Efecto antitumoral de la IL-12 acoplado a chitosano en un modelo tumoral murino VPH 16 positivo
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS EFECTO ANTITUMORAL DEL GEN DE LA IL-12 ACOPLADO A CHITOSANO EN UN MODELO TUMORAL MURINO EN CÉRVIX VHP 16 POSTIVO TESIS PROFESIONAL POR ETAPAS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: B I O L O G O P R E S E N T A: CECILIA ESTEFANIA SUASTEGUI BAHENA DIRECTOR: DR. VÍCTOR HUGO BERMÚDEZ MORALES CUERNAVACA, MORELOS OCTUBRE, 2015 Esta tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de Virus y Cáncer Departamento de Infecciones Crónicas y Cáncer Centro de Investigaciones Sobre Enfermedades Infecciosas Instituto Nacional de Salud Pública Bajo la dirección del: Dr. Víctor Hugo Bermúdez Morales Comité sinodal: M. en C. Josefina Benítez Salgado Dra. Rosa Estela Quiroz Castañeda Biól. Nayeli Sánchez Guevara M. en C. Pedro Romero Guido II Créditos Al Centro de Investigaciones Sobre Enfermedades Infecciosas, del Instituto Nacional de Salud Pública, por permitirme realizar el trabajo experimental en sus instalaciones. Al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por haberme otorgado una beca. No. de Becario: 168817 Al Sistema Único de Beneficiarios de Educación Superior (SUBES) por el apoyo económico recibido. No. de Becario: 888551 III Dedicatoria A todas las personas que han perdido la batalla contra el cáncer y aquellas que continúan en la lucha… IV Agradecimientos Al Dr. Víctor Hugo Bermúdez Morales por permitirme estar dentro de su grupo de trabajo. Aprendí muchas cosas de él, no solo en el ámbito académico si no también en el ámbito personal; todos sus consejos fueron en el mejor momento, ¡gracias!. Al comité sinodal conformado por la M. en C. Josefina Benítez Salgado, la Dra. Rosa Estela Quiroz Castañeda, la Biól. Nayeli Sánchez Guevara y el M. en C. Pedro Romero Guido, por todas sus críticas constructivas durante el desarrollo de este proyecto. A los miembros del L5PA, gracias por todos los buenos momentos que pasamos juntos, encontré a muy buenos amigos en este lugar. A mis amigos incondicionales que conocí desde el inicio de la carrera, gracias por la linda amistad que me brindan. A mis hermanos Omar y Fernando, gracias por alimentar mis sueños y motivarme para llevarlos a cabo. A mi abue Estefanía, por cuidarme y amarme tanto desde que era pequeña. Papá y mamá, gracias por todo el amor incondicional que me han brindado, que sin duda alguna ha sido la luz y pilar en el camino que estoy emprendiendo, gracias a ustedes culmino una meta de mi vida, les prometo que será la primera de muchas. Los amo con todo mi corazón. V Índice general Créditos ............................................................................................................................................................... III Dedicatoria ........................................................................................................................................................ IV Agradecimientos ...............................................................................................................................................V Índice general ................................................................................................................................................... VI Índice de figuras ............................................................................................................................................. VIII Índice de tablas .............................................................................................................................................. VIII Abreviaturas ...................................................................................................................................................... IX Resumen .............................................................................................................................................................. 1 1. Introducción ................................................................................................................................................... 2 2. Antecedentes ................................................................................................................................................ 4 2.1 Cáncer cérvicouterino ......................................................................................................................... 4 2.2 Asociación del Cáncer cérvicouterino y Virus del Papiloma Humano ....................................... 5 2.3 Características generales del VPH ...................................................................................................... 7 2.3.1 Ciclo viral del VPH............................................................................................................................ 8 2.3.2 Mecanismo de oncogénesis ....................................................................................................... 12 2.4 Respuesta inmune contra tumores ................................................................................................... 12 2.5 Citocinas como terapia génica contra el cáncer ........................................................................ 15 2.5.1 Interleucina 12 ................................................................................................................................ 15 2.6 Terapia génica ...................................................................................................................................... 17 2.6.1 Chitosano ....................................................................................................................................... 18 2.6.2 Formación de complejos de chitosano/ADN ......................................................................... 19 2.6.3 Mecanismo para la liberación de genes. ................................................................................ 19 3. Justificación .................................................................................................................................................. 20 4. Hipótesis ......................................................................................................................................................... 20 5. Objetivos ....................................................................................................................................................... 21 5.1 Objetivo general ................................................................................................................................... 21 5.2 Objetivos particulares .......................................................................................................................... 21 6. Metodología................................................................................................................................................. 21 6.1. Purificación de los plásmidos............................................................................................................. 23 6.2. Complejos de chitosano acoplados al plásmido pNGVL3-mIL-12 ............................................ 23 6.3. Cultivo de la línea celular BMK-16/myc .......................................................................................... 24 6.4. Desarrollo del modelo tumoral .......................................................................................................... 24 VI 6.5. Inmunización de los complejos chitosano/pADN en el modelo tumoral murino VPH 16 positivo en cérvix y detección de la expresión de la oncoproteína E7 .......................................... 25 7. Resultados ..................................................................................................................................................... 29 7.1 Purificación de los plásmidos pNGVL3-mIL-12 y pcDNA3 ............................................................. 29 7.2 Formación y caracterización de los complejos chitosano/pADN .............................................. 29 7.3 Desarrollo del modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo ............................................... 32 7.4 Efecto antitumoral de IL-12 ................................................................................................................. 32 8. Discusión ........................................................................................................................................................ 