2. Exercise impacts brain-derived neurotrophic factor plasticity (1) es (1)

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Revista Europea de Neurociencia
European Journal of Neuroscience, Vol. 33, pp. 383-390, 2011
doi:10.1111/j.1460-9568.2010.07508.x
NEUROCIENCIA MOLECULAR Y DEL DESARROLLO
El ejercicio influye en la plasticidad del factor neurotrófico
derivado del cerebro al activar mecanismos de regulación
epigenética
F. Gómez-Pinilla,1,2 Y. Zhuang,2 J. Feng,3 Z. Ying1 y G. Fan3
1
Departamento de Biología Integrativa y Fisiología, Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles, CA, EE.UU.
de Neurocirugía, Escuela de Medicina David Geffen, Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles, CA,
EE.UU.
3Departamento de Genética Humana, Escuela de Medicina David Geffen, Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles,
CA, EE.UU.
2Departamento
Palabras clave: hipocampo, modificación de histonas, rata, plasticidad sináptica
Resumen
Hemos evaluado la posibilidad de que la acción del ejercicio voluntario sobre la regulación del factor neurotrófico derivado del
cerebro (BDNF), una molécula importante para el aprendizaje en el hipocampo de las ratas, pueda implicar mecanismos de
regulación epigenética. Hemos centrado los estudios en el promotor IV del Bdnf, ya que esta región es muy sensible a la actividad
neuronal. Hemos encontrado que el ejercicio estimula la desmetilación del ADN en el promotor IV de la Bdnf, y eleva los niveles
de la proteína 2 de unión a metil-CpG activada, así como el ARNm y la proteína del BDNF en el hipocampo de rata. El ensayo de
inmunoprecipitación de la cromatina demostró que el ejercicio aumenta la acetilación de la histona H3, y la evaluación de las
proteínas mostró que el ejercicio eleva la proporción de acetilado : total de la histona H3, pero no tuvo efectos sobre los niveles de
la histona H4. El ejercicio también reduce los niveles de ARNm y proteína de la histona deacetilasa 5, implicada en la regulación
del gen Bdnf [N.M. Tsankova et al. (2006) Nat. Neurosci. , 9, 519-525], pero no afectó a la histona deacetilasa 9. El ejercicio elevó
las formas fosforiladas de calcio ⁄ proteína quinasa dependiente de la calmodulina II y de la proteína de unión al elemento de
respuesta al AMPc, implicadas en las vías por las que la actividad neuronal influye en la regulación epigenética de la transcripción
de los genes, es decir, la Bdnf. Estos resultados, que muestran la influencia del ejercicio en la remodelación de la cromatina que
contiene el gen Bdnf, subrayan la importancia del ejercicio en el control de la transcripción genética en el contexto de la función y
la plasticidad del cerebro. La información reportada sobre el impacto de un comportamiento, inherentemente involucrado en la
rutina humana diaria, en el epigenoma abre nuevas y emocionantes direcciones y oportunidades terapéuticas en la guerra contra
los trastornos neurológicos y psiquiátricos.
Introducción
Hoy sabemos que los animales y los seres humanos tienen un enorme
potencial de variabilidad genética, que les confiere la capacidad de
adaptar su fenotipo a las exigencias del entorno. Los mecanismos
epigenéticos permiten modificaciones duraderas en el genoma y las
subsiguientes manifestaciones conductuales, como el aprendizaje y la
memoria, y las emociones, y pueden ser responsables de las
disfunciones observadas en varios trastornos cerebrales (Nestler,
2009; Sweatt, 2009). El poderoso impacto del ejercicio en la
adaptación biológica y la vida útil de los individuos sugiere que el
ejercicio tiene el extraordinario potencial de promover cambios
estables en la función de los genes. Los efectos del ejercicio en la
preservación o mejora de la función cerebral se aplican en
condiciones homeostáticas (Vaynman et al. , 2004), en desafíos
cerebrales (Griesbach et al. , 2004) y durante el envejecimiento
(Hillman et al. , 2008). El impacto del ejercicio en la plasticidad
cerebral se ha asociado a la acción del factor neurotrófico derivado del
cerebro (BDNF) (Vaynman et al. , 2004), una molécula
profundamente implicada en la excitabilidad neuronal, el aprendizaje y
la memoria (para una revisión, véase Martinowich et al. , 2007).
Correspondencia: Fernando Gómez-Pinilla, como
arriba. Correo electrónico: [email protected]
Recibido el 27 de agosto de 2010, revisado el 8 de octubre de 2010, aceptado el 12 de
octubre de 2010
Se ha demostrado que los mecanismos epigenéticos que implican
modificaciones posteriores a la replicación del ADN y las proteínas
nucleares modulan el gen Bdnf. Hay al menos cuatro promotores de
Bdnf en la rata, que se activan de forma diferencial en respuesta a
varios tipos de eventos de señalización. La transcripción del
promotor IV (antes promotor III) responde a la actividad neuronal y
puede mediar la plasticidad de las sinapsis y el aprendizaje y la
memoria, y está sujeta a la regulación epigenética (Feng et al. ,
2007). La transcripción del promotor IV es suprimida por la
proteína de unión a metil-CpG (MeCP2), que pertenece a una
familia de proteínas de unión a metilcitos que contribuyen al efecto
de silenciamiento del ADN (Chao y Zoghbi, 2009). MeCP2 ocupa
un sitio en el promotor de Bdnf en ausencia de estimulación, lo que
reprime la transcripción de Bdnf (Martinowich et al. , 2003). La
despolarización neuronal disocia MeCP2 del promotor de Bdnf, lo
que resulta en la desmetilación dentro del promotor y la transcripción
de Bdnf (Chen et al. , 2003). La actividad neuronal es un importante
regulador epigenético del gen Bdnf, de tal manera que el
comportamiento similar a la depresión en ratones da lugar a la
metilación de la histona H3 y a una supresión duradera de la
transcripción de Bdnf a través de los promotores IV y VI (Tsankova
et al. , 2006). A su vez, el ejercicio y el BDNF se han asociado con la
reducción de la depresión y la promoción de la mejora cognitiva.
