LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE DETERMINACIÓN DE COBRE Y ZINC EN CABELLO POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA María del Pilar Peñaloza Hurtado (1631448-2131); [email protected]; Xiomara Chávez Giraldo (1632774-2131); [email protected] Melissa Muñoz Domínguez (1735739-2131); [email protected]; Universidad del Valle Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Química Laboratorio de Análisis Instrumental Docente: Harold Díaz Segura Fecha de la práctica: abril 14 de 2018 Fecha de entrega: mayo 31 de 2018 RESUMEN Se trabajó con una muestra de cabello (suministrada por un compañero), la cual se digestó con ácido nítrico concentrado (HNO3), donde se determinó el contenido de Cobre y Zinc mediante la técnica de espectrofotometría de absorción atómica por llama, la cuantificación se realizó por el método analítico patrón externo. Para el análisis se construyó dos curvas de calibración una para el cobre donde se usó soluciones estándar dentro del rango de (0.4-3.2) mg/L y en la del zinc (0.1-0.8) mg/L, a las cuales se les realizó las medidas absorciométricas por medio de un espectrofotómetro de absorción atómica modelo Aanalyst 100 marca Perkin Elmer, en el cual se empleó lámparas de cátodo hueco de Cobre y Zinc que operan a 324,8 nm y 213.9 nm con corriente alterna de 15 mA. Finalmente, por análisis estadísticos se obtuvo una concentración de cobre y zinc en la muestra de cabello expresada en mg/Kg de (13.7±2.1) y (185.9 ±8.1), con un error relativo de 29.4 % y 2.17 % respectivamente. Palabras Clave: Absorción atómica, atomización mediante llama, combustible y oxidante, Cabello. DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS Para la cuantificación de Zn se tomó un alícuota de 1.0 mL ± 0,01 de la solución anterior, se llevó a un matraz de 25 mL ± 0,03 y se enraso con agua destilada, el excedente de la muestra se utilizó para cuantificar el Cu Preparación de la muestra Inicialmente se cortó el cabello a ras del cuero cabelludo, se fragmentó la muestra en 2 longitudes de 5 cm, se descartó las puntas, se llevó a un vaso de 100.0 ± 0.1 donde se pesó 1.000 ± 0.0001 g de muestra, se adicionó unas gotas de solución de detergente no iónico, seguidamente se lavó con agua destilada y se procedió a secar en un horno con una temperatura de 110°C durante 90 minutos, posteriormente se pesó 0.800 ± 0.0001 g en un vaso de 100.0 ± 0.1 mL, se agregó 5.0 ± 0.015 mL de HNO3 concentrado, se suministró calor con una plancha de calentamiento (150°C), hasta que la solución sea traslúcida. Se dejó enfriar la solución de la digestión, se transfirió a un matraz de 10.0 ± 0.05 mL, se enraso con agua destilada. Preparación del Blanco En un vaso de 100.0 ± 0.1 mL se calentó 5.0 ± 0.015 mL de HNO3 concentrado a 150°C, Se dejó secar la solución de la digestión, se transfirió a un matraz de 100.0 ± 0.1 mL, se enraso con agua destilada. Preparación de soluciones Inicialmente se realizó el cálculo respectivo para preparar las soluciones utilizadas durante la práctica. 1 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Preparación solución patrón de Cobre (Cu) de 200.0 mg/L Se calculó el volumen necesario de la solución de 1005 mg/L de Cu+2, para preparar 25.00 ± 0.03 mL de solución 200.0 mg/L de Cu+2, donde se utilizó la ecuación 1. 𝐶1 = (2.0 ± 0.01) 𝑚𝐿 ∗ (201.0 ± 0.6)𝑚𝑔/𝐿 (50.00 ± 0.06) 𝑚𝐿 = 8. 04 𝐶1 = 8.04 𝑚𝑔/𝐿 Para calcular la desviación estándar de la solución de 8.0 mg/L, se utilizó ecuación 2. 𝑽𝟏 ∗ 𝑪𝟏 = 𝑽𝟐 ∗ 𝑪𝟐 (𝟏) 𝑉1 = (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 ∗ 200.0 𝑚𝑔/𝐿 = 4. 97 𝑚𝐿 1005 𝑚𝑔/𝐿 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐶𝑢 = 0.049 𝐶1 = (5.0 ± 0.015) 𝑚𝐿 ∗ 1005 𝑚𝑔/𝐿 = 201. 00 (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 Preparación solución patrón de Zinc (Zn) de 200.0 mg/L Se calculó el volumen necesario de la solución de 1000 mg/L de Zn+2, para preparar 25.00 ± 0.03 mL de solución 200.0 mg/L de Zn+2, se utilizó la ecuación 1. [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐶𝑢] = (8.04 ± 0.05) 𝑚𝑔/𝐿 𝑉1 = 5.0 ± 0.015 𝑠𝑙𝑛 𝐶𝑢+2 𝐶1 = 201.0 𝑚𝑔/𝐿 Teniendo en cuenta las desviaciones de los factores implicados en la determinación de la concentración de la solución patrón de Cobre de 201.0 mg/L, se procedió a realizar el cálculo para su respectiva desviación, se utilizó ecuación 2. 𝑺[𝒚] 𝑺𝒂 𝟐 𝑺𝒃 𝟐 𝑺𝒄 𝟐 √ = ( ) + ( ) +( ) [𝒚] 𝒂 𝒃 𝒄 (𝟐) 𝑆 0.03 2 0.015 2 √ = ( ) + ( ) [200.0] 25.00 5.0 𝐶1 = (5.0 ± 0.015) 𝑚𝐿 ∗ 1000 𝑚𝑔/𝐿 = 200. 00 (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 𝑉1 = 5.0 ± 0.015 𝑠𝑙𝑛 𝑍𝑛+2 𝐶1 = 200.0 𝑚𝑔/𝐿 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 𝑍𝑛 = 0.65 [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 𝐶𝑢] = (201.0 ± 0.6) 𝑚𝑔/𝐿 [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 𝑍𝑛] = (200.0 ± 0.6) 𝑚𝑔/𝐿 A partir de la solución patrón de 201.0 ± 0.6 mg/L, se preparó 50.0 ± 0.06 mL de una solución de 8.0 mg/L Cu+2, se utilizó la ecuación 1. A partir de la solución patrón de 200.0 ± 0.6 mg/L, se preparó 50.0 ± 0.06 mL de una solución de 2.0 mg/L Zn+2, se utilizó la ecuación 1. (50.00 ± 0.06) 𝑚𝐿 ∗ (8.00 ± 0.05) 𝑚𝑔/𝐿 (201.0 ± 0.6) 𝑚𝑔/𝐿 = 1. 990 𝑉1 = 2.00 ± 0.01 𝑠𝑙𝑛 𝐶𝑢 (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 ∗ (200.0 ± 0.6)𝑚𝑔/𝐿 = 1000 𝑚𝑔/𝐿 En el cálculo de la desviación estándar de la solución de 200.0 mg/L, se utilizó la ecuación 2. 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 𝐶𝑢 = 0.65 𝑉1 = 𝑉1 = 𝑉1 = +2 2 (50.00 ± 0.06) 𝑚𝐿 ∗ (2.00 ± 0.01) 𝑚𝑔/𝐿 = (200.0 ± 0.6) 𝑚𝑔/𝐿 𝑉1 = 0.5 ± 0.005 𝑠𝑙𝑛 𝑍𝑛+2 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE 𝐶1 = (0.5 ± 0.005 ) 𝑚𝐿 ∗ 200.0 𝑚𝑔/𝐿 = 2. 00 (50.00 ± 0.06) 𝑚𝐿 𝐶1 = 𝐶1 = 2.0 𝑚𝑔/𝐿 𝐶1 = 1.2 𝑚𝑔/𝐿 Para calcular la desviación estándar de la concentración 2.0 mg/L, se utilizó ecuación 2. En el cálculo de la desviación estándar de la solución de 1.2 mg/L, se utilizó la ecuación 2. 