ELABORACION DE UN MANUAL DE PRACTICAS DE LA ASIGNATURA DE BIOQUIMICA

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DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA
NOMBRE DEL PROYECTO
“ELABORACION DE UN MANUAL DE PRACTICAS DE LA
ASIGNATURA DE BIOQUIMICA”
EMPRESA
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MATAMOROS
INFORME FINAL DE RESIDENCIAS PROFESIONALES
PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO QUIMICO
PRESENTA:
Petra Nataly Ortiz
Septiembre 2020 - Febrero 2021
H. MATAMOROS, TAMAULIPAS, MÉXICO.
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Preliminares
2. Agradecimientos
Le doy gracias a mi padre por apoyarme en seguir estudiando, a mi familia por
motivarme en los momentos difíciles y un agradecimiento especial a todos mis
compañeros de trabajo de la Refaccionaria Potosí por otorgarme todo el apoyo
necesario para poder estudiar y trabajar. A mis maestros y compañeros de escuela que
siempre me enseñaron nuevas cosas y me motivaron más a estudiar esta carrera y
aunque fue poco el tiempo que compartí quiero también agradecerles a mis
compañeras y compañeros del área de saneamiento de la junta de aguas y drenajes
liderados por el ingeniero Javier Treviño que me brindaron todo su apoyo y
conocimiento.
MARCO ANTONIO HERNANDEZ SANCHEZ
Gracias a mi madre por ser mi guía y enseñarme lo bueno de las cosas, por toda su
entrega para poder cumplir este logro en mi vida, gracias a ella y a su esfuerzo, es que
ahora rinde frutos. Agradezco a mi familia por animarme a seguir adelante y nunca
dejarme vencer por ninguna situación, por siempre creer en mí. También a mis
compañeros y maestros que brindaron su apoyo ante alguna duda, ayudándome a seguir
creciendo y mejorando. Y sobre todo gracias a Dios por acompañarme en cada paso a
lo largo de mi carrera.
PETRA NATALY ORTIZ
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3. Resumen
El ¨Manual de prácticas de la asignatura de bioquímica¨ se presenta avocando a los
contenidos del mismo y está pensado como un apoyo didáctico para el estudiante, que
garantiza y facilita aspectos importantes en la formación presente, y que puede
auxiliarlo en sus tareas a futuro.
El propósito de este manual es su uso constante en el laboratorio, para así familiarizar al
estudiante con la metodología de trabajo de la Bioquímica, proporcionándole un
ambiente donde tenga oportunidad de encontrarse con sustancias e instrumentos que lo
motive a experimentar.
El presente manual contiene 13 prácticas de laboratorio, que se pueden realizar en
equipo o de manera individual. Ya que es considerado como un lugar donde el trabajo
en equipo se facilita, da lugar a un proceso de constante integración, comunicación,
investigación, construcción de ideas, surgimiento de nuevas preguntas, donde las
actividades experimentales que mencionaremos más adelante, propicien la
reorganización de conocimientos logrando alcanzar un aprendizaje significativo.
Se propuso este manual para reforzar el proceso de enseñanza, requiriendo de la
participación del estudiante y la guía del profesor en el laboratorio. Para que así futuras
generaciones puedan llevarlo a cabo de la mejor manera. También se anexaron
algunas normas de seguridad que se deben seguir dentro del laboratorio, estas
incluyen normas generales y normas para manipular instrumentos y productos.
Cada tema que se verá a continuación está 100% pensado para que el estudiante
obtenga el mejor entendimiento.
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4. INDICE DE CONTENIDO
5. Introducción ................................................................................................................. 6
6. Objetivo general .......................................................................................................... 7
6.1 Objetivos específicos ............................................................................................. 7
7. Justificación ................................................................................................................. 7
8. Marco teórico .............................................................................................................. 7
8.1 Cambios de energía ............................................................................................... 7
8.1.1 Reacciones exotérmicas.................................................................................. 8
8.1.2 Reacciones endotérmicas ............................................................................... 8
8.1.3 Transformación energética .............................................................................. 9
8.2 Aminoácidos .......................................................................................................... 9
8.2.1 Propiedades de los aminoácidos ................................................................... 10
8.2.2 Ninhidrina en aminoácidos............................................................................. 10
8.3 Cromatografía ...................................................................................................... 11
8.2.4 Clasificación de las técnicas cromatográficas................................................ 11
8.2.5 Etapas en la realización de una cromatografía .............................................. 13
8.3 Reacción de adamkiewicz.................................................................................... 14
8.4 Enzimas ............................................................................................................... 14
8.4.1 Cinética enzimática........................................................................................ 15
8.5 Carbohidratos ...................................................................................................... 17
8.5.1 Monosacáridos .............................................................................................. 17
8.5.2 Disacáridos .................................................................................................... 21
8.5.3 Polisacáridos ................................................................................................. 22
8.6 Calorimetría ......................................................................................................... 24
8.7 Glucolisis.............................................................................................................. 25
8.8 Ácido cítrico ......................................................................................................... 26
8.8.1 Producción y propiedades del ácido cítrico.................................................... 27
8.9 Electroforesis ....................................................................................................... 28
9. Resultados ................................................................................................................ 30
10. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................... 30
11. Competencias desarrolladas ................................................................................... 31
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12. FUENTES DE INFORMACION ............................................................................... 31
13. ANEXOS ................................................................................................................. 35
13.1 Normas de seguridad en el laboratorio ............................................................ 35
13.1.1 Normas generales ....................................................................................... 35
13.1.2 Normas para manipular instrumentos y productos ...................................... 35
13.2 Manual de prácticas de bioquímica................................................................. 36
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5. Introducción
Las prácticas de laboratorio en este manual corresponden a la necesidad de presentar
demostraciones de los conocimientos revisados durante el curso de bioquímica en el
programa educativo del Instituto Tecnológico de Matamoros.
La bioquímica es una ciencia joven que alberga un conjunto de conocimientos sobre los
componentes moleculares de la célula, sus interacciones y reacciones, de esta forma
brinda un panorama general del funcionamiento celular. Dicho estudio es básico para el
entendimiento de la vida a cualquier nivel y de cualquier especie. Las practicas son una
forma sencilla de demostrar los fenómenos y características de las principales
biomoléculas (glúcidos y proteínas) así como la ruta inicial del metabolismo energético.
El estudio de la bioquímica es básico para integrar los conocimientos adquiridos en
cada una de las áreas terminales de la carrera, y serán de gran utilidad en el
desempeño profesional; debido a los avances vertiginosos en la tecnología a partir de la
mitad del siglo pasado, que han acompañado y favorecido el mejor conocimiento.
La clase teórica tiene como complemento la actividad práctica, obteniendo la ayuda
necesaria para que los estudiantes adquieran destrezas para conocer y experimentar
las propiedades físicas, químicas y biológicas de las moléculas.
Debido a que se utilizan materiales provenientes de diversos seres vivos, es importante
la seriedad y responsabilidad para el estudio detallado de los antecedentes académicos,
la metodología a utilizar y para contar con reactivos y material limpio y suficiente, así
como conocer y aplicar las normas oficiales vigentes y las buenas prácticas de
laboratorio.
Uno de los problemas a resolver son las técnicas y métodos, estos fueron actualizados
con la finalidad de que cada grupo de alumnos pueda obtener resultados exactos,
precisos y específicos.
Esta asignatura aporta al perfil profesional del ingeniero bioquímico e ingeniero
ambiental, los conocimientos que permiten su desarrollo y utilización en los diferentes
procesos industriales necesarios para diseñar, seleccionar, adaptar, operar, controlar,
simular, optimizar y escalar equipos y procesos en los que se aprovechen de manera
sustentable los recursos bióticos relacionados con el campo de acción del ingeniero, así
que en las siguientes practicas veremos experimentalmente un poco de lo mucho que
puede realizar un futuro ingeniero ambiental.
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6. Objetivo general
Realizar un manual de prácticas de la asignatura de bioquímica para utilizarlo como
complemento a la asignatura, cumpliendo con los requisitos dados en el temario
impuestos por el Tecnológico Nacional de México.
6.1 Objetivos específicos
-Complementar la materia de Bioquímica de la mejor manera, de forma que el alumnado,
comprenda los temas de la asignatura.
-Investigar las aplicaciones de la Bioquímica y llevarlas a cabo en el laboratorio.
-Vincular la teoría aprendida en clase con la práctica. Promoviendo la participación
activa en cada una de ellas, además, se pretende motivar al alumno a la investigación y
al estudio de situaciones que relacionen hechos y fenómenos de la vida cotidiana en
ellas, obteniendo conocimientos cada vez más precisos en el laboratorio.
7. Justificación
La Práctica en el Instituto Tecnológico de Matamoros es el espacio de integración teóricopráctico, donde se da con mayor madurez, la construcción e integración de
conocimientos en pro de la cualificación continua de la acción profesional, una
construcción basada en vivencias que permite la articulación entre el pensar, el sentir y
el actuar, con un ciclo continuo de "acción - reflexión - acción", frente al compromiso
social que se adquiere, cuando se elige y ejerce la profesión.
Lo anterior, hace necesaria la divulgación de un Manual de Práctica que proporcione
estrategias académicas en la continua cualificación profesional de los estudiantes del
ITM, que les permita enfrentarse al entorno, con seguridad y responsabilidad, lo cual,
sólo será posible, si se posee el conocimiento, tanto de la profesión, como de las normas
que rigen las acciones de ésta.
8. Marco teórico
La Bioquímica es una ciencia que estudia la composición química de los seres vivos,
especialmente las proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos. Intenta
comprender la base química de la vida: las moléculas que componen las células y los
tejidos, que catalizan las reacciones químicas del metabolismo celular como la
digestión, la fotosíntesis y la inmunidad, entre otras muchas cosas.
También es empírica y, por tanto, su desarrollo está ligado a la observación y a la
experimentación. Para generar conocimientos, la Bioquímica utiliza el denominado
método científico. El método científico es un método o procedimiento que ha
caracterizado a la ciencia natural, que consiste en la observación sistemática, medición,
experimentación, la formulación, análisis y modificación de las hipótesis.
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8.1 Cambios de energía
En las reacciones químicas se producen transformaciones de energía, además de
materia. La energía interna de una sustancia es la suma de todas las energías de esa
sustancia, debida a las posiciones y los movimientos de las partículas subatómicas, de
los átomos y de las moléculas que la constituyen, y a las uniones de los átomos.
Las sustancias almacenan energía en sus átomos y moléculas. Estas partículas
materiales pueden tener tres tipos de movimientos: de traslación, de rotación y de
vibración. Según esto los átomos o moléculas poseen energía cinética debida a estos
continuos movimientos. La energía aumentará con la temperatura, ya que un aumento
de ésta supone una mayor agitación molecular. Pero los sistemas no sólo poseen
energía por los movimientos de las partículas, sino también por la posición relativa de
unas partículas respecto a otras, es decir, poseen energía potencial, que resulta menor
en los gases que en los líquidos y en éstos menor que en los sólidos, pues sus moléculas
se hayan más próximas. En las moléculas también hay energía debida a los enlaces
entre sus átomos. Incluso en los propios átomos también hay energía, según las
posiciones y los movimientos de sus partículas elementales. La suma de todas estas
energías es la energía interna
En todas las reacciones químicas se produce una variación en la energía interna de las
sustancias que intervienen.
En el estado inicial los reactivos tienen una energía interna y en el estado final los
productos tienen otra. La diferencia de energía entre ambos estados se absorbe
(reacciones endoenergéticas) o se desprende en la reacción (reacciones
exoenergéticas), Si el sistema químico disminuye su energía, la comunica al medio
ambiente, y si la aumenta, es porque la ha absorbido de él.
Atendiendo al intercambio de energía en forma de calor con el exterior, las reacciones
se clasifican en exotérmica y endotérmicas.
8.1.1 Reacciones exotérmicas
La termoquímica es una parte de la química que estudia la relación del calor con las
reacciones químicas.
A las reacciones químicas que liberan calor se les llaman exotérmicas. A temperatura
ambiente, el calor liberado por una reacción química es suficiente para producir un
aumento de temperatura que percibes al tocar el tubo de ensayo o matraz y sentirlo
“caliente”. Las moléculas excitadas del vidrio vibran tan intensamente que al tocarlas
pueden lastimar o “quemar” tu piel dependiendo de la cantidad de calor generado.
(Reacción exotérmica, s.f.)
Una reacción exotérmica es aquella que al efectuarse libera (genera o produce) calor.
8.1.2 Reacciones endotérmicas
Una reacción endotérmica es aquella que para efectuarse necesita calor. A temperatura
ambiente, algunas reacciones endotérmicas toman el calor suficiente del medio en que
se encuentran, para producir una disminución de temperatura observable. La reacción
se siente “fría al tacto”. Para que observes un ejemplo, observa el siguiente video:
Las reacciones exotérmicas y endotérmicas, de manera general, se llaman reacciones
térmicas para resaltar el papel del calor en el cambio. (Reacción endotérmica, s.f.)
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8.1.3 Transformación energética
Una transformación de energía es el cambio de energía de una forma a otra.
El Principio de conservación de la energía indica que la energía no se crea ni se destruye;
sólo se transforma de unas formas en otras. En estas transformaciones, la energía total
permanece constante; es decir, la energía total es la misma antes y después de cada
transformación.
En el caso de la energía mecánica se puede concluir que, en ausencia de rozamientos y
sin intervención de ningún trabajo externo, la suma de las energías cinética y potencial
permanece constante. Este fenómeno se conoce con el nombre de Principio de
conservación de la energía mecánica. La bioenergética, o termodinámica bioquímica, es
el estudio de los cambios de energía que acompañan a reacciones bioquímicas.
(Transformaciones energéticas, s.f.)
8.2 Aminoácidos
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen las funciones ácido
carboxílico y amino. Dos aminoácidos se pueden unir en condiciones adecuadas, a
través de un enlace amida, formando un dipéptido. El dipéptido puede incorporar un
tercer aminoácido, formando un tripéptido. Cadenas con más de 50 aminoácidos se
denominan proteínas. (Fernández, German, s.f. Aminoácidos)
Figura 1 Enlace Peptídico.
Se denomina enlace peptídico, al enlace que une los dos aminoácidos para formar el
dipéptido (Fig. 1).
Los aminoácidos se pueden clasificar en a, b o g-aminoácidos dependiendo de la
posición del grupo amino en la cadena carbonada (Fig. 2).
Figura 2 Clasificación de los aminoácidos.
Son especialmente importantes los a-aminoácidos, puesto que pertenecen a esta familia
los 20 aminoácidos que forman parte de las proteínas.