37 9. Conclusión .................................................................................................................................................... 40 10. Perspectivas ............................................................................................................................................... 40 11. Literatura citada ........................................................................................................................................ 41 12. Anexos ......................................................................................................................................................... 45 VII Índice de figuras Figura 1. Estimado de mortalidad de Cáncer de Cérvix a nivel mundial . . . 4 Figura 2. Árbol filogenético de los diferentes tipos de VPHs . . . . 6 Figura 3. Estructura y genoma del VPH . . . . . . . 8 Figura 4. Ciclo viral del VPH . . . . . . . 11 Figura 5. Mediadores de la respuesta inmune contra tumores . . . . 14 Figura 6. Estructura del chitosano . . . . . . . 18 Figura 7. Diseño experimental . . . . . . . . 22 Figura 8. Esquema de actividades . . . . . . . 26 Figura 9. Purificación del plásmido pNVGL3-mIL12 y pcDNA3 . . . . 29 Figura 10. Eficiencia de encapsulamiento del plásmido pNGVL3-mIL12 y pcDNA3 . . 30 Figura 11. Ensayo de retardamiento en gel de agarosa de los complejos chitosano/pDNA . 31 Figura 12. Biopsias del aparato reproductor de ratonas Balb/c posterior a la generación del modelo de CaCu . . . . . . . . . 34 Figura 13. PCR en tiempo real para detectar la expresión de los genes GAPDH y E7 . 35 Figura 14. Expresión del oncogén E7 . 36 . 9 . 27 . . . . . . . . Índice de tablas Tabla 1. Función de las proteínas virales del VPH . Tabla 2. Oligonucleótidos y sonda Taqman utilizadas para el RT-PCR tiempo real VIII Abreviaturas ADN Ácido desoxirribonucleico APC “Antigen-presenting cell” Células profesionales presentadoras de antígenos ARN Ácido ribonucleíco CaCu Cáncer Cérvicouterino CD Células dendríticas CH3COOH NIC Neoplasia Intraepitelial Cervial NK “Natural Killer” – Células Asesinas Naturales ORF “Open reading frame” - marco de lectura abierta Ácido acético Pb Pares de bases DMEM “Dulbecco's Modified Eagle Medium” PSV Partículas similares a virus VPH Virus del papiloma humano FDA “Food and Drug Administration” Administración de alimentos y medicamentos GM-CSF “Granulocyte macrophage colony - stimulating factor” Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos IL-10 Interleucina 10 IL-12 Interleucina 12 IL-18 Interleucina 18 IL-2 Interlelucina 2 IL-4 Interleucina 4 IL-5 Interleucina 5 IL-6 Interleucina 6 INF-ɣ Interferon gamma LCR “Long Control Region” región larga de control. MHC I “Major histocompatibility complex ” - Complejo mayor de histocompatibilidad tipo I Na2SO4 Sulfato de sodio IX Resumen A nivel mundial, el cáncer cérvicouterino (CaCu) es considerado como la segunda causa de mortalidad en mujeres, representando un gran problema de salud pública global. Actualmente, se ha desarrollado la primera generación de vacunas profilácticas contra la infección por el virus del papiloma humano (VPH tipo 6, 11, 16 y 18). Sin embargo, los casos actuales de lesiones pre-malignas y malignas del cérvix no serán protegidos por estas vacunas profilácticas, además estas vacunas sólo protegerán contra los tipos de VPH que son blanco, la protección no será absoluta y su longevidad es dudosa. Así como tampoco se puede excluir la posibilidad del reemplazo genotípico, que las mujeres mayores no serán cubiertas por los programas de vacunación y además el costo de las vacunas es muy alto. Por lo tanto, se deben desarrollar otros sistemas terapéuticos para la población en riesgo y de los casos de lesiones y neoplasias presentes en la actualidad. Basados en el hecho que durante el desarrollo del CaCu se presenta un estado de inmunosupresión local asociado a la expresión de citocinas inmunosupresoras y a la infección por VPH, se propuso una novedosa estrategia terapéutica para inhibir el estado de inmunosupresión local y favorecer la activación de la respuesta inmune de tipo celular, mediante el uso del gen de la interleucina 12 (IL-12). La estrategia propuesta se aplico de forma local y tópica, mediante el uso de un polímero de origen natural biodegradable, el chitosano; este polímero sirvió de vehículo para encapsular y liberar el gen de la IL-12 en la mucosa cervical. Se analizó la administración de 5 µg de pADN con el gen de IL-12 encapsulado en micropartículas de chitosano en ratones hembra Balb/c VPH 16 positivos. Se realizaron raspados cervicovaginales a diferentes tiempos, para determinar la expresión del ARNm del oncogén E7 mediante RT-PCR en tiempo real y se determinó que disminuye después de la aplicación de los complejos chitosano/pADN(IL-12). Estos resultados demuestran que se favoreció la expresión del gen de IL-12, para promover la activación de la respuesta inmune antitumoral y promover la regresión tumoral. Por lo que esta estrategia tiene un gran potencial como tratamiento tópico para el control de lesiones premalignas asociadas a la infección de VPH. 1 1. Introducción A nivel mundial, el cáncer cérvicouterino (CaCu) representa la segunda causa de mortalidad por neoplasias en mujeres. El 80% de los casos de CaCu se presentan en países en vías de desarrollo y aproximadamente 520 000 casos nuevos se registraron en el año 2012. En México en el año 2002 esta enfermedad fue la segunda causa de muerte debido a cáncer, en mujeres jóvenes.1,5 El virus del papiloma humano (VPH) es considerado como el principal agente etiológico asociado al desarrollo del CaCu, el VPH es detectado en aproximadamente el 99% de los casos de CaCu.2 Los papilomavirus humanos, son miembros de la familia Papovaviridae y están ampliamente distribuidos en la naturaleza e infectan específicamente el epitelio escamoso. Se han descrito más de 100 tipos de papilomavirus, y de todos ellos, el genotipo 16 y 18 son los VPH oncogénicos más prevalentes, los cuales son los responsables del 70% de los casos de CaCu. 13 El VHP 16 está asociado con la mitad de los casos, mientras que el VPH 18 está involucrado en el 20%.11 La capacidad transformante de los VPHs oncogénicos, está relacionada con las propiedades oncogénicas de las proteínas virales E6 y E7, las cuales son responsables del fenotipo transformante de las células epiteliales. 12 Actualmente se ha desarrollado la primera generación de vacunas profilácticas contra la infección por el VPH. Sin embargo, para determinar su eficacia sobre la incidencia y mortalidad por CaCu asociada al virus, se requiere de un seguimiento a largo plazo. Además, las vacunas están dirigidas para ciertos papilomavirus y no tiene protección para otros VPHs que están relacionados con eventos neoplásicos. 11,37 Es por este motivo que se ha realizado investigaciones para contribuir al tratamiento del CaCu y sus lesiones precursoras. Una alternativa es generar estrategias basadas en terapia génica para el tratamiento, prevención o eliminación de las lesiones precancerosas y cancerosas del cérvix uterino asociado con genes con propiedades antitumorales. 15,26 En este contexto, la IL-12 es una citocina que por sus propiedades como inmunomodulador y actividad antitumoral, se ha usado ampliamente en la terapia génica en diversos tumores. Se ha demostrado que la IL-12 además de inhibir el crecimiento de tumores experimentales reduce el número de metástasis y tiene efecto 2 adyuvante en diversos modelos animales.15,20,21 Esta citocina es excelente para el tratamiento de diversos tumores, incluyendo el CaCu31, sin embargo la administración sistémica como terapia muestran mucha toxicidad20. A pesar de esto, los efectos biológicos bien documentados indican que tiene un gran potencial para ser un compuesto terapéutico efectivo, incitando a la investigación hacia nuevos métodos de liberación de IL12 para evitar su toxicidad.21,31,34,36 Por lo tanto se ha propuesto que el uso del gen de la IL-12 mediante terapia génica no viral, reduce significativamente los efectos tóxicos, ya que su expresión local es mucho menor que la aplicación de la proteína a nivel sistémico. En la terapia génica no viral, los polímeros catiónicos están siendo ampliamente usados como vehículos de liberación de ADN, ya que es muy fácil lograr que el ADN se una al polímero; actualmente entre los polímeros más estudiados se encuentran la poliL-lisina (PLL), el polietilenglicol (PEG), la espermidina, la cobaltohexamina y el chitosano. 