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑍𝑛 = 0.012 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑍𝑛 = 0.0078 [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑍𝑛] = (2.00 ± 0.01) 𝑚𝑔/𝐿 [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑍𝑛] = (1.200 ± 0.008) 𝑚𝑔/𝐿 Preparación solución patrón con +2 concentración de 4.8 mg/L de Cu y 1.2 mg/L Zn+2 A partir de la solución de 8.04 ± 0.05 mg/L de Cu+2 se preparó 25.00 ± 0.03 mL de solución estándar de Cu+2 4.80 mg/L, se utilizó ecuación 1 𝑉1 = Los valores obtenidos para preparar las soluciones y sus respectivas desviaciones se encuentran en la Tabla 1. Tabla 1. Datos Experimentales en la preparación de las soluciones utilizadas en la práctica. Vol. sln Vol. sln C. exp. 1000 mg/L 200.0 mg/L Solución (mg/L) (mL) (mL) (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 ∗ 4.80 𝑚𝑔/𝐿 = 14. 925 (8.04 ± 0.05) 𝑚𝑔/𝐿 𝑉1 = 15.0 ± 0.03 𝑠𝑙𝑛 𝐶𝑢+2 (15.0 ± 0.03 ) 𝑚𝐿 ∗ (8.04 ± 0.05)𝑚𝑔/𝐿 𝐶1 = (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 = 4. 824 Cu+2 201,0 ± 0,6 5,0 ± 0,015 --- Cu+2 8,04 ± 0,05 --- 2.0 ± 0.01 Zn+2 200,0 ± 0,6 5,0 ± 0,015 --- Zn+2 2,00 ± 0,01 --- 0.5 ± 0.005 Curva de calibración por patrón externo. Preparación de soluciones Estándar de Cu. Seguidamente, se realizó el cálculo del volumen necesario de la solución patrón con concentración de 4.82 mg/L de Cu+2 y 1.20 mg/L Zn+2, para preparar 5 soluciones estándar de Cu+2 en matraz de 10.00 ± 0.05 mL con concentraciones entre el rango de (0.4 – 3.2) mg/L, se utilizó la ecuación 1. 𝐶1 = 4.82 𝑚𝑔/𝐿 En el cálculo de la desviación estándar de la solución de 4.8 mg/L, se utilizó la ecuación 2. 𝑆𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐶𝑢 = 0.031 [𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝐶𝑢] = (4.82 ± 0.03) 𝑚𝑔/𝐿 Estándar 1 A partir de la solución de 2.0 ± 0.01 mg/L de Zn+2 se preparó 25.00 ± 0.03 mL de solución estándar de Zn+2 1.2 mg/L, se utilizó ecuación 1 𝑉1 = (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 ∗ 1.2 𝑚𝑔/𝐿 𝑉1 = = 15.0 𝑚𝐿 2.0 ± 0.01 𝑚𝑔/𝐿 𝑉1 = 15.0 ± 0.03 𝑠𝑙𝑛 𝑍𝑛+2 (15.0 ± 0.03 ) 𝑚𝐿 ∗ (2.00 ± 0.01)𝑚𝑔/𝐿 (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 = 4. 824 0.48 𝑚𝑔/𝐿 ∗ (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 = 0. 996 (4.82 ± 0.03) 𝑚𝑔/𝐿 𝐶1 = 3 𝑉1 = 1.0 ± 0.01 (4.82 ± 0.03) 𝑚𝑔/𝐿 ∗ (1.0 ± 0.01) 𝑚𝐿 (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 = 0.482 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Tabla 3. Datos experimentales, medición de absorbancia a 324.8 nm en la solución estándares de Cu+2 y la muestra. 𝐶1 = 0.482 𝑚𝑔/𝐿 Para calcular la desviación estándar de la solución de 0.482 mg/L se utilizó la ecuación 2. Estándar Concentración (mg/L) Absorbancia (A) ± 0.001 RSD SD 10-3 1 0,482±0,006 0,019 0,41 1,0 2 0,965±0,009 0,042 0,74 0,3 3 1,45 ± 0,01 0,062 0,65 0,4 4 1,93 ± 0,02 0,076 0,94 0,7 5 2,89 ± 0,02 0,139 0,51 0,7 Muestra --- 0,046 0,45 0,2 Blanco --- 0,008 8,33 0,7 𝑆𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 1 𝐶𝑢+2 = 0.0062 [𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 1 𝐶𝑢 +2 ] = (0.482 ± 0.006) 𝑚𝑔/𝐿 De manera análoga se calculó el volumen necesario de la solución patrón y las desviaciones de las concentraciones para las soluciones restantes. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Al graficar Absorbancia (A) en función de la concentración (mg/L), se obtuvó una línea recta, como se muestra en el Gráfico 1. Tabla 2. Datos experimentales de las concentraciones y desviaciones de las soluciones estándar de Cu+2. Concentración Volumen Estándar Experimental Cu+2 Experimental (mg/L) (mL) Absorbancia (A) 0,15 A = 0,0484x - 0,0072 0,13 0,11 1 0,482 ± 0,006 1,0 ± 0,01 2 0,965 ± 0,009 2,0 ± 0,01 3 1,45 ± 0,01 3.0 ± 0,01 4 1,93 ± 0,02 4,0 ± 0,015 0,05 5 2,89 ± 0,02 6,0 ± 0,014 0,03 0,09 0,07 0,01 0,40 0,90 1,40 1,90 2,40 2,90 Concentracion Cu (mg/L) Determinación espectrofotométrica Posteriormente en las medidas absorciométricas se utilizó un espectrofotómetro de absorción atómica modelo Aanalyst 100 marca Perkin Elmer, donde se determinó la proporción adecuada de la mezcla aire-acetileno la cual fue de 4:2, y se seleccionó la longitud de onda de 324.8 nm para lámpara de cátodo hueco de Cu, con una corriente alterna de 15 mA. Luego se midió la absorbancia para cada estándar de Cu y la muestra, donde se estableció el 0.000 de absorbancia con el blanco. Los valores obtenidos experimentalmente en la medición de absorbancia a cada estándar de Cu+2 y la muestra, se encuentran tabulados en la Tabla 3. Gráfico 1. Curva de calibración de las soluciones estándar de Cu+2 por el método patrón externo. Debido a que el punto 4 (1.93,0.076) con absorbancia de 0.076 se encuentran por fuera de la tendencia lineal de la curva se procedió a realizar una prueba Q (prueba de Dixon) para descartar o no el punto en la curva. Prueba Q de Dixon 1. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑛𝑢𝑙𝑎 𝐻0 : 𝑛𝑜 𝑠𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑡𝑎 2. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎 𝐻1 : 𝑠𝑖 𝑠𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑡𝑎 4 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE 3. 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = |𝑋𝑞 − 𝑋𝑝 | |0.076 − 0.062| = = 𝑅𝑎𝑛𝑔𝑜 0.139 − 0.019 6. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛: Existe una relación lineal entre la señal analítica y la concentración. El método es lineal. 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 0.12 4. 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑎𝑟𝑎 (𝑛 − 1) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 95% Partiendo de este análisis se procedió a realizar los datos estadísticos. 5. 