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s41587-020-0500-9 es-ES unlocked

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Breve ComuniCaCión
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0500-9
Plantas con autoluminiscencia codificada
genéticamente
Tatiana Mitiouchkina1,2,10, Alexander S. Mishin1 ,2,10, Louisa González Somermeyer3 ,10, Nadezhda
M. Markina1,2,10, Tatiana V. Chepurnyh1,2, Elena B. Guglya2,4, Tatiana A. Karataeva1,2, Kseniia A.
Palkina1,2, Ekaterina S. Shakhova1,2, Liliia I. Fakhranurova1,2, Sofia V. Chekova1, Aleksandra S.
Tsarkova1,2,5, Yaroslav V. Golubev4, Vadim V. Negrebetsky4, Sergey A. Dolgushin6, Pavel V. Shalaev6, Dmitry Shlykov2,
Olesya A. Melnik1,2, Victoria O. Shipunova2, Sergey M. Deyev2,
,2,4,10 ✉
Ilia V. Yampolsky1
y Karen S. Sarkisyan 1,2,8,9,10 ✉ Andrey I. Bubyrev2, Alexander S. Pushin1,2,
Vladimir V. Choob7, Sergey V. Dolgov2, Fyodor A. Kondrashov3,
Las plantas autoluminiscentes diseñadas para expresar un
grupo de genes de bioluminiscencia bacteriana en los
plástidos no se han adoptado de forma generalizada debido a
su escasa producción de luz. Hemos diseñado plantas de
tabaco con un sistema de bioluminiscencia fúngica que
convierte el ácido cafeico (presente en todas las plantas) en
luciferina y produce una luminiscencia autosostenida visible
a simple vista. Nuestros hallazgos podrían apuntalar el
desarrollo de un conjunto de herramientas de imagen para
plantas.
Los reporteros bioluminiscentes no se han aplicado
ampliamente en plantas porque la adición exógena de luciferina es
cara y puede ser tóxica. Aunque los genes de bioluminiscencia
bacteriana pueden dirigirse a los plástidos para crear
autoluminiscencia, es técnicamente complicado y no produce
suficiente luz1. Recientemente se ha caracterizado el ciclo del ácido
cafeico, una vía metabólica responsable de la luminiscencia en
hongos2. Hemos descrito la emisión de luz en plantas Nicotiana
tabacum y Nicotiana benthamiana sin la adición de ningún
sustrato exógeno mediante la ingeniería de genes de
bioluminiscencia fúngica en el genoma nuclear de la planta.
El ácido cafeico es un intermediario en la vía fenilpropanoide,
que produce lignina y otros metabolitos en las plantas vasculares.
Pensamos que podría ser factible integrar el ciclo del ácido cafeico
fúngico en el metabolismo de las plantas. Además, la luminiscencia
verde producida por el ciclo del ácido cafeico encaja bien con la
ventana de transparencia óptica de los tejidos vegetales
pigmentados (Fig. 1a). Aunque el ácido cafeico no es nativo de los
animales, la luminiscencia autónoma también podría ser
habilitada en los animales mediante la inclusión de dos enzimas
adicionales necesarias para su biosíntesis a partir de la tirosinatirosina amoníaco liasa y el cou- marato 3-hidroxilasa-o sus
equivalentes funcionales (Fig. 1b y Fig. Suplementaria 1)3 .
Hemos diseñado plantas N. tabacum que brillan de forma
autónoma mediante la integración del genoma en sitios aleatorios
utilizando la transformación mediada por Agrobacterium de
casetes de ADN que comprenden versiones optimizadas de
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codones de cuatro genes de bioluminiscencia de Neonothopanus
nambi2
: nnluz (luciferasa), nnhisps (hispidina sintasa), nnh3h
(hispidina-3-hidroxilasa) y nncph (cafeoil piruvato hidrolasa) (Fig.
1, Métodos, Fig. suplementaria 2 y Nota suplementaria 1).
Quince líneas de plantas obtenidas de forma independiente
presentaban eventos de integración genómica confirmados. El
fenotipo general, el contenido en clorofila y carotenoides, el
tiempo de floración y la germinación de semillas no difirieron
del tabaco de tipo silvestre en el invernadero, con la excepción
de un aumento del 12% en la altura media de las plantas
transgénicas (Fig. suplementaria 3 y Nota suplementaria 2). Esto
sugiere que, a diferencia de la expresión del sistema de
bioluminiscencia bacteriana1, la expresión del ciclo del ácido cafeico no
es tóxica para las plantas y no impone una carga obvia sobre el
crecimiento de la planta, al menos en el invernadero. La emisión
de luz en todas las fases de desarrollo era visible a simple vista,
con una intensidad en las flores que alcanzaba los 1010 fotones por
minuto (Tabla suplementaria 1). Este nivel de brillo nos permitió
capturar imágenes detalladas con cámaras de consumo con
tiempos de exposición de 0,5-30 s, proporcionando una calidad
similar a la de equipos de imagen de luminiscencia más caros
(Fig. 2 y Figs. suplementarias 3-8).
Para identificar los metabolitos que podrían limitar la
emisión de luz, infundimos luciferina o sus precursores en las
hojas de plantas brillantes. Descubrimos que la luminiscencia
brillante se desarrollaba instantáneamente tras inyectar luciferina
o hispidina, mientras que se producía una menor intensidad más
lentamente si las hojas se suplementaban con ácido cafeico
(Vídeo suplementario 1). Dado que las líneas de N. tabacum
manipuladas no retenían los precursores exógenos infundidos en
el lugar de la inyección, creamos una línea brillante de N.
benthamiana. En la evaluación de todas las mezclas de
precursores de hispidina, el ácido cafeico produjo un aumento de
la luminiscencia, mientras que el malonil-CoA, CoA o ATP,
añadidos individualmente o como mezcla, no lo hicieron (Nota
suplementaria 3 y Fig. suplementaria 9). En conjunto, estos
experimentos sugieren que el ácido cafeico limita la biosíntesis de
hispidina (Nota suplementaria 4 y Vídeo suplementario 1).