18,24,39. Particularmente el chitosano es un polímero el cual sus características biológicas lo hacen un candidato ideal para usarlo en terapia génica no viral. El chitosano es de origen natural, no tóxico, biodegradable, biocompatible, no inmunogénico, mucoadherente, antimicótico y de bajo costo; es obtenido de la quitina presente en el exoesqueleto de todos los artrópodos y es el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. El chitosano favorece la formación de complejos con el ADN, encapsulándolo y protegiéndolo de su degradación por nucleasas y es considerado un excelente vehículo para liberación de genes. 22,23, 24 3 2. Antecedentes 2.1 Cáncer cérvicouterino El cáncer cérvicouterino (CaCu) es uno de los principales problemas de salud pública en el mundo, ya que representa la segunda causa de mortalidad por neoplasias en mujeres. El 80% de los casos de CaCu se presentan en países en vías de desarrollo y aproximadamente 520 000 casos nuevos se registran por año (Figura 1). En México esta enfermedad fue la segunda causa de muerte debido a cáncer, en mujeres jóvenes en el año 2002.1,7,9 Figura 1. Estimado de mortalidad de Cáncer de Cérvix a nivel mundial. (Tomada de: GLOBOCAN 2012 (IARC). Section of Cancer Surveillance) 4 2.2 Asociación del Cáncer cérvicouterino y Virus del Papiloma Humano Hace 30 años se descubrió que el Virus del Papiloma Humano (VPH) era el agente etiológico asociado al cáncer de cérvix uterino, y en el 2009 se le otorgó el Premio Nobel al profesor Haraldzur Hausen por tal demostración. Actualmente se ha demostrado que la infección persistente de tipos oncogénicos de VPH, es la causa necesaria del cáncer de cérvix.11 Se han reconocido más de 100 virus del papiloma humano (VPH´s), que causan un diverso rango de lesiones epiteliales. A nivel evolutivo todos los papilomavirus que se conocen se han agrupado en 16 géneros (Figura 2)13,33. Los dos géneros de VPH más importantes son los papilomavirus Alpha (α), que contiene los virus asociados con el desarrollo de tumores en mucosa en humanos y los Beta (β) que contienen aquéllos asociados al desarrollo de tumores cutáneos.10 Cerca de 35 tipos de VPH se identifican en lesiones benignas y malignas del tracto anogenital tanto en hombres como en mujeres; además 15 de estos tipos virales se asocian en diferente grado, al cáncer de cérvix. El papilomavirus tipo 16 es el más prevalente de los VPH oncogénicos, responsable de más de la mitad de los tumores, mientras que el papilomavirus tipo 18 está involucrado en el 20% de los mismos .11,33 Además de los tipos 16 y 18, los VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82 deben ser considerados oncogénicos o tipos de alto riesgo; mientras que los tipos 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 y 81 de bajo riesgo.12 La infección por VPH esencialmente es una enfermedad de transmisión sexual, es por ello que los factores asociados con la infección por VPH esencialmente están relacionados con el comportamiento sexual, como: la edad de inicio de vida sexual, un alto número de parejas sexuales a lo largo de la vida o contacto sexual con individuos de alto riesgo. En personas jóvenes la infección por VPH es muy frecuente, sin embargo la mayoría de las mujeres infectadas resuelven la infección espontáneamente (alrededor del 90%), persistiendo sólo en una pequeña fracción de ellas. Es este grupo de acarreadoras crónicas de VPH de alto riesgo quienes presentan un riesgo incrementado de desarrollar lesiones del tracto anogenital.1,11,12 5 Figura 2. Árbol filogenético de los diferentes tipos de VPHs. (Tomada de Ethel-Michele, et al. 2004) La historia natural del CaCu implica la progresión gradual de una serie de etapas secuenciales en que las células del cérvix presentan ciertas anormalidades histológicas, conocidas como Neoplasia Intraepitelial Cervical: NIC I (displasia leve), NIC II (displasia moderada), NIC III (displasia severa/carcinoma in situ) y finalmente, un cáncer invasor.11 Las neoplasias intraepiteliales cervicales o lesiones precursoras son las lesiones consideradas como la antesala del cáncer cervicouterino.38 En la actualidad se comercializan ampliamente dos vacunas anti-VPH en todo el mundo, VPH bivalente (tipo 16 y 18) y cuadrivalente (tipo 6, 11, 16 y 18). Ambas se fabrican con tecnología recombinante y se preparan a partir de proteínas estructurales 6 purificadas que se unen entre sí para formar cubiertas vacías de un tipo específico de VPH o partículas similares a virus (PSV). Ninguna de las vacunas contiene productos biológicos vivos ni ADN vírico, por lo que no son infecciosas. Las vacunas antiVPH se formularon sólo para uso profiláctico; no curan una infección ya existente por VPH ni sirven para tratar los signos de la enfermedad causada por el virus. 37 Además sólo protegerán contra los tipos de VPH que son blanco; la protección no será absoluta y su longevidad es dudosa; como también no se puede excluir la posibilidad del reemplazo genotípico; y las mujeres mayores no serán cubiertas por los programas de vacunación por lo tanto continuarán en riesgo.11,37 Es por este motivo que se ha realizado investigaciones para contribuir al tratamiento del CaCu y sus lesiones precursoras. Una alternativa es generar estrategias basadas en terapia génica para el tratamiento, prevención o eliminación de las lesiones precancerosas y cancerosas del cérvix uterino aunado a genes con propiedades antitumorales.15 2.3 Características generales del VPH Los papilomavirus humanos (VPH) miembros de la familia Papovaviridae, son pequeños virus de ADN de doble cadena, sin envoltura, de forma icosahédrica, de 5060 nm de diámetro, cuyo genoma está constituido por aproximadamente 7200-8000 pb (Figura 3)13. Estos virus constan de varios genes y marcos de lectura abierta (ORF) de dos tipos diferentes: la región temprana E (Early), la cual codifica para las proteínas virales E1, E2, E4, E5, E6 y E7, necesarias para la replicación del ADN viral, regulación de la trascripción y genes involucrados en la transformación e inmortalización celular; y una región Tardía L (Late), cuya expresión genera las proteínas para el ensamblaje de la cubierta viral y la cápside (L1 y L2). Existe también una región reguladora conocida como región larga de control LCR (Long Control Region), que contiene la secuencia de ADN que controla la replicación y expresión de los genes tempranos E6 y E7 12,13 (Tabla 1). El mecanismo de acción de los VPH de alto riesgo en el desarrollo de la neoplasia cervical, se explica principalmente por la acción de dos de sus oncoproteínas virales E6 y E7 que, respectivamente, serán capaces de bloquear a p53 y Rb del ciclo celular y protegen de la muerte por apoptosis a la célula infectada.4,11,12 7 Figura 3. Estructura y genoma del VPH. A) Las partículas de VPH tienen forma icosaédrica y un diámetro de 50-60 nm. B) El genoma del VPH es una molécula de ADN circular de doble cadena. Se divide en tres regiones: la región larga de control LCR; la región temprana, que contiene los genes E1, E2, E4, E5, E6 y E7 y la región tardía L1 y L2. (Tomado de López y Lizano 2006). 2.3.1 Ciclo viral del VPH La infección por papilomavirus requiere que las partículas tengan acceso a la capa de epitelio basal, esto ocurre a través de lesiones en el epitelio queratinoso del tracto genital femenino. La entrada del VPH en la célula huésped comienza con la unión de este a la superficie celular, específicamente en regiones modificadas ricas en proteoglicanos de heparina sulfatadas (HSPGs). Como otros virus, se sugiere que la infección requiere la presencia de receptores secundarios, para una infección eficiente, como son las α6X integrinas.10,17 8 TABLA 1. FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS VIRALES DEL VPH 11, 12, 13 Esencial para la replicación del ADN viral; tiene Región temprana (E) E1 actividad ADN helicasa y ATPasa. Regulador principal de la transcripción de genes virales, recluta a E1 permitiendo la replicación del ADN y transfiere el genoma viral a células hijas E2 durante la división en la célula huésped. Interacción tardía en el ciclo viral; interacciona con proteínas del citoesqueleto, induce el arresto en E4 fase G2 y permite el ensamblado y liberación viral. Regulación en la señalización de factores de E5 crecimiento y evasión de la respuesta inmune. Induce síntesis de ADN; induce la telomerasa, previene la diferenciación celular, interviene en la degradación de p53 e inhibe la actividad de otros E6 factores de reparación a daño del ADN. Induce la proliferación celular anormal; interactúa con histonas acetiltransferasas y con reguladores negativos del ciclo celular y supresores de tumores principalmente con la proteína pRb y desregula el E7 ciclo celular en fase G1/S. Proteína de la cápside mayor, interacciona con L2, receptores celulares y codifica para epítopes Región tardía (L) L1 neutralizantes. Proteína de la cápside menor; interacciona con el ADN, y el dominio nuclear 10s y facilita el L2 ensamblado de viriones. 