1 Titulo. VIRUS DE LA INFLUENZA A 2 Uso del ensayo. El kit PathoDxTM Respiratory Virus Panel (RVP) es un ensayo de inmunofluorescencia directa para la detección cualitativa de virus de la influenza A, en muestras de pacientes. 3 Condiciones de bioseguridad requeridas (instalaciones, EPP, eliminación de desechos). PRECAUCIONES DE SEGURIDAD 1. Se ha añadido a los reactivos azida sódica en concentraciones del 0,098% como agente antibacteriano. Para evitar la acumulación de azidas metálicas explosivas en las tuberías de plomo y cobre, los reactivos deben diluirse e irrigarse con grandes cantidades de agua antes de desecharlos. Utilice sistemas de drenaje que no contengan cobre ni plomo siempre que sea posible. 2. Muestras clínicas: Deben tomarse las precauciones de seguridad adecuadas durante la manipulación y procesamiento de todas las muestras clínicas ya que puede haber microorganismos vivos patógenos. Deben seguirse las buenas prácticas de laboratorio durante la manipulación de las muestras sospechados de contener virus infecciosos. 3. Material de desecho: Esterilice todo el material de desecho antes de eliminarlo, según los procedimientos de laboratorio habituales y las reglamentaciones locales. 4. El reactivo contiene el tinte azul de Evans. Aunque su concentración es tan baja que el producto no se puede clasificar como cancerígeno, debe evitarse el contacto con la piel. 5. La acetona (no suministrada) es un disolvente orgánico inflamable. Utilizar en un lugar bien ventilado y lejos de cualquier fuente de ignición potencial. PRECAUCIONES DE MANIPULACIÓN Este producto no se debe usar si (1) ha pasado la fecha de caducidad o (2) pueden observarse otros signos de deterioro. 4 Muestras a analizar. Las muestras que se analizaran son hisopeados combinado tanto de las vías nasales y faríngeas de tal forma que sea una muestra representativa. 5 Reactivos, materiales y equipamiento para el ensayo. CONTENIDO DEL KIT Respiratory Virus Panel 200 ensayos (R62400) 6 Procedimiento. Toma de muestra nasofaríngea en tubos de transporte viral medio MEM. Concentrado de células/centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos. Desechar el sobrenadante y homogenizar el pelet de células. Depositar 20 uL en las improntas de la placa de porta objetos. Realizar la fijación de las improntas por 12 horas a 37 ºC. Realizar la fijación de las improntas con 50 uL de acetona. Realizar el lavado en una caja koplin con agua ultra purificada estéril autoclavada las placas de los porta objetos en un shaker por 5 minutos. Realizar el secado del porta objeto por 15 minutos a 37 ºC. Adicionar 15 uL de los anticuerpos específicos de la inmunofluorescencia virus de la influenza A, e incubar por 30 minutos a 37ºC. Realizar el lavado en una caja koplin con PBS-IFI estéril autoclavada las placas de los porta objetos en un shaker por 5 minutos. Adicionar 15 uL del reactivo de contraste e incubar por 30 minutos a 37ºC. Realizar el lavado en una caja koplin con PBS-IFI estéril autoclavada las placas de los porta objetos en un shaker por 5 minutos. Realizar el secado del porta objeto por 15 minutos a 37 ºC. Realizar el montado de las improntas con cubre objetos y leer en el microscopio de inmunofluorescencia. 6.1 Obtención, identificación, conservación y preservación de muestras. Todas las muestras deben colocarse en un medio de transporte viral y transportarse lo antes posible al laboratorio. Debe evitarse congelar las muestras. Si la muestra no puede inocularse en dos días, debe congelarse a –70°C. Utilice medio de transporte viral (MTV) que no inhiba el crecimiento de ninguno de los virus respiratorios o células en cultivo. Los medios de transporte viral recomendados son M4®, M4RT® y M5® de Remel Inc. Los laboratorios deben establecer los procedimientos para la recogida y transporte de muestras adecuados a sus propias necesidades. Pueden encontrarse pautas y recomendaciones en varios manuales de laboratorio. 