𝐷𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛: Datos estadísticos 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 0.829 𝑠𝑖 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 < 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 → 𝑅𝑒𝑡𝑒𝑛𝑔𝑜 𝐻0 Método mínimos cuadrados Para determinar la mayoría de los valores por el método de mínimos cuadrados se necesita conocer el valor de tres variables (𝑆𝑥𝑥 ), (𝑆𝑦𝑦 ) 𝑦 𝑆𝑥𝑦 para calcular los valores se utilizó las ecuaciones 3, 4 y 5. 𝑠𝑖 0.12 < 0.829 6. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛: El dato atípico no se descarta con un 95% de confianza de la curva de calibración. La linealidad determina la relación directa entre la señal instrumental (absorbancia) y la concentración del producto analizado (Cu+2), el cual es un método lineal cuando presenta un r > 0.999, en base a esto y al r que se obtuvo en el gráfico 1. r = 0.9904, se realizó una prueba t para evaluar r. ̅)𝟐 (𝟑) 𝑺𝒙𝒙 = ∑(𝒙𝟏 − 𝒙 𝑆𝑥𝑥 = 3. 433 (𝑚𝑔/𝐿)2 ̅)𝟐 (𝟒) 𝑺𝒚𝒚 = ∑(𝒚𝟏 − 𝒚 Prueba t para evaluar r 𝑆𝑦𝑦 = 0.00822 1. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑛𝑢𝑙𝑎 𝐻0 : si r = 0 no hay correlación ̅) ∗ (𝒚𝟏 − 𝒚 ̅) (𝟓) 𝑺𝒙𝒚 = ∑(𝒙𝟏 − 𝒙 0.9902 = 0 2. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎 𝐻1 : r ≠ 0 hay correlación 3. 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 𝑆𝑥𝑦 = 0. 16631 (𝑚𝑔/𝐿) 0.9902 ≠ 0 |𝑟| ∗ √𝑛 − 2 √1 − 𝑟 2 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 12.30 = En el cálculo del Coeficiente de correlación (𝑟), la desviación estándar residual (𝑆𝑟 ) y la varianza residual, se utilizó las ecuaciones 6, 7 y 8 respectivamente. |0.9902| ∗ √3 √1 − (0.9902)2 4. 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑎𝑟𝑎 (𝑛 − 2) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 𝑟 = 0.99024 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 3.18 𝑺𝒙𝒚 √(𝑺𝒙𝒙 ) ∗ (𝑺𝒚𝒚 ) (𝟔) (𝑺𝒚𝒚 ) − (𝒃)𝟐 ∗ (𝑺𝒙𝒙 ) 𝑺𝒓 = √ (𝟕) 𝒏−𝟐 5. 𝐷𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛: 𝑠𝑖 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 > 𝑡𝑐𝑟𝑖𝑡𝑖𝑐𝑜 → 𝑅𝑒𝑐ℎ𝑎𝑧𝑜 𝐻0 𝑠𝑖 12.30 > 3.18 𝒓= 𝑆𝑟 = 0.00729 5 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE 𝑺𝒓 𝟐 Los datos obtenidos experimentalmente por método de mínimos cuadrados para el método de patrón externo, se encuentran tabulados en la tabla 4. (𝑺𝒚𝒚 ) − (𝒃)𝟐 ∗ (𝑺𝒙𝒙 ) (𝟖) = 𝒏−𝟐 𝑆𝑟 2 = 0.0000532 Tabla 4. Datos estadísticos de la regresión lineal curva de calibración por el método patrón externo para Cu+2. Variable Valor Para determinar la pendiente (𝑏), su desviación estándar (𝑆𝑏 ) y el intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑏 ) , se utilizó la ecuación 9, 10 y 11. 𝒃= −1 𝑏 = 0.04844 𝑚𝑔/𝐿 𝑺𝒃 = 𝑆𝑏 = 0.00394 𝑚𝑔/𝐿−1 Número de estándar 𝑺𝒙𝒚 (𝟗) 𝑺𝒙𝒙 𝑺𝒓 √𝑺𝒙𝒙 Pendiente (𝟏𝟎) Intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑏 ) ; ( 𝑡 = 3.18; 95%) 𝑰𝑪𝒃 = 𝒃 ± 𝒕( 𝒕 = 𝒏 − 𝟐) ∗ 𝑺𝒃 (𝟏𝟏) 𝐼𝐶𝑏 = (0.0484 ± 0.0125) 𝑚𝑔/𝐿−1 𝑎 = − 0.00718 𝟏 𝑺𝒂 = 𝑺𝒓 ∗ √ + 𝒏 𝑺𝒙𝒙 𝑆𝑎 = 0.00689 Intervalo de confianza pendiente 𝐼𝐶𝑏 0.0484 𝑚𝑔/𝐿−1 0.0039 𝑚𝑔/𝐿−1 (0.0484 ± 0.0125) 𝑚𝑔/𝐿−1 -0.0072 𝑆𝑎 0.0069 Intervalo de confianza intercepto 𝐼𝐶𝑎 (-0.0072 ± 0.0219) Coeficiente de determinación 𝑟2 Varianza residual Promedio de x Desviación en x Promedio de y (𝟏𝟑) 𝑎 5 Desviación estándar Intercepto Desviación estándar residual ̅ − 𝒃𝒙 ̅ (𝟏𝟐) 𝒂= 𝒚 (𝒙 ̅ )𝟐 𝑆𝑏 Coeficiente de correlación En el cálculo del intercepto (𝑎), su desviación estándar (𝑆𝑎 ) y el intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑎 ) , se utilizó la ecuación 12, 13 y 14. 𝑏 Desviación estándar pendiente Intercepto 𝑏 = (0.0484 ± 0.0039) 𝑚𝑔/𝐿−1 𝑛 Desviación en y Covarianza de x e y 0.9809 𝑟 0.9902 𝑆𝑟 𝑆𝑟 2 0.00005 𝑥̅ 1.54 𝑚𝑔/𝐿 0.007 𝑆𝑥𝑥 3.433 (𝑚𝑔/𝐿)2 𝑦̅ 𝑆𝑦𝑦 0.008217 𝑆𝑥𝑦 0.1663 𝑚𝑔/𝐿 0.06760 𝑎 = (−0.0072 ± 0.0069) A partir del método de mínimos cuadrados se halló la ecuación de la recta por patrón externo. 𝑰𝑪𝒂 = 𝒂 ± 𝒕( 𝒕 = 𝒏 − 𝟐) ∗ 𝑺𝒂 (𝟏𝟒) 𝑦 ± 𝑆𝑟 = (𝑏 ± 𝑆𝑏 )𝑥0 + (𝑎 ± 𝑆𝑎 ) Intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑎 ) ; ( 𝑡 = 3.18; 95%) 𝐼𝐶𝑎 = (−0.0072 ± 0.0219) 6 𝑨 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟕 = (𝟎. 𝟎𝟒𝟖𝟒 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟗)𝒎𝒈/𝑳−𝟏 (𝒙𝟎 ) − (𝟎. 𝟎𝟎𝟕𝟐 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟔𝟗) (𝟏𝟓) LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Determinación de la concentración de Cu+2 en la muestra por el método de patrón externo. Teniendo en cuenta la ecuación de la curva de calibración por el método de patrón externo y valor de la absorbancia obtenido en la muestra, se calculó la concentración de Cu+2 mg/L en la muestra y su desviación estándar se utilizó ecuación 16 y 17. −𝟏 𝑨 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟕 = (𝟎. 𝟎𝟒𝟖𝟒 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟗)𝒎𝒈/𝑳 − (𝟎. 𝟎𝟎𝟕𝟐 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟔𝟗) El intervalo de confianza se calculó con la ecuación 18. 𝑰𝑪 = 𝑪𝒙𝟎 ± 𝒕( 𝒕 = 𝒏 − 𝟐) ∗ 𝑺𝑪𝒙𝟎 (𝟏𝟖) 𝐼𝐶 = (1.1 ± 0.5) 𝑚𝑔/𝐿 𝐶𝑢+2 Determinación de la concentración de Cu+2 en la muestra expresado en mg/Kg. A partir de la concentración de Cu+2 en la muestra 1.1 ± 0.2 mg/L, se determinó la concentración de Cu+2 en la muestra expresado en mg/Kg (𝑪𝒙𝟎 ) Donde (A) es el valor de la señal en la muestra (absorbancia=0.046), (𝐶𝑥0 ) es la concentración de Cu+2 en mg/L, despejando (𝐶𝑥0 ) se tiene la concentración de Cu+2 en la dilución. 𝑪𝒙𝟎 = (1.1 ± 0.2) 𝑚𝑔 𝐶𝑢+2 1000 𝑚𝐿 1000 𝑔 = 13. 72 1 𝑘𝑔 𝑨 − (𝒂) (𝟏𝟔) 𝒃 0.046 − (−0.0072) 𝐶𝑥0 = = 1. 098 0.0484 𝑚𝑔/𝐿−1 13.7 𝑚𝑔/𝐾𝑔 𝐶𝑢+2 Para el cálculo de la desviación de concentración de Cu+2 expresada en mg/Kg se utilizó la ecuación 2. [𝐶𝑢+2 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ] = 1.1 𝑚𝑔/𝐿 La desviación estándar concentración del analito en la muestra (𝑆𝐶𝑥0 ) se calculó con la ecuación 17. 𝑺𝑪𝒙𝟎 = (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 ∗ (0.8000 ± 0.0001) 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 𝑆(𝐶𝑢+2 ) = 2. 11 [𝐶𝑢+2 ] = (13.7 ± 2.1) 𝑚𝑔/𝐾𝑔 𝐼𝐶 = (13.7 ± 6.7) 𝑚𝑔/𝐾𝑔 𝟐 𝟏 𝑺𝒓 𝟏 𝟏 𝒚𝟎 − 𝒚 ∗√ + +( 𝑬𝒄. 