Se observa que todos los aminoácidos obtenidos a partir de proteínas (naturales)
pertenecen a la serie L (grupo amino a la izquierda en la proyección de Fischer, Fig. 3).
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Figura 3 Proyección de Fisher
8.2.1 Propiedades de los aminoácidos
Los aminoácidos son compuestos sólidos; incoloros; cristalizables; de elevado punto de
fusión (habitualmente por encima de los 200ºC); solubles en agua; con actividad óptica
y con un comportamiento anfótero.
La actividad óptica se manifiesta por la capacidad de desviar el plano de luz polarizada
que atraviesa una disolución de aminoácidos, y es debida a la asimetría del carbono α
(alfa), ya que se halla unido (excepto en la glicina) a cuatro radicales diferentes. Esta
propiedad hace clasificar a los aminoácidos en Dextrógiros (+) si desvían el plano de luz
polarizada hacia la derecha, y Levógiros (-) si lo desvían hacia la izquierda.
El comportamiento anfótero se refiere a que, en disolución acuosa, los aminoácidos son
capaces de ionizarse, dependiendo del pH, como un ácido (cuando el pH es básico),
como una base (cuando el pH es ácido) o como un ácido y una base a la vez (cuando el
pH es neutro). En este último caso adoptan un estado dipolar iónico conocido como
zwitterión.
Figura 4 Estado dipolar iónico.
El pH en el cual un aminoácido tiende a adoptar una forma dipolar neutra (igual número
de cargas positivas que negativas) se denomina Punto Isoeléctrico. La solubilidad en
agua de un aminoácido es mínima en su punto isoeléctrico. (Propiedades de los
aminoácidos, s.f.)
8.2.2 Ninhidrina en aminoácidos
Es un reactivo común para la detección de amoniaco, aminas primarias y secundarias,
también es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos.
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Reacciona con todos los grupos amino para formar un producto colorido azul o púrpura
(llamado púrpura de Ruhemann).
La amina se condensa con una molécula de ninhidrina para dar una base de Schiff. En
este paso, debe haber también un protón alfa para la transferencia de base de Schiff, por
lo que una amina terciaria no puede ser detectada por la prueba de ninhidrina. La
reacción de ninhidrina con aminas secundarias da una sal de iminio generalmente de
color amarillo-anaranjado.
Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en general, ya que
detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidos y muchas
aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla.
Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos
por colorimetría.
8.3 Cromatografía
La Cromatografía es una técnica de separación en la que los componentes de una
muestra se separan en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una
fase móvil. El objetivo de la fase estacionaria es retrasar el paso de los componentes de
la muestra. Cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes
velocidades, estos se separan en determinados tiempos. Cada componente tiene un
tiempo de paso característico a través del sistema, llamado tiempo de retención. La
separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención del analito difiere del
resto de componentes de la muestra.
La cromatografía puede ser preparativa y analítica.
•
•
La cromatografía preparativa se refiere a la separación de los componentes de
una mezcla para su posterior procesamiento, y se puede considerar un método
de purificación.
En la cromatografía analítica generalmente se hace con una pequeña muestra
permitiendo para cuantificar la proporción relativa de los componentes en la
mezcla.
La cromatografía es una de los principales métodos analíticos y permite la separación y
cuantificación de sustancias muy similar en estructura y propiedades químicas. (TP
Laboratorio químico, s.f. ¿Qué es la cromatografía?)
8.2.4 Clasificación de las técnicas cromatográficas
De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:
Cromatografía plana
Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa
delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido. (Cromatografía,
s.f.)
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Figura 5 Cromatografía plana
Cromatografía ascendente en capa fina
Cromatografía ascendente en capa fina: colocación de una muestra (con 3
componentes), desarrollo de la cromatografía y revelado del cromatograma.
Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente
con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil.
Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D
Figura 6 Cromatografía ascendente.
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los
componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance.
Cromatografía en columna
F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud.
F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.
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F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso
más) de longitud.
Avance de las moléculas por la columna.
Figura 7 Cromatografía en columna.
Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos
momentos a lo largo de la elución:
1.
2.
3.
4.
Muestra depositada sobre el lecho cromatográfico
La muestra penetra en el lecho
Se añade fase móvil
Comienza la separación de los componentes de la muestra
7. Eluye el primer componente
9. Eluye el segundo componente
De acuerdo con el estado físico de las fases
Cromatografía de gases
Con fase móvil gaseosa:
•
•
Cromatografía gas-líquido
Cromatografía gas-sólido
Cromatografía líquida
Con fase móvil líquida:
•
•
Cromatografía líquido-líquido
Cromatografía líquido-sólido
8.2.5 Etapas en la realización de una cromatografía
Cromatografía en columna
1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.
2.- Aplicación de la muestra.
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3.- Elución:
a) Lavado de componentes no retenidos.
b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha de los componentes
retenidos.
4.- Recolección de fracciones o análisis del efluente en continuo.
5.- Análisis, cuantificación o revelado.
6.- Regeneración de la fase estacionaria.
Cromatografía plana (papel o capa fina)
1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.
2.- Aplicación de la muestra.
Secado.
3.- Desarrollo de la cromatografía.
4.- Secado de la placa.
5.- Revelado y cuantificación en su caso.
8.3 Reacción de adamkiewicz
La reacción de Adamkiewicz es parte de una prueba bioquímica que se utiliza para
detectar la presencia del aminoácido triptófano en las proteínas. Cuando el ácido
sulfúrico concentrado se combina con una solución de proteína y ácido glioxílico, se
produce un color rojo / púrpura. Lleva el nombre de su descubridor, Albert Wojciech
Adamkiewicz. El ácido sulfúrico puro y una cantidad mínima de formaldehído puro, junto
con un agente oxidante introducido en el ácido sulfúrico, permiten que prosiga la
reacción. En esta reacción de oxidación-reducción, el agente oxidante puede ser la
amalgama de sodio, que reduce el ácido oxálico, mientras que el agente reductor es el
ácido nítrico, que oxida un alcohol. La reducción del ácido oxálico se realiza en una
solución de ácido sulfúrico evitando un aumento de temperatura dentro del cátodo. Una
vez finalizada la reducción, el ácido oxálico disminuye y el ácido glioxílico liberado
produce las moléculas de indol, lo que le da el color rojo / púrpura.
8.4 Enzimas
Las enzimas son proteínas que se comportan como catalizadores muy potentes y
eficaces de las reacciones químicas de los sistemas biológicos. (Cinética enzimática,
2010)
La catálisis enzimática es esencial para los sistemas vivos.
La mayoría de las reacciones químicas ocurrirían muy lento en condiciones
biológicamente significativas. Hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar
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reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura
o pH.
Las biomoléculas son muy estables a pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso.
•
Catalizadores
Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan
indefinidamente, in vivo.
No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, sino que
solamente aceleran las que espontáneamente podrían producirse. ΔGo <0
Los enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de
reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido
de ellos. Esto es cierto in vivo, peor no in vitro, lo cual es el origen de las
Biotransformaciones.
•
Estructura-actividad catalítica
La actividad catalítica depende del mantenimiento de la conformación proteica nativa. Si
se desnaturaliza la proteína o se disocia en subunidades pierde su actividad.
Estructuras 1°, 2°, 3° y 4° son esenciales.
El sustrato es reconocido por la enzima (centro de reconocimiento) y Biotransformado en
el centro activo.
•
Cofactor (coenzima)
Átomo, ion o molécula que participa en el proceso catalítico sin ser enzima ni substrato.
Los cofactores participan de dos maneras distintas:
1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y no son modificados en el ciclo
catalítico. – cofactor.
2. Como un segundo substrato; se ven modificados en
el ciclo catalítico y por lo general requieren otra enzima
para volver al estado original. - coenzima
8.4.1 Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario
purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de
pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes
de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad
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máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los
productos o la desaparición de los reactivos. (Cinética enzimática, s.f.)
Figura 8 Cinética enzimática
Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función
del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la
cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación
del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción
(Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad
inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la
curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0
se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda
considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además,
en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad
de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta
forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.
Figura 9 Ecuación de velocidad
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de
sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima
constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura
de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional
a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0,
el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0.
En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).
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Figura 10 Enzima saturada por sustrato
8.5 Carbohidratos
La fuente principal de energía para casi todos los asiáticos, africanos y latinoamericanos
son los carbohidratos. Los carbohidratos constituyen en general la mayor porción de su
dieta, tanto como el 80 por ciento en algunos casos. Por el contrario, los carbohidratos
representan únicamente del 45 al 50 por ciento de la dieta en muchas personas en países
industrializados. (Macronutrientes, s.f.)
Los carbohidratos son compuestos que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno en las
proporciones 6:12:6. Durante el metabolismo se queman para producir energía, y liberan
dióxido de carbono (CO2) y agua (H2O). Los carbohidratos en la dieta humana están
sobre todo en forma de almidones y diversos azúcares. Los carbohidratos se pueden
dividir en tres grupos: monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
8.5.1 Monosacáridos
Los monosacáridos son moléculas relativamente pequeñas que constituyen la base
estructural de carbohidratos más complejos. Estos varían en términos de su estructura y
de su configuración estereoquímica. (Raven, P.H. 2014, Isómeros de azúcar)
Los monosacáridos son compuestos derivados de aldehídos o cetonas y contienen al
menos tres átomos de carbono en su estructura. No pueden sufrir procesos de hidrólisis
para descomponerse en unidades más simples.
El número tan alto de moléculas que pueden formar los monosacáridos hace posible que
sean ricos tanto en información como en función. De hecho, los carbohidratos son las
biomoléculas más abundantes en los organismos.
La unión de los monosacáridos da lugar a los disacáridos – como la sacarosa, lactosa y
maltosa – y a polímeros de mayor tamaño como el glucógeno, el almidón y la celulosa,
los cuales desempeñan funciones de almacenamiento energético, además de funciones
estructurales.
•
Características generales de los monosacáridos
Apariencia
18
De manera general, los monosacáridos son sustancias sólidas, de color blanco y de
apariencia cristalina con sabor dulce. Como son sustancias polares, son altamente
solubles en agua e insolubles en disolventes no polares.
Enlaces glicosídicos
Pueden enlazarse con otros monosacáridos por medio de enlaces glicosídicos y formar
una diversidad de compuestos, de gran importancia biológica y estructuralmente muy
variados.
Son los carbohidratos más sencillos
Los monosacáridos son los carbohidratos más sencillos. Estructuralmente son hidratos
de carbono y muchos de ellos pueden ser representados con la fórmula empírica (CH2O)n. Representan una fuente importante de energía para las células y forman parte
de distintas moléculas indispensables para la vida, como el ADN.
Compuestos por átomos de carbono
Los monosacáridos están compuestos por átomos de carbono, oxígeno e hidrógeno.
Cuando se encuentran en solución, la forma predominante de azúcares (como la ribosa,
la glucosa o la fructosa) no es una cadena abierta, sino que forman anillos
energéticamente más estables.
Los monosacáridos más pequeños están constituidos por tres carbonos y son la
dihidroxiacetona y los d- y l- gliceraldehido.
Grupo hidroxilo y carbonílico
El esqueleto carbonado de los monosacáridos no posee ramificaciones, y todos los
átomos de carbono, excepto uno, posee un grupo hidroxilo (-OH). En el átomo de
carbono restante se encuentra un oxígeno carbonílico que puede estar combinado en un
enlace acetal o cetal.
•
Estructura
Figura 11 Estructura de un monosacárido
Estereoisomería
19
Los monosacáridos – con la excepción de la dihidroxiacetona – poseen átomos de
carbono asimétrico, es decir, están enlazados a cuatro elementos o sustituyentes
distintos. Estos carbonos son los responsables de la aparición de moléculas quirales y
por tanto de isómeros ópticos.
Hemiaceles y hemicetales
Los monosacáridos tienen la capacidad de formación de anillos gracias a la presencia
de un grupo aldehído que reacciona con un alcohol y genera un hemiacetal. Igualmente,
las cetonas pueden reaccionar con un alcohol y general un hemicetal.
Los diagramas de Haworth sugieren que la estructura de los monosacáridos posee una
estructura plana, sin embargo, esta visión no es cierta.
Los anillos no son planos por la geometría tetraédrica presente en sus átomos de
carbono, por ello pueden adoptar dos tipos de conformaciones, llamadas silla y navío o
nave.
La conformación en forma de silla es, en comparación con la de nave, más rígida y
estable, por esta razón es la conformación que predomina en las disoluciones que
contienen hexosas.
En la forma de silla se pueden distinguir dos clases de sustituyentes, llamados axial y
ecuatorial. En las piranosas, los grupos hidroxilo ecuatoriales sufren procesos de
esterificación con mayor facilidad que los axiales.
•
Propiedades
Mutarrotación y formas anoméricas de la d-glucosa
Cuando se encuentran en disoluciones acuosas, algunos azúcares se comportan como
si tuvieran un centro asimétrico adicional. Por ejemplo, la d-glucosa existe en dos formas
isómeras que se diferencian en la rotación específica: la α-d-glucosa β-d-glucosa.
A pesar que la composición elemental es idéntica, ambas especies varían en términos
de sus propiedades físicas y químicas. Cuando estos isómeros entran en solución
acuosa, se evidencia un cambio en la rotación óptica a medida que pasa el tiempo,
alcanzando un valor final en el equilibrio.
Este fenómeno se denomina mutarrotación y ocurre cuando se mezclan un tercio de
isómera alfa con dos tercios del isómero beta, a una temperatura promedio de 20 °C.
Modificación de los monosacáridos
Los monosacáridos pueden formar enlaces glicosídicos con alcoholes y aminas para
formar moléculas modificadas.
Del mismo modo, pueden ser fosforilados, es decir, un grupo fosfato puede ser añadido
al monosacárido. Este fenómeno es de gran importancia en diversas rutas metabólicas.
20
A medida que la glicólisis avanza, se generan otros intermediarios metabólicos, como la
dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehído 3-fosfato, que son azúcares fosforilados.
El proceso de fosforilación otorga una carga negativa a los azúcares, evitando que estas
moléculas puedan abandonar la célula fácilmente. Además, les da reactividad para que
puedan formar enlaces con otras moléculas.
Acción del pH en los monosacáridos
Los monosacáridos son estables en ambientes a altas temperaturas y con ácidos
minerales diluidos. En contraste, cuando son expuestos a ácidos muy concentrados, los
azúcares sufren un proceso de deshidratación que produce derivados aldehídicos del
furano, llamados furfurales.
Cuando los furfurales se condensan con los fenoles, producen sustancias coloreadas
que pueden ser usados como marcadores en el análisis de los azúcares.