Esto implica la probable posibilidad de que el ejercicio pueda utilizar
mecanismos de regulación epigenética para reducir la depresión y
mejorar las capacidades cognitivas.
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
384 F. Gómez-Pinilla et al.
La influencia del ejercicio sobre el BDNF se ha relacionado con la
plasticidad sináptica del hipocampo y con el aprendizaje y la
memoria, implicando al sistema de señalización calcio ⁄ proteína
quinasa dependiente de la calmodulina II (CaMKII), y al regulador
de la transcripción proteína de unión al elemento de respuesta al
AMPc (CREB) (Vaynman et al. , 2004). Además, las activaciones de
CaMKII y CREB están implicadas en la regulación epigenética del
gen Bdnf. Hemos emprendido estudios para evaluar la posibilidad de
que la influencia del ejercicio en la plasticidad cerebral pueda
implicar modificaciones epigenéticas del gen Bdnf en el hipocampo.
Estas interacciones podrían determinar la capacidad del ejercicio para
promover modificaciones duraderas en el cerebro que ayuden a
afrontar los retos.
reverso: 5¢-TGGGTTTTCCTTCCATTGCT-3¢; par de cebadores del
exón IV de Bdnf (Lubin et al. , 2008), hacia delante: 5¢TGCGAGTATCTCCGC
CAT-3¢,
hacia
atrás:
5¢TCACGTGCTCAAAAGTGTCAG-3¢; y el par de cebadores de la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa,
hacia
delante:
5¢-TGC
CACTCAGAAGACTGTGG-3¢, hacia atrás: 5¢-TTCAGCTGGGATG
ACCTT-3¢. Los cebadores de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
fueron
Materiales y métodos
Paradigma del ejercicio
Las ratas Sprague-Dawley macho adultas de aproximadamente 3
meses de edad (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA,
EE.UU.) se mantuvieron bajo un ciclo de 12 ⁄ 12 h de luz ⁄ oscuridad
a 22-24 °C con comida y agua ad libitum. Los animales se dividieron
aleatoriamente en dos grupos (sedentarios y de ejercicio) y todas las
ratas se alojaron individualmente. Los animales del grupo de
ejercicio tuvieron acceso a una rueda para correr (de 31,8 cm de
diámetro y 10 cm de ancho) que giraba libremente contra una
resistencia de 100 g, y las revoluciones de la carrera se registraron y
analizaron utilizando el software del sistema de adquisición de datos
VitalViewer (MiniMitter, Bend, OR, USA). Los animales corrieron
una media de
1,55 ± 0,15 km ⁄ día (± SEM). Los animales sedentarios estaban
alojados individualmente en sus jaulas domésticas sin acceso a una
rueda de correr. Tras 7 días de ejercicio, todos los animales fueron
sacrificados por decapitación y sus hipocampos fueron disecados
rápidamente y almacenados a )70 °C. Estos estudios se realizaron de
acuerdo con las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de
Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de los
Estados Unidos, y fueron aprobados por los Comités de Investigación
Animal de la UCLA.
Aislamiento del ARN y reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa en tiempo real
Se utilizó un kit RNA STAT 60 (Tel-Test Inc., Friendswood, TX,
EE.UU.) para el aislamiento del ARN total y se siguió el
procedimiento del protocolo del fabricante. Se realizó una reacción
en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-PCR)
para medir los niveles de ARNm del BDNF, la histona desacetilasa
(HDAC)5 y la HDAC9.
La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa sirvió de control
interno para la normalización de las muestras. Se utilizó ARN total
(100 ng) para la síntesis de ADNc (kit de síntesis de ADNc iScript,
Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU.). El ADNc
sintetizado fue la plantilla para la amplificación de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real llevada a cabo por el
sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad
Laboratories Inc.) utilizando un kit SsoFast EvaGreen Supermix
(Bio-Rad Laboratories Inc.) y cebadores forward ⁄ reverse. Las
secuencias de los cebadores fueron las siguientes: Par de cebadores
HDAC5
(Tsankova
et
al.
,
2006),
directo:
5¢TGTCACCGCCAGATGTTTTG-3¢,
inverso:
5¢-TGAGCAGAGCCGAGACAG-3¢; par de cebadores HDAC9 (Tsankova
et al. , 2006), adelante: 5¢-GCGAGACAGATGCTCAGAC-3¢,
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
generados con el software Primer3. Los pasos de la reacción de
transcripción inversa para cada ciclo consistieron en un paso inicial
de incubación de 30 s a 95 °C para la activación de la enzima y
fueron seguidos por 5 s a 95 °C para la desnaturalización y luego 5
s a 60 °C para el recocido ⁄ extensión. Se realizaron tres controles
negativos (sin plantilla) para verificar la contaminación del ADN
genómico de la muestra. La cuantificación de los resultados de la
RT-PCR se realizó con el software CFX manager versión 1.6 (BioRad Laboratories Inc.).