9 Las partículas de papilomavirus son llevados dentro de la célula por endocitosis mediada por clatrina, los papilomavirus son desmontados en endosomas tardíos o lisosomas, con la transferencia del ADN viral al núcleo de la célula del huésped. Una vez que el VPH penetra la célula huésped es cuando se comienza el ciclo viral. 10 En principio el genoma del VPH se establece en las células huésped como plásmido nuclear o episomal; se mantiene controlado con un número bajo de copias virales, de esta forma se cree que no despierta una actividad inmunológica por parte del huésped en contra de las células infectadas, permitiendo al VPH infectar más células hasta que el genoma viral logre integrarse en el genoma celular, debido a la expresión de ciertos genes propios del VPH, lo cual ocurre durante la división de las células basales al diferenciarse el epitelio basal a un epitelio estratificado.11 Se ha observado frecuentemente, que la integración del genoma viral es debido a la disrupción del gen E2; se sabe que esta proteína funge como represor de la expresión de los oncogenes E6 y E7 (genes necesarios para la transformación e inmortalización celular) mientras el genoma viral se encuentra de manera episomal, característica que le permite poder invadir varias células y pasar desapercibido por el sistema inmunológico del huésped.13 E1, E2, E4 y E5 son proteínas requeridas para la replicación viral, mientras que las proteínas virales E6 y E7 son requeridas para la transformación e inmortalización celular. Una vez integrado el genoma viral en el genoma celular se producen proteínas de la cápside que envuelven a los viriones y de esta manera siguen infectando células basales epiteliales.10 (Figura 4) 10 Figura 4. Ciclo viral del VPH. Células basales en el epitelio cervical se encuentran en la base de la membrana, la cual es soportada por la dermis. El acceso a las células basales de los VPH es a través de microtraumas en el epitelio cervical. Después los genes de expresión temprana E1, E2, E4, E5, E6 y E7 son expresados y el ADN se replica de forma episomal (núcleo morado). En las capas superiores del epitelio (la capa media y superficial) el genoma viral se replica más y los genes tardíos L1, L2 y E4 son expresados. L1 y L2 encapsulan el genoma viral para formar progenies de viriones en el núcleo. La cubierta del virus puede iniciar una nueva infección. El progreso de lesiones sin tratamiento de cáncer micro-invasivo e invasivo es asociado con la integración del genoma del VPH a los cromosomas de la célula huésped (núcleo rojo), asociado a la pérdida o disrupción de E2, y subsecuentemente a la sobreexpresión de E6 y E7. (Tomado de Doorbar, 2006). 11 2.3.2 Mecanismo de oncogénesis Los VPH infectan las células basales del epitelio cervical y aprovechan el proceso de diferenciación del epitelio, para sintetizar las proteínas que les permitirán ensamblar nuevas partículas víricas; es entonces cuando las células epiteliales infectadas activan su mecanismo de defensa celular, esto está dirigido por una cascada de proteínas entre las que se destaca la p53 y la proteína Rb. 10 Cuando la célula localiza el ADN viral, en un proceso perfectamente regulado, intenta reparar el error y dado que este ADN es excesivamente grande para ser eliminado, p53 y Rb dirigen la célula infectada a una “muerte celular programada” por apoptosis, evitando así que esta célula sirva de propagadora de la infección. Los genes E6 y E7 respectivamente, serán capaces de bloquear a p53 y Rb del ciclo celular y protegen a la célula infectada de la muerte por apoptosis, pudiendo de este modo seguir utilizando a la célula huésped como centro de producción de partículas virales. Por esto E6 y E7 deben considerarse, en todos los efectos, oncogenes virales. Parece claro que el mecanismo de oncogénesis por VPH comienza con la expresión de E6 y E7. 4,11, Es por este motivo que gran avance de las investigaciones contra el cáncer cervical está enfocado principalmente a los oncogenes E6 y E7 del Virus del Papiloma Humano (VPH), como antígenos específicos del tumor para generar inmunogenicidad tumoral. 13,15 2.4 Respuesta inmune contra tumores La respuesta inmune contra tumores se mide mediante dos tipos de mecanismos: la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. La respuesta inmune innata se considera como la primera barrera contra las células tumorales, las cuales son reconocidas por un proceso independiente de antígeno. 19 Cuando las células de la respuesta inmune innata, detectan la presencia de un tumor en desarrollo, se producen moléculas pro-inflamatorias que atraen a la zona neoplásica células del sistema inmune, como células NK, NKT, macrófagos y células dendríticas, las cuales reconocen la baja o nula expresión de moléculas MHC I sobre la célula 12 tumoral, que induce la producción citocinas mediadoras del sistema inmune como los interferones, los cuales pueden inducir la muerte de algunas células tumorales. 14,15 En relación con la respuesta inmune adaptativa, ésta requiere del reconocimiento de antígenos tumorales para reconocer y eliminar la célula tumoral por medio de las células efectoras de la respuesta inmune. Se ha demostrado que la respuesta inmune mediada por células es la más importante para eliminar las células neoplásicas. Esta respuesta es dependiente de la activación de los linfocitos T y de las células profesionales presentadoras de antígenos (APC). La activación de los linfocitos T, requiere que las células dendríticas (CD) capturen y procesen el detritus celular tumoral, migren a los nódulos linfáticos regionales para presentar los antígenos tumorales a los linfocitos T CD8+ mediante las moléculas del MHC clase I. 15 En este proceso se activan tanto los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos contra péptidos tumorales, los cuales son reconocidos a través de las moléculas del MHC. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos son los responsable de lisar y eliminar a las células tumorales, por el reconocimiento de péptidos tumorales asociados a las moléculas del MHC clase I expresados en la superficie de la célula tumoral. Por otro lado, los linfocitos T CD4+ son los encargados de orquestar la respuesta inmune antitumoral, ya que están involucrados en la inducción y activación de los linfocitos T CD8+ citotóxicos a través de la producción de citocinas. Además, los linfocitos T CD4+ son capaces de interactuar con las células APCs en el proceso de presentación de antígenos tumorales y activar a los precursores de linfocitos T CD8+ 12,15,16 (Figura 5). Durante la respuesta inmune adaptativa, moléculas solubles llamadas citocinas están involucradas en regular los procesos inmunológicos. En general estas citocinas son producidas y secretadas por los linfocitos T CD4+, que pueden ser diferenciados en Th1 y Th2 en relación a las citocinas que secretan. Los T CD4+ Th1 secretan citocinas (INF-ɣ, IL-12 e IL-2) que colaboran con la respuesta inmune celular, y los linfocitos T CD4+ Th2 secretan citocinas (IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10) que activan la respuesta inmune humoral.17 13 Figura 5. Mediadores de la respuesta inmune contra tumores. La fase activadora de la respuesta inmune contra tumores inicia con la captura y procesamiento de vesículas de membrana liberadas por las células tumorales (exosomas) captadas por las células dendríticas (CD), las cuales migran a los nódulos linfoides regionales para activar a las células de la respuesta inmune. Este proceso de maduración-migración de las CD a los nódulos linfoides lo facilita la interacción del receptor del CD40 de las CD con el CD40L expresado en los linfocitos TCD4+ y en las células NKT. Por otro lado, en la fase efectora, el material endocitado del tumor se presenta a los linfocitos T CD8+ y CD4+ a través de las moléculas del MCH clase I y II, respectivamente. Los linfocitos T CD4+ activados son diferenciados en linfocitos T CD4+ TH1 y TH2 según las citocinas que secretan, y las citocinas pueden activar a la respuesta inmune humoral y celular. En la respuesta inmune humoral, los linfocitos B activados producen anticuerpos específicos contra antígenos tumorales, mientras que en la respuesta inmune celular, los linfocitos T CD8+ citotóxicos activados migran al sitio del tumor para reconocer y matar a la célula tumoral. (Tomada de Bermúdez-Morales, et al. 2005). 