En consonancia con la relación entre la disponibilidad de ácido
cafeico y la intensidad de la luminiscencia, la distribución de la
luminiscencia se asemejó a los patrones de expresión de las
enzimas implicadas en la vía fenil-propanoide4. Durante la germinación
de las semillas, se observó un aumento de la luminiscencia en las
puntas de los cotiledones y las raíces (Fig. 2a y Vídeo
suplementario 2). Las raíces también brillaron intensamente en
los puntos de ramificación (Fig. 2d), a menudo horas antes de la
aparición de la raíz lateral.
1Planta LLC, Moscú, Rusia. 2Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia Rusa de las Ciencias, Moscú, Rusia. 3Instituto de Ciencia y
Tecnología de Austria, Klosterneuburg, Austria. 4Pirogov Russian National Research Medical University, Moscú, Rusia. 5Institute of Biophysics, Krasnoyarsk Science
Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Krasnoyarsk, Rusia. 6Aivok LLC, Zelenograd, Moscú, Rusia.
7Jardín Botánico de la Universidad Estatal Lomonosov de Moscú, Moscú, Rusia. 8Grupo de Biología Sintética, MRC London Institute of Medical Sciences,
Londres, Reino Unido. 9Institute of Clinical Sciences, Faculty of Medicine and Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London,
Londres, Reino Unido.
✉e-mail: [email protected]; [email protected] 10Estos autores han contribuido a partes iguales: Tatiana Mitiouchkina, Alexander
Karen S. Sarkisyan.
S. Mishin, Louisa Gonzalez Somermeyer, Nadezhda M. Markina, Ilia V. Yampolsky,
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NAture
BiOtechNOlOgy
a
Luminiscencia
O
O
O
Absorbancia
O
RCC
H
Coniferaldehído
HO
SCoA
Feruloil-CoA
HO
Ligninas
CCOMT
2 Mal-CoA
HO
AMP
O
b
Ac cumárico id
C4H
ATP
4CL
C3 H
O
PAL
O
ATP
HO
CoA
HispS
OH
O
Hispidina
CPH
OH
OH
H2 O
Vía del shikimato
OH
Oxiluciferina
HO
OO
HO
Ácido
cafeoilpirúvico
Luciferina fúngica
Luz
Luz
CO2
HO
HO
O
Eriodictiol chalcona
OH
CHI
HO
HO
OH
O
Eriodictyol
NAD(P)H, H+ , O2
NAD(P)+ , H2 O
O
OH
Ácido
pirúvico
OH
O
HO
Ácido cafeico
HO
OO
H3H
OH
HO
HO
OH
HO
Ciclo del ácido
cafeico
O
NH2
Fenilalanina
CHS
OH
CO2
2 CoA
HO
O
HO
O
HO
HispS
OH
Ácido cinámico
O
CHS
AMP
Mal-CoA
S-X
HispS
S-X
HO
CoA-SH
OH
HO
2 CO2
2 CoA
O
400 450 500 550 600 650 700 750
Longitud de onda, nm
OH
Flavonoides
Antocianinas
Taninos
condensados
OO
3-Hidroxihispidina
O2
Fig. 1 | Sistema de bioluminiscencia fúngica. a, Espectro de bioluminiscencia fúngica (N. nambi, en verde) superpuesto al espectro de absorbancia de
hojas de planta (N. tabacum, en gris oscuro). b, El ciclo del ácido cafeico comparte metabolitos con algunas de las principales vías biosintéticas vegetales.
El origen fúngico o vegetal de las enzimas se indica con los símbolos del hongo y de la plántula, respectivamente. 4CL, 4-cumarato:CoA ligasa; C3H, ácido
p-cumárico 3-hidroxilasa; C4H, ácido cinámico 4-hidroxilasa; CCOMT, cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasa; CCR, cinamoil-CoA reductasa; CHI, chalcona
isomerasa; CHS, chalcona sintasa; CPH, putativa cafeoil piruvato hidrolasa; H3H, hispidina-3-hidroxilasa; HispS, hispidina sintasa; Luz, luciferasa; PAL,
fenilalanina amoniolilasa. El espectro de absorbancia de la hoja es representativo de un experimento realizado en tres hojas. El espectro de luminiscencia
procede de un conjunto de datos publicado en la ref. 3.
iniciación (Vídeos suplementarios 3 y 4). A medida que las
plantas se desarrollaban, la luminiscencia aumentaba en la zona
de transición entre la raíz y el tallo. Los brotes jóvenes eran más
brillantes en las yemas terminales y axilares y en la parte superior
del tallo; las partes más viejas del brote se atenuaban a medida
que las plantas maduraban (Vídeo suplementario 5). Las flores
produjeron la mayor luminiscencia (Fig. 2c,e, Fig. suplementaria 10
y Vídeo suplementario 6).
Se observó un aumento de la emisión de luz en condiciones en
las que se sabe que se activa la producción de fenilpropanoides
utilizando imágenes luminiscentes de lapso de tiempo. Además,
se caracterizaron los patrones espaciales y temporales de
luminiscencia de las plantas de tabaco (Notas suplementarias 57). En las hojas lesionadas5,6, observamos un aumento sostenido de la
emisión de luz en el lugar de la lesión. También discernimos que
la luminiscencia se propagaba desde el lugar de la lesión a través
de pequeñas venas a aproximadamente 2 µm s-1 (Fig.
suplementaria 11 y vídeo suplementario 7). La eliminación apical de
los brotes7 dio lugar a una luminiscencia brillante que se
mantuvo en los brotes laterales proximales al lugar del corte (Fig.
suplementaria 12 y vídeo suplementario 8). Las hojas envejecidas,
cuyo contenido en ácido cafeico se reduce gradualmente hasta la
senescencia
tardía8 , mostraron en general una menor emisión de luz.
