los canales verdes (G y G2). Las imágenes finales se renderizaron en pseudocolor con tablas de búsqueda lineales "Verde" o "Fuego" de ImageJ. Imágenes de plantas en IVIS Spectrum CT. Las imágenes de plantas en IVIS Spectrum CT se realizaron sin filtros delante de la cámara, con una exposición de 1 minuto y sin binning. Las muestras se adquirieron con la configuración "C" del campo de visión. La imagen de luz ambiental se tomó después de las mediciones de luminiscencia. Los demás ajustes se dejaron en los valores predeterminados. Contenido de clorofila en las hojas. A continuación, se homogeneizaron 0,5 g de muestra de hoja de planta fresca en un homogeneizador de tejidos con 10 ml de etanol al 95%. La mezcla de muestra homogeneizada se centrifugó a 10.000 r.p.m. durante 15 min. Una alícuota del sobrenadante (0,5 ml) se mezcló con etanol al 95% (4,5 ml). La mezcla de la solución en una cubeta de vidrio se analizó para determinar el contenido de clorofila-a, clorofila-b y carotenoides a 664, 649 y 470 nm. Imágenes de plantas en un smartphone. Utilizamos un smartphone Huawei P30 Pro para la fotografía. Para capturar la foto que se muestra en la Fig. 8b suplementaria, utilizamos los siguientes ajustes: 30 s de tiempo de exposición, ISO 6400 y apertura 1,6. Espectros de absorción de hojas de tabaco. Las hojas de los adultos de tipo salvaje Se recogieron plantas de N. tabacum y se midieron directamente con un espectrofotómetro (Cary 100 Bio, Varian). Obtención de imágenes de lesiones foliares. Las plantas se cultivaron en invernadero durante 6 semanas. BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Breve ComuniCaCión Las hojas de N. tabacum se hirieron con una cuchilla, provocando un corte a través de la nervadura central. Tratamiento con jasmonato de metilo. Bioluminiscentes transgénicos de tres semanas de edad Las plantas de N. tabacum se trataron con jasmonato de metilo (5 mM en tampón MES 10 mM, pH 7,0) mediante pulverización. Las plantas de control se trataron con tampón (tampón MES 10 mM, pH 7,0). A continuación, se tomaron imágenes de las plantas en frascos de cristal cerrados durante 3 d en la oscuridad. Incubación con piel de plátano. Bioluminiscentes transgénicos de tres semanas de edad Se tomaron imágenes de plantas de N. tabacum con piel de plátano maduro en frascos de vidrio cerrados durante 24 h. Breve ComuniCaCión PCR cuantitativa. En experimentos destinados a determinar si la expresión del gen nnluz oscila durante el día, recogimos la tercera hoja contando a partir de la yema apical de 27 plantas transgénicas brillantes de 25 días de edad. Las hojas se recogieron con intervalos de 3 h durante 24 h, y se recogieron hojas de tres plantas en cada punto temporal. De cada planta se recogieron hojas una sola vez. Todas las hojas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se homogeneizaron para la extracción de ARN con el kit TRIzol (Thermo Fisher Scientific). La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó con un kit MMLV (Evrogen). La PCR cuantitativa se realizó con el kit qPCRmix-HS SYBR + LowROX (Evrogen) en una máquina de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems) con cebadores de recocido en el transcrito nnluz: GGACCAGGAGTCCCAGGC y CTTGGCATTTTCGACAATCTTA con los cebadores programa siguiente: 95 °C durante 1 min y, a continuación, 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 15 s. NAture BiOtechNOlOgy intervalo de datos. Mann-Whitney de dos colas Las pruebas U (Fig. suplementaria 3) se calcularon con el paquete scipy.stats (https://www.scipy.org/, SciPy versión 1.3.1). El paquete Python Scikit-posthocs Infiltración de hojas de tabaco con precursores de hispidina. Para los experimentos de infiltración de hojas transgénicas de N. benthamiana, preparamos soluciones 100 uM de ácido cafeico, malonil-CoA, ATP y coenzima A en tampón MES 10 mM (pH 7,0). También preparamos mezclas de 100 uM de estos compuestos en el mismo tampón: Mezcla 1, completa (ácido cafeico, malonil-CoA, CoA, ATP); Mezcla 2 sin ácido cafeico (malonil-CoA, CoA, ATP); Mezcla 