14 2.5 Citocinas como terapia génica contra el cáncer Gran parte de los mecanismos de la respuesta inmune en contra de tumores están regulados por una serie de mediadores de respuesta llamadas citocinas; las cuales son proteínas de bajo peso molecular secretadas por una gran variedad de tipos celulares. Estas proteínas trabajan de manera autócrina o parácrina para regular la mayoría de las actividades celulares, y son importantes en la regulación de la proliferación y diferenciación de las células de respuesta inmune. 15,19, 21 Las citocinas IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 y el factor estimulador de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF) se han utilizado preferentemente como inmunoterapia contra el cáncer.21 Estas citocinas promueven la activación de linfocitos T contra antígenos tumorales, activan la respuesta inmune no especifica e inducen la expresión de otras citocinas activadoras. Además, pueden activar varias células de la respuesta inmune como: las células NK, monocitos y macrófagos. Estas citocinas favorecen la presentación de los antígenos específicos del tumor por parte de las propias células malignas. Sin embargo, la inmunoterapia con citocinas como activadores de la respuesta inmune está asociada con la vida media de estas citocinas y con la actividad tóxica a nivel sistémico. Por lo tanto, se deben buscar estrategias para evitar la toxicidad de estas citocinas.15 2.5.1 Interleucina 12 La interleucina 12 es una proteína heterodimérica conformada por dos subunidades las cuales son unidas por un puente disulfuro para formar la proteína bioactiva IL-12p70. Es una de las primeras citocinas que se producen en presencia de un antígeno y juega un papel importante en la respuesta Th1. La interleucina 12 es secretada exclusivamente por células presentadoras de antígeno, como las células dendríticas (DC), monocitos y macrófagos y es importante en la activación y proliferación de NK y células T.20,21 La IL-12 es una citocina que por sus propiedades como inmunomodulador de la respuesta celular y de la actividad antitumoral se ha usado ampliamente en la terapia 15 génica en diversos tumores murinos.34 La IL-12 ha sido demostrada como uno de las citocinas antitumorales más potentes en modelos tumorales, incluyendo cáncer de pecho, colon riñón, ovario, pulmón, cerebro, fibrosarcoma y melanoma. 30,31,35 Es probable que la IL-12 sea una de las citocinas que más se usa como terapia génica contra el cáncer cervical.15,26 EL tratamiento con el gen de IL-12 se ha empleado usando la terapia génica no viral, como liposomas21, terapia génica viral con el uso de adenovirus, terapia génica ex vivo, y en combinación con los oncogenes E6 y E7.15 El efecto de represión del crecimiento tumoral se observa en todos los casos. Además, la IL-12 es capaz de inhibir la formación de metástasis experimentales y se considera como un buen candidato para el tratamiento basado en la terapia génica contra el cáncer cervical.31,15 El efecto antitumoral de IL-12 es dependiente de la activación y proliferación de los linfocitos T CD8+ citotóxicos, y del aumento en la producción de IFN-γ en el sitio de inmunización, el cual es producto de la activación de las células NK.21 El interferón gamma (IFN γ) es un mediador en la resistencia viral, fúngica, bacteriana y parasitaria, la inducción de IL-12 por los productos microbianos es un potente estímulo para el INF, lo que hace que la infección por estos agentes rápidamente controlada por el organismo; si esta respuesta no es controlada, la síntesis de IL-12 pude resultar en una activación excesiva del sistema inmune lo que causa daño en el tejido del huésped y hasta la muerte, esto ocurre en las enfermedades autoinmunes durante el curso de infecciones microbianas en el shock séptico. 20,26 A pesar de esto, los efectos biológicos bien documentados indican que tiene un gran potencial para ser un compuesto terapéutico efectivo21,31,34,36 incitando a la investigación hacia nuevos métodos de liberación de IL12 para evitar su toxicidad. 35 Una de las medidas ideadas para disminuir la toxicidad ocasionada por la administración sistémica de la IL-12, es el empleo de estrategias de terapia génica que permitan la transferencia local, en el seno del propio tumor o en la vecindad del mismo, con el fin de conseguir elevados niveles locales de la citocina a la vez que una mínima liberación sistémica. Con este fin se han empleado diferentes vectores basados en virus y también vectores físicos o no virales.26 16 Es por este motivo que se propone desarrollar una estrategia terapéutica para inhibir el estado de inmunosupresión local y favorecer la activación de la respuesta inmune de tipo celular por el uso del gen de la interleucina 12 (IL-12). 2.6 Terapia génica La terapia génica consiste en el tratamiento, prevención o eliminación de alguna enfermedad mediante la transferencia de ADN o el uso de genes para reemplazar algún gen que esté alterado, que codifique para un antígeno de origen infeccioso, tumoral, o para moléculas inmunoreguladoras de la respuesta inmune como: citocinas y quimiocinas. Adicionalmente la terapia génica tiene un potencial para el tratamiento de trastornos genéticos, enfermedades autoinmunes, enfermedades metabólicas, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y cáncer. 15 Diferentes estrategias se han implementado para garantizar el éxito de la expresión de los genes, sin embargo es importante el tipo de células a donde está dirigido el gen, la expresión transitoria y prolongada de la expresión y la seguridad del vehículo que transporta el material genético. Existen dos tipos de vehículos mediante los cuales se introduce el material genético exógeno en las células: los vehículos virales y los vehículos no virales.8,29,37 -Terapia génica viral: introduce el material genético a las células susceptibles por un mecanismo de infección viral, característica que brinda una mayor capacidad de transgénesis y expresión del gen terapéutico. Adicionalmente, los virus se pueden manipular genéticamente con la finalidad de introducir genes ectópicos al genoma viral, favoreciendo la infección y replicación negativa. Esto favorece que los virus sólo sirvan de vehículos para liberar material genético a las células susceptibles de infectar y no generen infección o enfermedad. -Terapia génica no viral: La terapia génica no viral, emplea sólo el material genético para ejercer el efecto biológico, pero tiene menor capacidad de transgénesis. Generalmente es inocuo para el organismo y pueden ser combinados con vehículos de liberación para aumentar la transgénesis y favorecer la expresión génica. En este contexto, los polímeros catiónicos están siendo ampliamente usados como vehículos de 17 liberación de ADN, ya que es muy fácil lograr que el ADN se una al polímero, actualmente entre los polímeros más estudiados se encuentran la poli-L-lisina (PLL), el polietilenglicol (PEG), la espermidina, la cobaltohexamina y el chitosano. 18,24,39 2.6.1 Chitosano El chitosano es un polisacárido catiónico de origen natural, no tóxico, biodegradable, biocompatible, no inmunogénico, mucoadherente, antimicótico y de bajo costo. Está constituido por subunidades de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina (Figura 6) que se encuentran distribuidas de forma aleatoria a lo largo del polímero. 39 El chitosano es obtenido de la quitina presente en el exoesqueleto de todos los artrópodos y es el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. Se obtiene mediante un proceso de desacetilación de la quitina. El chitosano favorece la formación de complejos con el ADN, encapsulándolo y protegiéndolo de su degradación por nucleasas y es considerado como un excelente vehículo para liberación de genes.22,23, 24 Figura 6. Estructura del chitosano. (Tomada de Park T. G. et al, 2006) 18 2.6.2 Formación de complejos de chitosano/ADN Debido a que el chitosano cuenta con un pKa de 6.5, a pH ligeramente ácido sus grupos amina se encuentran protonados, lo que le confiere una densidad de carga positiva y le permite interactuar con los grupos fosfato del ADN que cuentan con una densidad de carga negativa; de este modo se favorece la formación de complejos de chitosano/ADN. Durante el proceso de formación de complejos, el ADN se condensa en estructuras más pequeñas y se cree que se encuentra en el interior del complejo, de este modo los complejos cuentan con una densidad de carga positiva, debido a los grupos amina que se encuentran expuestos en la superficie del complejo.23,24 2.6.3 Mecanismo para la liberación de genes. La unión de los complejos chitosano/ADN con la membrana celular se ve facilitada por densidad de carga positiva con la que cuentan los complejos de quitosano/ADN, la captación celular de los complejos de chitosano/ADN se lleva a cabo por endocitosis, donde el escape endosomal de los complejos chitosano/ADN podría ser una limitante en la transcripción.22,39 Adicionalmente la degradación de los complejos de chitosan/ADN es un factor determinante en la eficiencia de transfección, dependiendo de la velocidad a la que se degrade el complejo, será la velocidad a la que se libere el ADN encapsulado y por ende la expresión de los genes. 