Guías de trabajos prácticos Procesos de Bioseparación Ingeniería en Biotecnología TRABAJO PRÁCTICO N°4 CROMATOGRAFÍA TEORÍA La cromatografía es una técnica de fraccionamiento de solutos que se basa en la distribución dinámica de moléculas que se desea separar entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil. La fase estacionaria está compuesta por un sólido, puede ser una sola pieza (“monolitos”) de material altamente poroso, o por partículas esféricas porosas que se deben empacar en una columna, para conformar un lecho empacado. La fase móvil pasa a través de la columna, normalmente a una velocidad de flujo fija. Se inyecta un pulso de muestra que contiene las proteínas a separar, junto con fase móvil. La velocidad con que se mueven las moléculas a lo largo del lecho depende de las interacciones respectivas entre cada tipo de molécula y la fase estacionaria. Por ejemplo, si una molécula no interactúa con la fase estacionaria, su velocidad será prácticamente la misma que la de la fase móvil. Para moléculas que sí interactúan con la fase estacionaria, mientras mayor sea la intensidad de la interacción, más lenta será la migración a lo largo de la columna. Este tipo de separación cromatográfica se llama “cromatografía de pulso”. La cromatografía se utiliza para la separación de diferentes substancias, tales como proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, antibióticos, hormonas, azúcares, etc.; en estos casos se habla de “cromatografía preparativa”. Además se puede utilizar con fines analíticos (“cromatografía analítica”). Algunas aplicaciones de la cromatografía son las siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Producción biofarmacéutica Análisis farmacéutico y biomédico Análisis ambiental Producción de alimentos y nutraceuticos Diagnosis Monitoreo de procesos Sistema cromatográfico Un sistema de separación cromatográfico consiste de una columna, reservorios para la fase móvil, bombas, inyector de muestra, detector y colector de fracciones. La figura 1 muestra un esquema de un sistema cromatográfico. Figura 1. Sistema de cromatografía en lecho empacado. Se utilizan distintos tipos de columnas para cromatografía: 1. 2. 3. 4. 5. Columna de lecho empacado Columna capilar empacada Columna tubular abierta Membrana Monolito Las más populares son las columnas de lecho empacado. Las columnas capilares empacadas y las tubulares abiertas se utilizan con fines analíticos de compuestos sintéticos. El uso de membranas es poco frecuente en cromatografía de pulso; se utiliza más bien como parte de procesos integrados de purificación. Los monolitos han ganado popularidad en los últimos años, principalmente con fines analíticos. La figura 2 muestra diferentes tipos de columnas. Figura 2. Diferentes tipos de columnas cromatográficas. Los diferentes mecanismos de separación que se usan en cromatografía son: 1. Intercambio iónico: explota las diferencias en la interacción electrostática entre los solutos y la fase estacionaria 2. Fase reversa: explota las diferencias de solubilidad en solventes orgánicos 3. Interacción hidrofóbica: explota las diferencias de hidrofobicidad superficial de los solutos 4. Afinidad: aprovecha la afinidad específica de algunos solutos por la fase estacionaria 5. Exclusión por tamaño: explota la diferencia en tamaño molecular de los solutos La figura 3 muestra una representación de los diferentes mecanismos de separación usados en cromatografía. Figura 3. Mecanismos de separación en cromatografía. En un proceso cromatográfico, la concentración de los componentes individuales en el efluente de la columna debe ser monitoreada. Un gráfico de la concentración de diferentes componentes en función del tiempo o volumen acumulado de efluente se llama “cromatograma”. La figura 4 muestra esquemáticamente la separación cromatográfica de una mezcla binaria. Figura 4. Esquema de la separación cromatográfica de una mezcla binaria. Las concentraciones se pueden monitorear de dos formas. El primer método consiste en colectar manualmente las fracciones o utilizar un colector de fracciones automático, seguido del análisis de las fracciones individuales mediante un método químico o físico adecuado (espectrofotometría UV/VIS, detección de fluorescencia, detector de conductividad, etc.). Esta forma de proceder corresponde a un análisis fuera de línea u “offline”. El segundo enfoque es más directo, y consiste en usar un detector adecuado en línea para medir una propiedad física, que esté relacionada con la concentración de los componentes de interés. Las propiedades que se miden usualmente son absorbancia UV/VIS y conductividad. Mediante las calibraciones adecuadas es posible determinar las concentraciones. Cromatografía de exclusión por tamaño La cromatografía de exclusión por tamaño o SEC (Size Exclusion Chromatography) se basa en el uso de partículas porosas inertes como fase estacionaria, las que separan los solutos exclusivamente en base a su tamaño molecular. Esta es una cromaografía