3 sin malonil-CoA (ácido cafeico, CoA, ATP); Mezcla 4 sin CoA (ácido cafeico, malonil-CoA, ATP); y Mezcla 5 sin ATP (ácido cafeico, malonil-CoA, CoA). Las soluciones se inyectaron en los limbos de hojas cortadas de N. benthamiana, y se tomaron imágenes de las hojas durante 15 min después de las inyecciones. El análisis del fotograma 1 min después de la inyección se presenta en la Fig. suplementaria 9. Se siguió un diseño de experimento similar para la inyección de precursores de luciferina en hojas de N. tabacum, seguida de 16 h de obtención de imágenes (Vídeo suplementario 1). Análisis LC-MS/MS. El ácido cafeico y el ácido acético estándar analítico (≥ 98,0) se adquirieron a Sigma-Aldrich. La hispidina fue sintetizada por Planta (≥ 95,0%). El acetonitrilo de grado HPLC se adquirió a J.T. Baker. El agua desionizada se obtuvo de un sistema Milli-Q. Analizamos varios grupos de muestras: hojas y flores del tipo salvaje N. tabacum (NT000) y dos líneas transgénicas de plantas (NT001 y NT078). Inmediatamente después de la recogida, las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se trituraron manualmente en un mortero. Para reducir la variabilidad biológica, mezclamos material vegetal de tres organismos diferentes del mismo grupo. Para cada muestra, se liofilizó aproximadamente 1 g del tejido congelado en tubos Falcon de 50 ml, y el material liofilizado se almacenó a -20 °C. Cada muestra se preparó y analizó en tres réplicas. Para el análisis, se pesaron unos 50 mg de polvo liofilizado y se trataron con 7 ml de metanol al 70% durante 30 min en un baño de ultrasonidos y, a continuación, se centrifugaron durante 10 min a 4.000 r.p.m. Se recogió el sobrenadante, se filtró con filtro de jeringa Phenex GF/PVDF (diámetro 30 mm, tamaño de poro 0,45 μm) y se analizó en un instrumento LCMS. Los análisis se realizaron con un sistema Shimadzu 8030 compuesto por HPLC acoplado a PDA y espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (HPLC-DAD-ESI-TQ MS). La separación cromatográfica se realizó en columna Discovery C18 de 4,6 × 150 mm, 5 μm en modo de gradiente con componentes de fase móvil A (ácido acético al 0,3% en agua) y B (acetonitrilo). La corrida en gradiente se realizó de la siguiente manera: 0-4 min 10-40% B, 4-5 min 40-80%, 5-10,5 min, elución isocrática con 100% B y luego se regresó a la condición inicial. La temperatura de la columna fue de 40 °C, el caudal fue de 1 ml min-1 y el volumen de inyección de la muestra fue de 20 μl. La fuente de ionización por electrospray (ESI) se configuró en modo de ionización negativa. Se utilizó la monitorización de reacción múltiple para realizar la cuantificación por espectrometría de masas. Condiciones de EM: tensión de interfaz 3.500 V (ESI-), gas nebulizador (nitrógeno) flujo 2,5 l min-1, gas de secado (nitrógeno) flujo 15 l min-1, presión del gas CID 60 kPa, temperatura DL 250 °C y temperatura del bloque térmico 400 °C. Como gas de colisión se utilizó argón de gran pureza. Los iones precursores y producto (m/z) de los analitos diana fueron 178,95 y 134,95 para el ácido cafeico y 245,05 y 159,00 para la hispidina; la energía de colisión fue de 35 V para ambos compuestos. Debido a la falta de estándares marcados con isótopos, añadimos estándares a las muestras para tener en cuenta el importante efecto matriz. Cada muestra se analizó dos veces, con y sin la adición de estándares. Tras el primer análisis, se añadió una solución con una cantidad conocida de ácido cafeico e hispidina. Asumiendo una relación lineal entre la señal observada y la concentración de compuestos, la concentración del extracto se calculó como Cextr = Cad × Sextr/(Stot Sextr), donde Cad es la concentración del compuesto añadido en el extracto y Sextr y Stot son el área del pico del analito en el primer y segundo análisis. Estadísticas. Los datos se representan como diagramas de caja implementados en el paquete Seaborn (https://seaborn. pydata.org/) (versión 0.10, Python versión 3.6). Las cajas se extienden desde los valores del cuartil inferior al superior de los datos, y la línea