𝟏𝟕 ) 𝑺𝒙𝒙 𝒃 𝒃 𝒎 𝒏 Para determinar el porcentaje de error en la concentración de Cu+2 en la muestra por el método patrón externo, se tomó como valor teórico el reportado en la literatura.1 (10.6 ± 0.7) μg/g es decir 10.6 mg/Kg Cu+2, se utilizó la ecuación 19. 𝑚 = 1 # 𝑟é𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑛 = 5 # 𝑑𝑒 𝑑𝑎𝑡𝑜𝑠 𝑜 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑆𝐶𝑥0 %𝑬 = 1 1 0.046 − 0.06760 2 1 0.007 ∗√ + +( ) = 1 5 0.0484 3.433 0.0484 %𝐸 = 𝑆𝐶𝑥0 = 0. 169 [𝐶𝑢+2 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ] = (1.1 ± 0.2) 𝑚𝑔/𝐿 7 𝑽𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒕𝒆𝒐𝒓𝒊𝒄𝒐 − 𝑽𝒂𝒍𝒐𝒓𝒆𝒙𝒑. ∗ 𝟏𝟎𝟎 (𝟏𝟗) 𝑽𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒕𝒆𝒐𝒓𝒊𝒄𝒐 10.6 − 13.7 ∗ 100 = 29.43 10.6 % 𝐸 = 29.4 % LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Curva de calibración por patrón externo. Preparación de soluciones Estándar de Zn. Seguidamente, se realizó el cálculo del volumen necesario de la solución patrón con concentración de 4.8 mg/L de Cu+2 y 1.2 mg/L Zn+2, para preparar 5 soluciones estándar de Zn+2 en matraz de 10.00 ± 0.05 mL con concentraciones entre el rango de (0.1 – 0.8) mg/L, se utilizó la ecuación 1. Límite de detección (LD) Método patrón externo Para determinar la mínima concentración de Cu+2 que produce la señal analítica significativamente diferente a la señal del blanco, se utilizó la ecuación 20. 𝑳𝑫 = (𝒚𝑩 + 𝟑𝑺𝒂 ) − 𝒂 (𝟐𝟎) 𝒎 Estándar 1 Donde (𝑦𝐵 ) es la señal del blanco (intercepto) (𝑆𝑎 ) es la desviación del intercepto, (𝑎) es el intercepto de la pendiente y (𝑚) es la pendiente de la recta. Se remplazó por los valores de la (ecuación 15) curva de calibración patrón externo en la ecuación 20. 𝑉1 = 𝐶1 = (−0.0071 + 3(0.0068) − (−0.0071) 𝐿𝐷 = = 0.42 0.0484 (𝑚𝑔/𝐿)−1 𝐿𝐷 = 0.4 𝑚𝑔/𝐿 𝐶𝑢+2 (1.2 ± 0.008) 𝑚𝑔/𝐿 ∗ (1.0 ± 0.01) 𝑚𝐿 = 0.12 (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 𝑆𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 1 𝑍𝑛+2 = 0.0016 [𝐸𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 1 𝑍𝑛+2 ] = (0.120 ± 0.002) 𝑚𝑔/𝐿 De manera análoga se calculó el volumen necesario de la solución patrón y las desviaciones de las concentraciones para las soluciones restantes. Los resultados se muestran en la Tabla 5. (𝒚𝑩 + 𝟏𝟎𝑺𝒂 ) − 𝒂 (𝟐𝟏) 𝒎 Se remplazó por los valores de la (ecuación 15) curva de calibración patrón externo en la ecuación 21. 𝐿𝐶 = 𝑉1 = 1.0 ± 0.01 Para calcular la desviación estándar de la solución de 0.12 mg/L se utilizó la ecuación 2. Límite de cuantificación (LC) Método patrón externo Se determinó la mínima concentración de Cu+2 que puede ser cuantificada con precisión, se utilizó ecuación 21. 𝑳𝑪 = 0.12 𝑚𝑔/𝐿 ∗ (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 = 1.0 𝑚𝐿 (1.2 ± 0.03) 𝑚𝑔/𝐿 Tabla 5. Datos experimentales de las concentraciones y desviaciones de las soluciones estándar de Zn+2. Concentración Volumen Estándar Experimental Zn+2 Experimental (mg/L) (mL) (−0.0071 + 10(0.0068) − (−0.007) = 1.41 0.0484 (𝑚𝑔/𝐿)−1 𝐿𝐶 = 1.4 𝑚𝑔/𝐿 𝐶𝑢+2 8 1 0,120 ± 0,002 1,0 ± 0,01 2 0,240 ± 0,002 2,0 ± 0,01 3 0,360 ± 0,003 3.0 ± 0,01 4 0,480 ± 0,004 4,0 ± 0,015 5 0,720 ± 0,006 6,0 ± 0,014 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Determinación espectrofotométrica Posteriormente en las medidas absorciometricas se utilizó un espectrofotómetro de absorción atómica modelo Aanalyst 100 marca Perkin Elmer, donde se determinó la proporción adecuada de la mezcla aire-acetileno la cual fue de 4:2, y se seleccionó la longitud de onda de 213.9 nm para lámpara de Zn, con una corriente alterna de 15 mA. Luego se midió la absorbancia para cada estándar de Zn+2 y la muestra, donde se estableció el 0.000 de absorbancia con el blanco. Los valores obtenidos experimentalmente en la medición de absorbancia a cada estándar de Zn+2 y la muestra, se encuentran tabulados en la Tabla 6. Debido a que el punto 2 (0.240,0.081) con absorbancia de 0.081 se encuentran por fuera de la tendencia lineal de la curva se procedió a realizar una prueba Q (prueba de Dixon) para descartar o no el punto en la curva. Prueba Q de Dixon 1. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑛𝑢𝑙𝑎 𝐻0 : 𝑛𝑜 𝑠𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑡𝑎 2. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎 𝐻1 : 𝑠𝑖 𝑠𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑎𝑟𝑡𝑎 3. 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = Tabla 6. Datos experimentales, medición de absorbancia a 213.9 nm en la solución estándares de Zn+2 y la muestra. Estándar Concentración (mg/L) Absorbancia (A) ± 0.001 1 0,120±0,002 0,023 3,56 0,8 2 0,240±0,002 0,081 0,85 0,7 3 0,360±0,003 0,108 0,77 0,8 4 0,480±0,004 0,166 1,37 2,3 5 0,720±0,006 0,255 1,59 4,1 Muestra --- 0,207 0,65 1,3 Blanco --- 0,001 68,8 0,8 RSD SD 10-3 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 0.12 4. 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑎𝑟𝑎 (𝑛 − 1) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 95% 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 0.829 5. 𝐷𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛: 𝑠𝑖 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 < 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 → 𝑅𝑒𝑡𝑒𝑛𝑔𝑜 𝐻0 𝑠𝑖 0.12 < 0.829 Al graficar Absorbancia (Abs) en función de la concentración (mg/L), se obtuvó una línea recta, como se muestra en el Gráfico 2. Absorbancia (A) 0,27 6. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛: El dato atípico no se descarta con un 95% de confianza de la curva de calibración. A = 0,3814x - 0,0199 R² = 0,9938 La linealidad determina la relación directa entre la señal instrumental (absorbancia) y la concentración del producto analizado (Zn+2), el cual es un método lineal cuando presenta un r > 0.999, en base a esto y al r que se obtuvo en el gráfico 1. r = 0.9969, se realizó una prueba t para evaluar r. 0,22 0,17 0,12 0,07 0,02 0,10 |𝑋𝑞 − 𝑋𝑝 | |0.081 − 0.108| = = 𝑅𝑎𝑛𝑔𝑜 0.255 − 0.023 0,30 0,50 0,70 Concentracion Zn (mg/L) Gráfico 2. Curva de calibración de las soluciones estándar de Zn+2 por el método patrón externo. 