6.2 Controles de calidad. Reactivo de detección de panel de virus respiratorio reactivo screening Un frasco cuentagotas con 10,0 ml (aproximadamente 200 ensayos) de anticuerpos monoclonales murinos purificados marcados con fluoresceína específicos para el virus sincitial respiratorio, virus de la influenza A, virus de la influenza B, virus para influenza 1, 2 y 3 y adenovirus y contratinción de azul de Evans en una solución tampón estabilizada con proteína, con 0,098% de azida sódica como conservante. Reactivo de control negativo Un frasco cuentagotas con 10,0 ml de anticuerpos IgG murinos purificados marcados con fluoresceína, no reactivos con ningún virus respiratorio y contratinción de azul de Evans en una solución tampón estabilizada con proteína, con 0,098% de azida sódica como conservante 6.3 Preparación de reactivos y equipos para el ensayo. MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Portaobjetos para microscopio (de 2 pocillos y 8 pocillos) con pocillos de 5–8 mm de diámetro con recubrimiento hidrófobo resistente a la acetona. Los pocillos deben estar separados a una distancia suficiente para evitar que las muestras o reactivos pasen de un pocillo a otro. Utilice portaobjetos limpiados con acetona. 2. Acetona — grado de reactivo o superior, almacenada en vidrio. 3. Tubos de cultivo de 16×125 mm o viales sellados de un dram y un diámetro de 12 mm, cubreobjetos n° 1, con células adecuadas para aislar los virus respiratorios. Para ello se recomienda utilizar células primarias de riñón de mono, MDCK, LLC-MK2, HEp2 u otras células que sean sensibles a los diferentes virus respiratorios. 4. Centrífuga con capacidad de al menos 600–700×g para el procesamiento de las muestras de los pacientes. 5. Cepas de virus respiratorios conocidos como controles, como por ejemplo cepas American Type Culture Collection (ATCC®) o aislados de laboratorio previamente identificados: 5496. Medio de mantenimiento de cultivo tisular [Medio esencial mínimo de Eagle con suero bovino fetal al 2%, HEPES 15 mM, 0,8 g/l de bicarbonato de sodio y antibióticos (100– 250 U/ ml de penicilina G y 100 μg/ml de estreptomicina o de 5 a 10 μg/ml de gentamicina, o equivalente)]. 7. Medio de mantenimiento de cultivo tisular sin suero. 8. Pipetas graduadas estériles de 10, 5 y 1 ml. 9. Pipetas Pasteur estériles. 10. Pinzas de punta fina. 11. Solución salina tamponada con fosfato (PBS: fosfato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 7,2–7,4, sin calcio ni iones de magnesio). Puede añadirse 0,05 g/dl de timerosal o 0,01 g/dl de azida sódica como agente bacteriostático. 12. Cubreobjetos n° 1 de 22×50 mm. 13. Vaso de precipitado, jarra de Coplin o botella para lavado para lavar los portaobjetos. 14. Papel absorbente para secar los portaobjetos. 15. Cámara húmeda oscura adecuada para incubar portaobjetos. 16. Incubadora de 30–36°C, con un aparato de tambor de rodillo, si se utilizan tubos de cultivo. 17. Microscopio de fluorescencia con filtros para fluorescencia (excitación máxima – 490 nm; emisión máxima – 520 nm) con objetivos con una capacidad de aumento de 160–250X y 400–630X. 18. Centrífuga con soporte para viales de 1 dram. (Opcional – para método de centrifugación-cultivo en vial sellado únicamente.) 