24 19 3. Justificación El cáncer cervical (CaCu) representa en la actualidad un gran problema de salud pública en el mundo ya que representa la segunda causa de mortalidad generadas por neoplasias en mujeres. A pesar de que se han desarrollado vacunas profilácticas contra la infección por el VPH, para determinar su eficacia sobre la incidencia y mortalidad por CaCu asociada al virus, se requiere de un seguimiento a largo plazo. Además los casos actuales de lesiones pre-malignas y malignas del cérvix no serán protegidos por estas vacunas profilácticas; por lo tanto se deben desarrollar sistemas terapéuticos adicionales para la población. La IL-12 ha sido demostrada como uno de las citocinas antitumorales más potentes en modelos tumorales, sin embargo la administración sistema de la IL-12 produce toxicidad, por lo que se ha propuesto que el uso del gen de la IL-12 mediante terapia génica no viral, reduce significativamente los efectos tóxicos, ya que su expresión local es mucho menor que la aplicación de la proteína a nivel sistémico. En este contexto el chitosano es un excelente polímero que por sus propiedades biológicas lo hacen un excelente vehículo para encapsular ADN y protegerlo de su degradación. En este sentido se propone una estrategia terapéutica dirigida a una aplicación tópica, no invasiva y de liberación prolongada mediante terapia génica no viral usando nanotecnología. Para ello se empleará el chitosano como un vehículo para encapsular al ADN plasmídico que lleva el gen de la IL-12. Esta estrategia está visualizada para ser aplicable en lesiones precancerosas del cérvix y como una alternativa a los tratamientos convencionales de los pacientes, que permitirá favorecer la activación de la respuesta inmune y evitar las recurrencias o progresión de las lesiones cervicales. 4. Hipótesis La aplicación de complejos de chitosano acoplados con el gen de la IL-12 en un modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo, favorecerá la activación de la respuesta inmune y se reflejará en la disminución de la expresión del oncogén E7. 20 5. Objetivos 5.1 Objetivo general Determinar el efecto antitumoral del gen de la IL-12 acoplado a chitosano en un modelo experimental tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo. 5.2 Objetivos particulares Generar complejos de chitosano acoplados al ADN plasmídico pNGVL3-mIL12. Evaluar el efecto antitumoral de los complejos chitosano/ pNGVL3-mIL12 en un modelo tumoral murino VPH 16 positivo. 6. Metodología Etapas del trabajo experimental: 1. Purificación de los plásmidos pNGVL3-mIL-12 y pcDNA3. 2. Realización de complejos de chitosano de bajo peso molecular acoplados al plásmido pNGVL3-mIL-12. 3. Cultivo de la línea celular BKMK-16/myc. 4. Desarrollo de un modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo. 5. Inmunización de los complejos chitosano/pADN en el modelo tumoral murino VPH 16 positivo en cérvix y detección de la expresión de la oncoproteína E7 (Figura 7). 21 Chitosano de bajo peso molecular (0.5%) Purificación de los plásmido pNGVL3-mIl12 y pcDNA3 (E. coli DH5α) Generar complejos de chitosano/pADN Aplicar en un modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo Detección de la expresión de la oncoproteína E7 Evaluar el efecto antitumoral de la IL-12 acoplado a chitosano, en un modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo Figura 7. Diseño experimental 22 6.1. Purificación de los plásmidos En medio LB suplementado con kanamicina (50 mg/ml) se cultivaron bacterias DH5 α de E. coli trasformadas con el plásmido pNGVL3-mIL-12, el cual contiene las dos subunidades (p40 y p35) del gen de la IL-12 de ratón regulado por el promotor de CMV (Anexo 1). El cultivo se mantuvo en agitación constante a 150 rpm a 37°C durante toda la noche. El plásmido fue purificado con un kit comercial libre de endotoxinas (QIAfilterplasmid mega kit, Qiagen, HildenGermany). De igual manera se purificó el plásmido pcDNA3, el cual es un plásmido vacío que no tiene genes terapéuticos insertados. Como antibiótico de selección para este plásmido se utilizó ampicilina (50 mg/ml) (Anexo 2). Posteriormente, la concentración de los plásmidos purificados se determinó espectrofoto-métricamente midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260/280nm mediante un equipo NanoDrop Lite (Thermoscientific). La integridad de los plásmidos se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.9% (Anexo 3). Los plásmidos se almacenaron a -20°C para su posterior uso. 6.2. Complejos de chitosano acoplados al plásmido pNGVL3-mIL-12 Los complejos chitosano/pADN se preparados por el método de coacervación, en el que un polímero en solución acuosa es separado en dos fases inmiscibles: una fase coacervada (complejos) y otra fase en equilibrio. El chitosano es insoluble en medios alcalinos, por lo que precipita cuando se pone en contacto con una solución alcalina como el sulfato de sodio (Na2SO4), el cual funge como agente coacervante. 8 Se prepararon soluciones de chitosano de bajo peso molecular al 0.50 % con ácido acético (p/v) (CH3COOH) y se agitó por una hora. Posteriormente, el ADN plasmídico fue diluido en Na2SO4, usando una concentración total de 33 g, en un volumen final de 100 µl. Los complejos de chitosano/pADN se formaron, mezclando: el chitosano al 0.50 % en solución con CH3COOH y el pADN en solución con Na2SO4, en relación 1:1 (v/v), después la mezcla se colocó en agitación por una hora (Anexo 4). Los complejos (fase de coacervación) fueron recuperados por centrifugación y resuspendidos en agua 23 desionizada, la cantidad de ADN en el sobrenadante (fase de equilibrio) fue cuantificada espectrofotométricamente con el fin de determinar la cantidad de ADN libre sin encapsular. La formación de los complejos se analizó mediante un ensayo de retardación en gel de agarosa al 0.9%. Determinación del porcentaje de retención: El porcentaje de retención (% de ADN encapsulado por el chitosano) se determinó utilizando la siguiente fórmula: %R= (pADNTotal – pADN Libre/pADN Total) x 100 Donde: %R= Porcentaje de retención pADN Total= Cantidad total de pADN pADN Libre= Cantidad de pADN sin encapsular 6.3. Cultivo de la línea celular BMK-16/myc La línea celular murina BMK-16/myc donada por la Dr. Sophie Hallez (Université Libre de Buxelles, Rhode-saint-genése, Bélgica) fue generada por cotransformación con el genoma del VPH 16 y el proto-oncogen c-Myc, la línea expresa constitutivamente los oncogenes E6 y E7. Esta línea se cultivó en medio mínimo esencial DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium, Gibco) suplementado con 5% de suero bovino fetal (BY productos), 1 ml/100ml de estreptomicina (Caisson) y 1 ml/ lt de fungizona (Gibco), a 37°C, 5% de CO2, y una humedad del 95% (incubadora Sanyo) (Anexo 5). 6.4. Desarrollo del modelo tumoral Se utilizaron ratones hembra de la cepa Balb/c de seis semanas de edad. Las ratonas se obtuvieron de la Unidad del Bioterio del INSP, cuya cepa proviene del The 24 Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine USA). A las ratonas previo a la administración de las células BMK-16/myc, se les generó una lesión en el cérvix mediante un “microbrush” (aplicador desechable) en presencia de 30 μl de ácido acético al 50%. Un día después de generar la lesión, se administraron 2.5X10 5 células BMK-16/myc en el cérvix utilizando una micropipeta, en un volumen máximo de 20 μl. (Anexo 6). El crecimiento tumoral en el cérvix de las ratonas, se determinó midiendo la expresión del oncogén E7, el cual es expresado por las células BMK-16/myc. Adicionalmente, se obtuvo el aparato reproductor de las ratonas a diferentes tiempos para observar cambios morfológicos del tejido. 6.5. Inmunización de los complejos chitosano/pADN en el modelo tumoral murino VPH 16 positivo en cérvix y detección de la expresión de la oncoproteína E7 Transcurridos cinco días después de la aplicación de las células BMK-16/myc (tiempo necesario para que se exprese el oncogén E7 en el cérvix, a partir de raspados), a ratones hembra de la cepa Balb/c, se les administró chitosano/pADN (día 0). Se inocularon 5 µg de complejos chitosano/pADN (bajo peso molecular) utilizando una micropipeta. Se establecieron 3 grupos de ratones (n=20): 1. Grupo A: Inoculado con células BMK-16/myc (control). 