9 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Prueba t para evaluar r En el cálculo del Coeficiente de correlación (𝑟), la desviación estándar residual (𝑆𝑟 ) y la varianza residual, se utilizó las ecuaciones 6, 7 y 8 respectivamente. 1. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑛𝑢𝑙𝑎 𝐻0 : si r = 0 no hay correlación 0.9969 = 0 𝑟 = 0.9969 2. 𝐻𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎 𝐻1 : r ≠ 0 hay correlación 3. 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 0.9969 ≠ 0 |𝑟| ∗ √𝑛 − 2 √1 − 𝑟 2 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 = 21.99 = 𝑆𝑟 = 0.0080 |0.9969| ∗ √3 𝑆𝑟 2 = 0.000064 √1 − (0.9969)2 Para determinar la pendiente (𝑏), su desviación estándar (𝑆𝑏 ) y el intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑏 ) , se utilizó las ecuaciones 9, 10 y 11. 4. 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑝𝑎𝑟𝑎 (𝑛 − 2) 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 = 3.18 𝑏 = 0.38141 𝑚𝑔/𝐿−1 𝑆𝑏 = 0.017 𝑚𝑔/𝐿−1 5. 𝐷𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛: 𝑏 = (0.3814 ± 0.0173) 𝑚𝑔/𝐿−1 𝑠𝑖 𝑡𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 > 𝑡𝑐𝑟í𝑡𝑖𝑐𝑜 → 𝑅𝑒𝑐ℎ𝑎𝑧𝑜 𝐻0 𝑠𝑖 21.99 > 3.18 Intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑏 ) ; ( 𝑡 = 3.18; 95%) 𝐼𝐶𝑏 = (0.3814 ± 0.0552) 𝑚𝑔/𝐿−1 6. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛: Existe una relación lineal entre la señal analítica y la concentración. El método es lineal. En el cálculo del intercepto (𝑎), su desviación estándar (𝑆𝑎 ) y el intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑎 ) , se utilizó las ecuaciones 12, 13 y 14. Partiendo de este análisis se procedió a realizar los datos estadísticos. 𝑎 = − 0.01986 Datos estadísticos 𝑆𝑎 = 0.0076 Método mínimos cuadrados Para determinar la mayoría de los valores por el método de mínimos cuadrados se necesita conocer el valor de tres variables (𝑆𝑥𝑥 ), (𝑆𝑦𝑦 ) 𝑦 𝑆𝑥𝑦 para calcular los valores se utilizó las ecuaciones 3, 4 y 5. 𝑎 = (−0.0199 ± 0.0076) Intervalo de confianza (𝐼𝐶𝑎 ) ; ( 𝑡 = 3.18; 95%) 𝐼𝐶𝑎 = (−0.0199 ± 0.0241) 𝑆𝑥𝑥 = 0. 213 (𝑚𝑔/𝐿)2 Los datos obtenidos experimentalmente por método de mínimos, se encuentran tabulados en la tabla 7. 𝑆𝑦𝑦 = 0.03120 𝑆𝑥𝑦 = 0. 08129 (𝑚𝑔/𝐿) 10 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Determinación de la concentración de Zn+2 en la muestra por el método de patrón externo. Teniendo en cuenta la ecuación de la curva de calibración por el método de patrón externo y valor de la absorbancia obtenido en la muestra, se calculó la concentración de Zn+2 mg/L en la muestra y su desviación estándar se utilizó ecuación 16 y 17. Tabla 7. Datos estadísticos de la regresión lineal curva de calibración por el método patrón externo para Zn+2. Variable Número de estándar Pendiente Valor 𝑛 𝑏 Desviación estándar pendiente 𝑆𝑏 Intervalo de confianza pendiente 𝐼𝐶𝑏 Intercepto 𝑎 5 0.3814 𝑚𝑔/𝐿−1 0.0173 𝑚𝑔/𝐿−1 -0.0199 Desviación estándar Intercepto 𝑆𝑎 0.0076 Intervalo de confianza intercepto 𝐼𝐶𝑎 (-0.0199 ± 0.0241) Coeficiente de determinación 𝑟2 Coeficiente de correlación Desviación estándar residual Varianza residual Promedio de x Desviación en x Promedio de y Desviación en y Covarianza de x e y 0.9969 𝑆𝑟 𝑆𝑟 2 0.00006 𝑥̅ 0.384 𝑚𝑔/𝐿 𝐶𝑥0 = 0.008 0.12660 𝑆𝑥𝑦 0.08129 𝑚𝑔/𝐿 0.207 − (−0.0199) == 0. 5947 0.3814 𝑚𝑔/𝐿−1 [𝑍𝑛+2 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ] = 0.595 𝑚𝑔/𝐿 La desviación estándar concentración del analito en la muestra (𝑆𝐶𝑥0 ) se calculó con la ecuación 17. 0.2131 (𝑚𝑔/𝐿)2 𝑦̅ 𝑆𝑦𝑦 Donde (A) es el valor de la señal en la muestra (absorbancia=0.207), (𝐶𝑥0 ) es la concentración de Zn+2 en mg/L, despejando (𝐶𝑥0 ) se tiene la concentración de Zn+2 en la dilución. 0.9938 𝑟 𝑆𝑥𝑥 𝑨 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟖 = (𝟎. 𝟑𝟖𝟏𝟒 ± 𝟎. 𝟎𝟏𝟕𝟑)𝒎𝒈/𝑳−𝟏 (𝑪𝒙𝟎 ) − (𝟎. 𝟎𝟏𝟗𝟗 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟕𝟔) (0.3814 ± 0.0552) 𝑚𝑔/𝐿−1 𝑆𝐶𝑥0 = 0.03120 0.008 1 1 0.207 − 0.1266 2 1 ∗√ + +( ) 0.3814 1 5 0.3814 0.2131 𝑆𝐶𝑥0 = 0. 02493 A partir del método de mínimos cuadrados se halló la ecuación de la recta por patrón externo. [𝑍𝑛+2 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ] = (0.595 ± 0.025) 𝑚𝑔/𝐿 𝑦 ± 𝑆𝑟 = (𝑏 ± 𝑆𝑏 )𝑥0 + (𝑎 ± 𝑆𝑎 ) El intervalo de confianza se calculó con la ecuación 18. 𝑨 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟖 = (𝟎. 𝟑𝟖𝟏𝟒 ± 𝟎. 𝟎𝟏𝟕𝟑)𝒎𝒈/𝑳−𝟏 (𝒙𝟎 ) − (𝟎. 𝟎𝟏𝟗𝟗 ± 𝟎. 𝟎𝟎𝟕𝟔) (𝟐𝟐) 𝐼𝐶 = (0.595 ± 0.0792) 𝑚𝑔/𝐿 𝑍𝑛+2 11 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE Determinación de la concentración de Zn+2 en la muestra expresado en mg/kg. A partir de la concentración de Zn+2 en la muestra 0.595 ± 0.025 mg/L, se determinó la concentración de Zn+2 en la muestra expresado en mg/Kg 4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS En la práctica se determinó la cuantificó zinc y cobre de una muestra de cabello utilizando el método de espectroscopia atómica; con esta técnica los elementos presentes en una muestra se convierten en átomos o iones elementales en estado gaseoso por medio de un proceso llamado atomización, de esta manera se mide la absorción ultravioleta-visible, emisión o fluorescencia de las especies atómicas en el vapor. (0.595 ± 0.025) 𝑚𝑔 𝑍𝑛+2 (25.00 ± 0.03) 𝑚𝐿 ∗ (1.00 ± 0.01) 𝑚𝐿 ∗ 1000 𝑚𝐿 (10.00 ± 0.05) 𝑚𝐿 1000 𝑔 ∗ 1 𝑘𝑔 = 185. 87 (0.8000± 0.0001) 𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 185.9 𝑚𝑔/𝐾𝑔 𝑍𝑛+2 Para implementar dicho método se utilizó un equipo de absorción atómica de atomización por llama (AAs) de doble haz como se ve en la Figura 1. Para el cálculo de la desviación de concentración de Zn+2 expresada en mg/Kg se utilizó la ecuación 2. 𝑆(𝑍𝑛+2 ) = 8. 