Por otro lado, los ambientes alcalinos suaves producen reordenaciones en torno al
carbono anomérico y al carbón contiguo. Cuando se trata a la d-glucosa con sustancias
básicas se crea una mezcla de d-glucosa, d-frutosa y d-manosa. Estos productos ocurren
a temperatura ambiente.
Cuando ocurre un incremento de la temperatura o de las concentraciones de sustancias
alcalinas, los monosacáridos sufren procesos de fragmentación, polimerización o
reordenación.
•
Funciones
Fuente de energía
Los monosacáridos, y los carbohidratos de manera general, los elementos
indispensables en la dieta como fuentes de energía. Además de funcionar como
combustible celular y almacenamiento de energía, funcionan como metabolitos
intermediarios en las reacciones enzimáticas.
Interacción celular
También pueden estar enlazados a otras biomoléculas – como proteínas y lípidos – y
cumplir funciones claves relacionadas con la interacción celular.
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son las moléculas responsables de la herencia y
poseen en su estructura azúcares, específicamente pentosas. La d-ribosa es el
monosacárido que se encuentra en el esqueleto del ARN. Los monosacáridos también
son componentes importantes de lípidos complejos.
Componentes de los oligosacáridos y polisacáridos
Los monosacáridos son los componentes estructurales básicos de los oligosacáridos (del
griego oligo, que significa pocos) y de los polisacáridos, que contienen muchas unidades
de monosacáridos, ya sea de una sola clase o variados.
21
•
Clasificación
Cetonas y aldehídos
Los monosacáridos se clasifican de dos maneras distintas. La primera depende de la
naturaleza química del grupo carbonilo, ya que este puede ser una cetona o un aldehído.
La segunda clasificación se enfoca en el número de átomos de carbono presente en el
azúcar.
Cetosas y aldosas
Por ejemplo, la dihidroxiacetona contiene un grupo cetona y por ello se le llama “cetosa”,
en contraste con el gliceraldehido que contiene un grupo aldehído y se considera una
“aldosa”.
A los monosacáridos se les asigna un nombre en específico dependiendo del número de
carbonos que contenga su estructura. Así, un azúcar con dos, tres, cuatro, cinco, seis y
siete átomos de carbono se denominan diosas, triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y
heptosas, respectivamente.
De todas las clases de monosacáridos mencionados, las hexosas son, por mucho, el
grupo más abundante.
Ambas clasificaciones pueden combinarse y el nombre otorgado a la molécula es una
mezcla del número de carbonos y del tipo de grupo carbonilo.
En el caso de la glucosa (C6H12O6) es considerada una hexosa porque presenta seis
átomos de carbono y además es una aldosa. Según las dos clasificaciones esta molécula
es una aldohexosa. Del mismo modo, la ribulosa es una cetopentosa.
8.5.2 Disacáridos
Los disacáridos (di- = “dos”) se forman cuando dos monosacáridos se unen por medio
de una reacción de deshidratación, también conocida como reacción de condensación o
síntesis por deshidratación. En este proceso, el grupo hidroxilo de un monosacárido se
combina con el hidrógeno de otro, libera una molécula de agua y forma un enlace
covalente conocido como enlace glucosídico.
22
Figura 12 Enlace glucosídico.
En algunos casos, es importante saber cuáles átomos de carbono de los dos anillos del
azúcar están unidos a través de un enlace glucosídico. A cada átomo de carbono de un
monosacárido se le asigna un número, comenzando con el carbono terminal más
cercano al grupo carbonilo (cuando el azúcar se encuentra en su forma lineal). Arriba se
muestra la numeración de la glucosa y la fructosa. En una molécula de sacarosa, el
carbono 1 de la glucosa está unido al carbono 2 de la fructosa, por lo que se llama enlace
1-2 glucosídico.
Entre los disacáridos comunes se encuentran la lactosa, la maltosa y la sacarosa. La
lactosa es un disacárido compuesto de glucosa y galactosa y se encuentra de manera
natural en la leche. Mucha gente adulta no puede digerir la lactosa, lo que causa
intolerancia a la lactosa (la cual tus amigos o tú seguramente conocen). La maltosa, o
azúcar de malta, es un disacárido compuesto de dos moléculas de glucosa. El disacárido
más común es la sacarosa (azúcar de mesa), la cual se compone de glucosa y fructosa.
8.5.3 Polisacáridos
Los polisacáridos son largas moléculas de hidratos de carbono formadas por la unión de
numerosas unidades individuales de monosacáridos unidas entre sí por enlaces
glicosídicos. Los polisacáridos son carbohidratos, y por lo tanto contienen carbono,
hidrógeno, y oxígeno y tienen la fórmula general Cx(H2O)y.
Convencionalmente, se ha considerado polisacárido a aquel polímero constituido por
más de 10 monosacáridos unidos por distintos enlaces glucosídicos; los compuestos de
menos de 10 monosacáridos (entre 2 y 9) son los oligosacaridos. A pesar de esta
distinción, la gran mayoría de los polisacáridos naturales contienen cientos de
monómeros y, en ocasiones, varios miles. No producen verdaderas soluciones, sino más
bien dispersiones de tamaño coloidal; puros no tienen color, aroma o sabor. Su peso
molecular, que puede llegar a ser hasta de millones, es en realidad un promedio de los
pesos, puesto que las moléculas no son iguales y siempre presentan una distribución de
valores.
23
Los polisacáridos se encuentran como cadenas lineales, o bien, ramificadas, que a su
vez pueden estar integradas por un solo tipo de monosacárido (homopolisacárido). De
cualquier manera, sus componentes siempre están unidos regularmente con una
secuencia y estructura repetitivas, representando polímeros con un alto grado de
ordenación. (Polisacáridos, 2013)
De los hidratos de carbono contenidos en la mayoría de los tejidos animal y vegetal, los
polisacáridos son los más abundantes; los azúcares libres generalmente están en una
menor concentración. Interaccionan fuertemente con las proteínas en los sistemas
biológicos lo cual determina muchas de las funciones celulares; la unión entre estos
polímeros se efectúa principalmente por enlaces electrostáticos, aun cuando pueden
existir puentes de hidrógeno, hidrófobos y, en ocasiones, covalentes. Algunos de estos
complejos forman geles cuando se calientan y producen una estructura ordenada
tridimensional en la que queda atrapada el agua.
De acuerdo con su función biológica los polisacáridos se han divido en dos grandes
grupos:
1. Los que constituyen la estructura celular y les confieren rigidez a los tejidos (celulosa,
pectinas, gomas).
2. Los que representan la reserva energética de animales y vegetales (glucógeno, inulina
y almidón).
•
Características de los polisacáridos
Forman puentes de hidrógeno intermoleculares muy fuertes
Producen fibras muy rígidas
Insoluble en agua
Enlaces glucosídicos generalmente B
Muy resistentes a enzimas, microorganismos y agentes químicos
Sus dispersiones son de alta viscosidad
En los polisacáridos, al igual que la de los oligosacáridos, la hidrólisis depende del pH,
la temperatura, el tipo de enlace glucosídico, la configuración anomérica y la presencia
de grupos voluminosos (vg. sulfatos) que ejercen un efecto estabilizador. Por ejemplo,
los α-D-enlaces del almidón son más susceptibles que los β-D-enlaces de la celulosa; a
su vez, los α(I, 3) se rompen más fácilmente que los α(I, 6) o los α (I, 4). Las uniones en
que intervienen furanosas (fructosa) son más labiles que en las que contienen piranosas.
La presencia de grupos sulfato estabiliza los enlaces glucosídicos a pesar de que éstos
en forma individual.
Son muy sensibles a los ácidos. Los azúcares anhidros, como la 3,6-anhidro-galactosa,
son sumamente hábiles y aceleran la hidrólisis de los polisacáridos. Al igual que otras
24
macromoléculas, estos polímeros también pueden tener una conformación ordenada o
carecer de ella y estar al "azar"; cada una de éstas es el resultado de las interacciones
que tienen sus monómeros constituyentes y que, en términos generales, se agrupan en
su entropía conformacional. Debido al gran número de uniones covalentes y no
covalentes, los polisacáridos, con un cambio muy pequeño en su energía interna,
presentan una cierta rotación y flexibilidad de movimiento. Las estructuras de hélice,
como en el almidón y la celulosa, son más ordenadas y rígidas, que las estructuras al
azar.
Los polisacáridos se encuentran en forma natural en muchos alimentos, pero en algunas
ocasiones se añaden a otros para obtener la formulación correcta, coma en el caso del
almidón, la carragaenina y las pectinas, que se utilizan por sus propiedades funcionales.
Por su gran capacidad de retener agua, producen partículas coloidales muy hidratadas,
razón por la cual a los polisacáridos se les da el nombre de hidrocoloides.
8.6 Calorimetría
La Calorimetría es la parte de la física que se encarga de medir la cantidad de calor
generada o perdida en ciertos procesos físicos o químicos.
El aparato que se encarga de medir esas cantidades es el calorímetro. Consta de un
termómetro que está en contacto con el medio que está midiendo. En el cual se
encuentran las sustancias que dan y reciben calor. Las paredes deben estar lo más
aisladas posible ya que hay que evitar al máximo el intercambio de calor con el exterior.
De lo contrario las mediciones serían totalmente erróneas. (André Patricio, 2013, ¿Qué
es la calorimetría?)
También hay una varilla como agitador para mezclar bien antes de comenzar a medir.
Básicamente hay dos tipos de calorímetros. Los que trabajan a volumen constante y los
que lo hacen a presión constante.
Figura 13 Calorímetro
La cantidad de calor que recibe o transmite un cuerpo está determinada por la siguiente
fórmula:
Q = m x Ce x (Tf – Ti)
25
Donde Q es el calor, m es la masa del cuerpo, Ce es el calor específico del cuerpo, que
está determinada por el material que lo compone. Y la variación de temperatura se
representa por la diferencia entre Tf y Ti (temperatura final e inicial).
Cuando un cuerpo transmite el calor hay otro que lo recibe. Este es el principio del
calorímetro. El termómetro es el que determinara la temperatura final del proceso
también llamada temperatura de equilibrio. El líquido más usado es el agua, que actúa
como receptor de las calorías que transmite el cuerpo.
8.7 Glucolisis
La Glucolisis o glicolisis es la ruta metabólica mediante la que se degrada la glucosa
hasta dos moléculas de piruvato, a la vez que se produce energía en forma de ATP y de
NADH. (Tejedor MC, 2014)
La ruta está formada por diez reacciones enzimáticas: 3 irreversibles y 7 reversibles
Es una ruta metabólica universalmente distribuida en todos los organismos y células.
-
Se
considera
que
tiene
2 fases
o
etapas:
a) Preparatoria: Cuatro reacciones: dos son de fosforilación y consumen 2 ATP por
molécula de glucosa. La ruptura de la hexosa-BP acaba en 2 de gliceraldehido-3-P.
b) De beneficios: Oxidación del gliceraldehido-3-fosfato (x 2) hasta piruvato (x 2) y
formación acoplada de ATP en 2 de las reacciones, en total se forman 4 ATP y 2 NADH.
26
Figura 14 Glucolisis
Regulación de la glucolisis
Se realiza sobre las tres enzimas que catalizan las tres reacciones irreversibles, que,
junto a la catalizada por la fosfoglicerato quinasa (7), son fuertemente exergónicas.
Figura 15 Regulación de la glucolisis.
8.8 Ácido cítrico
Los ácidos carboxílicos son los ácidos orgánicos, se encuentran ampliamente
distribuidos en la naturaleza, ya sea en su forma original o en la de alguno de sus
derivados (ésteres, amidas y anhídridos); por ejemplo: el ácido cítrico se encuentra en
las frutas como los limones y las naranjas; el ácido acético en el vinagre; el ácido láctico
se produce en la leche cuando esta inicia su descomposición, dando como consecuencia
un sabor “agrio”. (Muñoz-Villa Alejandra, 2014, Acido cítrico)
Los ácidos carboxílicos pueden ser de origen natural y/o sintético, donde se destacan el
ácido cítrico ampliamente usado como reactivo en síntesis orgánica.
El ácido cítrico (ácido 2-hidroxi-1,2,3- propanotricarboxílico), es uno ácido orgánico que
puede ser considerado natural, sin embargo, también puede ser sintetizado vía
laboratorio, es un ácido orgánico que se encuentra en casi todos los tejidos animales y
27
vegetales, se presenta en forma de ácido de frutas en el limón, mandarina, lima, toronja,
naranja, piña, ciruela, guisantes, melocotón, así como en los huesos, músculos y sangre
de animales. Es considerado un ácido carboxílico versátil y ampliamente utilizado en el
campo de la alimentación, de los productos farmacéuticos y cosméticos, entre otros.
(Thangavelu y col. 2011). Físicamente es un polvo cristalino blanco que puede
presentarse de manera anhidra o como mono hidrato, considerado un tríacido
carboxílico.
Figura 16 Estructura química del ácido cítrico.
Actualmente, la producción mundial de ácido cítrico se estima en millones de toneladas
por año, destacando que la producción en su mayoría es lleva a cabo por fermentación,
donde se involucra el uso de dextrosa o melaza de caña de azúcar como materia prima
y Aspergillus niger como organismo de fermentación. El constante aumento en su
consumo cada año, genera la necesidad de encontrar nuevas alternativas para su
obtención.
8.8.1 Producción y propiedades del ácido cítrico
La producción de ácidos orgánicos mediante el uso de microorganismos constituye una
fuerza motriz de gran importancia para el estudio de regulaciones metabólicas, lo cual
permite el desarrollo de la biotecnología.
La producción industrial del ácido cítrico surgió como resultado de experimentación
sistemática y exhaustiva desde los trabajos pioneros de James Currie en 1917
(Papagianni y col. 2007). Sin embargo, no es sino hasta épocas más recientes que los
avances en fisiología microbiana permiten lograr un mayor entendimiento de la relación
entre medio ambiente y acumulación de ácido cítrico (López y col 2006).
La obtención del ácido cítrico está fuertemente influenciada por la composición del
medio, especialmente en los procesos de fermentación sumergida. Se ha demostrado
que los factores que afectan principalmente a la fermentación cítrica son el tipo y la
concentración de la limitación de fuente de carbono, nitrógeno y fosfato, pH, aire, la
concentración de oligoelementos, y la morfología del microorganismo productor. Ciertos
nutrientes tienen que presentarse en exceso (tales como azúcares y proteínas), otros en
los niveles limitantes (aquellos que contengan fosfato) y otros por debajo de los valores
umbral bien establecidos.