Sin embargo, algunas hojas mostraron ondas de emisión de luz
intensa durante las etapas finales de la senescencia (Vídeo
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Suplementario 5), posiblemente reflejando la removilización de
nutrientes relacionada con la edad9,10 . Por último, las plantas
tratadas con jasmonato de metilo11,12 o con piel de plátano maduro
(que emite etileno, entre otros compuestos)13
Breve
ComuniCaCión
respondió con un
aumento masivo de la luminiscencia en toda la
NAture
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planta (Fig. suplementaria 13a,b).
Hemos establecido la viabilidad del uso de genes de
bioluminiscencia fúngica para producir plantas brillantes que
son al menos un orden de magnitud más brillantes de lo que se
había logrado anteriormente utilizando un sistema de
bioluminiscencia bacteriana (Tabla suplementaria 1 y Figs.
suplementarias 6 y 7)1. Al permitir la emisión autónoma de luz,
los procesos dinámicos en las plantas pueden ser monitorizados,
incluyendo el desarrollo y la patogénesis, las respuestas a las
condiciones ambientales y los efectos del tratamiento químico.
Al permitir la emisión autónoma de luz, se pueden monitorizar
los procesos dinámicos en las plantas, incluyendo el desarrollo y
la patogénesis, las respuestas a las condiciones ambientales y los
efectos del tratamiento químico. Los métodos de cribado
también deberían verse facilitados por la simplicidad y eficiencia
de la adquisición de datos luminiscentes. Al eliminar la necesidad
de la adición exógena de luciferina u otros subestratos, estas
capacidades luminiscentes deberían ser especialmente útiles para
los experimentos con plantas cultivadas en el suelo.
Contenidos en línea
Todos los métodos, referencias adicionales, resúmenes de
informes de Nature Research, datos fuente, datos ampliados,
información suplementaria, agradecimientos, información sobre
la revisión por pares; detalles de las contribuciones de los autores
y los intereses en competencia; y declaraciones de disponibilidad
de
datos
y
códigos
están
disponibles
en
https://doi.org/10.1038/s41587- 020-0500-9.
Recibido: 24 de julio de 2019; Aceptado: 26 de marzo de 2020;
Publicado: xx xx xxxx
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a
b
d
e
c
Fig. 2 | Plantas bioluminiscentes durante el desarrollo. Emisión de luz de plantas de N. tabacum en las fases de germinación (a), vegetativa (b) y
floración (c); emisión de luz de las raíces (d) y sección transversal de las flores (e). Las fotos se tomaron con una cámara Sony Alpha ILCE-7M3
(Métodos). Las 110 plántulas representadas en a son representativas de tres experimentos independientes. Las imágenes de plantas en estado
vegetativo (b, 3 semanas) y de floración (c, 8 semanas), así como de flores individuales (e) son representativas de 100 plantas seguidas desde in vitro
hasta la floración en cuatro experimentos independientes. La edad de las plantas se indica en relación con el traslado de in vitro al invernadero. La
imagen de las raíces de una planta individual representada en d es representativa de tres experimentos independientes de obtención de imágenes en
seis plantas.
referencias
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Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones
jurisdiccionales en los mapas publicados y las afiliaciones institucionales.
© El autor(es), bajo licencia exclusiva de Springer Nature America, Inc. 2020
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Métodos
Ensamblaje de plásmidos para la transformación de plantas. Las secuencias
codificantes de los genes nnluz, nnhisps, nnh3h y nncph de N. nambi se
optimizaron en codones para su expresión en N. tabacum y se encargaron
sintéticamente a Evrogen. Los genes sintéticos estaban flanqueados por sitios de
restricción BsaI diseñados para dejar salientes AATG-GCTT, compatibles con
el estándar de clonación modular existente descrito
en ref. 14. A continuación, cada gen se clonó en un vector de nivel 1, bajo el
control del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor y el
terminador ocs de Agrobacterium tumefaciens. A continuación, estos plásmidos
de nivel 1 se digirieron con BpiI y se ensamblaron juntos en una columna
vertebral de nivel 2 en el siguiente orden: nnhisps-nnh3h-nnluz-nncph o, en el
caso de la versión sin cph, nnhisps-nnh3h-nnluz. Este grupo de genes iba
precedido de un casete de resistencia a la kanamicina para su selección en
plantas. La construcción completa, formada por el casete de kanamicina y los
genes de luminiscencia, estaba flanqueada por secuencias de inserción de A.
tumefaciens para facilitar la integración aleatoria de la construcción en los
genomas de las plantas mediada por Agrobacterium (Fig. suplementaria 2).
Todas las clonaciones descritas anteriormente se llevaron a cabo según los
métodos de clonación Golden Gate establecidos, en los que la digestión y la
ligación se realizan conjuntamente en un solo paso. Todas las reacciones se
realizaron en tampón 1× T4 ligasa (Thermo Fisher) que contenía 10 U de T4
ligasa, 20 U de BsaI o BpiI (Thermo Fisher) y 100 ng de ADN de cada parte de
ADN. Las reacciones Golden Gate se realizaron de acuerdo con las condiciones
de ciclado de "resolución de problemas" descritas en la ref. 15: 25 ciclos entre 37
°C y 16 °C (90 s a 37 °C, 180 s a 16 °C) y luego
5 min a 50 °C y 10 min a 80 °C.
Las secuencias correctas de todos los plásmidos se confirmaron mediante
secuenciación Sanger e Illumina antes de su uso (Datos suplementarios).