horizontal representa la mediana. Los bigotes representan todo el BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology NAture BiOtechNOlOgy (https://pypi.org/project/scikit-posthocs/, versión 0.6.2) se utilizó para múltiples pruebas U de Mann-Whitney post hoc por pares con valores P corregidos por el método step-down utilizando ajustes de Sidak (Fig. suplementaria 9). El número de muestras (n), las pruebas estadísticas utilizadas y los valores exactos de P figuran en las leyendas de las figuras. Resumen del informe. Encontrará más información sobre el diseño de la investigación en el Resumen de los informes de investigación de Nature enlazado a este artículo. Disponibilidad de datos Los conjuntos de datos generados o analizados en el presente estudio pueden solicitarse a los autores correspondientes. Las imágenes sin procesar de flores luminiscentes capturadas con una cámara Sony Alpha ILCE-7M3 e IVIS Spectrum CT están disponibles en Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.11353601). Las secuencias de plásmidos están disponibles en Genbank con los siguientes números de acceso: pHpaB-C1, MT233533; pHpaC-C1, MT233534; pnnCPH-C1, MT233535; pnnH3H-C1, MT233536; pnnHispS-C1, MT233537; pnnLuz-C1, MT233538; pnpgA-C1, MT233539; pRcTAL-C1, MT233540; pX037, MT233541. Sanger y Los resultados de la secuenciación Illumina están disponibles como Datos complementarios. referencias 14. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S. & Marillonnet, S. PLoS ONE 6, e16765 (2011). 15. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J. & Densmore, D. M. ACS Synth. Biol. 5, 99-103 (2016). 16. Lazo, G. R., Stein, P. A. & Ludwig, R. A. Biotecnología 9, 963-967 (1991). 17. Rogers, S. O. & Bendich, A. J. Manual de biología molecular vegetal (Springer, 1994). Agradecimientos Este estudio fue diseñado, realizado y financiado por Planta LLC. Agradecemos a K. Wood su ayuda en la elaboración del manuscrito. Planta agradece el apoyo del Centro de Innovación Skolkovo. Damos las gracias a D. Bolotin y al Milaboratory (milaboratory. com) por el acceso a la infraestructura informática y de almacenamiento. Damos las gracias a S. Shakhov por facilitarnos el equipo fotográfico. El Grupo de Biología Sintética está financiado por el MRC London Institute of Medical Sciences (UKRI MC-A658-5QEA0, K.S.S.). K.S.S. recibe una beca de investigación del Imperial College. Los experimentos se llevaron a cabo en parte con equipos proporcionados por el Instituto de Química Bioorgánica de la Academia Rusa de Ciencias (CKP IBCH; financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia de Rusia, subvención RFMEFI62117X0018). El laboratorio de F.A.K. cuenta con el apoyo del acuerdo de subvención 771209-CharFL del ERC. Este proyecto recibió financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención -Curie 665385. K.S.S. agradece el apoyo de la subvención del presidente 075-15-2019-411. Diseño y ensamblaje de algunos de los plásmidos se financió con la subvención 19-74-10102 de la Fundación Científica Rusa. Los experimentos de imagen se financiaron parcialmente con la subvención 17-14-01169p de la Fundación Científica Rusa. Los análisis LC-MS/MS de los extractos fueron financiados por la subvención 1614-00052p de la Fundación Científica Rusa. El diseño y ensamblaje de plásmidos se financió en parte con la subvención 075-15-2019-1789 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de Rusia. Federación Rusa asignado al Centro de Edición Genómica de Precisión y Tecnologías Genéticas para la Biomedicina. Contribuciones de los autores T.M., A.S.M., L.G.S., T.V.C., E.B.G., T.A.K., N.M.M., S.V.C., A.S.T., L.I.F., K.A.P., E.S.S., Actuaron Y.V.G., V.V.N., S.A.D., P.V.S., O.A.M., V.O.S., S.M.D., A.I.B., A.S.P. y K.S.S. experimentos. T.M., A.S.M., L.G.S., T.V.C., E.B.G., T.A.K., N.M.M., S.V.C., A.S.T., L.I.F., K.A.P., E.S.S., Y.V.G., V.V.N., S.A.D., P.V.S., O.A.M., V.O.S., S.M.D., A.I.B., A.S.P., V.V.C., S.V.D., F.A.K., I.V.Y. y K.S.S. realizaron el análisis de los datos. A.S.M. diseñó el sistema de obtención de