06 [𝑍𝑛+2 ] = (185.9 ± 8.1) 𝑚𝑔/𝐾𝑔 𝐼𝐶 = (185.9 ± 25.6) 𝑚𝑔/𝐾𝑔 Para determinar el porcentaje de error en la concentración de Zn+2 en la muestra por el método patrón externo, se tomó como valor teórico el reportado en la literatura.2 (190.0 ± 0.5) μg/g es decir 190.0 mg/Kg Zn+2, se utilizó la ecuación 19. % 𝐸 = 2.17 % Límite de detección (LD) cuantificación (LC), método patrón externo. Con los datos estadísticos reportados en la Tabla 7. y la ecuación de la curva de calibración, se determinó la mínima concentración de Zinc que produce la señal analítica (𝐿𝐷) y la concentración de Zinc que puede ser cuantificada con precisión (𝐿𝐶), se utilizó las ecuaciones 20 y 21. Figura 1. Esquema de equipo de absorción atómica por llama de doble haz. Estos equipos utilizan fuentes de radiación discretas como la lámpara de cátodo hueco o descarga sin electrodo. Estas fuentes emiten las líneas de resonancia del espectro de emisión del elemento que compone la fuente y como los espectros de emisión y absorción para un mismo elemento son iguales, se construyen estas fuentes con el elemento que se busca cuantificar. 𝐿𝐷 = 0.06 𝑚𝑔/𝐿 𝑍𝑛+2 𝐿𝐶 = 0.2 𝑚𝑔/𝐿 𝑍𝑛+2 12 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE estos deflectores, la mayor parte de la muestra se recoge en el fondo de la cámara de mezcla, donde se drena hacia un contenedor de desechos. El aerosol, el oxidante y el combustible se queman en un mechero provisto de una ranura, que produce una llama que generalmente mide entre 5 y 10 cm. Los mecheros de flujo laminar proporcionan una llama relativamente estable y larga. Estas propiedades tienden a aumentar la sensibilidad y la reproducibilidad. En la llama se producen una serie de procesos en los que se incluye la atomización. El primer proceso es la desolvatación del analito, en la que se evapora el disolvente y que se genera un aerosol molecular sólido finamente dividido, luego se disocian la mayoría de estas moléculas y se forma un gas atómico, además de esto también hay procesos como excitación molecular, ionización y excitación iónica; lo que convierte al proceso de la atomización en la llama el más crítico en este método. Figura 2. Lámpara de cátodo hueco de cobre. Se utilizaron lámparas de cátodo hueco de cobre y de zinc, cuyas energías eran de 7.0 y 5.2 respectivamente. Estas lámparas consisten de un cilindro de vidrio sellado al vacío y con un gas inerte en su interior. Dentro de este cilindro se encuentran dos filamentos; uno de ellos es el cátodo y el otro el ánodo. El ánodo generalmente es un alambre de tungsteno, el cátodo es en forma de un cilindro hueco, en el interior del cual se encuentra depositado en forma de una capa el elemento metálico que se va a excitar. Se aplica una diferencia de potencial aplicado entre los dos electrodos que genera una descarga eléctrica, estas descargas eléctricas aumentan la energía cinética y favorecen la ionización de las moléculas de gas inerte, las especies ionizadas requieren carga positiva, por lo cual son atraídas hacia el cátodo. Al chocar los iones de gas inerte (Ar en este caso) con las paredes del cátodo, son desprendidos átomos del metal que se encuentra en el cátodo, los átomos producidos son excitados por choques moleculares con los iones y átomos de argón. Los átomos excitados no pueden permanecer indefinidamente en un estado de energía superior y procede el paso de emisión electromagnética. Figura 3. Regiones de una llama. La llama tiene varias regiones como se ilustra en la Figura 3; Las regiones más importantes de la llama producida son: la zona de combustión primaria, la región interconal y la zona de combustión secundaria. El aspecto y tamaño relativo de estas regiones varía con el tipo y la relación entre el combustible y oxidante (en este El proceso de atomización es el que caracteriza el método utilizado. En un atomizador en llama la disolución de la muestra es absorbida y nebulizada a finas gotas mediante un flujo de gas oxidante mezclado con el gas combustible y pasa a través de una serie de deflectores que eliminan las gotitas de la disolución que no sean muy finas. Como consecuencia de la acción de caso acetileno y aire respectivamente). La zona de combustión primaria en una llama de 13 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE debido a que la concentración de minerales presentes en el cabello son superiores a las encontradas en otros tejidos y además tiene la propiedad de memoria a largo plazo la cual nos da información sobre la exposición a contaminantes en periodos hasta mayores a un año, en la práctica se obtuvieron concentraciones en la muestra para el Cu+2 de 13.7 ± 2.1 mg/Kg y para el Zinc+2 de 185.9 ± 8.0 mg/Kg, con porcentajes de error frente al teórico suministrado en la literatura del 29.4 % y 2.17 %, respectivamente. hidrocarburos se reconoce por su coloración azul que proviene de los espectros de bandas de C2, CH y otros radicales. La región interconal, que es relativamente estrecha en llamas de hidrocarburos estequiométricas, puede alcanzar varios centímetros de altura con fuentes ricas en combustible de acetileno/oxigeno o acetileno/ óxido nitroso. Esta zona es frecuentemente rica en átomos libres y es la parte de la llama más ampliamente utilizada en espectroscopia. En la zona de combustión secundaria, los productos formados en la región interior se convierten en óxidos moleculares estables que se dispersan por los alrededores. Es importante tener en cuenta que, para obtener una máxima sensibilidad analítica, la llama debe ajustarse con respecto al haz hasta obtener una absorbancia máxima. La determinación de cobre y zinc se pudo realizar por medio de interpolación de la curva de calibración, que es determinar el valor de la concentración dentro de un rango de valores medidos experimentalmente, rango en que se tiene la certeza del comportamiento lineal de la ley de Beer. La ley de Beer describe correctamente el comportamiento de absorción de un medio que contiene concentraciones de analito relativamente bajas. A concentraciones