Bioquímica de la Producción de Ácido Cítrico
28
Para revisar la bioquímica de la formación de ácido cítrico se puede decir que el exceso
de producción de ácido cítrico requiere una combinación única de las condiciones
nutricionales inusuales (exceso de fuente de carbono, iones de hidrógeno y el oxígeno
disuelto, y altas concentraciones de ciertos metales traza y de fosfato), que influyen
sinérgicamente el rendimiento de fermentación (Papagianni y col. 2007).
El ácido cítrico es un intermediario en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) o ciclo
de Krebs. Las funciones de este ciclo son generar energía en forma de ATP en
conjunción con la fosforilación oxidativa durante el metabolismo aeróbico de
carbohidratos y crear precursores de otros ciclos biosintéticos como aminoácidos. En
condiciones ambientales que promueven el desarrollo celular el ciclo funciona en estado
estacionario, los intermediarios que lo constituyen se mantienen a niveles bajos sin
acumulación de alguno en particular. Tal acumulación resultaría en un ineficiente uso de
los nutrientes. El mantenimiento de dicho estado estacionario se efectúa mediante una
regulación precisa de enzimas presentes en rutas metabólicas que alimentan el ciclo o
que parten de él. Las enzimas pueden ser controladas a nivel de síntesis de proteínas
(represión o inducción) o de actividad enzimática (inhibición o activación) (López y col.
2006).
Algunas Aplicaciones
El uso de compuestos acidulantes en la conservación y mejora de propiedades
organolépticas en alimentos es extenso, en particular, los ácidos que contienen uno o
más carboxilos son aditivos alimentarios importantes. Estos ácidos orgánicos, son
intermediarios o productos terminales de ciclos metabólicos básicos por lo cual ocurren
en una gran variedad de organismos vivientes. Tales compuestos incluyen los ácidos
cítrico, málico, láctico, acético, tartárico, fumárico y glucónico. (García y col. 1993).
El ácido cítrico se utiliza principalmente en la industria alimentaria debido a su agradable
sabor ácido y su alta solubilidad en agua. Las industrias farmacéuticas y cosméticas
retienen el 10% de su utilización y el resto se utiliza para otros fines.
8.9 Electroforesis
La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya magnitud depende del
pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se
ven sometidas a un campo eléctrico. (Electroforesis de proteínas, s.f.)
Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en
disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica
fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una
velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con
la resistencia al avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que
se desplaza.
Fuerza del campo eléctrico=Fuerza de fricción
29
q⋅E=f⋅v
q = carga (C)
E = intensidad del campo (V/m = N/C)
f = coeficiente de fricción (C·V·s / m2 = kg/s)
v = velocidad de la molécula (m/s)
El coeficiente de fricción mide la resistencia intrínseca debida a las características de
cada molécula, siendo éstas esencialmente su forma y su tamaño. Así, por ejemplo, las
moléculas grandes y de forma irregular poseen un mayor coeficiente de fricción que las
pequeñas y compactas.
La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electroforética, μ
(Z = número entero; e = carga del electrón).
En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada
molécula definirá su separación en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van
separando progresivamente unas de otras.
Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, está constituido por iones, que son
atraídos y así recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de éstos
en el campo. Todo ello hace que el tratamiento teórico cuantitativo de la electroforesis
sea muy difícil y que esta técnica resulte poco útil para obtener información precisa sobre
la estructura de las moléculas. Sin embargo, es enormemente útil como técnica analítica
y preparativa.
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
•
•
•
De frente móvil: los componentes de la muestra están presentes en toda la
disolución y se determina ópticamente la posición del frente de avance o frontera
con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran
a través de un disolvente, utilizando además un medio que da soporte a éste. En
este caso no se determina la movilidad, sino que el único objetivo de la técnica es
separar los componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica también en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso
Aplicaciones
Determinación de la masa molecular
30
Como se ha indicado, se puede obtener una estimación de la masa molecular (en kDa)
de proteínas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando
electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una
mezcla de moléculas patrón de tamaño conocido, con el fin de poder trazar la curva de
calibrado. Para las proteínas, la validez del dato obtenido depende de que la
desnaturalización con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las
subunidades gracias a la reducción con mercaptoetanol; además, la presencia de
oligosacáridos en las glicoproteínas altera la movilidad, que ya no proporciona valores
de masa molecular fiables.
Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeñas diferencias en su estructura y en su actividad
enzimática, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante
isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces de su
movilidad electroforética. Se puede aplicar análogamente a las isoformas de proteínas
no enzimáticas.
Mapas de restricción
Una de las formas de estudiar la secuencia de los ácidos nucleicos, en especial el DNA,
consiste en tratarlo con distintas enzimas de restricción, analizar mediante electroforesis
en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la
molécula original formando su mapa de restricción, uno de los tipos de mapa físico.
Secuenciación de ácidos nucleicos
La obtención de la secuencia completa, nucleótido a nucleótido, también depende del
análisis electroforético de fragmentos de DNA, tanto en el método químico de Maxam y
Gilbert como en el método enzimático de Sanger. Se utilizan en este caso geles de
poliacrilamida, debido al tamaño pequeño de los fragmentos, pudiéndose resolver
fragmentos que se diferencian en un solo nucleótido.
8.10 Fotosíntesis
La fotosíntesis es un proceso químico que convierte dióxido de carbono en compuestos
orgánicos utilizando la energía lumínica, normalmente energía solar. Este proceso se
realiza en determinadas células vegetales a partir de materia inorgánica.
La fotosíntesis se produce en las plantas, las algas, y algunos grupos de bacterias. En
estos procesos fotosintéticos la energía lumínica se transforma en energía química
estable. Sin embargo, no todos los organismos que utilizan la luz como fuente de
energía efectúan la fotosíntesis. (Planas Oriol, 2018, ¿Qué es la fotosíntesis?)
Este proceso permite reducir la cantidad de dióxido de carbono (CO2) en la atmósfera
de una manera natural. Tiene una importancia crucial para la vida en la Tierra.
Reacción química de la fotosíntesis
Durante la fotosíntesis, con la mediación de las moléculas de clorofila, la radiación solar
convertirá seis moléculas de CO2 y seis moléculas H2O en una molécula de glucosa
(C6H12O6), que es un azúcar fundamental para la vida de la planta.
31
La fotosíntesis es el proceso primario de producción de moléculas orgánicas de
sustancias inorgánicas.
Como subproducto de la reacción, se libera oxígeno (seis moléculas) a través de los
estomas que se encuentran en la hoja.
La fórmula de la reacción es la siguiente: 6 CO2 + 6 H2O → C6H12O6 + 6 O2.
8.10.1 Fases de la fotosíntesis
La fotosíntesis de la clorofila, también llamada fotosíntesis oxigénica, se lleva a cabo
por etapas en dos fases:
•
Fase luminosa
La fase luminosa o reacción dependiente de la luz es el paso de la fotosíntesis en la
que se convierte energía solar en energía química. La clorofila y otros pigmentos
fotosintéticos como el caroteno absorben la luz. La se utiliza para fragmentar una
molécula de agua, por lo que se produce oxígeno como residuo.
•
Fase oscura
La fase oscura es un conjunto de reacciones que se realizan sin luz. (no
necesariamente de noche). Durante esta fase, la planta convierte el dióxido de carbono
y otros compuestos en glucosa.
Estas reacciones toman los productos de la fase luminosa que son básicamente ATP
(adenosín trifosfato) y NADPH (nicotín adenín dinucleótido fosfato) y realizan más
procesos químicos sobre ellos.
Las reacciones de la fase oscuras son la fijación del carbono y el Ciclo de Calvin.
8.10.2 Elementos que intervienen en la fotosíntesis
Los factores externos más importantes que intervienen en el rendimiento de la
fotosíntesis son:
•
La temperatura: cada especie vegetal tienen un intervalo de temperaturas en la
que se siente más cómoda.
•
La concentración de dióxido de carbono: el rendimiento aumenta con la
concentración de CO2.
•
La concentración de oxígeno: cuanto más oxígeno, menor rendimiento.
•
La intensidad luminosa: a mayor intensidad luminosa, mayor rendimiento.
•
El tiempo de iluminación: existen especies que presentan una mayor producción
fotosintética cuanto mayor sea el número de horas de luz.
•
La abundancia de agua.
•
El color de la luz: dependiendo del color de la luz y de las características de la
especie, la conversión fotosintética es distinta.
8.11 Clorofila
32
Las clorofilas son una familia de pigmentos que se encuentran en las cianobacterias y en
todos aquellos organismos que contienen plastos en sus células, lo que incluye a las
plantas y a los diversos grupos de protistas que son llamados algas. (La clorofila, s.f.)
•
Función
La función de las clorofilas es la absorción de energía luminosa en la variante de la
fotosíntesis que llamamos fotosíntesis oxigénica, la que es característica de los
organismos antes enumerados.
El principal papel de las clorofilas en la fotosíntesis es la absorción de fotones de luz con
la consiguiente excitación de un electrón. Ese electrón excitado cede su energía,
volviendo al estado normal, a algún pigmento auxiliar (a veces otras clorofilas), donde se
repite el fenómeno. Al final el electrón excitado facilita la reducción de una molécula,
quedando así completada la conversión de una pequeña cantidad de energía luminosa
en energía química, una de las funciones esenciales de la fotosíntesis.
Además del papel citado, el de pigmento primario de la antena fotosintética, las clorofilas
abundan en los fotosistemas como pigmentos auxiliares, los que se van transfiriendo la
energía de excitación de la manera mencionada en el párrafo anterior.
•
Estructura química
La estructura de la molécula de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituida
con pequeños grupos enlazados, sustituyentes) y una cadena larga llamada fitol.
El anillo de porfirina es un tetrapirrol, con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados
para formar un anillo mayor que es la porfirina. La hemoglobina de la sangre y otras
proteínas contienen también una porfirina, que en ese otro caso constituye lo principal de
un grupo hemo; y también se encuentra porfirina en la estructura de la vitamina B12. El
grupo hemo contiene un átomo de hierro (Fe); la porfirina de la clorofila lleva en lugar
equivalente un átomo de magnesio (Mg2+). La absorción de determinados picos del
espectro de radiación (ver gráfica más abajo) es una propiedad de aquellas moléculas
orgánicas que contienen dobles enlaces conjugados (dobles enlaces alternando con
enlaces simples); puede verse en las fórmulas desarrolladas contiguas que el anillo
porfirínico es rico en tales enlaces.
El fitilo (o resto de fitol; llamamos resto o residuo a la parte de una molécula incorporada
a la estructura de otra mayor) es una cadena hidrocarbonada con restos de metilo (-CH3)
a lo largo. Tiene, como todas las cadenas orgánicas basadas sólo en C e H, un carácter
“hidrófobo”; es decir, que repele al agua. La cadena del fitilo sirve para anclar la molécula
de clorofila en la estructura anfipática de los complejos moleculares en que residen las
clorofilas.
•
Localización en las células
Las clorofilas se encuentran en las membranas de los tilacoides, que en las
cianobacterias son invaginaciones de la membrana plasmática, y en los plastos de las
células eucarióticas son vesículas distribuidas por su interior. Las clorofilas aparecen
insertas en la membrana, a las que se anclan por la cadena lateral constituida por un
resto de fitol, asociadas a proteínas y otros pigmentos, con los que forman los
fotosistemas.
33
Cada fotosistema contiene alrededor de 200 moléculas de clorofila, además de
pigmentos auxiliares, con los que constituye la llamada antena. La antena está formada
por conjuntos ordenados de moléculas de clorofila, otros pigmentos y proteínas, que se
llaman complejos colectores de la luz. Sólo una molécula de clorofila a en cada
fotosistema convierte propiamente la energía radiante (luz) en energía química, cuando
recibe un fotón con energía suficiente desde las moléculas de la antena, que se la van
pasando.
•
Espectro de absorción y color
Las clorofilas tienen típicamente dos picos de absorción en el espectro visible, uno en el
entorno de la luz azul (400-500 nm de longitud de onda), y otro en la zona roja del
espectro (600-700 nm); sin embargo, reflejan la parte media del espectro, la más nutrida
y correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta es la razón por la que las clorofilas
tienen color verde y se lo confieren a los organismos, o a aquellos tejidos, que tienen
cloroplastos activos en sus células, así como a los paisajes que forman.
Fuera de las plantas verdes, que son de este color, las clorofilas van acompañadas de
grandes cantidades de pigmentos auxiliares, principalmente carotenoides y ficobilinas,
que son de distinto color y dominan el conjunto, tiñendo al organismo de colores como el
amarillo dorado típico de los cromófitos, o el rojo púrpura de las algas rojas.
9. Metodología
El trabajo se realizará consultando con las diferentes bibliografías que están disponibles
tanto en el temario y las encontradas en diferentes universidades. Para este proyecto lo
primero que debemos conocer son las unidades, que fueron proporcionadas por el
temario “A007 Bioquímica”. Una vez conocido estos temas procedimos a la investigación
de las practicas, donde consultamos distintos tipos de practicas tanto de proyectos de
investigación como tesis. Recopilamos todas las practicas referentes a los temas y
seleccionamos solo algunas prácticas, posteriormente diseñamos/creamos formato para
nuestro manual con un estilo a las Normas Oficiales Mexicanas donde nuestro objetivo
fue que los alumnos tengan cierta familiaridad con este manual y finalmente
acomodamos y adaptamos las prácticas para nuestro proyecto.
10. Resultados
Se realizó con éxito el manual de practicas de la asignatura de Bioquímica (ANEXO II).
11. Conclusiones y recomendaciones
Se creo y desarrolló un Manual de prácticas de la asignatura de Bioquímica, donde se
espera que dicho manual sirva como base para las nuevas generaciones. Además, la
importancia de implementarlo radica en el hecho de que sirve de plataforma para el
desarrollo al interior de la institución, dando una serie de actividades, procesos y
procedimientos, encaminados a lograr que las características de éste cumplan con los
34
requisitos del profesor a cargo de la clase y claro de igual manera con el estudiante. Con
ello, esperar que el laboratorio mantenga una constante vanguardia.
Se espera que este proyecto se actualice constantemente con base a las experiencias y
opiniones de los alumnos y se mejore con el paso del tiempo y de los avances
tecnológicos para la carrera de ingeniería bioquímica y ambiental.
También se desarrolló e implementó una metodología para realizar el Manual de
prácticas de la asignatura de Bioquímica permitiendo cubrir los requisitos de la clase. Se
recomienda que todo lo anterior se haga bajo una mejora continua.