imágenes, planificó y realizó los experimentos, analizó los datos y redactó el artículo. I.V.Y. y K.S.S. propusieron y dirigieron el estudio, planificaron los experimentos y redactaron el artículo. Todos los autores revisaron y comentaron el borrador del artículo. Intereses contrapuestos Este trabajo ha contado con el apoyo de Planta LLC. I.V.Y. y K.S.S. son accionistas y empleados de Planta. Planta ha presentado solicitudes de patente relacionadas con el uso de componentes del sistema bioluminiscente fúngico y el desarrollo de organismos transgénicos brillantes. Información complementaria BIOTECNOLOGÍA NATURAL | www.nature.com/naturebiotechnology Breve ComuniCaCión La información complementaria de este artículo está disponible en https://doi.org/10.1038/ s41587-020-0500-9. La correspondencia y las solicitudes de material deben dirigirse a I.V.Y. o K.S.S. Encontrará información sobre autorizaciones y reimpresiones en www.nature.com/reprints. Última actualización por el autor: 22 de febrero de 2020 Resumen de informes Nature Research desea mejorar la reproducibilidad de los trabajos que publica. Este formulario proporciona una estructura para la coherencia y la transparencia en la presentación de informes. Para más información sobre las políticas de Nature Research, véase Autores y árbitros y Lista de control de la política editorial. investigación sobre la naturaleza | resumen del informe Autores correspondientes: Karen Sarkisyan, Ilia Yampolsky Estadísticas Para todos los análisis estadísticos, confirme que los siguientes elementos están presentes en la leyenda de la figura, la leyenda de la tabla, el texto principal o la sección Métodos. n/a Confirmado El tamaño exacto de la muestra (n) para cada grupo/condición experimental, dado como número discreto y unidad de medida. Una declaración sobre si las mediciones se tomaron de muestras distintas o si se midió repetidamente la misma muestra La(s) prueba(s) estadística(s) utilizada(s) Y si son unilaterales o bilaterales Sólo las pruebas comunes deben describirse únicamente por su nombre; describa las técnicas más complejas en la sección Métodos. Descripción de todas las covariables analizadas Una descripción de los supuestos o correcciones, como las pruebas de normalidad y el ajuste para comparaciones múltiples. Una descripción completa de los parámetros estadísticos, incluida la tendencia central (por ejemplo, la media) u otras estimaciones básicas (por ejemplo, el coeficiente de regresión) Y la variación (por ejemplo, la desviación típica) o las estimaciones de incertidumbre asociadas (por ejemplo, los intervalos de confianza). Para la comprobación de hipótesis nulas, el estadístico de la prueba (por ejemplo, F, t, r) con intervalos de confianza, tamaños del efecto, grados de libertad y valor P anotado. Indique los valores P como valores exactos siempre que sea conveniente. Para el análisis bayesiano, información sobre la elección de los a priori y la configuración de la cadena de Markov Monte Carlo. Para los diseños jerárquicos y complejos, identificación del nivel adecuado para las pruebas e información completa de los resultados Estimaciones del tamaño de los efectos (por ejemplo, d de Cohen, r de Pearson), indicando cómo se han calculado Nuestra colección web sobre estadística para biólogos contiene artículos sobre muchos de los puntos anteriores. Software y código Información política sobre la disponibilidad del código Código Python para la adquisición automática de imágenes informático Recogida de datos Análisis de datos LibRaw versión 0.19.2, herramienta de línea de comandos 4channels, plugin RankFilters de ImageJ, código Python personalizado para el tratamiento de imágenes y datos, paquete Seaborn (https://seaborn.pydata.org/), paquete scipy.stats (https://www.scipy.org/). Paquete Scikit-posthocs Python (https:// pypi.org/project/scikit-posthocs/) para el análisis estadístico. En el caso de los manuscritos que utilicen algoritmos personalizados o software que sean fundamentales para la investigación pero que aún no se hayan descrito en la