de no – adsorción, ya que no existe interacción física o química entre los solutos y la fase estacionaria. En el trayecto que recorren a través de la columna cromatográfica, los solutos más pequeños entran en todos los poros de la fase estacionaria, mientras que las moléculas más grandes no pueden recorrer el mismo camino, es decir, son excluidas de los poros, y por lo tanto sólo pasan por el exterior de las partículas de resina. Esta trayectoria es más corta, y por lo tanto las moléculas grandes abandonan la columna en menor tiempo. La trayectoria de las moléculas más pequeñas es considerablemente más larga que la trayectoria de las moléculas más grandes, saliendo de la columna en último lugar (mayor tiempo de retención). Todas las moléculas de tamaño mayor que el límite de exclusión por tamaño de la columna viajan a través del lecho a la misma velocidad, y abandonan la columna (eluyen) al mismo tiempo. Esto corresponde al tiempo requerido para que las moléculas de solvente viajen a través del volumen de huecos dentro de la columna. Para moléculas de tamaño inferior al límite de exclusión de la columna, la velocidad depende del tamaño molecular: moléculas grandes viajan más rápido que las moléculas pequeñas y por lo tanto eluyen antes. La figura 5 representa la separación de 3 tipos de proteínas de tamaño molecular grande, mediano y pequeño, con su respectivo cromatograma. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño Además de la separación de solutos tales como proteínas y ácidos nucleicos, la cromatografía de exclusión por tamaño se puede utilizar con los fines que se describen a continuación. 1. Remoción de impurezas de bajo peso molecular. Permite la separación rápida de fragmentos proteolíticos de proteínas, cofactores, sales, etc. 2. Separación de proteínas de dímeros y otros oligómeros. 3. Estudio de la unión proteína – ligando. 4. Cambio de buffer para soluciones de proteínas. Si se elige una matriz que excluye completamente la proteína de interés, ésta puede ser eluida en un buffer distinto al inicial. Para ello la columna se equilibra con el nuevo buffer antes de inyectar la solución de proteína. Este método también se usa para des-salinizar una solución con alta concentración de sal, como ocurre por ejemplo en el efluente proveniente de una cromatografía de intercambio iónico. 5. Determinación del tamaño molecular. Se puede obtener una estimación del tamaño molecular de una proteína, ya que las proteínas normalmente pasan a través de la columna sin interactuar físicamente con la matriz. Este método es aplicable sólo a proteínas globulares. Figura 5. Separación de tres proteínas de distinto tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Determinación del tamaño molecular mediante SEC Para estimar el tamaño molecular de una proteína se utiliza el parámetro “coeficiente de partición” (Kav), que representa el tiempo de retención de la proteína en la columna, el que tiene una relación logarítmica con el tamaño molecular. La ecuación 1 define Kav. k av = VE − Vo Vt − Vo (1) En la ecuación 1, VE es el volumen de elución de la proteína, V0 es el volumen de huecos del lecho, y Vt es el volumen total del lecho. Para determinar el tamaño molecular se debe interpolar en una curva de calibración que correlaciona el coeficiente de partición de diferentes proteínas con su respectivo tamaño molecular. La ecuación 2 muestra la relación entre tamaño molecular y coeficiente de partición. Kav = A – B log MW (2) La figura 6 muestra la relación entre tamaño molecular y factor de capacidad característica de diferentes tipos de columnas comerciales para cromatografía de exclusión por tamaño. 1,0 S-1000 Kav 0,8 0,6 S-500 0,4 S-400 0,2 0,0 1e+4 1e+5 1e+6 1e+7 Peso Molecular Figura 6. Curvas de calibración para estimar tamaño molecular de proteínas mediante distintas columnas comerciales pre-empacadas. OBJETIVO Estimar el tamaño molecular de la proteína BSA. MATERIAL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Columna para cromatografía de exclusión por tamaño Buffer tris-HCl pH 8.0 más 0.1 M NaCl Soluciones de proteínas de tamaño molecular conocido Solución de BSA 0.2 M Programa Biorad para cromatógrafo biocompatible Jeringa Etanol 20% PROTOCOLO 1. Equilibrar la columna con el buffer apropiado (2 – 3 CV) 2. Inyectar 2 mL de solución de proteína 0.2 mg/mL 3. Iniciar el flujo a través de la columna, a un caudal de 0.5 mL/min, utilizando el modo manual 4. Monitorear la absorbancia a la saluda de la columna 5. Detener el flujo cuando se haya completado 1 CV 6. Registrar el tiempo o volumen de retención de la proteína 7. Repetir para diferentes proteínas de tamaño molecular conocido 8. Con los datos obtenidos construir la curva de calibración para estimación de tamaño molecular 9. Inyectar 2 mL de solución de BSA 0.2 mg/mL 10. Monitorear la absorbancia a la salida de la columna 11. Registrar el tiempo o volumen de retención 12. Interpolar en la curva de calibración para estimar el tamaño molecular de la BSA