2. Grupo B: Inoculados con células BMK-16/myc, e inmunizados con células BMK-16/myc, e inmunizados con chitosano/pADN-IL12. (5µg). 3. Grupo C: Inoculados con chitosano/pcDNA3. (5µg). A las ratonas se realizaron raspados cervicovaginales con un “microbrush” para obtener células cervicovaginales del tejido y estás se resuspendieron en 50 µl de PBS 1x. Los raspados cervicales se tomaron a 24, 48, 72 horas después de la inmunización de chitosano/pADN. A partir los raspados se obtuvo el ARN por el método de TRIzol 25 (Anexo 7) para realizar RT-PCR-tiempo real y detectar la expresión del ARN mensajero de la oncoproteína E7 como producto de las células tumorales (BMK-16/myc) (Figura 8). Día 0 Día -7 Día -6 Día -5 Lesión cervical Día-4 4 Día -3 Día-2 Día 1 (24 h) Día 2 (48 h) Día 3 (72 h) Inmunización de los grupos B y C. Administración de células BMK-16/myc a todos los grupos (A, B y C) Raspado cervical, extracción de RNA y detección de la expresión de la oncoproteína E7. Figura 8. Esquema de actividades. La reacción de RT-PCR en tiempo real para medir la expresión del oncogén E7 del VPH 16, se realizó usando el kit de un sólo paso (GoTaq® 1-Step RT-Qpcr System) mediante el protocolo de Promega y una sonda comercial TaqMan diseñada para la oncoproteína E7 de VPH 16 (Tabla 2) (AppliedBiosystems). Brevemente, las reacciones se llevaron a cabo usando 200 ng de RNA, 5 µl master mix 2X, 0.25 µl de RT (Go Script RT-mix) 0.5 µl de mezcla de sonda TaqMan para E7, en un volumen final de 10 µl. Adicionalmente, se amplificó el gen GAPDH, el cual se utilizó como control endógeno. 26 Tabla 2. Oligonucleótidos y sonda Taqman utilizadas para el RT-PCR tiempo real Gen Secuencia GAPDH Mm00484668_m1 Sonda Tamaño FAM: CTACGCTTCGGTTGTGCG 91 pb F: CCGGACAGAGCCCATTACAATAT E7 (VPH16) R: GAATGTCTACGTGTGTGCTTTGT Las reacciones se llevaran a cabo en placas de 384 pozos con las siguientes condiciones: Etapa de mantenimiento: 37°C - 15 seg 95°C - 10 min Etapa de ciclado (40 ciclos): 95°C - 10 seg 60°C - 30 seg 72°C - 30 seg El análisis de la expresión cuantitativa de cada gen se realizará mediante el método comparativo CT (Método 2-ΔΔ Ct), este método permite determinar la expresión de los niveles de ARNm de un grupo de células o tejidos respeto a una referencia (control o condición experimental). Para la cuantificación relativa debe tenerse en 27 cuenta que todas las muestras provienen de individuos diferentes; por tanto, debe realizarse un procedimiento conocido como normalización, con un gen control endógeno (constitutivo), para eliminar la variabilidad entre muestra y muestra, en este trabajo se utilizó GAPDH. Este cálculo se realiza relativo a un grupo que se considera calibrador, (grupo de ratonas con células tumorales sin tratamiento) donde: Δ CT = CT promedio del grupo de muestras para el gen de interés (Grupos de ratonas con células tumorales y con administración de tratamiento) – CT promedio del grupo de muestras para el constitutivo (GAPDH). Δ ΔCT = ΔCT grupo calibrador (grupo de ratonas con células tumorales sin tratamiento) – ΔCT grupo de interés (grupo de ratonas con células tumorales y con tratamiento). Por tanto, después de la normalización de los datos respecto al gen constitutivo (Δ CT) se selecciona un grupo que funciona como calibrador del experimento y los datos del resto de los grupo se comparan con el grupo calibrador tendrá el valor de 1 y el resto de los grupos, un valor menor o mayor lo que proporciona un valor semicuantitativo.40 Adicionalmente, se extrajo el aparto reproductor del grupo de ratonas que sólo fueron inoculadas con células BMK-16/myc a la a diferentes intervalos de tiempo con la finalidad de ver cambios morfológicos debido a la implantación tumoral. 28 7. Resultados 7.1 Purificación de los plásmidos pNGVL3-mIL-12 y pcDNA3 Los plásmidos pNGVL3-mIL12 y pcDNA3 fueron purificados a través de un kit de Qiagen (ver metodología). En la figura 9 muestra un gel de agarosa al 0.9% donde se visualiza la integridad de los plásmidos purificados; el peso molecular del plásmido pNGVL3-mIL12 es de 6 247 pares de bases y el del plásmido pcDNA3 es de 5 446 pb los cuales fueron corroborados al compararlos con el marcador de peso molecular. Figura 9. Purificación del plásmido pNVGL3-mIL12 y pcDNA3 1) Marcador de alto peso molecular ( DNA Ladder, MDR 10 CAISSON), 2) Plásmido pcDNA3 (5 446 pb). 3) Plásmido pNGVL3-IL12 (6 247pb). 7.2 Formación y caracterización de los complejos chitosano/pADN Para determinar la capacidad de encapsulamiento del ADN por el chitosano, se midió la eficiencia de encapsulamiento (%R) de manera indirecta mediante espectrofotometría. Se cuantificó la cantidad de plásmido sin encapsular (sobrenadante), infiriendo la cantidad de plásmido encapsulado por el chitosano. La 29 cantidad inicial de ADN plasmídico inicial fue de 33 µg, y la eficiencia real de ADN encapsulada por el chitosano fue determinada de la siguiente manera: %R = (pADNTotal – pADNLibre)/pADNTotal X 100. Se determinó la eficiencia de encapsulamiento del plásmido pNGVL3-mIL12 y del plásmido pcDNA3 en tres ensayos independientes. Para el plásmido pNGVL3-mIL12 la eficiencia de encapsulamiento por el chitosano fue del 92.2% al 98.2%, con una media de 95.2% y del plásmido pcDNA3 la eficiencia de % de DNA encapsulado encapsulamiento fue del 86.51% al 98.29 % con una media de 94.75 % (Figura 10). 100 80 60 40 20 0 pNGVL3-mIL12 pCDNA3 Plásmidos Figura 10. Eficiencia de encapsulamiento de los plásmidos pNGVL3-mIL12 y pcDNA3, por chitosano de bajo peso molecular al 0.50%. Por otro lado, se caracterizaron los complejos chitosano/pADN formados mediante un ensayo de retardamiento en gel de agarosa al 0.9%. En la figura 11, se observa en los carriles 1 y 2 el corrimiento electroforético del ADN plasmídico, donde se observa la integridad del pADN migrando de acuerdo a su peso molecular. En el carril 3, se observa la integridad y movilidad electroforética del pADN no se ven afectadas por el tratamiento con Na2SO4 el cual es usado para aumentar la carga (-) del ADN. Por otro lado, cuando el pADN es encapsulado por el chitosano, los complejos chitosano/pADN son retenidos y no migran a través del gel debido a su peso molecular (carriles 6 y 10). La cantidad de pADN sin encapsular es tan pequeña que no es posible ser visualizada en el gel (carril 7, 8 y 9), sin embargo es cuantificable espectrofotométricamente. 30 Figura 11. Ensayo de retardamiento en gel de agarosa al 0.9% de los complejos chitosano/pADN. A) Complejos de chitosano con el plásmido pNGVL3-mIL12. B) Complejos de chitosano con el plásmido pcDNA3. 1) Marcador de Peso Molecular (DNA Ladder, MDR 10 CAISSON), 2) ADN plasmídico, 3) ADN plasmídico + Na2SO4. 4) Chitosano, 5) Chitosano + Na2SO4. 6) Complejo de chitosano/pADN, 7) sobrenadante, 8) Complejo chitosano/pADN (lavado 1), 9) Complejo chitosano/pDNA (lavado 2). 10) Complejo chitosano/pDNA (puro). Gel de agarosa al 0.9% teñido con BrEt y expuesto a luz UV, se observa pDNA y complejos chitosano/pADN. 31 7.3 Desarrollo del modelo tumoral murino en cérvix VPH 16 positivo Para generar el modelo tumoral murino en cérvix VPH16 positivo, se tomó como base un modelo tumoral generado en la vagina de ratas donde se implantó una línea tumoral de melanoma.25 Después de generar el modelo tumoral murino VPH 16 postivo y con el objetivo de verificar la masa tumoral y el desarrollo de un modelo tumoral en los grupos de ratonas, se realizó la extirpación del aparato reproductor de las ratonas después de la aplicación de las células BMK16/myc. En la figura 12 se muestran fotografías representativas de la región vulvoperineal de tres ratonas, donde es evidente la inflamación en esta zona en el aparato reproductor extirpado. Se observa que desde el día 5 posterior a la aplicación de las células BMK-16/myc, se observan cambios morfológicos de la región cérvico vaginal aunque mínimos. No obstante, son más evidentes los cambios morfológicos del tejido reproductor a los 10 días y 30 días posteriores a la administración de las células tumorales. Notablemente, a esos días se observa el crecimiento de una masa tumoral en la región cervicovaginal, así como un aumento en el tamaño en los cuernos uterinos, lo cual es evidente cuando se compara con la morfología de un aparato reproductor de una ratona sin lesión. 