Ejercicio
y epigenética
finales se expresaron como el cambio
porcentual
respecto 385
a los
valores medios sedentarios. Se calcularon las relaciones entre fosfoCREB y CREB total, entre fosfo-CaMKII y CaMKII total, entre
AceH3 y la histona H3 total y entre AceH4 y la histona H4 total para
cada rata con el fin de facilitar la interpretación de los datos, y se
calcularon las medias de los grupos para esta medida de activación;
upshift
Western blot
El tejido del hipocampo de un hemisferio se disecó y se sonicó
briefly en tampón de lisis (137 mm de NaCl, 20 mm de Tris-HCl,
pH 8,0, 1% de NP-40 (NP-40 tipo Tergitol), 10% de glicerol, 1 mm
de PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro), 10 lg ⁄ mL de aprotinina,
0,1 mm de ben- zotonio, 0,5 mm de vanadato de sodio). Se sabe que
este procedimiento permite obtener extractos celulares completos
(incluido el núcleo), y se ha utilizado
con éxito para medir la histona H3 acetilada (AceH3), la histona
H3 y otras proteínas nucleares (Chakrabarti et al. , 2003). Después
de centrifugar a 12 500 g durante 20 minutos, se recogieron los
sobrenadantes y se procesaron inmediatamente para la
determinación de la concentración total de proteínas según el
procedimiento Micro BCA (Pierce, Rockford, IL, USA), utilizando
albúmina de suero bovino como estándar. Todos los productos
químicos se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, EE.UU.), a
menos que se indique lo contrario.
Los niveles de proteína de BDNF, fosfo-MeCP2, AceH3, histona
H3, histona H4 acetilada (AceH4), histona H4, HDAC5 fosfoCAMKII, CaMKII y fosfo-CREB se analizaron mediante análisis
de western blot. La actina se utilizó como control interno, y cada
blot se estandarizó con su correspondiente valor de actina. Las
muestras de proteínas se separaron por electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 10% y se transfirieron por electrodos a una
membrana de PVDF (polivinilideno fluoruro). Los sitios de unión
no específicos se bloquearon en solución salina tamponada con Tris
con un 2% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de Tween-20
durante 1 hora a temperatura ambiente (20 °C). Las membranas se
enjuagaron en tampón (0,1% de Tween-20 en solución salina
tamponada con Tris) y se incubaron a 4 °C durante la noche, con
los siguientes anticuerpos primarios: anti-BDNF (1 : 1000, catálogo
# sc-546; Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA), anti-MeCP2
(1 : 1000, catálogo # 07-013; Millipore, Temecula, CA, USA), antiAce H3 (1 : 1000, catálogo # 07-353; Millipore), anti-Ace H4 (1 :
500, catálogo
# 06-598; Millipore), anti-histona H4 (1 : 500, catálogo # 07-108;
Millipore), anti-fosfo-CaMKII (1 : 1000, catálogo # sc-12886-R;
Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-CaMKII (1 : 1000, catálogo #
sc- 9035; Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-fosfo-CREB (1 :
1000,
catálogo # 06-519; Millipore) y anti-CREB (1 : 1000, catálogo #
06- 863; Millipore) fueron seguidos por conjugado de peroxidasa
de rábano anti-conejo IgG (1 : 100 000; Santa Cruz Biotechnology
Inc.); anti-HDAC5 (1 : 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.) y
anti-histona H3 total (1 : 1000, catálogo # 05-499; Millipore)
fueron seguidos por un conjugado de peroxidasa de rábano antimouse IgG (1 : 100 000; Santa Cruz Biotechnology Inc.); y antiactina (1 : 1000, catálogo # sc- 1616; Santa Cruz Biotechnology
Inc.) fue seguido por un conjugado de peroxidasa de rábano anticabra IgG (1 : 100 000; Santa Cruz Biotech- nology Inc.). Tras
enjuagar en tampón cuatro veces durante 10 minutos, los
inmunocomplejos se analizaron por quimioluminiscencia utilizando
el kit ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway,
NJ,
EE.UU.),
según
las instrucciones
del fabricante.
Los datos
ª 2010
Los autores.
European
Journal of Neuroscience
ª 2010 Federation
of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
386 F. Gómez-Pinilla et al.
Las bandas de MeCP2 se utilizaron para la cuanficación de la fosfoMeCP2 (Zhou
et al. , 2006; Tao et al. , 2009).
Análisis de la metilación del ADN
de metilación del ADN y los ensayos de ChIP. Se realizó un anova
de una vía (software spss 16.0) para determinar las diferencias
entre grupos. Los resultados se convirtieron en porcentajes de
controles para su presentación en fi g u r a s , y los valores representan
la media ± SEM. Las diferencias estadísticas se consideraron
significativas cuando P < 0,05.
El bisulfite de la conversión genómica y el análisis de la
secuenciación de los clones individuales se realizó según los
protocolos publicados (Feng et al. , 2010). Briefly, el ADN se extrajo
del tejido del hipocampo, se digirió con la enzima Bgl II y se trató
con bisulfite de sodio. El ADN convertido se amplificó con nestPCR, que se realizó con dos pares de cebadores diseñados con el
software Methprimer (Feng et al. , 2010): fuera forward:
TTATTTTAAATTTTGGTTAAAGATTTAA
AA,
reverso:
CCTTCAATAAAAAACTCCATTTACTAA; y enlado adelante: TTTATAAAGTATGTAATGTTTTGGAA, reverso: AAA
ACTCCATTTAATCTAAACAAAAACTAA. Los productos de la
PCR se clonaron en el vector TOPO pCR4.1 (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EE.UU.). A continuación, se secuenciaron los clones
individuales para detectar los patrones de secuenciación de
metilación, y el porcentaje de metilación se calculó dividiendo los
clones metilados por el total de clones en sitios CpG concretos.
Análisis de inmunoprecipitación de la cromatina
El análisis se llevó a cabo utilizando un kit de inmunoprecipitación
de acetil-histona H3 en la cromatina (ChIP) (Upstate, Temecula, CA,
USA). En resumen, se utilizó el hipocampo de rata entero para
extraer la cromatina, y las muestras obtenidas antes de la
inmunoprecipitación (Input) y después de la inmunoprecipitación de
acetil-histona H3 (AceH3) se sometieron a la amplificación por PCR.