NAture
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membrana Amersham Hybond-N+ (GE Healthcare) y se inmovilizaron. La
sonda de ADN se construyó mediante PCR utilizando el gen sintético nnluz
clonado como molde y los cebadores específicos de nnluz enumerados en la
Tabla Suplementaria 2. El ADN de la sonda se marcó con un marcador de
ADN. El ADN de la sonda se marcó con fosfatasa alcalina utilizando el
AlkPhos Direct Labeling Kit
(GE Healthcare). La prehibridación, la hibridación (toda la noche a 60 °C) con la
sonda marcada con fosfatasa alcalina y los lavados posteriores de la membrana se
realizaron según el protocolo del AlkPhos Direct Labeling Kit. Detección
se realizó utilizando el reactivo de detección Amersham CDP-Star siguiendo las
Montaje de plásmidos para células de mamífero. El ADN que codifica para
RcTAL, HpaB, HpaC, nnHispS, NpgA, nnH3H, nnCPH y nnLuz se encargó
sintéticamente (Evrogen) y se clonó en el vector pKatushka2S-C1 (Evrogen)
en lugar de la secuencia codificante de Katushka2S, bajo el control del
promotor CMV. Las secuencias del plásmido están disponibles en Genbank
con los siguientes números de acceso: pHpaB-C1, MT233533; pHpaC-C1,
MT233534; pnnCPH-C1, MT233535; pnnH3H-C1, MT233536; pnnHispSC1, MT233537; pnnLuz-C1, MT233538; pnpgA-C1, MT233539; pRcTAL-C1,
MT233540; pX037, MT233541. Correcto
Las secuencias de todos los plásmidos se confirmaron con secuenciación Sanger e
Illumina antes de su uso (Datos suplementarios).
Expresión en células de mamífero cultivadas e imágenes de luminiscencia. La
línea celular HEK293T se transfectó con una mezcla de los ocho plásmidos
mediante el reactivo de transfección FuGENE HD (Promega). Las células
transfectadas se cultivaron en DMEM (PanEco) suplementado con un 10% de
suero bovino fetal (HyClone) y 4 mM de L-glutamina,
10 U ml-1 de penicilina y 10 µg ml-1 de estreptomicina, a 37 °C y 5% de CO2. Veinticuatro
horas después de la transfección, el medio se cambió a MEM suplementado con
con 20 mM de HEPES, y la luminiscencia se analizó mediante IVIS Spectrum
CT (PerkinElmer). Para el análisis, la señal de luminiscencia de fondo de los
pocillos vacíos se restó de la señal de luminiscencia de los pocillos con células
de control y autoluminiscentes.
Transformación de plantas mediada por Agrobacterium. Los plásmidos
ensamblados se transfirieron a la cepa AGL0 de A. tumefaciens (ref. 16). Las
bacterias se cultivaron en matraces en un agitador durante la noche a 28 °C en
medio LB suplementado con 25 mg l-1 de rifampicina y 50 mg l-1 de kanamicina. Los
cultivos bacterianos se diluyeron en medio líquido Murashige y Skoog (MS) hasta
una densidad óptica de 0,6 a 600 nm.
Los explantes de hoja utilizados para los experimentos de transformación se
cortaron de plantas de tabaco de 2 semanas de edad (N. tabacum cv. Petit
Havana SR1, N. benthamiana) y se incubaron con cultivo bacteriano durante 20
min. A continuación, los explantes de hoja se colocaron en papel de filtro sobre
medio MS (sales MS, vitamina MS, 30 g l-1 de sacarosa, 8 g l-1 de agar,
pH 5,8) suplementado con 1 mg l-1 de 6-bencilaminopurina y 0,1 mg l-1 de ácido
indolilacético. Dos días después de la inoculación, los explantes se transfirieron al
mismo medio suplementado con 500 mg l-1 de cefotaxima y 75 mg l-1 de kanamicina.
Se cortaron brotes de regeneración y se cultivaron en medio MS con antibióticos.
Análisis molecular de las plantas transgénicas. El ADN genómico se extrajo de
hojas jóvenes de plántulas cultivadas en invernadero utilizando el método del
bromuro de cetiltrimetilamonio17. La presencia de cada uno de los genes transferidos se
confirmó mediante PCR con cebadores específicos para cada gen (Tabla
suplementaria 2).
Para los Southern blots, 30 μg de ADN genómico de la planta se
digirieron durante la noche a 37 °C con 100 U de EcoRV, una enzima de
restricción que corta las construcciones de ADN-T utilizadas en este estudio
en una única posición dentro de la región codificante de nnHispS. Tras la
electroforesis en gel, los productos de la digestión se transfirieron a una
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protocolo del fabricante (GE Healthcare). La señal de la membrana se
acumuló en una película de rayos X (XBE blue sensitive, Retina) en un casete
de película a temperatura ambiente durante 24 h. Las películas de rayos X se
escanearon en un Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences).
Condiciones de crecimiento de las plantas. La transgénesis y el cultivo de plantas
se llevaron a cabo en la estación de clima artificial Biotron N2-2.9 (sucursal del
Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica de la Academia Rusa
de Ciencias). Las plantas de tabaco se propagaron en medio MS suplementado con
30 g l-1 de sacarosa y
0,8 p/vol agar (Panreac). Los cultivos in vitro se incubaron a 24 ± 1 °C con
un fotoperiodo de 12-16-d, con luz mixta blanca fría y roja (lámparas
fluorescentes Cool White y Gro-Lux) a una intensidad luminosa de 40
s-1 m-2
. Después de que la raíz
desarrollo, las plántulas se transfirieron a macetas de 9 cm con tierra esterilizada
(mezcla 1:3 peso/peso de arena y turba). Las plantas en macetas se colocaron en el
invernadero a 22 ± 2 °C bajo condiciones de día neutro (12 h luz/12 h oscuridad;
150 μmol s-1 m-2) y 75% de humedad relativa. Para obtener imágenes time-lapse de
las semillas en germinación (vídeo suplementario 2), las semillas se esterilizaron en
hipoclorito sódico (25%/15 min) y luego se propagaron en medio MS
suplementado con 30 g l-1 de sacarosa y 0,3 wt/
vol Goma Gellan en polvo (MP Biomedicals). Se utilizó el mismo medio para
obtener imágenes de luminiscencia de las raíces (Fig. 2d y vídeos suplementarios 3
y 4).