12. Competencias desarrolladas
Para las competencias que se desarrollaron en este proyecto fueron las siguientes:
• Conocieron la estructura de los compuestos químicos orgánicos, sus propiedades
físicas y químicas y el impacto ambiental
• Identificaron, compararon y analizaron las características estructurales, y las
propiedades de glúcidos y proteínas para tener una base fundamental de la
diversidad de grupos funcionales para comprender el metabolismo celular.
• identificaron la relación existente entre las biomoléculas y su función en los
sistemas biológicos, analizaron los fenómenos bioquímicos y la vinculación con el
estudio integral y comprensión del metabolismo para su aplicación en el
aprovechamiento de recursos bióticos y en el diseño de sistemas de tratamiento
de efluentes y residuos contaminantes.
• Conocieron el efecto positivo de los microorganismos en la contaminación
ambiental y su aplicación en acciones de remediación.
• Identificaron y aplicaron correctamente los diferentes tipos de reacciones
orgánicas: sustitución, eliminación, adición, transposición y oxido-reducción.
• Aplicaron los mecanismos de reacción de las moléculas
• Comprendieron, aplicaron y relacionaron la espectroscopia atómica por absorción
molecular ultravioleta y visible para el análisis cualitativo y cuantitativo de diversos
componentes moleculares
• Emplearon conocimientos sobre estructura y función celular, para comprender los
procesos metabólicos.
Las competencias desarrolladas fueron aplicadas tanto en el marco teórico como en cada
una de las prácticas.
13. Fuentes de información
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Trudy Mckee, J. R. (2013). Bioquímica las bases moleculares de la vida. México D.F: McGrawHill.
38
14. ANEXO l
13.1
Normas de seguridad en el laboratorio
13.1.1 Normas generales
1. No fumes, comas o bebas en el laboratorio.
2. Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada, así protegerás tu ropa.
3. Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario o taquilla y
no los dejes nunca sobre la mesa de trabajo.
4. No lleves bufandas, pañuelos largos ni prendas u objetos que dificulten tu
movilidad.
5. Procura no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no corras dentro
del laboratorio.
6. Si tienes el cabello largo, recógetelo.
7. Dispón sobre la mesa sólo los libros y cuadernos que sean necesarios.
8. Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes alguna herida, tápala.
9. No pruebes ni ingieras los productos.
10. En caso de producirse un accidente, quemadura o lesión, comunícalo
inmediatamente al profesor.
11. Recuerda dónde está situado el botiquín.
12. Mantén el área de trabajo limpia y ordenada.
13.1.2 Normas para manipular instrumentos y productos
1. Antes de manipular un aparato o montaje eléctrico, desconéctalo de la red
eléctrica.
2. No pongas en funcionamiento un circuito eléctrico sin que el profesor haya
revisado la instalación.
3. No utilices ninguna herramienta o máquina sin conocer su uso, funcionamiento y
normas de seguridad específicas.
4. Maneja con especial cuidado el material frágil, por ejemplo, el vidrio.
5. Informa al profesor del material roto o averiado.
6. Fíjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los productos
químicos.
7. Lávate las manos con jabón después de tocar cualquier producto químico.
39
8. Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua abundante. Si
salpicas la mesa, límpiala con agua y sécala después con un paño.
9. Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas sustancias
inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y retirarlo del fuego, utiliza
pinzas de madera. Cuando calientes los tubos de ensayo con la ayuda de dichas
pinzas, procura darles cierta inclinación. Nunca mires directamente al interior del
tubo por su abertura ni dirijas esta hacia algún compañero.
10. Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y
separados de los ácidos, las bases y los reactivos oxidantes.
11. Los ácidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaución, ya que
la mayoría son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir
heridas y quemaduras importantes.
12. Si tienes que mezclar algún ácido con agua, añade el ácido sobre el agua, nunca,
al contrario, pues el ácido «saltaría» y podría provocarte quemaduras en la cara y
los ojos.
13. No dejes destapados los frascos ni aspires su contenido. Muchas sustancias
líquidas emiten vapores tóxicos.
14. Al acabar la práctica, limpia y ordena el material utilizado.
15. Anexo ll
14.1
Manual de prácticas de bioquímica
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 6
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 7
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 8
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 9
PROCEDIMIENTO .................................................................................................................... 10
OBSERVACIONES .............................................................................................................................. 12
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 13
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
OBJETIVOS
•
Observar los cambios de energía de una reacción endotérmica.
•
Observar e identificar una reacción exotérmica mezclando dos soluciones.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
RESUMEN DEL MÉTODO.
Toda reacción química puede considerarse como un proceso en el que la materia que
constituye el sistema, se encuentra inicialmente en forma de ciertas sustancias
(reactivos) y al final como otras muy distintas (productos).
Los cambios químicos casi siempre van acompañados de cambios de energía. La
combustión de materiales fósiles, tales como la hulla, los derivados del petróleo y el gas
natural, constituyen en la actualidad la principal fuente de aprovisionamiento de energía
de nuestra civilización.
Constantemente tienen lugar numerosas reacciones químicas, muchas de ellas a nuestro
alrededor. Unas ocurren a temperatura ambiente, como la decoloración de tejidos (por
ejemplo, con lejía) y del pelo (con una disolución acuosa de peróxido de hidrógeno), la
fermentación de la leche, la fotosíntesis, la maduración de frutas y vegetales, el revelado
de fotos y la corrosión de los metales y las aleaciones. Otras reacciones químicas ocurren
a temperaturas superiores al ambiente, por lo cual es necesario calentar las sustancias
que participan en la reacción. Ejemplo de estas son la extracción de metales a partir de
sus minerales y las reacciones de combustión. También en el cuerpo humano, animales
y plantas se llevan a cabo diversas y complejas reacciones químicas, como las que
ocurren durante el proceso de la respiración.
Ahora bien, en las reacciones químicas no sólo ocurre la transformación de unas
sustancias en otras, también en todas ellas se desprende o se absorbe energía. Las que
ocurren con desprendimiento de energía en forma de calor se llaman reacciones
exotérmicas. Ejemplo de esta son las que tienen lugar durante la respiración y la de
combustión.
Las reacciones que ocurren con absorción de energía en forma de calor se denominan
reacciones endotérmicas. La fotosíntesis y la descomposición térmica de la caliza en cal
viva y dióxido de carbono son reacciones endotérmicas.
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
El término oxidación se aplicó originalmente a la ganancia de oxígeno en una reacción;
posteriormente se generalizó a las reacciones con otros elementos (por ejemplo, a la
pérdida de hidrógeno) y se acuñó la palabra “reducción” para el proceso inverso.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
REACTIVOS REQUERIDOS.
Agua
2 g de Permanganato de potasio
(KMnO4)
2 g de cloruro de amonio (NH4Cl)
o tiocinato de amonio (NH4SCN)
5 ml de etanol (CH3CH2OH)
Glicerina
2g de Hidróxido de bario
octahidratado Ba(OH)2 • 8H2O
10 ml de peróxido de hidrógeno
comercial (H2O2
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
*No se requiere
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
EQUIPO REQUERIDO.
*No se requiere
EQUIPO
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
1 espátula
1 jeringa desechable
Papel indicador
1 pipeta Pasteur
1 probeta de 25 ml
1 termómetro
1 vaso de precipitado de 150 ml
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 vidrio de reloj
1 varilla de vidrio
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
PROCEDIMIENTO.
Practica 1a. Reacción endotérmica
I.
Agregar aproximadamente 2 g de cristales de hidróxido de bario octahidratado
[Ba(OH)2•8H2O] en un vaso de precipitado de 150 ml.
II.
El vaso de precipitado deberá estar sobre un vidrio de reloj el cual contendrá un
poco de agua.
III.
Anotar la temperatura ambiente en la cual se está trabajando.
IV.
Agregar al vaso de precipitado los 1 g de cloruro de amonio o tiocianato de
amonio, mezclar con la varilla de vidrio. Trabajar en la campana de extracción.
V.
La reacción es la siguiente: Ba(OH) 2 ∙8H2O (s) + 2 NH4Cl (s) → BaCl2∙2H2O (s)
+ 2 NH3 (a q) + 8 H2 O (l)
VI.
Confirmar la presencia de amoniaco usando papel indicador.
VII.
Anotar sus observaciones. Medir la disminución de la temperatura.
Practica 1b. Reacciones exotérmicas
A. Colocar una pequeña cantidad de algodón y encima 1 g de permanganato de
potasio granular, en el centro de un vidrio de reloj.
B. Agregar gota a gota glicerina (aproximadamente de 15 a 20 gotas) encima del
permanganato de potasio.
C. La reacción es la siguiente: 14 KMO4 + 4 C3H5(OH)3 → 7 K2CO3 + 7 Mn2O3 +
5 CO2 + 16 H2O.
D. La reacción ocurrirá en 15 o 20 s. El producto de la reacción produce una llama
de un color intenso.
E. Disolver lo que quedó en el vidrio de reloj en agua y filtrar. Anotar todas las
observaciones.
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
Practica 1c.
1. Colocar el vidrio de reloj en la campana de extracción sobre una zona resistente
al calor. Agregar 6 ml de una disolución de peróxido de hidrógeno comercial y 3
ml de etanol, encender la mezcla con un cerillo.
2. Espolvorear aproximadamente 0.1 g de permanganato de potasio dentro del vidrio
de reloj. Inmediatamente habrá una serie de fuertes explosiones.
3. La reacción que ocurre es la siguiente:
2MnO4 – (aq) + 5H2O2 (aq) + 6H+ (aq) → 2MnO2 (s) + 3O2(g) + 8H2O(l) 45
4. Observar lo que ocurre y anotar todas sus observaciones.
11
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
OBSERVACIONES.
12
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 1
REACCIONES ENDOTÉRMICAS Y EXOTÉRMICAS
PREGUNTAS.
1.- Investigar aplicaciones enfocadas en la bioquímica de una reacción endotérmica.
2.- Investigar aplicaciones enfocadas en la bioquímica de una reacción exotérmica.
3.- ¿La temperatura inicial de las soluciones afectará el cambio final en la temperatura?
4.- ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo utilizando el tiocianato de amonio?
5.- ¿Cuál es el color del producto en la práctica 1a?
13
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
ÍNDICE
OBJETIVOS ......................................................................................................................3
RESUMEN DEL MÉTODO. ............................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS ......................................................................................................5
SOLUCIONES PARA PREPARAR .............................................................................................6
EQUIPO REQUERIDO...................................................................................................... 7
MATERIAL REQUERIDO ...........................................................................................................8
PROCEDIMIENTO......................................................................................................................9
CÁLCULOS.....................................................................................................................10
PREGUNTAS ..................................................................................................................11
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
OBJETIVOS
•
Identificar las características fisicoquímicas a partir de pruebas sencillas como
Ninhidrina.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
RESUMEN DEL MÉTODO.
Los aminoácidos son las unidades constituyentes de las proteínas, biomoléculas estas
últimas de interés en las organizaciones estructurales y funcionales de células y tejidos.
Téngase en cuenta que todas las enzimas, fundamentales para las reacciones
bioquímica, y todos los anticuerpos, esenciales en los procesos de inmunidad, son
proteínas y se encuentran por tanto constituidos por aminoácidos.
Prueba de ninhidrina
Esta prueba se utiliza para la identificación de α-aminoácidos en esta reacción
intervienen dos moléculas de ninhidrina por cada molécula de aminoácido, se produce la
liberación de CO2 (g), NH3 y se forma un complejo de color violeta conocido como
Purpura de Ruhemann que está estabilizado por resonancia. La ninhidrina produce este
color independientemente de la estructura del aminoácido original, pues la cadena lateral
de los aminoácidos se pierde en forma de aldehído. Por esto esta prueba es positiva
para todos los grupos libres, ya sea en aminoácidos, péptidos o proteínas.
Tipo de aminoácido dependiendo del color producido en la reacción de ninhidrina.
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
REACTIVOS REQUERIDOS.
Agua destilada
Lisina 0.5%
Aspártico 0.5%
Prolina 0.5%
Ninhidrina
Etanol
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Reactivo de ninhidrina: disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y
aforar a 100 ml con agua destilada.
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Calentador
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
3 tubo de ensaye 20 ml
1 pipeta graduada 5 ml
1 vaso precipitado 250 ml
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
PROCEDIMIENTO.
En un tubo de ensaye agregar 2 ml de lisina posteriormente en un segundo tubo de
ensaye 2 ml de aspártico y por último en un tercer tubo agregar 2 ml prolina.
Después agregaremos 2 ml de ninhidrina en cada uno de los tubos y calentar en baño
maría durante 6 minutos.
Observar los cambios en los tubos y anotar resultados en la tabla.
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
CÁLCULOS.
Tabla 1. Identificación del aminoácido
Tubo
Color de la mezcla
Tipo de aminoácido
1
2
3
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 2
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS
PREGUNTAS.
1.- ¿Para qué nos sirve conocer que tipo de aminoácido es?
2.- ¿Qué es un mecanismo de reacción?
3.- Ilustre el mecanismo de reacción de la ninhidrina.
11
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 6
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 7
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 8
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 9
PROCEDIMIENTO .................................................................................................................... 10
OBSERVACIONES .............................................................................................................................. 12
PREGUNTAS ....................................................................................................................................... 13
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
OBJETIVOS
Llevar a cabo la separación de aminoácidos mediante la aplicación del método indicado,
usando papel cromatográfico.
Analizar en qué aminoácidos se obtiene una coloración morada.
Determinar la presencia de los aminoácidos presentes en la muestra problema y
establecer una relación con los estándares utilizados.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
RESUMEN DEL MÉTODO.
La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y permite el
análisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados
químicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican según la fase móvil
(de gases, líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados.
La separación se lleva a cabo según la distinta interacción que presenta cada uno de los
componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra móvil que
fluye sobre ella. Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a
distintas subclases de cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de
afinidad, etc.
En esta práctica, vamos a usar la más simple de ellas, la cromatografía ascendente sobre
papel. La fase estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes
orgánicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de agua entrelazada entre sus
fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra
aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del
agua. Según la solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto de las
dos fases así será su movilidad.
El uso de la cromatografía en papel para la separación e identificación de aminoácidos
es de gran importancia desde que fue introducida por Martin en 1944, la fase móvil
empleada generalmente es una mezcla de n‐butanol/ácido acético/agua o dilución
acuosa
de
fenol
(polar
y ácida), estas combinaciones de fases móviles poseen densidad mayor que otr
os sistemas de solventes y requiere de por lo menos de 2 a 3 horas para que el frente
del solvente alcance una distancia prudente en una placa relativamente larga. Los
procesos cromatográficos tanto instrumentales como no instrumentales (en cualquiera
de sus variantes), son receptivos a nuevas alternativas metodológicas y
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
continuamente sufren cambios que beneficien en aspectos como resolución, separación,
empleo de recursos y tiempo por mencionar algunos.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
REACTIVOS REQUERIDOS.