La PCR se llevó a cabo utilizando siete cebadores que correspondían
a diferentes regiones de Bdnf, tal y como se había descrito
previamente (Chen et al. , 2003): exón I, forward:
GCAGTTGGACAGTCATTGGTA
ACC,
reverso:
ACGCAAACGCCCTCATTCTG;
exón
II,
forward:
GCAGTCCATTCAGCACCTTG, reverso: TGGCTTGACAGCGAGGAAAAG; exón IV ()637 a )535 pb), forward: AACAAGAGGCTGTGACTATGCTC, reverso: CAGTAAGTAAAGGCT
AGGGCAGGC; exón IV ()73 a +14 pb), directo: TCTATTTCGAG
GCAGAGGTATC, reverso: AATGGGAAAGTGGGTGGGAG;
exón
IV
(de
+71
a
+155
pb),
hacia
adelante:
GCATGAAATCTCCCAGTCTC
TGC,
reverso:
TGGAAATTGCATGGCGAG; exón IV (+723 a
+1007 pb), adelante: TTGGATGGGAAAGATGG, reverso: CAGA
GTAGGAGGGAACAAGTGTGAC; y exón VI, hacia adelante:
TTTGG
GGCAGACGAGAAAGC,
inverso:
GGCAGTGGAGTCACATTGTT
GTC. Los niveles de acetilación de la histona H3 en la región IV del
promotor de Bdnf ()73 a +14 pb) se determinaron mediante un
análisis cuantitativo de PCR en tiempo real utilizando el sistema iQ
SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc.). Briefly, el firme
ciclo umbral (Ct) se normalizó restando el valor del control negativo
de cada muestra correspondiente. Se calculó un DCt que representaba
la diferencia entre las muestras de entrada y las inmunoprecipitadas
(ip) mediante la fórmula: DCt = Ctip ) Ctinput , y a continuación se
determinó la diferencia de pliegues elevando 2 a la potencia del DCt.
Análisis estadístico
Se utilizaron ocho animales por grupo para las mediciones de
ARNm y proteínas, y cuatro animales por grupo para los ensayos
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Ejercicio y epigenética 387
Resultados
Anteriormente hemos informado de que el ejercicio voluntario eleva
los niveles de BDNF en el hipocampo con importantes efectos en el
rendimiento del aprendizaje y la memoria (Vaynman et al. , 2004).
Aquí examinamos la posibilidad de que el ejercicio pueda influir en
el BDNF utilizando mecanismos de regulación epigenética. Dado
que el promotor IV de Bdnf (antes promotor III) juega un papel
clave en la regulación de Bdnf dependiente de la actividad en ratas
(Chen et al. , 2003), centramos nuestros estudios en la región del
promotor IV de Bdnf.
El ejercicio reduce la metilación de CpG en el promotor IV
de Bdnf (Fig. 1)
Los animales fueron expuestos a una semana de ejercicio
voluntario, un período que eleva los niveles de ARNm del BDNF y
el rendimiento del aprendizaje y la memoria. Para determinar si el
ejercicio tiene un efecto sobre el patrón de metilación CpG dentro
del gen Bdnf, evaluamos el estado de metilación dentro de una
región de 230 pb que se extiende desde )148 a +82 pb del promotor
del exón IV de la rata Bdnf. Esta región, que incluía 14 sitios CpG
situados inmediatamente aguas arriba del sitio de inicio de la
transcripción (par de bases +1), ha demostrado ser crucial para la
regulación de la expresión de Bdnf. Realizamos un análisis de
bisulfite-secuencia en seis sitios CpG de un total de 14 sitios, y
encontramos que un sitio CpG ()148 bp) era significantemente
menos
A
Fig. 1. El ejercicio redujo la metilación del ADN del promotor del exón IV
de Bdnf en el hipocampo de rata. (A) El gráfico de barras muestra los niveles
de metilación del ADN de los animales de control ejercitados (Exc) y
sedentarios (Sed) en seis sitios CpG. El análisis de bisulfite de secuencias
mostró que el nivel de metilación del ADN era menor en
animales expuestos al ejercicio, el sitio CpG )148 que muestra la
desmetilación más dramática del ADN. (B) El número en la parte superior
del diagrama etiqueta la posición de los sitios CpG en relación con el sitio de
inicio de la transcripción (+1), y cada línea horizontal representa el resultado
de un clon (círculos abiertos, CpGs no metilados; círculos rellenos, CpGs
metilados). El nivel de metilación del ADN se calculó mediante el número
de CpGs metilados dividido por el número total de CpGs analizados.
Los valores representan la media + SEM; *P < 0,05; n = 4 ⁄ grupo.
B
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
388 F. Gómez-Pinilla et al.
metilado (clon no metilado ⁄ clon total) en los animales expuestos al
ejercicio. En particular, encontramos que el sitio CpG en )148 pb,
que está asociado con la unión de MeCP2, mostró la metilación más
frecuente en las ratas sedentarias. Curiosamente, los efectos del
ejercicio fueron suficientes para reducir la metilación de este sitio
CpG del 59,2% (ratas sedentarias) al 18,4% (F1,7 = 6,409, P = 0,045,
Fig. 1A y B).
El ejercicio afecta al nivel de la proteína de unión a metil-CpG
junto con la Bdnf (Fig. 2)
Se ha demostrado que MeCP2 puede modular la expresión y función
del gen Bdnf interactuando con la cromatina metilada y reprimiendo
la transcripción del promotor IV (Martinowich et al. , 2003). En
ausencia de estimulación, MeCP2 ocupa un sitio en el promotor de
Bdnf reprimiendo la activación de la transcripción de Bdnf, pero la
despolarización neuronal fosforila a MeCP2 de manera que la fosfoMeCP2 se disocia del promotor de Bdnf permitiendo la transcripción
de Bdnf (Chen et al. , 2003; Martinowich et al. , 2003). El análisis de
Western blot utilizando los mismos animales que para el ensayo de
metilación mostró que el ejercicio promovió un aumento del 25%
(F1,7 = 38,861, P = 0,001) en la fosfo-MeCP2 en relación con las
ratas sedentarias (Fig. 2A). Para verificar los efectos del ejercicio
sobre el Bdnf, medimos los niveles de ARNm del BDNF en el exón
IV y la proteína del BDNF en los mismos animales utilizados para
evaluar los niveles de fosfo-MeCP2. Encontramos que el ARNm de
Bdnf se incrementó en un 41% (F1,15 = 6,574, P = 0,025, Fig. 2B) y
la proteína Bdnf se incrementó en un 30% (F1,15 = 6,874, P = 0,024,
Fig. 2C) en las ratas ejercitadas en comparación con las ratas
sedentarias.