Configuración de imágenes de plantas con cámaras fotográficas. Utilizamos
una cámara Sony Alpha ILCE-7M3 para capturar todas las fotos y vídeos
presentados en este artículo, excepto los tomados con un smartphone (Fig.
suplementaria 8) y un lapso de tiempo a largo plazo filmado con una cámara
Nikon D800 (Vídeo suplementario 5). Dependiendo del montaje experimental, la
apertura del objetivo y otras consideraciones, se utilizó una gama de valores ISO
de 3.200
a 40.000, con tiempos de exposición de 5 s (lesión foliar) a 20 min (microscopía
radicular). La mayoría de las fotos se capturaron con un tiempo de exposición de
30 s.
Se utilizó un objetivo SEL50M28 (Sony, f/2,8) o un objetivo 35-mm T1,5
ED AS UMC VDSLR (Samyang, ~f/1,4). Se capturó un lapso de tiempo a
largo plazo de plantas de tabaco en crecimiento (Fig. 13c y Vídeo 5
suplementarios) con una cámara Nikon D800 y un Sigma AF 35-mm f/1.4
DG HSM Art a ISO 8063 y una velocidad de obturación de 30 segundos. La
microscopía de raíces se realizó con una cámara Sony Alpha
Cámara ILCE-7M3 con Meiji MA833 U. En la cámara se montó una lente
objetivo Plan 20× mediante un adaptador hecho a medida. Para la
comparación cuantitativa, se utilizó como referencia la fuente de luz calibrada
XLS-4 (PerkinElmer) (emite 1,6 × 109 fotones por segundo a 525 nm).
A continuación, las fotos se procesaron de la siguiente manera. En primer
lugar, una foto en bruto obtenida en la oscuridad con los mismos ajustes se
sustrajo por canal de una foto en bruto de plantas (LibRaw versión 0.19.2,
herramienta 4channels) para eliminar los píxeles calientes y reducir el ruido.
Opcionalmente, se aplicó un plugin de ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/
source/ij/plugin/filter/RankFilters.java) para eliminar los valores atípicos (píxeles
calientes). En la mayoría de las fotos, sólo se conservaron en la imagen final los
canales verdes (G y G2). Las imágenes finales se renderizaron en pseudocolor con
tablas de búsqueda lineales "Verde" o "Fuego" de ImageJ.
Imágenes de plantas en IVIS Spectrum CT. Las imágenes de plantas en IVIS
Spectrum CT se realizaron sin filtros delante de la cámara, con una exposición de
1 minuto y sin binning. Las muestras se adquirieron con la configuración "C" del
campo de visión. La imagen de luz ambiental se tomó después de las mediciones
de luminiscencia. Los demás ajustes se dejaron en los valores predeterminados.
Contenido de clorofila en las hojas. A continuación, se homogeneizaron 0,5 g
de muestra de hoja de planta fresca en un homogeneizador de tejidos con 10
ml de etanol al 95%. La mezcla de muestra homogeneizada se centrifugó a
10.000 r.p.m. durante 15 min. Una alícuota del sobrenadante (0,5 ml) se
mezcló con etanol al 95% (4,5 ml). La mezcla de la solución en una cubeta de
vidrio se analizó para determinar el contenido de clorofila-a, clorofila-b y
carotenoides a 664, 649 y 470 nm.
Imágenes de plantas en un smartphone. Utilizamos un smartphone Huawei
P30 Pro para la fotografía. Para capturar la foto que se muestra en la Fig. 8b
suplementaria, utilizamos los siguientes ajustes: 30 s de tiempo de exposición,
ISO 6400 y apertura 1,6.
Espectros de absorción de hojas de tabaco. Las hojas de los adultos de tipo salvaje
Se recogieron plantas de N. tabacum y se midieron directamente con un
espectrofotómetro (Cary 100 Bio, Varian).
Obtención de imágenes de lesiones foliares. Las plantas se cultivaron en
invernadero durante 6 semanas.
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Breve ComuniCaCión
Las hojas de N. tabacum se hirieron con una cuchilla, provocando un
corte a través de la nervadura central.
Tratamiento con jasmonato de metilo. Bioluminiscentes transgénicos de tres
semanas de edad
Las plantas de N. tabacum se trataron con jasmonato de metilo (5 mM en tampón
MES 10 mM, pH 7,0) mediante pulverización. Las plantas de control se trataron
con tampón (tampón MES 10 mM, pH 7,0). A continuación, se tomaron imágenes
de las plantas en frascos de cristal cerrados durante 3 d en la oscuridad.
Incubación con piel de plátano. Bioluminiscentes transgénicos de tres semanas de
edad
Se tomaron imágenes de plantas de N. tabacum con piel de plátano
maduro en frascos de vidrio cerrados durante 24 h.
Breve ComuniCaCión
PCR cuantitativa. En experimentos destinados a determinar si la expresión del
gen nnluz oscila durante el día, recogimos la tercera hoja contando a partir de la
yema apical de 27 plantas transgénicas brillantes de 25 días de edad. Las hojas se
recogieron con intervalos de 3 h durante 24 h, y se recogieron hojas de tres
plantas en cada punto temporal. De cada planta se recogieron hojas una sola
vez. Todas las hojas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se
homogeneizaron para la extracción de ARN con el kit TRIzol (Thermo Fisher
Scientific). La síntesis de la primera cadena de ADNc se realizó con un kit
MMLV (Evrogen). La PCR cuantitativa se realizó con el kit qPCRmix-HS SYBR
+ LowROX (Evrogen) en una máquina de PCR en tiempo real 7500 (Applied
Biosystems) con cebadores de recocido en el transcrito nnluz:
GGACCAGGAGTCCCAGGC y CTTGGCATTTTCGACAATCTTA con los
cebadores
programa siguiente: 95 °C durante 1 min y, a continuación, 40 ciclos de 95 °C
durante 15 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 15 s.