7 Cálculos, validación e interpretación de resultados. INTERPRETACIÓN DEL ENSAYO NOTA: Los resultados deben ser interpretados por un profesional especializado en el uso de un microscopio de fluorescencia. Preparaciones de cubreobjetos de vial sellado teñido Resultado positivo: Los cubreobjetos que muestran una o más células con un patrón citoplásmico granular de fluorescencia de color verde claro brillante contra el fondo rojo de las células no infectadas contrateñidas se consideran positivos para uno de los 7 virus respiratorios incluidos en este kit. Las células teñidas pueden aparecer como células aisladas o multinucleadas, según el tiempo que lleva la infección y la etapa en la que se encuentra. Resultado negativo: Los cubreobjetos en los que las células sólo muestran contratinción de color rojo oscuro se consideran negativos. Los negativos deben informarse de la siguiente manera: “Supuestamente negativos para virus sincitial respiratorio, virus de la influenza A, virus de la influenza B, virus para influenza 1, 2 y 3 y adenovirus. Patrón de tinción fluorescente de las células infectadas con virus El patrón de inmunofluorescencia depende del virus causante y su crecimiento y maduración dentro de la célula infectada. A continuación se describen los patrones de tinción típicos observados con los virus respiratorios. Virus de la influenza A: la fluorescencia es nuclear, citoplásmica o ambas. La tinción nuclear es uniformemente brillante y la tinción citoplásmica suele ser punteada con grandes inclusiones. Células negativas: las células no infectadas se tiñen de color rojo debido a la contratinción de azul de Evans en cada reactivo de tinción. 8 Limitaciones del método. Los resultados varían según la ubicación geográfica, la edad deb la población, el estado socioeconómico, la época del año, el tipo de laboratorio (hospital, referencia, investigación, etc.) y la manipulación de las muestras. La acetona absorbe la humedad si no se guarda de forma adecuada. Esta humedad provocará una turbidez no específica después de la fijación. En este caso, utilice un frasco nuevo de acetona y repita el ensayo. No deje que los reactivos de tinción de anticuerpo monoclonal marcados con fluoresceína se sequen sobre el portaobjetos ya que producirán tinción no específica alrededor de los pocillos. Asegúrese de que hay suficiente colorante para cubrir todo el pocillo. La fluorescencia de fondo no asociada con la tinción de la superficie puede ser resultado de un lavado insuficiente e impedir la total eliminación del conjugado de fluoresceína. En estos casos, retire el cubreobjetos, lávelo bien con PBS y vuelva a montarlo. Puede producirse una fluorescencia de color verde amarillento opaco debido al conjugado atrapado por células agregadas que dificultaron la fijación y el lavado. Evite la observación de esta área del pocillo. Deben eliminarse las mucosidades de la muestra el máximo posible para evitar la ocurrencia de reacciones falsopositivas y falso-negativas con los anticuerpos fluorescentes. Deben tomarse las máximas precauciones al interpretar las muestras de frotis directo en presencia de mucosidades. Los portaobjetos teñidos deben lavarse bien para evitar que los reactivos pasen a los pocillos adyacentes. Si se produce o sospecha una infección doble, se recomienda utilizar portaobjetos separados fijados para cada uno de los reactivos específicos al virus sospechado para confirmar esta posibilidad. 9 Tiempo de ejecución del ensayo. La duración del ensayo se realiza en 3 horas y 30 minutos 10 Reporte de resultados. Las plantillas de los resultados ya se diseñaron en el laboratorio 11 Referencias. 1. Lenette, E.H., P. Halonen, and H.A. Murphy. 1988. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and Practices. Vol. 2. Springer-Verlag, New York, NY. 247-260. 2. Fields, B.N., D.M. Knipe, J.L. Melnick, R.M. Chanock, B. Roizman, and R.E. Shope. 1985. Virology. Raven Press, New York, NY. 3. White D.O., and F. Fenner, 1986. Medical Virology. 3rd ed. Academic Press, New York, NY. 4. Hall C.B., et al.1976. J. Pediatr. 89:1-15. 5. Parrott R.H., et al. 1974. Prev. Med. 3:473-480. 6. Welliver, R.C. 1988. Clin. Microbiol. Rev. 1:27-39. 7. Balows, A., W.J. Hausler Jr., K.L. Hermann, H.D. Isenberg, and H.J. Shadomy. 1991. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed., ASM, Washington, D.C.
