EXTRACCIÓN DE RNA

EXTRACCIÓN DE RNA de Saccharomyces (modif. SCSIE)
Mantener todo en hielo, usar guantes y material preparado especialmente para RNA (40‘ autoclave). En todos los pasos de
fenolización emplear tubos con tapón de rosca de 2 ml.
1.- Inocular precultivos de las cepas toda la noche.
2.- Inocular 25 mL de medio fresco con estos precultivos a DO600= 0,18 y crecer hasta DO600  0,6.
3.- Centrifugar a 4ºC / 5 minutos / 3500rpm en falcon de 50 mL.
4.- Lavar con H2O de RNA. (unos 10mL)
5.- Congelar el pellet a -80ºC toda la noche (opcional).
6.- Se descongelan las muestras en hielo.
7.- Preparar tubos con tapón de rosca de 2 mL con perlas de vidrio (500 l).
8.- Resuspender las células en 500 L de LETS y 500 L de fenol-tris para RNA.
9.- Romper las células en el Fast-Prep o Mini Beadbeater, 6 x 30 segundos, con periodos intercalados
de 30 segundos en hielo.
10.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm.
11.- Recoger el sobrenadante en nuevo tubo y extraer de nuevo con fenol-tris de RNA. Vórtex.
12.- Centrifugar a 4ºC durante 5 minutos a 13000rpm.
13.- Recoger el sobrenadante y extraer con fenol-cloroformo (5:1) de RNA.
14.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a 13000rpm.
15.- Repetir la extracción con fenol-cloroformo (5:1) dos veces más.
16.- Recoger el sobrenadante y extraer con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Vórtex.
17.- Centrifugar a 4ºC durante 5 min a 13000rpm.
18.- Recoger el sobrenadante y precipitar con 1 V de LiCl 5M, a –20ºC durante toda la noche.
19.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm.
20.- Lavar con EtOH al 70% (unos 500L).
21.- Dejar secar el pellet (en este punto yo no lo seco, recojo los restos de SN con una P20 después
de dar un pulso de centrífuga).
22.- Resuspender en 500 L de H2O de RNA.
23.- Precipitar con 1/10 V de NaOAc 3M y 2 V de EtOH absoluto, a –80ºC durante 2-3 horas.
24.- Centrifugar a 4ºC durante 20 minutos a 13000rpm.
25.- Lavar con EtOH al 70%.
26.- Quitar los restos de SN con P20 y secar 5 minutos al aire o 1 min en speed-vac.
27.- Resuspender en un volumen de 50 a 100 L, dependiendo del tamaño del pellet. Cuantificar en
el NanoDrop (Concentración máxima RNA en NanoDrop 3 g/l).
LETS: LiCl 0,1M; EDTA 10mM; SDS 0,2%, Tris.HCl 10mM pH=7,4.
Referencias
1. Perlas de vidrio, lavadas con ácido (100 g) 425-600 m
SIGMA
Ref G8772-100G
2. Fenol Saturado pH 4,5 (400 ml)
AMRESCO
Ref 0981-400ML
Fenol equilibrado pH 4,5 (400 ml)
USB (Isogen)
Ref 77510-400ml
3. Fenol-Cloroformo 5:1 acid equilibrated pH 4,7 (400 ml)
(es fenol-cloroformo-alcohol isoamílico 125:24:1)
SIGMA
Ref P1944-400ML
4. Cloroformo:alcohol isoamílico 24:1 (100 ml)
FLUKA (SIGMA)
Ref 25666