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intervalo de datos. Mann-Whitney de dos colas
Las pruebas U (Fig. suplementaria 3) se calcularon con el paquete scipy.stats
(https://www.scipy.org/, SciPy versión 1.3.1). El paquete Python Scikit-posthocs
Infiltración de hojas de tabaco con precursores de hispidina. Para los
experimentos de infiltración de hojas transgénicas de N. benthamiana,
preparamos soluciones 100 uM de ácido cafeico, malonil-CoA, ATP y coenzima
A en tampón MES 10 mM (pH 7,0). También preparamos mezclas de 100 uM
de estos compuestos en el mismo tampón:
Mezcla 1, completa (ácido cafeico, malonil-CoA, CoA, ATP); Mezcla 2 sin ácido
cafeico (malonil-CoA, CoA, ATP); Mezcla 3 sin malonil-CoA (ácido cafeico,
CoA, ATP); Mezcla 4 sin CoA (ácido cafeico, malonil-CoA, ATP); y Mezcla 5 sin
ATP (ácido cafeico, malonil-CoA, CoA). Las soluciones se inyectaron en los
limbos de hojas cortadas de N. benthamiana, y se tomaron imágenes de las hojas
durante 15 min después de las inyecciones. El análisis del fotograma 1 min
después de la inyección se presenta en la Fig. suplementaria 9. Se siguió un diseño
de experimento similar para la inyección de precursores de luciferina en hojas de
N. tabacum, seguida de 16 h de obtención de imágenes (Vídeo suplementario 1).
Análisis LC-MS/MS. El ácido cafeico y el ácido acético estándar analítico (≥ 98,0)
se adquirieron a Sigma-Aldrich. La hispidina fue sintetizada por Planta (≥ 95,0%).
El acetonitrilo de grado HPLC se adquirió a J.T. Baker. El agua desionizada se
obtuvo de un sistema Milli-Q.
Analizamos varios grupos de muestras: hojas y flores del tipo salvaje
N. tabacum (NT000) y dos líneas transgénicas de plantas (NT001 y NT078).
Inmediatamente después de la recogida, las muestras se congelaron en
nitrógeno líquido y se trituraron manualmente en un mortero. Para reducir
la variabilidad biológica, mezclamos material vegetal de tres organismos
diferentes del mismo grupo. Para cada muestra, se liofilizó
aproximadamente 1 g del tejido congelado en tubos Falcon de 50 ml, y el
material liofilizado se almacenó a -20 °C. Cada muestra se preparó y
analizó en tres réplicas.
Para el análisis, se pesaron unos 50 mg de polvo liofilizado y se trataron con
7 ml de metanol al 70% durante 30 min en un baño de ultrasonidos y, a
continuación, se centrifugaron durante 10 min a 4.000 r.p.m. Se recogió el
sobrenadante, se filtró con filtro de jeringa Phenex GF/PVDF (diámetro 30 mm,
tamaño de poro 0,45 μm) y se analizó en un instrumento LCMS. Los análisis se
realizaron con un sistema Shimadzu 8030 compuesto por HPLC acoplado a
PDA y espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (HPLC-DAD-ESI-TQ
MS). La separación cromatográfica se realizó
en columna Discovery C18 de 4,6 × 150 mm, 5 μm en modo de gradiente con
componentes de fase móvil A (ácido acético al 0,3% en agua) y B (acetonitrilo). La
corrida en gradiente se realizó de la siguiente manera: 0-4 min 10-40% B, 4-5 min
40-80%, 5-10,5 min, elución isocrática con 100% B y luego se regresó a la
condición inicial. La temperatura de la columna fue de 40 °C, el caudal fue de 1 ml
min-1
y el volumen de inyección de la muestra fue de 20 μl.
La fuente de ionización por electrospray (ESI) se configuró en modo de
ionización negativa. Se utilizó la monitorización de reacción múltiple para
realizar la cuantificación por espectrometría de masas. Condiciones de EM:
tensión de interfaz 3.500 V (ESI-), gas nebulizador
(nitrógeno) flujo 2,5 l min-1, gas de secado (nitrógeno) flujo 15 l min-1, presión del gas
CID 60 kPa, temperatura DL 250 °C y temperatura del bloque térmico 400 °C.
Como gas de colisión se utilizó argón de gran pureza. Los iones precursores y
producto (m/z) de los analitos diana fueron 178,95 y 134,95 para el ácido cafeico y
245,05 y 159,00 para la hispidina; la energía de colisión fue de 35 V para ambos
compuestos.
Debido a la falta de estándares marcados con isótopos, añadimos estándares a
las muestras para tener en cuenta el importante efecto matriz. Cada muestra se
analizó dos veces, con y sin la adición de estándares. Tras el primer análisis, se
añadió una solución con una cantidad conocida de ácido cafeico e hispidina.
Asumiendo una relación lineal entre la señal observada y la concentración de
compuestos, la concentración del extracto se calculó como Cextr = Cad × Sextr/(Stot Sextr), donde Cad es la concentración del compuesto añadido en el extracto y Sextr y Stot
son el área del pico del analito en el primer y segundo análisis.
Estadísticas. Los datos se representan como diagramas de caja implementados en
el paquete Seaborn (https://seaborn. pydata.org/) (versión 0.10, Python versión
3.6). Las cajas se extienden desde los valores del cuartil inferior al superior de los
datos, y la línea horizontal representa la mediana. Los bigotes representan todo el
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NAture
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(https://pypi.org/project/scikit-posthocs/, versión 0.6.2) se utilizó para múltiples
pruebas U de Mann-Whitney post hoc por pares con valores P corregidos por el
método step-down utilizando ajustes de Sidak (Fig. suplementaria 9). El número de
muestras (n), las pruebas estadísticas utilizadas y los valores exactos de P figuran en
las leyendas de las figuras.
