Purificación de ADN plasmídico MADE IN HOUSE - LBB Protocol

Purificación de ADN plasmídico a escala mini preparativa.
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Crecer las colonias de transformantes en medio rico selectivo Ej. LB-A,
hasta D.O.= 2.0 aproximadamente (esto generalmente se hace toda la
noche en agitación).
Centrifugar a 6000 rpm 1.5 ml del cultivo durante 5 min. en un tubo
colector, desechar el sobrenadante y repetir.
Resuspender pellet mediante vortex “en seco”.
Resuspender el precipitado en 100 µl de buffer 1 (liso-, RNasa 10µg/ml),
garantizar total resuspención.
Añadir 100 µl de sln II (NaOH +SDS) y mezclar por inversión, incubar a
TA 5 min.
Añadir 100 µl de sln III (KAc +HAc) y mezclar fuerte, incubar en hielo 10
min.
Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min.
Recuperar el sobrenadante a un tubo limpio y desechar el pellet.
Añadir 1 Vol de isopropanol (aprox 300 µl).
Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 min.
Desechar el sobrenadante.
Centrifugación rápida al tubo y extracción con pipeta, secar el precipitado
a TA.
Resuspender en 20 µl de H2O destilada y aplicar 2 µl en gel de agarosa
1% (electroforesis)
slnII: 0.4 g NaOH, H2O hasta 35 ml, diluir ,añadir 2.5 ml de SDS al 20%, completar
con H2O a 50 ml.
Purificación de ADN plasmídico a escala de masivo.
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Crecer las colonias de transformantes en medio rico selectivo Ej. LBA,
hasta D.O.= 2 aproximadamente (esto generalmente se hace toda la
noche en agitación).
Centrifugar a 8000 rpm el cultivo de 300 ml durante 10 min, desechar el
sobrenadante.
Resuspender el precipitado en 10 ml de buffer 1 (add RNasa 10µg/ml).
Añadir 10 ml de sln II (NaOH +SDS) y mezclar, incubar a TA 10 min.
Añadir 10 ml de sln III (KAc +HAc) y mezclar, incubar en hielo 15 min.
Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min.
Extraer el sobrenadante y filtrar en un tubo limpio, añadir 1 Vol de
isopropanol y mezclar.
Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min.
Desechar el sobrenadante y secar exhaustivamente el pellet.
Resuspender en 600 µl de TE 1X y añadir RNasa 10µg/ml, incubar a 37º
C 1-2 h.
Fenol/ Cloroformo (vol/vol), centrifugar a 12000 rpm 5´, extraer el
sobrenadante y repetir 2X, o +.
Precipitar con 2,5 vol de ETOH 100% y 1/10 vol NaAc.
Incubar -20ºC 30´ a ∞.
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Centrifugar 10000 rpm 12´.
Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con ETOH 70%, añadiendo
500µl de ETOH 70% y centrifugar 10000 rpm 10´.
Resuspender en 200 µl de H2O destilada o TE 1X.
slnII: 0.4 g de NaOH, H2O hasta 35 ml, diluir, añadir 2.5 ml de SDS al 20%,
completar con H2O a 50 ml.
TE 1X: tris-HCl 10 mM pH 7.6 – EDTA 1 mM
Fenol/cloroformo: ½ vol fenol saturado + ½ vol cloroformo, centrifugar a
12 000 rpm 10´, extraer la fase superior a un tubo limpio cuidadosamente
sin tocar la interfase proteica.
Precipitación de ADN:
• 2.5 vol de ETOH 100% y 1/10 vol NaAc 3M.
• Incubar -20ºC durante 30´a ∞.
• Centrifugar 12000 rpm 12´(plasmidios) o 20´ (fragmentos o bandas de
ADN).
• Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con ETOH 70%, añadiendo 500
µl de ETOH 70% y centrifugar 12000 rpm 10´.
• Resuspender en X µl de H2O destilada