altas, la distancia media entre los átomos responsables de la absorción de la radiación disminuye hasta el punto en que cada átomo altera la distribución de carga de su átomo vecino. Esta interacción, a su vez puede alterar la capacidad de absorber radiación a determinada longitud de onda y como la magnitud de esta interacción depende de la concentración, la aparición de este fenómeno da lugar desviaciones de la linealidad entre absorbancia y concentración. Como se observa en la Figura 1, la fuente produce radiación de potencia P0 y al pasar por la llama que contiene el analito se obtiene una potencia P, esto es debido a la absorción producida por el analito en que los átomos pasan de un estado basal a un estado excitado, lo que causa una disminución de la potencia radiante y el logaritmo del cociente de estas nos produce unidades de absorbancia, lo que nos permite cuantificar el analito a partir de la ley de Beer. Cabe resaltar que el equipo de absorción atómica usado es de doble haz como se muestra en la Figura 1. Esto significa que el haz proveniente de la fuente del cátodo hueco se divide mediante un cortador reflectante, una mitad pasa atraves de la llama y la otra mitad fuera de ella, siendo esta de referencia. Los dos haces se juntan mediante un espejo semiplateado y llegan a un monocromador y finalmente a un detector. Esto se hace con el fin de corregir la potencia generada por la luz de la llama, sin embargo, no es una corrección de la pérdida de potencia radiante debido a la absorción o la dispersión en por la propia llama y los compuestos producidos por la combustión de esta; esta corrección se realiza fácilmente midiendo la absorbancia de un blanco.3 El porcentaje de error presentado en ambos casos se atribuye en gran medida al analista, aunque tanto la curva de calibración del cobre como la del zinc presentaron datos atípicos mediante una prueba t realizada al método de cada elemento se concluyó que éste era un método lineal; incluyendo el punto 4 (1.93,0.076) para el cobre y el punto 2 (0.240,0.081) para el zinc ya que una prueba Q de Dixon realizada para cada punto arrojó un 95% de confianza para dichos puntos, lo que representaba un desfase no significativo. El cabello humano es el tejido más idóneo para evaluar la exposición crónica a ciertos metales, 14 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE importancia para poder tratar enfermedades a tiempo, por esto se necesitó de métodos sensibles que permitan analizar matrices complejas como es la espectrometría de absorción atómica. A propósito, los elementos metálicos medidos en estos en estos los análisis clínicos se dividen en tres grupos según su función en el metabolismo humano y son generalmente clasificados como esenciales, tóxicos o terapéuticos4. 5. CONCLUSIONES La determinación de un elemento por espectroscopia atómica es una técnica selectiva; se debe cambiar la lámpara de cátodo hueco por cada elemento que se pretenda cuantificar. La concentración tanto de cobre como de zinc en la muestra de cabello humano analizada está por encima/debajo de las concentraciones normales. Elementos esenciales Elementos Esenciales principales: Ca, Mg, Na, K De acuerdo al coeficiente de correlación R de las curvas de calibración del zinc y el cobre se infiere que no hubo buena linealidad con relación a la ley de BeerLambert. Elementos Esenciales menores: Zn, Cu, Fe Oligoelementos Esenciales: Cr, Mn, Mo, Co, V, Se, Ni El método de espectroscopia atómica de llama es lineal. b. ¿Qué métodos alternativos, al usado en la práctica, se reportan en la literatura para determinación de metales en fluidos biológicos? Haga una breve descripción de ellos. Los niveles de cobre y zinc de la persona a quien se le extrajo la muestra de cabello humano no son alarmantes. R// métodos alternativos para determinación de metales en fluidos biológicos, como: el análisis de horno de grafito de los elementos traza y el análisis de vapor para el grupo de tóxicos, sobre todo la formación de hidruro. Técnicas de preparación de las muestras son a menudo importantes, en especial cuando el horno de grafito se va a utilizar. Los niveles de fondo de alta de los metales alcalinos significan que la eficiencia de corrección de fondo de alta puede ser necesaria para los análisis del horno, junto con la capacidad de utilizar cubetas de plataforma y los procedimientos de modificación de la matriz. Análisis clínicos a menudo utiliza técnicas de detección para acelerar el rendimiento.4 6. PREGUNTAS a. ¿consulte y resuma sobre la aplicación de la espectrofotometría de absorción química en otros análisis clínicos? R//. El análisis clínico representa una parte muy importante de la absorción atómica, segmento de las aplicaciones que comparte algunas similitudes con el análisis del medio ambiente. La mayoría de las muestras analizadas se toman del grupo principal de los fluidos biológicos, como sangre entera, plasma, suero y orina. En menor medida, los tejidos duros y blandos, como los huesos, las uñas y el pelo, también puede ser utilizado para propósitos específicos (principalmente toxicidad). Los estudios nutricionales relacionados con su dieta significan que las heces pueden ser analizadas en algunas ocasiones. por ello la determinación de algunos compuestos presentes en el organismo es de mucha Espectroscopia de absorción atómica en flama: La espectroscopia de absorción atómica (EAA), tiene como fundamento la absorción de radiación de una longitud de onda determinada. Esta radiación es absorbida selectivamente por átomos que tengan niveles energéticos cuya 15 LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE atómico. La longitud de onda a la cual la luz es absorbida es específica de cada elemento. Se mide la atenuación de la intensidad de la luz como resultado de la absorción, siendo la cantidad de radiación absorbida