Glutamina
Agua
Fenilalanina
Treonina
Arginina
Sustancia desconocida
proporcionada por el maestro
n-butanol
Acido acético
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Fase móvil: 12 partes de n-butanol, 3 partes de acido acético y 5 partes de agua preparar
para un volumen de 120 ml.
Solución de ninhidrina: disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y
aforar a 100 ml con agua destilada.
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
EQUIPO REQUERIDO.
*No se requiere
EQUIPO
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
Vaso precipitado de 500 ml que servirá como cámara
cromatográfica
Probeta 50 ml
Probeta 10 ml
Papel whatmann
Tijeras
Regla
5 capilares o goteros
5 frascos ensaye pequeños
Secadora de pelo en caso de no tener, utilizar horno
Atomizador
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
PROCEDIMIENTO.
1. Realizar las mediciones de altura y circunferencia de la cámara cromatográfica en
el papel Whatman.
2. Recortar dos rectángulos con las medidas de las cámaras, un rectángulo debe ser
un poco más pequeño de manera que quede de esta forma.
3. Realizar pruebas para para que el cilindro menor no toque las paredes de la
cámara. Si es el caso, corregir las medidas y continuar con el procedimiento.
4. En el cilindro pequeño medir en la parte inferior 1.5 cm de separación y trazar una
línea horizontal, una vez trazada marcar 5 puntos de forma equitativa de esta
forma.
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
5. Teniendo el cilindro de papel se debe sembrar la muestra. Para esto introducir el
primer cilindro (grande) en la cámara cromatográfica, humedeciéndolo para que
se adhiera a las paredes, retirar el exceso de agua.
6. Introducir una pequeña cantidad de cada una de las soluciones en cada tubo.
7. Agitar los frascos e introducir un CAPILAR y poner solo una gota en el papel
whatmann SE DEBE SEMBRAR CON UN CAPILAR DIFERENTE CADA
SOLUCIÓN.
8. Con la secadora de pelo secar la gota y agregar otra, repetir esto hasta alcanzar
las 5 muestras.
9. Identificar cada posición de la muestra
10. Cuando el cilindro este seco doblas los extremos del papel de manera que se
pueda engrapar en la parte superior e inferior del final.
11. Dejar en mesa hasta que esté lista la fase móvil.
12. Preparar la fase móvil y introducir una pequeña cantidad en la cámara
cromatográfica (aproximadamente a una altura de 0.5cm) posteriormente taparla.
13. Destapar la cámara cromatográfica e introduzca el cilindro (pequeño) de la fase
estacionaria sin que toque el papel que la rodea NO SE DEBEN TOCAR, SI SE
TOCAN NO SERVIRA EL EXPERIMENTO.
14. Después de introducir la fase estacionaria cerrar la cámara y dejar en un lugar en
donde no sea movida.
15. El tiempo de espera es de 20 minutos, o dependerá de lo que indique el maestro
16. Pasado el tiempo se debe sacar la fase estacionaria. NO tocar el papel que rodea
la cámara Quitar las 2 grapas.
17. Con lápiz dibujar una línea hasta donde corrió la fase móvil eluyente. Secar el
exceso de solvente con la secadora.
18. Preparar la solución de ninhidrina.
19. Cuando la fase estacionaria esta seca llevarla al área de revelado y rociarla con
el atomizador con la solución de ninhidrina, hacerlo con precaución. Secar con la
secadora de pelo hasta obtener un cambio en la fase estacionaria.
11
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
OBSERVACIONES.
12
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 3
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
PREGUNTAS.
1.- ¿Qué tipo de aminoácido era la muestra?
2.- ¿Qué utilidad tiene la cromatografía en papel?
3.- Escriba una conclusión sobre todas las observaciones
13
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 5
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 6
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 7
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 8
PROCEDIMIENTO ...................................................................................................................... 9
CÁLCULOS. .............................................................................................................................. 10
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
OBJETIVOS
•
Propiedades fisicoquímicas de los aminoácidos, identificar las características
fisicoquímicas a partir de pruebas sencillas como Prueba de Adamkiewics.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
RESUMEN DEL MÉTODO.
El triptófano es un componente vital de las proteínas. Su destrucción se asocia con
sabores desagradables en los alimentos irradiados y con el amarillamiento de la lana.
Varios productos metabólicos son importantes en la función normal del cerebro y en la
regulación del crecimiento de las plantas, y algunos son fármacos potentes. Puede ser
incluso más importante en funciones actualmente desconocidas. Es nutricionalmente
esencial para muchos animales y para el hombre. Debido a estos significados conocidos
y sospechados.
La reacción de Hopkins-Cole, también conocida como reacción del ácido glioxílico o
reacción de Adamkiewics es una prueba química que se utiliza para detectar la presencia
de triptófano en proteínas.
La positividad se reconoce por la aparición de un anillo color violeta-rojizo. La reacción
es la siguiente:
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
REACTIVOS REQUERIDOS.
Triptofano 1%
Glicina 1%
H2SO4
Reactivo de Hopkins- Cole
Albumina (clara de huevo)
Sustancia
desconocida
(proporcionada por el profesor)
Agua destilada
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Reactivo de Hopkins- Cole Preparación: 10 mg de magnesio en 250 ml de ácido oxálico,
se afora a 1 litro con agua destilada
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
EQUIPO REQUERIDO.
*No se requiere
EQUIPO
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
4 tubos de ensaye 10 ml
Pipeta graduada 5 ml
Gradilla
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
PROCEDIMIENTO.
Rotule 4 tubos de ensayo como:
•
blanco
•
triptófano
•
problema
•
albúmina de huevo
Adicione a cada uno 2 mL. de la solución correspondiente y 2 mL. del reactivo de Hopkins
Cole. Mezcle bien el contenido y adicione a cada tubo por las paredes lenta y
cuidadosamente, sin mezclar 1 mL. de ácido sulfúrico concentrado, pronto vera un
cambio en el color de la interfase.
Anote sus observaciones
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 4
PRUEBA DE ADAMKIEWICS.
CÁLCULOS.
Tabla 1
Tubo
¿Cambio en el color de la
interfase?
blanco
triptófano
problema
albúmina de huevo
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
ÍNDICE
OBJETIVOS................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO.......................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ..................................................................................................... 6
SOLUCIONES PARA PREPARAR.............................................................................................. 7
EQUIPO REQUERIDO ............................................................................................................... 8
MATERIAL REQUERIDO............................................................................................................ 9
PROCEDIMIENTO.................................................................................................................... 10
CÁLCULOS. ............................................................................................................................. 12
PREGUNTAS. .......................................................................................................................... 13
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
OBJETIVOS
•
Conocer el mecanismo de acción de las enzimas durante una reacción química
•
Identificar factores que afectan la actividad enzimática
•
Distinguir entre inhibición competitiva e inhibición no-competitiva
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
RESUMEN DEL MÉTODO.
Las células son sistemas abiertos y, como tales, intercambian constantemente materia,
energía e información con el exterior. El metabolismo celular es el conjunto de reacciones
de degradación y síntesis a través de las cuales las células intercambian materia y
energía con el medio, permitiendo el mantenimiento del sistema. Para hacer posibles
estos procesos a temperaturas compatibles con los tejidos vivos, la velocidad de reacción
de estos procesos es modificada por los catalizadores biológicos o enzimas. El término
cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una
enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores.
Es esencial entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas
moleculares, por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima
que la produce. También es usual medir la actividad enzimática con diferentes sustratos
para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de diferentes
tejidos u organismos para entender cómo las diferencias en actividad están relacionadas
con la función y/o la fisiología del organismo del que proceden.
Las enzimas, en su mayoría proteínas o RNA (riboenzimas), son catalizadores químicos
que agilizan una reacción que envuelve la formación o rompimiento de enlaces químicos.
Las enzimas reducen la energía de activación necesaria para llevar a cabo una reacción;
es decir, reducen la barrera de energía que hay que sobrepasar para que la reacción se
lleve a cabo.
Los activadores se conocen como cofactores y pueden ser tan simples como iones
metálicos. Los cofactores orgánicos se conocen como coenzimas. Las enzimas pueden
afectarse negativamente por inhibidores que impidan la actividad enzimática. Estos
inhibidores pueden afectar el sitio activo de dos maneras: competitivamente, al bloquear
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
el sitio activo, o no competitivamente, al pegarse en otro lugar de la enzima y alterar
indirectamente la forma del sitio activo.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
REACTIVOS REQUERIDOS.
Peroxido de hidrogeno
3M de HCL
3M de NaOH
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
*No se requiere
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Calentador
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
Hígado
Papa
Espinaca
11 tubos de ensaye grandes
Gradilla
Pipeta graduada 5 ml
Termómetro
Hielo
3 vasos de precipitado de 100 ml
Mortero
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
PROCEDIMIENTO.
Practica 5
En esta práctica se prepararán varias muestras para obtener particular pequeñas y
uniformes al mezclarlas con el agua.
1. Para preparar las muestras, corte en pedazos por separado las muestras de papa,
espinaca e hígado.
2. Usando una licuadora o mortero muela el material con un poco de agua hasta diluir
parte de la muestra; no muela excesivamente para que no queden pedazos muy
pequeños del material.
3. Rotule cuatro tubos de ensayo con las letras A a Ia D.
2. Ponga 3 ml. de cada muestra en los tubos como sigue:
A. Hígado
B. Papa
C. Espinaca
D. Agua
3. Marque el nivel hasta donde Ilega cada muestra.
4. Ponga 3 ml. de peróxido de hidrogeno en cada tubo de ensayo.
5. Observe Ia reacción que sucede en cada tubo y marque el cambio en el nivel del
líquido.
6. Tabule los resultados en Ia Tabla 1
Practica 6
1. Rotule cuatro tubos de ensayo del 1 al 4 y caliente un baño de agua con dos vasos de
precipitado uno hasta 37 °C y otro hasta 80°C.
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
2. Añada 5 mL de hígado en forma de muestra a cada tubo.
3. Mantenga los tubos a las siguientes temperaturas:
•
Tubo 1 = 80 °C por 15 minutos
•
Tubo 2 = 37 °C por 15 minutos
•
Tubo 3 = Temperatura ambiental
•
Tubo 4 = Hielo por 30 minutos
4. Añada 2 ml. de peróxido de hidrógeno al tubo 1.
5. Mida el tiempo transcurrido desde que se añadió el peróxido hasta que se comienzan
a producir burbujas, y anótelo en la Tabla 2.
6. Repita con los demás tubos.
7. Compare sus resultados en término de tiempo de reacción vs. temperatura.
Practica 7
1. Rotule tres tubos de ensayo A, B y C
2. Añada 3 ml de muestra de hígado a cada tubo.
3. Añada soluciones 3M de HCI y 3M de NaOH a los tubos como sigue, y agite
suavemente hasta mezclar:
•
Tubo A — 3 ml de 3M HCI
•
Tubo B— 3 ml de 3M NaOH
•
Tubo C — control (sin ácido ni base)
4. Añada 3 ml. de peróxido de hidrógeno a cada tubo.
5. Observe y anote las reacciones en la Tabla 3.
11
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
CÁLCULOS.
Tabla 1. Resultados producción de catalasa en varios organismos
Tubo
Cantidad de burbujas
Cantidad de muestra
consumida
A
B
C
D
Tabla 2. Resultados del efecto de temperatura
Tubo
Temperatura
1
80°C
2
37°C
3
Ambiente
4
Hielo
Tiempo que tardo en
comenzar la reacción
Observaciones
Tabla 3. Resultados del efecto del pH sobre la actividad enzimatica
Tubo
Tiempo que toma la reacción
en completarse
Descripción comparativa de
las reacciones
A
B
C
12
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 5 a 7
ACCIÓN ENZIMATICA
PREGUNTAS.
1.- ¿En dónde hubo un mayor cambio del nivel del líquido? ¿por qué?
2.- ¿En que muestra tardo más en reaccionar debido al efecto de la temperatura? ¿por qué?
3.- ¿Cuál muestra tardo más en reaccionar? ¿por qué?
13
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 7
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 8
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 9
MATERIAL REQUERIDO ..................................................................................................................... 10
PROCEDIMIENTO .................................................................................................................... 11
CÁLCULOS. .............................................................................................................................. 13
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 15
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS
•
Identificación de carbohidratos: Monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
•
Poder diferenciar la estructura y propiedades de mono, di y polisacáridos
mediante pruebas coloreadas sencillas como Fehling, Tollens y Barfoed.
•
Reconocer la capacidad oxido-reductora de los monosacáridos
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
RESUMEN DEL MÉTODO.
El sistema digestivo maneja todos los carbohidratos de la misma forma: los rompe (o
trata de romperlos) en moléculas de azúcar simples, ya que sólo éstos son lo
suficientemente pequeños para pasar al torrente sanguíneo. También convierte la
mayoría de los carbohidratos digestibles en glucosa (también conocida como azúcar en
la sangre), porque las células están diseñadas para utilizar esto como una fuente de
energía universal.
Los carbohidratos son biomoléculas que presentan un grupo funcional carbonilo
(aldehído y cetona) y varios grupos hidroxilos en cada carbono. Los carbohidratos
también
llamados
polihidroxicetonas
azúcares,
o
osas
compuestos
o
sacáridos,
poliméricos
son
que
por
polihidróxialdehidos
hidrólisis
o
producen
polihidróxialdehidos y polihidroxicetonas. Según el número de unidades de azúcares
sencillos que posean se clasifican en: MONOSACÁRIDOS o azúcares sencillos, que a
su vez pueden ser ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehído o CETOSAS cuando
contienen el grupo cetona. Los monosacáridos naturales pertenecen a la serie D de los
azúcares y pueden tener entre tres y hasta siete átomos de carbono.
DISACÁRIDOS que están formados por dos monosacáridos unidos entre sí por enlaces
glucosídicos.
OLIGOSACÁRIDOS que tienen entre tres y diez monosacáridos unidos también por
enlaces glucosídicos.
POLISACÁRIDOS que son polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcar
sencillo ligadas entre sí. De acuerdo con lo anterior, además de reconocer si un
compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, diferenciaríamos si se trata de un
monosacárido tipo aldosa o cetosa, si es fácilmente oxidable o no, es decir si es un
AZÚCAR REDUCTOR o no lo es, si es de cinco átomos de carbono (pentosa) o de seis
átomos de carbono (hexosa), si es disacárido o polisacárido.
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Prueba de Fehling.