El ejercicio induce la acetilación de la histona H3 (Figs. 3 y 4)
Utilizamos un ensayo ChIP para evaluar la modificación en la histona
H3 tras el ejercicio, y encontramos que el ejercicio aumentó la
acetilación de la histona H3 en la región del promotor IV de Bdnf.
Para examinar en qué
A
región AceH3 ocurrió, evaluamos los enriquecimientos relativos
ChIP utilizando siete pares de cebadores correspondientes a
diferentes regiones del gen Bdnf. Encontramos que AceH3 se asocia
principalmente a la región promotora del exón IV de Bdnf de pares
de bases )73 a +14, pero no al exón I, II o VI. A continuación,
realizamos la PCR en tiempo real para evaluar el ADN unido a
AceH3, y encontramos niveles un 75% más altos (F1,7 = 23,718, P =
0,003) de ADN unido a AceH3 en ratas ejercitadas en comparación
con ratas sedentarias (Fig. 3A).
En los tejidos del hipocampo para el ensayo ChIP, evaluamos los
niveles de AceH3 y de la histona H3 total mediante un análisis de
Western blot. Encontramos que el nivel de AceH3 se incrementó
significativamente (60%, P = 0,006) en el grupo ejercitado en
comparación con las ratas sedentarias, pero no se observaron cambios
significativos en la histona H3 total. La relación entre AceH3 y la
histona H3 total fue un 75% mayor en las ratas ejercitadas en
comparación con las ratas sedentarias (F1,7 = 90,309, P = 0,001, Fig.
3A). Medimos los niveles proteicos de AceH4 y de la histona H4
total en la misma muestra utilizada anteriormente. No se encontraron
diferencias significativas de AceH4 ni de su ratio (AceH4 : histona
H4 total) en el grupo ejercitado en comparación con el grupo
sedentario (F1,7 = 0,171, P = 0,686, Fig. 3B). El hecho de que la
modificación de la acetilación se observara particularmente en la
histona H3 indica que la histona H3, pero no la histona H4, está
relacionada con la regulación epigenética de la Bdnf después del
ejercicio. La acetilación frente a la desacetilación de las histonas es
un proceso dinámico controlado por enzimas específicas o
desacetilasas (HDAC). Basándonos en los indicios de que la HDAC5
parece estar asociada a la regulación del gen Bdnf en modelos
animales de depresión (Tsankova et al. , 2006), medimos los niveles
de HDAC5 en nuestro paradigma (Fig. 4). Encontramos que el
ejercicio redujo los niveles de ARNm de HDAC5 en un 25% (F1,15 =
9,68, P = 0,008, Fig. 4B) y su proteína en un 91% (F1,15 = 5,718, P =
0,038, Fig. 4A) en el tejido del hipocampo utilizado para las
evaluaciones de las histonas. Por razones comparativas, también
medimos los niveles de ARNm de HDAC9, pero no se encontraron
cambios significativos en los grupos ejercitados y sedentarios (F1,15 =
1,667, P = 0,218, Fig. 4B).
B
C
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Fig. 2. El ejercicio eleva (A) los niveles de fosfo-MeCP2, (B) los niveles de ARNm de BDNF y (C) los niveles de proteína de BDNF.
Se sabe
que MeCP2 trabaja
Ejercicio
y epigenética
389
con la cromatina metilada para suprimir la transcripción del promotor IV y para modular la expresión y la función del Bdnf, y según nuestros resultados estos
eventos podrían ser influenciados por el ejercicio. Las proteínas se midieron mediante el análisis de Western blot y el ARNm del BDNF se midió mediante la
reacción en cadena de la polimerasa RT cuantitativa relativa; las bandas de MeCP2 de desplazamiento ascendente se cuantificaron para los niveles de fosfo-MeCP2.
Los valores representan la media + SEM; *P < 0,05, **P < 0,01. Sed, sedentario; Exc, ejercicio n = 8 ⁄ grupo.
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
390 F. Gómez-Pinilla et al.
A
B
Fig. 3. (A) El ejercicio voluntario aumentó la acetilación de la histona H3 en el hipocampo de las ratas evaluado mediante el ensayo ChIP. Se utilizaron cebadores
específicos para el promotor IV de Bdnf para amplificar el ADN de los inmunoprecipitados de AceH3, y se midieron los enriquecimientos relativos del promotor
IV de Bdnf en los inmunoprecipitados de AceH3 mediante PCR en tiempo real. Se utilizaron cantidades iguales de ADN de hipocampos de ratas sedentarias (Sed)
o ejercitadas (Exc) para la inmunoprecipitación (Input). El gel de ADN muestra los productos de la PCR en tiempo real. Los datos se presentan como media +
SEM. *P < 0,05; n = 4 ⁄ grupo. (B) Se evaluaron los niveles de AceH3 y de la histona H3 mediante análisis de western blot
en el mismo tejido del hipocampo utilizado para el ensayo ChIP, y encontramos un aumento significativo (**P < 0,01) en la relación AceH3 : histona H3 en el
grupo ejercitado en comparación con las ratas sedentarias. Por razones comparativas, evaluamos los niveles de AceH4 e histona H4, y no encontramos cambios
significativos en la relación AceH4 : histona H4 en las ratas ejercitadas en relación con las ratas sedentarias.