Resumen del informe. Encontrará más información sobre el diseño de la
investigación en el Resumen de los informes de investigación de Nature enlazado a
este artículo.
Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados o analizados en el presente estudio pueden
solicitarse a los autores correspondientes. Las imágenes sin procesar de flores
luminiscentes capturadas con una cámara Sony Alpha ILCE-7M3 e IVIS Spectrum
CT están disponibles en Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.11353601).
Las secuencias de plásmidos están disponibles en Genbank con los siguientes
números de acceso:
pHpaB-C1, MT233533; pHpaC-C1, MT233534; pnnCPH-C1, MT233535;
pnnH3H-C1, MT233536; pnnHispS-C1, MT233537; pnnLuz-C1, MT233538;
pnpgA-C1, MT233539; pRcTAL-C1, MT233540; pX037, MT233541. Sanger y
Los resultados de la secuenciación Illumina están disponibles como Datos
complementarios.
referencias
14. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S. & Marillonnet, S. PLoS ONE
6, e16765 (2011).
15. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J. & Densmore, D. M. ACS Synth. Biol.
5, 99-103 (2016).
16. Lazo, G. R., Stein, P. A. & Ludwig, R. A. Biotecnología 9, 963-967 (1991).
17. Rogers, S. O. & Bendich, A. J. Manual de biología molecular vegetal
(Springer, 1994).
Agradecimientos
Este estudio fue diseñado, realizado y financiado por Planta LLC. Agradecemos a
K. Wood su ayuda en la elaboración del manuscrito. Planta agradece el apoyo del
Centro de Innovación Skolkovo. Damos las gracias a D. Bolotin y al Milaboratory
(milaboratory. com) por el acceso a la infraestructura informática y de almacenamiento.
Damos las gracias a S. Shakhov por facilitarnos el equipo fotográfico. El Grupo de
Biología Sintética está financiado por
el MRC London Institute of Medical Sciences (UKRI MC-A658-5QEA0, K.S.S.).
K.S.S. recibe una beca de investigación del Imperial College. Los experimentos se
llevaron a cabo en parte con equipos proporcionados por el Instituto de Química
Bioorgánica de la Academia Rusa de Ciencias (CKP IBCH; financiado por el
Ministerio de Educación y Ciencia de Rusia, subvención RFMEFI62117X0018). El
laboratorio de F.A.K. cuenta con el apoyo del acuerdo de subvención 771209-CharFL
del ERC. Este proyecto recibió financiación del Programa de Investigación e
Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención
-Curie 665385. K.S.S. agradece el apoyo de la subvención del
presidente 075-15-2019-411. Diseño y ensamblaje de algunos de los plásmidos
se financió con la subvención 19-74-10102 de la Fundación Científica Rusa. Los
experimentos de imagen se financiaron parcialmente con la subvención 17-14-01169p de
la Fundación Científica Rusa.
Los análisis LC-MS/MS de los extractos fueron financiados por la subvención 1614-00052p de la Fundación Científica Rusa. El diseño y ensamblaje de plásmidos
se financió en parte con la subvención 075-15-2019-1789 del Ministerio de
Ciencia y Educación Superior de Rusia.
Federación Rusa asignado al Centro de Edición Genómica de Precisión y Tecnologías
Genéticas para la Biomedicina.
Contribuciones de los autores
T.M., A.S.M., L.G.S., T.V.C., E.B.G., T.A.K., N.M.M., S.V.C., A.S.T., L.I.F., K.A.P., E.S.S.,
Actuaron Y.V.G., V.V.N., S.A.D., P.V.S., O.A.M., V.O.S., S.M.D., A.I.B., A.S.P. y K.S.S.
experimentos. T.M., A.S.M., L.G.S., T.V.C., E.B.G., T.A.K., N.M.M., S.V.C., A.S.T., L.I.F.,
K.A.P., E.S.S., Y.V.G., V.V.N., S.A.D., P.V.S., O.A.M., V.O.S., S.M.D., A.I.B., A.S.P., V.V.C.,
S.V.D., F.A.K., I.V.Y. y K.S.S. realizaron el análisis de los datos. A.S.M. diseñó el
sistema de obtención de imágenes, planificó y realizó los experimentos, analizó los
datos y redactó el artículo. I.V.Y. y K.S.S. propusieron y dirigieron el estudio,
planificaron los experimentos y redactaron el artículo. Todos los autores revisaron y
comentaron el borrador del artículo.
Intereses contrapuestos
Este trabajo ha contado con el apoyo de Planta LLC. I.V.Y. y K.S.S. son accionistas y
empleados de Planta. Planta ha presentado solicitudes de patente relacionadas con el
uso de componentes del sistema bioluminiscente fúngico y el desarrollo de organismos
transgénicos brillantes.
Información complementaria
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Breve ComuniCaCión
La información complementaria de este artículo está disponible en
https://doi.org/10.1038/ s41587-020-0500-9.
La correspondencia y las solicitudes de material deben dirigirse a I.V.Y. o K.S.S.
Encontrará información sobre autorizaciones y reimpresiones en
www.nature.com/reprints.
Última actualización por el autor: 22 de febrero de 2020
Resumen de informes
Nature Research desea mejorar la reproducibilidad de los trabajos que publica. Este formulario proporciona una estructura para la coherencia y la
transparencia en la presentación de informes. Para más información sobre las políticas de Nature Research, véase Autores y árbitros y Lista de
control de la política editorial.
investigación sobre la naturaleza |
resumen del informe
Autores correspondientes: Karen Sarkisyan, Ilia Yampolsky
Estadísticas
Para todos los análisis estadísticos, confirme que los siguientes elementos están presentes en la leyenda de la figura, la leyenda de la
tabla, el texto principal o la sección Métodos. n/a Confirmado
El tamaño exacto de la muestra (n) para cada grupo/condición experimental, dado como número discreto y unidad de medida.