El ensayo con el licor de Fehling se fundamenta en el poder reductor del grupo carbonilo
de un aldehído. Éste se oxida a un ácido carboxílico y reduce la sal de cobre (II) en medio
alcalino a óxido de cobre (I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto
importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse fácilmente,
aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor de Fehling a óxido
de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor. Esta reacción se produce en medio
alcalino fuerte, por lo que algunos compuestos no reductores como la fructosa (que
contiene un grupo cetona) puede enolizarse a la forma aldehído dando lugar a un falso
positivo.
Reacción de Barfoed.
Es un ensayo químico utilizado para detectar monosacáridos. Esta prueba fue descrita
por primera vez por el químico danés Christen Thomsen Barfoed y se utiliza
principalmente en botánica. La prueba es similar a la prueba de Fehling. El reactivo de
Barfoed se compone de una solución de 0.33 molar de acetato de cobre neutro en una
solución de 1% de ácido acético. No es recomendable guardar el reactivo, sino prepararlo
previamente a su uso.
Se basa en la reducción de cobre (II) (En forma de acetato) a cobre (I) (En forma de
óxido), el cual forma un precipitado color rojo ladrillo. Los disacáridos también pueden
reaccionar, pero en forma más lenta. El grupo aldehído del monosacárido que se
encuentra en forma de hemiacetal se oxida a su ácido carboxílico correspondiente.
Muchas sustancias, entre ellas el cloruro de sodio,3 pueden interferir en la prueba.
Reactivo de Tollens
Sin duda, el nombre de Tollens está asociado para la mayor parte de profesores y
alumnos de Química Orgánica con el reactivo que recibe su nombre para reconocer los
aldehídos. Apareció publicado en 1882. Su descubrimiento forma parte de sus trabajos
de investigación para tratar de identificar compuestos químicos que obtenía a partir de
árboles para utilizar en la alimentación del ganado, dentro de su labor en la Escuela de
Agronomía.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
El reactivo de Tollens tiene importancia desde el punto de vista didáctico no solo para
identificación de aldehídos sino para el estudio de reacciones redox y, sobre todo, para
que los estudiantes se den cuenta de que una forma de mantener los iones de plata en
una disolución muy básica, para que puedan reaccionar con los aldehídos, es formando
el complejo amoniacal. Para entenderlo, deberían escribir la reacción entre nitrato de
plata e hidróxido de sodio en disolución acuosa, pues así precipitaría el hidróxido de plata
(óxido de plata hidratado). Al tratarse de un sólido ya no estarían presentes los iones
plata en disolución y se dificultaría la reacción con aldehídos.
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
REACTIVOS REQUERIDOS.
Sulfato
de
cobre
pentahidratado
Tartrato sódico-potásico
Hidróxido de sodio
(II) Acido acético glacial
Glucosa
Galactosa
Nitrato de plata
Maltosa
Hidróxido de amonio
Lactosa
Acetato de cobre
Sustancia
problema
proporcionada por el profesor
Agua
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Solución de Tollens: añadir 2 gotas de una disolución de NaOH al 5% a 1 ml de
disolución acuosa de AgNO3 al 5%. Agitar el tubo y añadir gota a gota y con agitación
NH4OH 2N, hasta que se consiga disolver el precipitado de AgOH, que previamente se
había formado.
Solución de Barfoed: Pesar 13,3 g Acetato de cobre cristalizado en 200 ml de H2O
destilada, filtrar si es necesario. Añadir 1,8 ml de ácido acético glacial (CH2 COOH).
Solución de Fehling se divide en dos soluciones:
Solución A: Disolver 3´5 gr de sulfato de cobre (II) pentahidratado en 50 mL. de agua.
Solución B: Disolver 17´3 gr de tartrato sódico-potásico (KNaC4H4O6.4H2O) y 5 gr de
hidróxido sódico en agua. Una vez frío, diluir hasta 50 mL con agua.
Nota.
El reactivo de Tollens debe ser preparado en el momento y nunca almacenado por más
de un par de horas. Después de realizar el test, la mezcla resultante debe ser acidificada
con ácido diluido antes de ser desechada. Estas precauciones previenen la formación
del altamente explosivo fulminato de plata.
Así como el reactivo de Fehling y el de Barfoed también deben ser preparados en el
momento debido a la corta duración de vida que tienen estos reactivos.
8
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Baño maría o Calentador
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
Tubos de ensaye
Pipeta graduada 5 mL
Espátula
Pinzas para tubos de ensayo
Cronometro
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
PROCEDIMIENTO.
Prueba de Barfoed
En cuatro tubos de ensaye introducir un 1 mL de carbohidrato a cada tubo de la siguiente
forma:
•
Glucosa 1%
•
Galactosa 1%
•
Maltosa 1%
•
Lactosa 1%
•
Sustancia problema
Agregar Reactivo de Barfoed 2,5 ml a cada una de las muestras. Mezclar y calentar en
baño hirviente, contando los minutos y sacar del baño cada tubo inmediatamente
después que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de oxido cúprico. Anotar el tiempo
que corresponde a cada carbohidrato en la tabla 1. La aparición de un precipitado antes
de los 6 minutos indica la presencia de un monosacárido, un escaso precipitado rojo a
los 9 y 12 minutos indica la presencia de disacárido
Prueba de Fehling
En cuatro tubos de ensaye introducir un 1 mL de carbohidrato a cada tubo de la siguiente
forma:
•
Glucosa 1%
•
Galactosa 1%
•
Maltosa 1%
•
Lactosa 1%
•
Sustancia problema
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Agregar 1 ml del reactivo Fehling A y 1 ml del reactivo Fehling B. Mezclar bien y ponerlo
a baño maría o en la flama del mechero durante cierto tiempo.
Sí mira a marrón o rojo la prueba es positiva. Esta prueba es una reacción de oxidoreducción, los alcoholes del azúcar se oxidan a aldehídos y ácidos, el cobre se reduce
de cúprico a cuproso por eso cambia de color la solución y se forma el precipitado.
Anotar los resultados en la tabla 2.
Prueba de Tollens
En cuatro tubos de ensaye introducir un 1 mL de carbohidrato a cada tubo de la siguiente
forma:
•
Glucosa 1%
•
Galactosa 1%
•
Maltosa 1%
•
Lactosa 1%
•
Sustancia problema
Añadir 1 ml de reactivo de Tollens a los tubos de ensaye. Agitar perfectamente y calentar
a baño maría durante 5 minutos máximo. Observar la forma de espejo de plata (las
paredes del tubo se recubren con una fina capa de plata) que se forma si es positivo.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
CÁLCULOS.
Tabla 1 Prueba de Barfoed
Tubo
Resultados
Observaciones
Resultados
Observaciones
Resultados
Observaciones
Glucosa
Galactosa
Maltosa 1
Lactosa
Sustancia problema
Tabla 2 Prueba de Fehling
Tubo
Glucosa
Galactosa
Maltosa 1
Lactosa
Sustancia problema
Tabla 3 Prueba de Tollens
Tubo
Glucosa
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
Galactosa
Maltosa 1
Lactosa
Sustancia problema
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 8
IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
PREGUNTAS.
1.- Explique el mecanismo de reacción de cada una de las pruebas.
2.- ¿Qué es un azúcar reductor?
3.- ¿Qué efecto puede tener en el organismo, la presencia de azucares reductores en
los alimentos?
4.- ¿Qué es un epímero?
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 6
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 7
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 8
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 9
PROCEDIMIENTO .................................................................................................................... 10
OBSERVACIONES .............................................................................................................................. 11
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 12
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
OBJETIVOS
•
Comprobar la producción de dióxido de carbono y etanol durante la fermentación
de glucosa por levaduras.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
RESUMEN DEL MÉTODO.
Se cree que la glucólisis, es un conjunto de reacciones que ocurren en todas las células,
es de las vías bioquímicas más antiguas. Tanto las enzimas como el número y los
mecanismos de los pasos de la vía son muy semejantes en las procariotas y en las
eucariotas. Además, la glucólisis es un proceso anaerobio, que debió ser necesario en
la atmósfera carente de oxígeno de la Tierra pre-eucariota.
En la glucólisis cada molécula de glucosa se divide y se transforma en dos unidades de
tres carbonos (piruvato). Durante este proceso se oxidan numerosos átomos de carbono.
La pequeña cantidad de energía que se captura durante las reacciones glucolíticas
(alrededor del 5% de la total disponible) se almacena de forma temporal en dos
moléculas de ATP (trifosfato de adenosina) y una de NADH (deshidrogenasa del
dinucleótido de nicotinamida y adenina) por cada triosa. El destino metabólico
subsiguiente del piruvato depende del organismo que se considere y de sus
circunstancias metabólicas. En los organismos anaerobios (aquellos que no utilizan
oxígeno para generar energía), el piruvato puede convertirse en productos de desecho
como etanol, ácido láctico, ácido acético y moléculas semejantes. Utilizando oxígeno
como aceptor electrónico terminal, los organismos aerobios, como los animales y los
vegetales, oxidan por completo el piruvato para formar CO2 y H2O en un complejo
mecanismo escalonado, conocido como respiración aerobia.
La fermentación es un proceso catabólico, es decir, se rompe una molécula en
componentes más simples. Por ejemplo, los productos finales de la degradación de la
glucosa (glucólisis) pueden ser ácido láctico o alcohol, bióxido de carbono y energía
química. Como se mencionó, la fermentación en los seres vivos es un proceso que no
necesita oxígeno por lo que es considerada anaerobia, es propia de microorganismos
como bacterias y levaduras. Sin embargo, también se produce fermentación (láctica) en
el tejido muscular de los animales o los humanos cuando el aporte de oxígeno a sus
células no es suficiente para el metabolismo y la contracción muscular. Desde el punto
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
de vista energético, la fermentación es menos eficiente porque produce 2 moléculas de
ATP a partir de una molécula de glucosa, mientras que en la respiración celular aerobia
se producen 38 moléculas de ATP.
La fermentación ha sido utilizada por el ser humano en la producción de cerveza, vino,
queso y yogurt, procesos que implican el uso de bacterias o levaduras con el fin de
convertir un producto natural en un producto fermentado. De acuerdo al tipo de producto,
la fermentación puede dividirse en términos generales en: láctica y alcohólica.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
REACTIVOS REQUERIDOS.
Solución de glucosa al 10%
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Balanza
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
1 matraz Erlenmeyer (125 mL)
Espátula
Balanza
Globos pequeños
Levadura de cerveza activa
Hoja de papel
Cronometro
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
PROCEDIMIENTO.
Colocar en el matraz Erlenmeyer 25 mL aproximadamente de solución de glucosa al 10%
y agregar 1 g de levadura de cerveza.
Tapar el matraz con el globo de forma que selle completamente la boca del matraz
Marcar el volumen inicial de la mezcla
Después de algunos minutos (tomar tiempo), observa el desprendimiento de burbujas.
Observar si hay algún efecto en el globo.
Por último, marca el volumen final de la mezcla y destapa el matraz, ¿Qué olor despide
la mezcla?
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
OBSERVACIONES.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 9
FERMENTACIÓN
PREGUNTAS.
1.- ¿Qué sucedió en el matraz y el globo?
2.- ¿Cuáles fueron los productos obtenidos de esta reacción?
3.- Que es piruvato?
4.- Las células musculares pueden presentar también la respiración anaerobia ¿cuál es
el compuesto producto de este proceso?
5.- ¿Hubo un cambio en el volumen del matraz? Si es así, explica por qué sucedió
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 5
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 6
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 7
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 8
PROCEDIMIENTO ...................................................................................................................... 9
OBSERVACIONES .............................................................................................................................. 10
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 11
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
OBJETIVOS
•
comprensión de los términos de solubilidad, pureza, reacciones ácidos bases,
recristalización, etc.
•
Aprendizaje sobre el uso de microscopio.
•
Familiarizar al alumno con la técnica de extracción de ácido cítrico.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
RESUMEN DEL MÉTODO.
Los ácidos carboxílicos son los ácidos orgánicos, se encuentran ampliamente
distribuidos en la naturaleza, ya sea en su forma original o en la de alguno de sus
derivados (ésteres, amidas y anhídridos); por ejemplo: el ácido cítrico se encuentra en
las frutas como los limones y las naranjas; el ácido acético en el vinagre; el ácido láctico
se produce en la leche cuando esta inicia su descomposición, dando como consecuencia
un sabor “agrio”.
Para revisar la bioquímica de la formación de ácido cítrico se puede decir que el exceso
de producción de ácido cítrico requiere una combinación única de las condiciones
nutricionales inusuales (exceso de fuente de carbono, iones de hidrógeno y el oxígeno
disuelto, y altas concentraciones de ciertos metales traza y de fosfato), que influyen
sinérgicamente el rendimiento de fermentación.
El ácido cítrico es un intermediario en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT) o ciclo
de Krebs. Las funciones de este ciclo son generar energía en forma de ATP en
conjunción con la fosforilación oxidativa durante el metabolismo aeróbico de
carbohidratos y crear precursores de otros ciclos biosintéticos como aminoácidos.
En condiciones ambientales que promueven el desarrollo celular el ciclo funciona en
estado estacionario, los intermediarios que lo constituyen se mantienen a niveles bajos
sin acumulación de alguno en particular. Tal acumulación resultaría en un ineficiente uso
de los nutrientes. El mantenimiento de dicho estado estacionario se efectúa mediante
una regulación precisa de enzimas presentes en rutas metabólicas que alimentan el ciclo
o que parten de él. Las enzimas pueden ser controladas a nivel de síntesis de proteínas
(represión o inducción) o de actividad enzimática.
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
REACTIVOS REQUERIDOS.
Ácido sulfúrico
Agua destilada
Carbonato de calcio
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
*No se requiere
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Microscopio
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
Varilla de vidrio
Mechero de Bunsen
Vidrio de reloj
Papel tornasol
Una tira de ph
6 papeles filtro
Trípode
Porta objeto
20 ml de jugo de limón
Algodón
Vaso precipitado
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
PROCEDIMIENTO.
a) Colocar 20 ml de jugo de limón con ayuda de un algodón filtrar el jugo en un vaso
de precipitado, enjuagado previamente con agua destilada, y agregar igual
volumen de agua. Luego agitar con la varilla de vidrio.
b) Filtrar. Añadir al filtrado carbonato de calcio, hasta que desaparezcan las burbujas
con el agitado
c) En un vidrio de reloj colocar una pequeña porción de papel tornasol rojo y con la
varilla de vidrio humedecida en la solución mojar el papel, verificar en la tira de
PH, si es un ácido continuar agregando carbonato de calcio.
d) Como el vaso de precipitado va a poseer un exceso de carbonato de calcio, filtrar
nuevamente.
e) Calentar lo filtrado a ebullición suave, hasta obtener un precipitado blanco.
f) Filtrar nuevamente en caliente.
g) Retirar, con cuidado, el papel de filtro y depositar lo obtenido en un nuevo vaso de
precipitado, agregar agua destilada, de a poco hasta disolver el sólido, revolviendo
constantemente.
h) Agregar gota a gota ácido sulfúrico concentrado, hasta que no se forme más
precipitado (aproximadamente 30 gotas de ácido sulfúrico).
i) Filtrar y aguardar el líquido filtrado. Tomar una gota del líquido, con una varilla de
vidrio, en un porta objeto y mirar la muestra por el microscopio.
j) Evaporar la solución lentamente hasta que la solución quede a un tercio del
volumen. Dejar enfriar o entibiar, y sacar una gota para mirarlo por el microscopio.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
OBSERVACIONES.