A
B
Fig. 4. Basándonos en las indicaciones de que HDAC5 es importante para la regulación del gen Bdnf (Tsankova et al. , 2006), medimos los niveles de HDAC5 en
nuestro paradigma. Encontramos que el ejercicio redujo los niveles de (A) proteína HDAC5 (*P < 0,05) y (B) ARNm de HDAC5 (**P < 0,01, n = 8 ⁄
grupo) pero no el ARNm de HDAC9 (n = 8 ⁄ grupo). Los valores representan la media + SEM. Sed, sedentario; Exc, ejercicio.
El ejercicio elevó la proteína de unión al elemento de
respuesta al AMP y los niveles de fosfo-calcio ⁄ proteína
quinasa II dependiente de la calmodulina (Fig. 5)
en las ratas ejercitadas en comparación con las ratas sedentarias (F1,15
= 30,049, P = 0,001, Fig. 5).
Evaluamos los índices de activación de CaMKII y CREB en nuestro
paradigma basándonos en la participación de estos sistemas en los
mecanismos por los que la señalización intracelular afecta a la
remodelación de la cromatina. La activación de la CaMKII puede
conducir a la fosforilación de CREB y, a su vez, la fosfo-CREB
puede reclutar a la CBS (proteína de unión a CREB) dotada de una
fuerte actividad promotora de la acetilación de histonas. Se ha
demostrado previamente que la actividad neuronal provoca la
fosforilación de MeCP2 con la fosforilación de CaMKII, activando
así la transcripción de Bdnf. Los resultados del análisis de western
blot mostraron que la fosfo-CREB ⁄ CREB se incrementó en un 53%
(F1,15 = 9,282, P = 0,009, Fig. 5) en ratas ejercitadas en comparación
con ratas sedentarias. Los resultados también mostraron que el
ejercicio elevó la proporción de fosfo-CaMKII : CaMKII en un 40%
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European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
Discusión
Ejercicio y epigenética 391
Las pruebas acumuladas en los últimos años indican que el ejercicio
ejerce una fuerte influencia en la plasticidad cerebral y la cognición,
a través de mecanismos centrados en la acción del BDNF. Nuestros
resultados muestran que un régimen de ejercicio conocido por su
capacidad para elevar los niveles de ARNm y proteína del BDNF en
el hipocampo, funcional para la mejora del aprendizaje y la
memoria inducida por el ejercicio, promueve la remodelación de la
cromatina que contiene el gen Bdnf. Hemos centrado estos estudios
en la región del promotor IV (antes promotor III) del gen Bdnf, ya
que esta región es altamente sensible a la actividad neuronal y es el
objetivo de la regulación epigenética. Informamos que el ejercicio
afecta a la acetilación de histonas y a la metilación del ADN
localizada en la región del promotor IV del gen Bdnf. El ejercicio
también afecta a los niveles de fosfo-MeCP2, una molécula
importante para la regulación de la transcripción del gen Bdnf. Los
efectos del ejercicio también fueron suficientes para elevar los
niveles de fosfo-CaMKII y fosfo-CREB (moléculas íntimamente
involucradas en las vías por las que la actividad neuronal involucra
mecanismos de regulación epigenética
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
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392 F. Gómez-Pinilla et al.
Fig. 5. El ejercicio eleva los niveles de fosfo-CREB y fosfo-CaMKII.
Medimos los niveles de CaMKII total y fosforilada y de CREB en función de
su implicación en los efectos de señalización intracelular sobre la
remodelación de la cromatina. Los resultados del análisis de western blot
mostraron que las proporciones de fosfo-CREB : CREB total
y fosfo-CaMKII : CaMKII total aumentaron en las ratas ejercitadas (Exc) en
comparación con las ratas sedentarias (Sed). Los valores representan la media
+ SEM.
**P < 0,01; n = 8 ⁄ grupo.
actividad neuronal es un importante activador de MeCP2, de manera
que la fosforilación de MeCP2 por la actividad neuronal conduce a la
liberación de MeCP2 y a la activación de la transcripción de Bdnf. La
influencia de la MeCP2 en la regulación de la Bdnf es más evidente
durante las condiciones de deficiencia de la MeCP2 en el cerebro, lo
que conduce a una reducción del BDNF (Abuhatzira et al. ,
para estimular la transcripción de Bdnf). Los resultados son
consistentes con la noción de que el ejercicio influye en los
mecanismos epigenéticos para promover elevaciones estables en la
expresión del gen Bdnf, lo que puede tener importantes
implicaciones para la regulación de la plasticidad sináptica y el
comportamiento (Fig. 6).
El ejercicio influye en la metilación del ADN
Nuestros resultados muestran que el ejercicio aumenta la fase de
hipometilación (disminución de la metilación CpG) de la región
promotora del gen Bdnf. La metilación del ADN juega un papel
crucial en la remodelación de la cromatina en el cerebro, y
contribuye en gran medida a la regulación de la Bdnf, ya que puede
reprimir la transcripción y la función de la Bdnf (Martinowich et al. ,
2003). Por lo tanto, el hecho de que nuestros resultados muestren que
el ejercicio induce la hipometilación del promotor de Bdnf IV sugiere
la posibilidad de que la metilación del ADN pueda ser un paso
crucial por el cual el ejercicio regula la expresión de BDNF. Estos
resultados están de acuerdo con los hallazgos actuales y anteriores
que muestran que el ejercicio eleva los niveles de ARNm del BDNF
del hipocampo (Vaynman et al. , 2004) y de la proteína (Ding et al. ,
2006).