literatura publicada, el software debe ponerse a disposición de los editores/revisores. Recomendamos encarecidamente depositar el código en un repositorio comunitario (por ejemplo, GitHub). Para más información, consulte las directrices de Nature Research para el envío de código y software. Información política sobre disponibilidad de datos Todos los manuscritos deben incluir una declaración de disponibilidad de datos. Esta declaración debe proporcionar la siguiente información, cuando proceda: Octubre de 2018 Datos - Códigos de acceso, identificadores únicos o enlaces web para los conjuntos de datos disponibles públicamente - Lista de figuras con datos brutos asociados - Descripción de cualquier restricción a la disponibilidad de los datos Los conjuntos de datos generados o analizados durante el presente estudio están a disposición de los autores correspondientes previa solicitud razonable. 1 investigación sobre la naturaleza | resumen del informe Informes específicos Seleccione a continuación la que mejor se adapte a su investigación. Si no está seguro, lea las secciones correspondientes antes de hacer su selección. Ciencias de la vidaCiencias sociales y del comportamientoCiencias ecológicas , evolutivas y medioambientales Para obtener una copia de referencia del documento con todas las secciones, consulte nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf Diseño de estudios de ciencias de la vida Todos los estudios deben revelar estos puntos, incluso cuando la revelación sea experimentos negativa. Tamaño Los de la muestra descritos en este estudio se realizaron por primera vez. Debido a la naturaleza exploratoria de nuestro estudio, nos abstuvimos de generalizaciones innecesarias. No se pudo determinar a priori un tamaño del efecto preestablecido. En los casos de evaluación del efecto de estímulos externos sobre las plantas transgénicas, y en el caso de la determinación de la composición química de las muestras vegetales, el tamaño de la muestra se seleccionó de acuerdo con las normas en la materia. Exclusión de No se excluyó ningún dato del estudio. datos El número de réplicas se indica explícitamente en las leyendas de las figuras. En su caso, los resultados comunicados se repitieron sistemáticamente en varios experimentos y todas las repeticiones generaron resultados similares. Replicación Aleatorización La aleatorización no es relevante para el diseño de nuestro estudio porque los investigadores estaban comparando muestras de plantas en condiciones bien controladas. No se utilizaron sujetos humanos ni animales en el estudio. Cegador No se realizó cegamiento, ya que no había grupos de animales ni de humanos. Informes sobre materiales, sistemas y métodos específicos Requerimos información de los autores sobre algunos tipos de materiales, sistemas experimentales y métodos utilizados en muchos estudios. Indique aquí si cada material, sistema o método de la lista es pertinente para su estudio. Si no está seguro de si un elemento de la lista se aplica a su investigación, lea la sección correspondiente antes de seleccionar una respuesta. n/a Participa en el estudio n/a Participa en el estudio Anticuerpos Líneas ChIP-seq celulares eucariotas Citometría de flujo Paleontología Neuroimagen por resonancia magnética Animales y otros organismos Participantes humanos en la investigación Datos y clínicos Materiales sistemas experimentales Métodos Líneas celulares eucariotas Información política sobre líneas celulares Fuente(s) de la(s) HEK293T (origen desconocido) línea(s) celular(es) La línea celular se autentificó morfológicamente. Contaminación por Las líneas celulares se sometieron con frecuencia a pruebas de contaminación por micoplasma. Se verificó que la línea celular utilizada en este estudio era negativa al micoplasma antes de emprender experimentos con ella. Octubre de 2018 Autentificación micoplasma Líneas comúnmente mal identificadas No se utilizaron células comúnmente mal identificadas. Todas las células presentaban una morfología característica (Véase el registro ICLAC) homogénea. 2