Una declaración sobre si las mediciones se tomaron de muestras distintas o si se midió repetidamente la misma muestra La(s)
prueba(s) estadística(s) utilizada(s) Y si son unilaterales o bilaterales
Sólo las pruebas comunes deben describirse únicamente por su nombre; describa las técnicas más complejas en la sección Métodos.
Descripción de todas las covariables analizadas
Una descripción de los supuestos o correcciones, como las pruebas de normalidad y el ajuste para comparaciones múltiples.
Una descripción completa de los parámetros estadísticos, incluida la tendencia central (por ejemplo, la media) u otras estimaciones básicas
(por ejemplo, el coeficiente de regresión) Y la variación (por ejemplo, la desviación típica) o las estimaciones de incertidumbre asociadas
(por ejemplo, los intervalos de confianza).
Para la comprobación de hipótesis nulas, el estadístico de la prueba (por ejemplo, F, t, r) con intervalos de confianza, tamaños del efecto,
grados de libertad y valor P anotado.
Indique los valores P como valores exactos siempre que sea conveniente.
Para el análisis bayesiano, información sobre la elección de los a priori y la configuración de la cadena de Markov Monte Carlo.
Para los diseños jerárquicos y complejos, identificación del nivel adecuado para las pruebas e información completa de los
resultados Estimaciones del tamaño de los efectos (por ejemplo, d de Cohen, r de Pearson), indicando cómo se han
calculado
Nuestra colección web sobre estadística para biólogos contiene artículos sobre muchos de los puntos anteriores.
Software y código
Información política sobre la disponibilidad del código
Código
Python para la adquisición automática de imágenes
informático Recogida de
datos
Análisis de datos
LibRaw versión 0.19.2, herramienta de línea de comandos 4channels, plugin RankFilters de ImageJ, código Python personalizado para
el tratamiento de imágenes y datos, paquete Seaborn (https://seaborn.pydata.org/), paquete scipy.stats (https://www.scipy.org/).
Paquete Scikit-posthocs Python (https:// pypi.org/project/scikit-posthocs/) para el análisis estadístico.
En el caso de los manuscritos que utilicen algoritmos personalizados o software que sean fundamentales para la investigación pero que aún no se hayan descrito en la literatura publicada,
el software debe ponerse a disposición de los editores/revisores. Recomendamos encarecidamente depositar el código en un repositorio comunitario (por ejemplo, GitHub). Para más
información, consulte las directrices de Nature Research para el envío de código y software.
Información política sobre disponibilidad de datos
Todos los manuscritos deben incluir una declaración de disponibilidad de datos. Esta declaración debe proporcionar la siguiente información,
cuando proceda:
Octubre de
2018
Datos
- Códigos de acceso, identificadores únicos o enlaces web para los conjuntos de datos disponibles públicamente
- Lista de figuras con datos brutos asociados
- Descripción de cualquier restricción a la disponibilidad de los datos
Los conjuntos de datos generados o analizados durante el presente estudio están a disposición de los autores correspondientes previa solicitud razonable.
1
investigación sobre la naturaleza |
resumen del informe
Informes específicos
Seleccione a continuación la que mejor se adapte a su investigación. Si no está seguro, lea las secciones correspondientes antes de hacer su selección.
Ciencias de la vidaCiencias sociales y
del comportamientoCiencias ecológicas
, evolutivas y medioambientales
Para obtener una copia de referencia del documento con todas las secciones, consulte nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf
Diseño de estudios de ciencias de la vida
Todos los estudios deben revelar estos puntos, incluso cuando la revelación sea
experimentos
negativa. Tamaño Los
de la
muestra descritos en este estudio se realizaron por primera vez. Debido a la naturaleza exploratoria de nuestro estudio, nos
abstuvimos de generalizaciones innecesarias. No se pudo determinar a priori un tamaño del efecto preestablecido. En los casos de evaluación
del efecto de estímulos externos sobre las plantas transgénicas, y en el caso de la determinación de la composición química de las muestras
vegetales, el tamaño de la muestra se seleccionó de acuerdo con las normas en la materia.
Exclusión de
No se excluyó ningún dato del estudio.
datos
El número de réplicas se indica explícitamente en las leyendas de las figuras. En su caso, los resultados comunicados se repitieron
sistemáticamente en varios experimentos y todas las repeticiones generaron resultados similares.
Replicación
Aleatorización
La aleatorización no es relevante para el diseño de nuestro estudio porque los investigadores estaban comparando muestras de plantas
en condiciones bien controladas. No se utilizaron sujetos humanos ni animales en el estudio.
Cegador
No se realizó cegamiento, ya que no había grupos de animales ni de humanos.
Informes sobre materiales, sistemas y métodos específicos
Requerimos información de los autores sobre algunos tipos de materiales, sistemas experimentales y métodos utilizados en muchos estudios. Indique aquí si cada
material, sistema o método de la lista es pertinente para su estudio. Si no está seguro de si un elemento de la lista se aplica a su investigación, lea la sección
correspondiente antes de seleccionar una respuesta.
n/a Participa en el estudio
n/a Participa en el estudio
Anticuerpos Líneas
ChIP-seq
celulares eucariotas
Citometría de flujo
Paleontología
Neuroimagen por resonancia magnética
Animales y otros organismos
Participantes humanos en la
investigación
Datos y
clínicos
Materiales
sistemas experimentales
Métodos
Líneas celulares eucariotas
Información política sobre líneas
celulares Fuente(s) de la(s)
HEK293T (origen desconocido)
línea(s) celular(es)
La línea celular se autentificó morfológicamente.
Contaminación por
Las líneas celulares se sometieron con frecuencia a pruebas de contaminación por micoplasma. Se verificó que la línea celular
utilizada en este estudio era negativa al micoplasma antes de emprender experimentos con ella.
Octubre de
2018
Autentificación
micoplasma
Líneas comúnmente mal identificadas
No se utilizaron células comúnmente mal identificadas. Todas las células presentaban una morfología característica
(Véase el registro ICLAC)
homogénea.
2
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