El ejercicio influye en la señalización intracelular
implicada en la regulación dependiente de la actividad
de Bdnf
Nuestros resultados mostraron que el ejercicio elevó los niveles de
fosfo-MeCP2 en el hipocampo. Aunque los puntos finos de la
interacción entre MeCP2 y Bdnf necesitan ser dilucidados más a
fondo, hay consenso en que MeCP2 es crucial para la regulación de
Bdnf. Se ha demostrado que la MeCP2 reclutada al ADN metilado
contribuye a reprimir la transcripción del promotor IV de Bdnf (antes
promotor III) (Martinowich et al. , 2007; Chao & Zoghbi, 2009). La
ª 2010 Los autores. European Journal of Neuroscience ª 2010 Federation of European Neuroscience Societies y Blackwell Publishing Ltd
European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
Ejercicio y epigenética 393
Fig. 6. Mecanismo propuesto por el cual el ejercicio impacta en la
plasticidad sináptica y en las capacidades cognitivas al involucrar aspectos
de la regulación epigenética. El ejercicio promueve la desmetilación del
ADN en el promotor IV de Bdnf, lo que implica la fosforilación de MeCP2
y la acetilación de la histona H3. Estos eventos pueden resultar en la
disociación de MeCP2 y en eventos de remodelación de la cromatina que
conducen a la transcripción del gen Bdnf. Los efectos del ejercicio sobre la
regulación del BDNF también pueden implicar la acción de la HDAC5,
implicada en la regulación del gen Bdnf (Tsankova
et al. , 2006). El ejercicio eleva las fases de activación de CaMKII (fosfo
CaMKII) y CREB (fosfo-CREB), que a su vez pueden contribuir a regular
la transcripción del Bdnf, así como participar en los eventos de señalización
por los que el BDNF influye en la plasticidad sináptica y las capacidades
cognitivas. El impacto del ejercicio en la remodelación de la cromatina que
contiene el gen Bdnf enfatiza la importancia del ejercicio en el control de la
transcripción de genes en el contexto de la función y la plasticidad del
cerebro. A: acetilación de histonas; CBP: proteína de unión a CREB; M:
metilación de sitios CpG; P: fosforilación.
2007), mientras que la sobreexpresión de MeCP2 aumenta los
niveles de BDNF (Larimore et al. , 2009). Aunque se necesita más
información para tener una imagen completa de la acción de
MeCP2 en la regulación de la Bdnf, hay motivos para hipotetizar
que el ejercicio puede servir para activar MeCP2, aumentando así
el ARNm y la proteína del BDNF.
Nuestros resultados mostraron que el ejercicio elevó la fase de
activación de CaMKII y CREB en el hipocampo. El modulador de
señalización CaMKII y el activador de la transcripción CREB han
sido implicados en los mecanismos por los que la señalización
intracelular puede afectar a la remodelación de la cromatina. Por
ejemplo, la activación de CaMKII conduce a la fosforilación de
CREB y MeCP2, de manera que la fosfo-CREB puede reclutar la
proteína de unión a CREB con una fuerte actividad promotora de la
acetilación de histonas. La fosforilación de MeCP2 dependiente de
CaMKII parece ser un paso crucial en la regulación dependiente de
la actividad del BDNF, ya que se ha demostrado que la
despolarización de la membrana aumenta la transcripción
dependiente de Ca del exón IV del Bdnf. Estudios anteriores han
demostrado que las funciones de CaMKII y CREB son pasos
necesarios para la acción del ejercicio sobre la plasticidad sináptica
mediada por el BDNF y la cognición (Vaynman et al. , 2003). Por
ejemplo, el bloqueo de la función de la CaMKII en el hipocampo
durante el ejercicio mediante un inhibidor específico reduce el
ARNm del BDNF y anula la mejora cognitiva provocada por el
ejercicio (Vaynman et al., 2007). Las pruebas generales parecen
indicar que la participación de la fosfo-CaMKII y la fosfo-CREB
en los efectos del ejercicio sobre el BDNF y la cognición puede
estar asociada a mecanismos epigenéticos.
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394 F. Gómez-Pinilla et al.
El ejercicio influye en la acetilación de las histonas
Implicaciones funcionales
Se sabe que la acetilación de las histonas asociadas al ADN puede
promover una cromatina permisiva o activa que puede conducir a la
transcripción selectiva de genes específicos como el Bdnf (Tsankova
et al. , 2006). Curiosamente, la inhibición de la desacetilación de las
histonas conduce a un aumento de los niveles de ARNm del BDNF
(Tian et al. , 2010). En consecuencia, dirigimos nuestros estudios a
determinar los efectos del ejercicio sobre la acetilación de las
histonas, y evaluamos la histona H3 y la histona H4 en base a su
potencial participación en la plasticidad dependiente de la
experiencia (Sweatt, 2009). Utilizando un ensayo ChIP, encontramos
que la histona 3 acetilada estaba mayormente enriquecida dentro de
la secuencia del promotor IV de Bdnf ()73 a
+14 pb, Fig. 2), y que este enriquecimiento se vio significativamente
potenciado por el ejercicio. Además, utilizamos el análisis de western
blot para determinar si estas modificaciones de la cromatina podían
estar relacionadas con cambios en los niveles de proteínas. Los
resultados mostraron que el ejercicio aumentó la proporción relativa
de AceH3 hippocampal pero no afectó a los niveles de histona H4.
Estos resultados argumentan a favor de la especificidad relativa de la
acción del ejercicio sobre la histona H3, que podría conducir a una
facilitación de la transcripción de Bdnf.