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 10
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE JUGO DE LIMÓN
PREGUNTAS.
1.- Escriba las reacciones implicadas en la obtención del ácido cítrico a partir de los
limones
2.- Escriba detalladamente que observaciones notaron en cada paso
3.- Mencione que otro producto se podría extraer del limón
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 5
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 6
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 7
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 8
PROCEDIMIENTO ...................................................................................................................... 9
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 11
NOTAS. .................................................................................................................................... 12
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
OBJETIVOS
•
Comprobar la migración electroforética de los aminoácidos sometidos a un campo
eléctrico en función de su carga y PI
•
Separación, identificación y análisis de aminoácidos.
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
RESUMEN DEL MÉTODO.
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de
estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa
por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.
La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un
electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depósitos independientes que contienen
ambos al electrolito y están unidos a los electrodos del generador de corriente. La
muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de
migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas con sales
de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado
gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los
procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica permite separar
bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y
compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos
clásicos de electromigración en soporte.
Puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se
moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica, 2) su tamaño,
3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio. Si la molécula tiene
carga positiva migrará hacia el cátodo; si tiene carga negativa, hacia el ánodo.
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
REACTIVOS REQUERIDOS.
Glicina 1%
Ninhidrina
Leucina 1%
Acido aspártico 1%
Etanol
Muestra problema
proporcionada por el profesor
Lisina 1%
Piridina
Acido acético glacial
Agua
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Tampón piridina 6,1: 40 ml piridina, 3.2 ml ácido acético glacial y aforar con agua hasta
1L
Solución de ninhidrina: disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y aforar
a 100 ml con agua destilada
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Secador
Una fuente de alimentación que suministre un potencial constante (300 V).
Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos
compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de platino,
que deben conectarse a la fuente de alimentación mediante los cables con conectores
adecuados, uno para el electrodo que hace de cátodo y otro para el que hace de ánodo.
7
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
Papel whatmann #1
Pinzas de madera
Micropipeta
Pulverizador u atomizador
Tijeras
Guantes
Celulosa
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
PROCEDIMIENTO.
Se traza con el lápiz una línea muy débil en el centro del papel. En la línea se señalan
débilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho del papel.
Al mismo tiempo se señala en el margen superior derecho de la tira de papel el signo (+),
para indicar el extremo del papel que se va a situar en el compartimento de la cubeta
que va a actuar como ánodo.
Una vez aplicadas las muestras, se rocía ligeramente el papel con la solución tampón de
electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente las muestras.
Se quita la tapadera de la cubeta, se coge el papel con las pinzas y se coloca sobre la
cubeta. Se introducen cada uno de los extremos del papel en los compartimentos de la
cubeta, procurando que el extremo señalado en el papel con (+) sea el compartimento
del ánodo.
Si los extremos no quedan bien sumergidos en la solución tampón de electroforesis, se
llenan los compartimentos con más tampón.
Antes de comenzar la electroforesis, hay que asegurarse que el papel está bien
humedecido.
Se coloca la tapadera en la cubeta, se conecta la fuente de alimentación a la red de
alimentación y se enciende la misma. Con el mando del voltaje se ajusta el potencial a
unos 300 V.
9
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
Al cabo de media hora se apaga la fuente, se desconecta de la red, se quita la tapadera,
se saca el papel de la cubeta mediante las pinzas, procurando no romperlo y se coloca
encima del papel de filtro de la mesa del laboratorio.
Se airea el papel para que se seque y con las pinzas de madera se sumerge en la cubeta
que contiene la solución de ninhidrina. Nada más que se impregne, se saca de la
solución, dejando que escurra el exceso de la misma.
Se espera hasta que se produce la reacción de color la detección de los aminoácidos
patrón y de la muestra problema se realiza por la aparición de las manchas de color
púrpura.
Los aminoácidos contenidos en la muestra problema se identifican mediante la
comparación de los desplazamientos de las manchas con los correspondientes a los de
los aminoácidos patrones.
10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
PREGUNTAS.
1.- ¿Qué aminoácidos están presentes en la muestra problema?
2.- Señala de que factores depende el movimiento de los aminoácidos en la electroforesis
en papel
3.- ¿Se podría identificar mediante esta técnica una mezcla de los aminoácidos valina y
triptófano utilizando las condiciones de la práctica?
4.- ¿Qué reacción se produce entre los aminoácidos y la ninhidrina?
11
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 11
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS
NOTAS.
Las principales precauciones que hay que tener son:
El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel hay que
manejarlo con las pinzas de madera.
No contaminar las soluciones de los aminoácidos patrón y de la muestra problema.
Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente a la cubeta de electroforesis,
hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables, conexiones o disolución
que esté en contacto con la corriente.
12
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
ÍNDICE
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 3
RESUMEN DEL MÉTODO ..................................................................................................................... 4
REACTIVOS REQUERIDOS. ................................................................................................................ 6
SOLUCIONES PARA PREPARAR. ....................................................................................................... 7
EQUIPO REQUERIDO ........................................................................................................................... 8
MATERIAL REQUERIDO ....................................................................................................................... 9
PROCEDIMIENTO .................................................................................................................... 10
OBSERVACIONES .............................................................................................................................. 12
PREGUNTAS. ...................................................................................................................................... 13
2
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
OBJETIVOS
•
Conocer el efecto que produce la luz sobre las plantas de Elodea en condiciones
de luminosidad y oscuridad.
•
Comprobar que las plantas producen oxígeno
•
Analizar que el bióxido de carbono, el agua y la luz son necesarios para que se
realice la fotosíntesis
3
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
RESUMEN DEL MÉTODO.
La fotosíntesis fabrica todas las moléculas orgánicas básicas que un vegetal necesita
para sobrevivir, prosperar y reproducirse. De manera general, los organismos
fotosintéticos posibilitan la existencia de los organismos no fotosintéticos
La fotosíntesis es un proceso de anabolismo autótrofo. Constituye no sólo la forma de
nutrición del reino vegetal sino por la base de la alimentación de todas las cadenas
tróficas. Consta de dos fases: una luminosa y otra oscura. En ellas se produce la
transformación no sólo de materia inorgánica en orgánica, sino también de energía
luminosa en energía química de enlace.
Para que se lleve a cabo la fotosíntesis se necesitan los siguientes elementos: Sol
(energía solar), gas carbónico (CO2) que entrara por las estomas de las hojas, Clorofila,
Agua y Sales minerales (absorbidas por las raíces).
La fotosíntesis se realiza en los cloroplastos, donde se encuentran los pigmentos
capaces de captar y absorber la energía luminosa procedente del sol. Estos pigmentos
son: clorofila (verde), xantofila (amarillo) y carotenoides (anaranjados). Se trata de uno
de los procesos anabólicos más importantes de la naturaleza, ya que la materia orgánica
sintetizada en su transcurso permite la realización del mismo.
El proceso de utilizar la energía luminosa para convertir CO2 y H20 en azucares consiste
en dos series de reacciones: las reacciones luminosas y el ciclo de Calvin.
Además, la fotosíntesis produce la mayor parte del oxígeno de la atmosfera, esta se
realiza en dos etapas:
Fase luminosa. Fase en donde se transforma la energía luminosa en química: que es
usada por todos los seres vivos. Los vegetales son el primer y único eslabón productor
de la cadena trófica. Esta fase depende de la luz que reciben los cloroplastos de las
células vegetales que son captados por medio de la clorofila, esta energía lumínica
descompone el agua en Oxigeno e Hidrogeno, liberándose el oxígeno y generándose 2
4
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
moléculas por medio del movimiento de sus electrones de un nivel a otro liberando
energía para producir la molécula ATP y el poder reductor que es la molécula NADPH2
que aportaran a la fase siguiente energía química para la transformación de CO2 en
Hidratos de carbono
En la Fase oscura en la que ya no interviene la luz y las moléculas formadas en la fase
luminosa (ATP y NADPH2) participan en la reducción del bióxido de carbono (CO2)
mediante una serie de reacciones el “Ciclo de Calvin” en donde se combina Se combina
CO2 con RDP (difosfato de ribulosa) para formar PGA (ác. Fosfoglicérido) Se combina
PGA con NADPH2 y ATP por lo que se libera agua, se forma PGAL para la nutrición de
la planta, se produce glucosa a partir de PGAL, este azúcar se disuelve en agua y recorre
toda la planta proporcionándole la energía necesaria para crecer se transforma materia
inorgánica en orgánica: a partir de la fuente de carbono del dióxido de carbono del aire.
5
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
REACTIVOS REQUERIDOS.
Sulfato
de
cobre
pentahidratado
Tartrato sódico-potásico
(II)
Hidróxido sódico
Glucosa 1%
Agua destilada
6
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA
PRÁCTICA 12 Y 13
PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
SOLUCIONES PARA PREPARAR.
Solución A: Disolver 3.5 gr de sulfato de cobre (II) pentahidratado en 50 mL. de agua.
Solución B: Disolver 17.3 gr de tartrato sódico-potásico (KNaC4H4O6.4H2O) y 5 gr de
hidróxido sódico en agua. Una vez frío, diluir hasta 50 mL con agua.
Nota.
El reactivo de Fehling debe ser preparado en el momento debido a la corta duración de
vida que tienen estos reactivos.
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PRÁCTICA 12 Y 13
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EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
EQUIPO REQUERIDO.
EQUIPO
Balanza granataria electrónica
Parrilla con agitador magnético
Microscopio óptico
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MATERIAL REQUERIDO.
MATERIAL
1 Palangana
1 pliego de papel aluminio
1 vaso de precipitados de 250 ml
2 vasos de precipitados de 600 ml
1 caja de Petri ó vidrio de reloj
2 embudos de vidrio de tallo corto
2 tubos de ensayo
1 probeta de 10 ml
1 gotero
1 espátula
Cerillos
2 ramas de Elodea
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PRODUCCIÓN DE OXÍGENO E IDENTIFICACIÓN DE GLUCOSA EN ELODEA
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PROCEDIMIENTO.
I.
Enjuaga con agua de la llave la planta de Elodea que se utilizará en la práctica.
II.
Selecciona dos ramas jóvenes. Verifica en la balanza granataria electrónica que
las ramas pesen exactamente lo mismo.
III.
Llena la palangana con agua de la llave. Lo siguiente deberá hacerse dentro de la
palangana, por debajo del agua:
•
Introduce un vaso de precipitados de 600 ml
•
Coloca una rama de Elodea dentro de un embudo de vidrio de tallo corto e
introduce el embudo en forma invertida al vaso de precipitados de 600 ml,
cuidando que la planta se mantenga dentro del embudo.
•
Posteriormente introduce un tubo de ensayo y colócalo en forma invertida
en el tallo del embudo, verificando que no contenga burbujas.
•
Saca el montaje y colócalo sobre la mesa. Repite la misma operación con
la otra rama de Elodea
IV.
Una vez que ya se tienen los dos montajes, colócalos a temperatura ambiente.
Uno de ellos se dejará en condiciones de luminosidad natural y el otro se cubrirá
con papel aluminio.
V.
Deja transcurrir 48 horas
Después de transcurridas las 48 horas. Antes de iniciar la actividad observa ¿Qué se
formó en los tubos de ensaye de los montajes que dejaste en luz y en oscuridad?
VI.
Enseguida toma el montaje que se dejó en condiciones de luminosidad natural y
agrega más agua al dispositivo, de tal manera que, al sumergir la mano al vaso
de precipitados, puedas tapar con el dedo pulgar ó índice la boca del tubo de
ensayo que se encuentra invertido en el vaso de precipitados, con el propósito de
impedir la salida del gas contenido en el interior del tubo.
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VII.
Enciende un cerillo, y espera hasta que aparezca una pequeña brasa, apaga la
flama de la pajilla e introdúcela al interior del tubo que contiene el gas, observa
qué le sucede a la brasa de la pajilla.
VIII.
Repite los pasos VI y VII con el montaje que se dejó envuelto con el papel
aluminio.
Practica 13 Identificación de glucosa en Elodea
1. Preparar Glucosa al 1%
2. Mezcla 2 ml de Solución A y 2 ml de Solución B en un tubo de ensayo, agrega 10
ml de la solución de glucosa al 1%. Agita suavemente.
3. Calienta en baño maría hasta la ebullición y observa lo que sucede.
4. Toma todas las hojas de la planta de Elodea del montaje que se dejó en
condiciones de luz, y tritúralas en un mortero hasta obtener un homogenizado.
5. Para Preparar la prueba de identificación de glucosa debemos Mezcla 2 ml de
Fehling A y 2 ml de Fehling B en otro tubo de ensayo.
6. Coloca el macerado de las hojas de Elodea. Ponlos a calentar en baño maría
hasta la ebullición.
7. Realiza una preparación temporal de Elodea y observa al microscopio con el
objetivo de 10x.
8. Repite la practica 13 desde el paso 4, con el montaje que se dejó en condiciones
de oscuridad.
Si en la prueba de identificación de glucosa, se observa el cambio de coloración de azul
a naranja, indica positivo para la presencia de glucosa. Si al examinar la preparación en
el objetivo de 10x se observan zonas teñidas de color naranja, indican positivo para la
presencia de glucosa.
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OBSERVACIONES.
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EXPUESTA A LA LUZ Y A LA OSCURIDAD
PREGUNTAS.
1.- ¿Qué sucedió con el encendedor al acercarla a los dos tubos de ensayo? ¿Por qué
crees que ocurrió esto?
2.- ¿Cómo se llama lo que se produjo dentro de los tubos de ensayo?
3.- ¿Cuáles son los productos para que se inicie la fotosíntesis?
4.- ¿Cuál es el papel de la luz en la fotosíntesis?
5.- ¿Qué relación existe entre la elodea, el agua y la luz?
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