proporcional a la cantidad de átomos del elemento presente. El método involucra fundamentalmente 2 procesos: la atomización de la muestra y la absorción de radiación proveniente de una fuente por los átomos libres. diferencia en energía corresponda en valor a la energía de los fotones incidentes. La cantidad de fotones absorbidos, está determinada por la ley de Beer, que relaciona ésta pérdida de poder radiante, con la concentración de la especie absorbente y con el espesor de la celda o recipiente que contiene los átomos absorbedores. Los componentes instrumentales de un equipo de espectrofotometría de absorción atómica son los similares a los de un fotómetro o espectrofotómetro de flama, excepto que en EAA se requiere de una fuente de radiación necesaria para excitar los átomos del analito. La EAA en flama es a la fecha la técnica más ampliamente utilizada (aunque cada vez más competida por la EEP) para determinar elementos metálicos y metaloides. Esta técnica tiene grandes convenientes y es de costo relativamente bajo, pudiéndose aplicar tal técnica a una gran variedad de muestras. Acoplado un instrumento de Absorción Atómica a un horno de Grafito y a un generador de hidruros se alcanzan límites de detección hasta de ppb, lo cual lo hace indispensable en áreas como son: estudios de contaminación ambiental, análisis de alimentos, análisis de aguas potables y residuales, diagnóstico clínico, etc. El tratamiento de la muestra hasta la atomización comprende las siguientes etapas: La técnica de absorción atómica en flama en una forma concisa consta de lo siguiente: la muestra en forma líquida es aspirada a través de un tubo capilar y conducida a un nebulizador donde ésta se desintegra y forma un rocío o pequeñas gotas de líquido. Las gotas formadas son conducidas a una flama, donde se produce una serie de eventos que originan la formación de átomos. Estos átomos absorben cualitativamente la radiación emitida por la lámpara y la cantidad de radiación absorbida está en función de su concentración. La señal de la lámpara una vez que pasa por la flama llega a un monocromador, que tiene como finalidad el discriminar todas las señales que acompañan la línea de interés. Esta señal de radiación electromagnética llega a un detector o transductor y pasa a un amplificador y por último a un sistema de lectura.5 EAA con horno de grafito: El principio del método se basa en la absorción de luz por parte de un elemento en estado 16 Secado: Una vez que la muestra ha sido inyectada en el tubo de grafito, se calienta a una temperatura algo inferior al punto de ebullición del solvente (usualmente entre 80 a 180 ºC). El objetivo de esta etapa es la evaporación del solvente. La muestra inyectada (2-20 µL) en el horno de grafito es sometida a una temperatura algo inferior al punto de ebullición del solvente (80-180 ºC). Aquí se evaporan el solvente y los componentes volátiles de la matriz. Calcinado: El próximo paso del programa es el calcinado por incremento de la temperatura, para remover la mayor cantidad de material (materia orgánica) de la muestra como sea posible, sin pérdida del analito. La temperatura de calcinación usada varía típicamente en el rango de 350 a 1600 ºC. Durante el calcinado, el material sólido es descompuesto mientras que los materiales refractarios, como por ejemplo los óxidos, permanecen inalterados. Atomización: En esta etapa, el horno es calentado rápidamente a altas temperaturas (1800-2800 ºC) para vaporizar los residuos del paso de calcinado. Este proceso lleva a la creación de átomos libres en el camino óptico. Se mide la absorbancia durante este paso. La temperatura de atomización depende de la volatilidad del LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL - UNIVERSIDAD DEL VALLE http://fcq.uach.mx/index.php/docencia/columna2/material-de-estudio/category/15-analisisinstrumental?download=56:lectura9 (Consultado el 26 de mayo del 2018) elemento. Usualmente se agrega una cuarta etapa para limpieza del horno a una temperatura algo superior a la temperatura de atomización. Cuanto mejor sea la separación de los elementos concomitantes del analito, mejor será la atomización y la determinación estará más libre de interferencias.6 6. Absorción atómica con horno de grafito en: http://riquim.fq.edu.uy/archive/files/02ba23e6cc 083af03bfc55ac63a98a0c.pdf (Consultado el 26 de mayo del 2018) EAA con generación de hidruros: Los hidruros gaseosos de ciertos metales son químicamente producidos en un frasco de reacción por la adición de boro hidruro sódico, el cual genera hidrógeno naciente en contacto con ácidos. Los hidruros gaseosos e hidrógeno producidos, son arrastrados por una corriente de argón hacia una célula de cuarzo, alineada en el paso óptico del espectrofotómetro de absorción atómica. Dicha célula es necesario calentarla para algunos elementos (por ejemplo, el arsénico) aproximadamente a 800ºC, sin embargo, no precisa dicho calentamiento para otros.7 7. Determinación de metales por absorción atómica-Generador de hidruros, en: http://www.ugr.es/~fgil/proyecto/hidruros/funda mento4.html (Consultado el 26 de mayo del 2018). 7. REFERENCIAS 1. Radomska K, Graczyk A, Konarski J, Adamowicz B. Evaluation of macro- and micro Element Content in the Human Body Determined by Hair Analysis. Pol Tyg Lek. 1991 2. Hadla S. Walter N; Raigenis P; Fiuza J; Ferreira S. Determination of zinc and copper in human hair by slurry sampling employing sequential multi-element flame atomic absorption spectrometry. 2007. Science Direct. 3. Skoog, Holler, Crouch. Principios de análisis instrumental. Cenage Learning, sexta edición, 2001. pp. 203, 2019-221, 228, 230, 324-325. 4. Espectrometría de absorción atómica en: https://es.scribd.com/document/59837750/espe ctrometria-de-absorcion-atomica (Consultado el 26 de mayo del 2018) 5. Espectrometría de absorción atómica en: 17