Se plantea la cuestión de cómo los efectos del ejercicio pueden
traducirse en una plasticidad sináptica que implique procesos de
regulación epigenética. La fisiología del ejercicio está directamente
relacionada con los ajustes en la biogénesis energética, de manera
que el ejercicio se percibe como una estrategia viable para combatir
la obesidad y los trastornos mentales. Las nuevas investigaciones
indican que la regulación del metabolismo energético a través de la
Bdnf es un mecanismo importante por el que el ejercicio puede influir
en la plasticidad sináptica y la función cognitiva (Vaynman et al. ,
2006; Gómez-Pinilla et al. , 2008). Los resultados de los estudios
proteómicos han demostrado que la mayoría de las proteínas que se
regulan por el ejercicio están asociadas con el metabolismo
energético y la plasticidad sináptica (Ding et al., 2006). Las
funciones de varias de estas proteínas sobre la cognición y la
plasticidad se consiguen mediante la interacción con el BDNF, en la
que el BDNF actúa como mediador entre el metabolismo y la
plasticidad cerebral (Gómez-Pinilla et al. , 2008). A su vez, cada vez
hay más pruebas que indican que las principales proteínas que
modulan las transacciones bioenergéticas en la célula pueden
impulsar modificaciones en el epigenoma (Wallace y Fan, 2010), lo
que retrata al metabolismo energético como una fuerza motriz para la
ocurrencia de eventos epigenéticos. Por ejemplo, los niveles de
calorías pueden determinar la producción de ATP, acetil-CoA, sadenosil-l-metionina y NADH (nicotinamida adenina dinucleo- tida),
que están directamente implicados en las modificaciones de la
histona y la cromatina. Esta evidencia es probablemente la punta del
iceberg de un conjunto de eventos moleculares por los que los
cambios calóricos impulsados por estímulos ambientales como el
ejercicio y la dieta pueden promover profundas modificaciones en el
genoma (para una revisión, véase Feinberg, 2007; Wallace y Fan,
2010). Además, nuestros resultados que muestran la influencia del
ejercicio en la regulación del gen Bdnf mediante mecanismos
epigenéticos están en armonía con las influencias descritas de otros
factores ambientales. Por ejemplo, recientemente se ha informado de
que los cambios en la metilación del ADN durante el control de la
termotolerancia afectan a la unión de CREB al BDNF (Yossifoff et
al. , 2008), y que el enriquecimiento ambiental induce modificaciones
epigenéticas del gen Bdnf (Kuzumaki et al. , 2010).
Aunque todos los tejidos de los mamíferos contienen un inmenso
número de genes, sólo una pequeña fracción de ellos se vuelve
funcional en un momento dado, en un proceso en el que la regulación
epigenética desempeña un papel crucial. La poderosa influencia del
ejercicio en la adaptación biológica probablemente involucra
mecanismos epigenéticos para controlar la función de los genes.
Existen abundantes pruebas que demuestran que el ejercicio
contribuye a promover la salud mental
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European Journal of Neuroscience, 33, 383-390
salud y aliviar los efectos de la depresión, la ansiedad, la
esquizofrenia, el deterioro cognitivo y la adicción a las drogas. Por
tanto, los resultados actuales pueden arrojar luz sobre los
mecanismos por los que el ejercicio contribuye a aliviar los
trastornos psiquiátricos. Por ejemplo, las acciones antidepresivas del
ejercicio y del BDNF (para una revisión, véase Duman et al. , 2008)
armonizan bien con otro conjunto de estudios que muestran la
participación de la regulación epigenética en la acción antidepresiva
del BDNF (Tsankova et al. , 2006). Los niveles anormales de
BDNF también se han asociado con la etiología de diversos
trastornos cognitivos, como la enfermedad de Alzheimer (Caraci et
al. , 2010). A su vez, se ha demostrado que la acetilación de la
histona H3 y la metilación del ADN en el hipocampo desempeñan
un papel en la regulación del gen Bdnf durante la consolidación de
la memoria del miedo (Lubin et al. , 2008). Dada la acción
demostrada del ejercicio y el BDNF en el apoyo al aprendizaje y la
memoria y la plasticidad sináptica (Vaynman et al. , 2004), es
probable que la regulación epigenética del Bdnf por el ejercicio
pueda servir para modular los eventos de aprendizaje y memoria.
Nuestros resultados sugieren la fascinante posibilidad de que la
regulación epigenética del gen Bdnf pueda ser un mecanismo
biológico por el cual el ejercicio puede promover la salud mental y
la resistencia a los trastornos neurológicos. Estos resultados que
muestran la influencia del comportamiento o la experiencia en el
epigenoma abren nuevas vías y perspectivas terapéuticas en la
guerra contra los trastornos neurológicos y psiquiátricos. El
concepto original de epigenética implica la idea de que las
modificaciones en la expresión y la función del ADN pueden
contribuir a la herencia de la información (Waddington, 1942).
Aunque este principio no se ha demostrado plenamente en los
mamíferos, existen pruebas convincentes en la literatura
epidemiológica que sugieren que los factores ambientales pueden ser
heredados (Feinberg, 2007). Además, los estudios en animales
muestran que los factores ambientales, como las toxinas conocidas
por sus efectos en la disminución de la fertilidad masculina, pueden
alterar la metilación del ADN, y que estos rasgos pueden
transmitirse a través de las generaciones (Anway et al. , 2005).
Además, basándose en la fuerte fuerza adaptativa del ejercicio, éste
sigue siendo un candidato crucial para promover adaptaciones
biológicas heredables estables con profundas implicaciones para la
salud pública.
enfermedad de Alzheimer: vínculosEjercicio
neurobiológicos
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Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por las becas NS50465 y NS56413 de los
Institutos Nacionales de Salud (F.G.-P.) y NS51411 (G.F.).
Abreviaturas
AceH3, histona H3 acetilada; AceH4, histona H4 acetilada; BDNF, factor
neurotrófico derivado del cerebro; CaMKII, proteína quinasa dependiente de
la calmodulina II; ChIP, inmunoprecipitación de la cromatina; CpG:
citosina-fosfato-guanina; CREB: proteína de unión a elementos de respuesta
al AMPc; HDAC: histona desacetilasa; MeCP2: proteína de unión a metilCpG 2; PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
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