7.4 Efecto antitumoral de IL-12 Para medir el efecto antitumoral, se monitoreó el crecimiento tumoral mediante la expresión del oncogén E7 (oncogén que es expresado por las células tumorales, BMK16/my) en raspados cérvico vaginales a los tiempos de 24, 48 y 72 horas posteriores al tratamiento. La expresión del gen de E7 se comparó con el grupo de ratonas con lesión cervical VPH 16 positivas sin ser tratadas con los complejos chitosano/pADN-(IL-12). El análisis de la expresión del oncogén E7 se realizó por RT-PCR tiempo real, además previamente se midió la expresión del gen de GAPDH como gen constitutivo para realizar la cuantificación relativa de la expresión génica, usando el método de 2-ΔΔ Ct (ver materiales y métodos). Como grupos control se utilizaron ratonas Balb/c sin tratamiento y otro grupo de ratonas con tumor tratadas con el plásmido pcDNA3, el cual es un plásmido que no contiene genes terapéuticos insertados. 32 En la figura 13 muestra las curvas de expresión de los genes de GAPDH y E7. Se observan curvas de amplificación muy claras de la expresión de ambos genes. Para realizar el análisis e interpretación de los resultados, la expresión de E7 de VPH 16 fue normalizado con el gen de GAPDH y comparada la expresión con el calibrador. El análisis de la expresión de E7 muestra que bajo significativamente a las 24 horas posteriores al tratamiento con el chitosano/pADN-IL-12. Sin embargo, a las 48 horas la expresión del oncogén E7 presentó un ligero aumento, pero disminuyó notablemente a las 72 horas (es muy clara la baja expresión del oncogén E7 por el tratamiento con el gen de IL-12 respecto a la expresión inicial, figura 14a). No obstante, el grupo control correspondiente a ratonas con tumor y sin tratamiento, se observó un aumento significativo de la expresión de E7, a las 24 y 48 horas (65 veces más respecto al tiempo cero) y una ligera disminución al tiempo de 72 (figura 14,b). Por otro lado, en el grupo control referido como ratonas con tumor y tratadas con complejos de chitosano/pcDNA3, no se detectaron cambios aparentes en la expresión de E7 a las 24 y 48 horas posteriores al tratamiento comparado con el tiempo 0, pero si se detectó baja expresión de E7 a las 72 horas (Figura 14,c). 33 1. Ovarios 2. Cuernos de Falopio 3. Vejiga 4. Cavidad cervicovaginal Figura 12. Biopsias del aparato reproductor de ratonas Balb/c posterior a la generación de modelo de CaCu A) Aparato reproductor sin inoculación de células tumorales, B) cérvix extraído a los 5 días, C) cérvix de ratona extraído a los 10 días. D) cérvix de ratona extraído a los 30 días Se observan un crecimiento anormal en la cavidad cérvico vaginal; se observan cambios muy claros en la morfología y en la coloración del tejido. Los cambios son progresivos, entre mayor pasa el tiempo se observa crecimiento indicando que es resultado de un proceso neoplásico. 34 . Figura 13. RT- PCR en tiempo real para detectar la expresión de los genes GAPDH y E7 A) Grupo de ratonas con complejos pNGVL3-mIL12, B) Grupo de ratonas sin plásmido (sólo con tumor) y C) Grupo de ratones con complejos pcDNA3. 35 Expresión de E7. Tratamiento chitosano/pNGVL3-mIL12 Fig. 14, a Expresión relativa 2 1.5 1 0.5 0 0 24 Tiempo (Horas) 48 72 Fig. 14, b Expresión relativa Fig. 14, c Expresión de E7 . Grupo control. Chitosano/pcDNA3. 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 24 48 72 Tiempo (Horas) Figura 14. Expresión del oncogén E7 A) Grupo con complejos chitosano/pNGVL3-mIL12, B) grupo control: sin aplicación de complejos, C) grupo control: aplicación de los complejos chitosano/ pcDNA3. 36 8. Discusión El cáncer cervicouterino (CaCu) representa un grave problema de salud pública a nivel mundial, por lo tanto se deben intensificar esfuerzos para mejorar los sistemas de diagnóstico, control y tratamiento de esta neoplasia. En este sentido, el presente trabajo pretende ser un acercamiento para el desarrollo de una estrategia terapéutica, como tratamiento para lesiones cervicales precancerosas asociadas a la infección por el virus del papiloma humano. Se propuso una estrategia terapéutica dirigida a los estadios precancerosos y como una alternativa a los tratamientos convencionales de los pacientes, que permitirá favorecer la activación de la respuesta inmune y evitar recurrencias o progresión de las lesiones cervicales. Para ello se empleó el chitosano como un vehículo para encapsular al ADN plasmídico que lleva el gen de la IL-12 y aplicarlo en un modelo tumoral murino VPH 16 positivo. Se realizaron complejos chitosano/pADN que fueron preparados por el método de coacervación y, caracterizados considerando la eficiencia de encapsulamiento, en un ensayo de retardamiento en gel. En relación a la eficiencia de encapsulamiento, se obtuvo una media de 95% para el plásmido pNGVL3-mIL12 (6.2 Kb) y un 94% para el plásmido pcDNA3 (5.4 kb), demostrando que el chitosano es un muy buen polímero para encapsular ADN plasmídico ya que muestra altos porcentajes de captación. Se demostró que la integridad del ADN plasmídico no fue afectada por el proceso de preparación de los complejos. El análisis electroforético de los complejos y los productos intermediarios de los procesos, demostraron que la integridad y movilidad electroforética del ADN plasmídico no se afectan por el tratamiento con Na 2SO, el cual es usado para aumentar la carga (-) del ADN (Figura 11). Cuando el ADN plasmídico es encapsulado por el chitosano, se forman complejos que impiden que el ADN sea liberado, por lo que en los geles de agarosa se detecta al ADN plasmídico en el pozo de carga del gel encapsulado por el chitosano y el cual es incapaz de migrar a través del gel. La concentración del ADN plasmídico sin encapsular es tan pequeña que no es posible ser visualizada en el gel. Estos resultados demuestran que el chitosano es un polímero que tiene capacidad de encapsular al ADN plasmídico con alta eficiencia. Aunado a esto, se sabe que el chitosano tiene la capacidad de ser biodegrado a un pH 37 ácido (6 a 5),8 esta característica favorece la liberación del complejo chitosano/IL-12 en el cérvix del modelo tumoral murino, ya que el pH de la mucosa cervical es ácido (alrededor de pH 4.5), lo cual permitiría que los complejos presentes en esta cavidad, pueden ser desacoplados y liberar al ADN. En este trabajo se desarrolló un modelo de cáncer cervicouterino en ratonas Balb/c inmunocompetentes mediante la implantación de células transformadas con el genoma completo del virus del papiloma humano y con la expresión de los oncogenes E6 y E7 (BMK-16/myc).25 Se extirpó el aparato reproductor de ratonas para poder obtener una imagen clara del crecimiento de la masa tumoral. El análisis macroscópico del aparato reproductor de las ratonas, demostró evidente inflamación en la región cervicovaginal y en los cuernos uterinos, así como el crecimiento de una masa tumoral en la región cervical, la cual es evidente cuando se compara con la morfología de un aparato reproductor de una ratona sin lesión. Cabe mencionar que aunque no es objetivo del presente proyecto, se están evaluando a nivel histopatológico los tumores generados en la región cérvico-vaginal. Adicionalmente, se evaluó el efecto antitumoral del gen de IL-12 aplicado mediante complejos chitosano/pADN. El efecto antitumoral del gen de IL-12 sobre el modelo de lesión en cérvix se evaluó de una forma indirecta. Se detecto la expresión del oncogén E7 en raspados cervicovaginales de ratonas con tumor tratadas con el gen de IL-12 a diferentes tiempos mediante RT-PCR tiempo real. Los niveles de expresión de E7 se compararon con los detectados por los ratones control (sin tratamiento y con células BMK-16/myc). En el análisis de expresión, el oncogén E7, disminuye significativamente por el tratamiento de los complejos de chitosano/pADN-IL12. La determinación de la expresión de E7 en los tiempos evaluados, representa grupos de ratonas independientes, por lo que se registró diferente respuesta de los grupos de ratonas al tratamiento. Bajo esta observación al tiempo de 24 horas posterior al tratamiento con chitosano/pADN-IL-12, se detectó baja expresión del oncogén. No obstante, a las 48 horas se detectó que la expresión del oncogén aumenta ligeramente y disminuye nuevamente a las 72 horas, la expresión es mucho menor que la detectada en las ratonas sin tratamiento (tiempo cero). Esta expresión hace referencia al efecto transitorio del tratamiento de los complejos chitosano/pADN-IL-12, y que posiblemente a 38 las 24 horas se da el mejor efecto atitumoral de los complejos. Sin embargo se tiene que medir otros marcadores tumorales para confirma esta hipótesis, lo cual plantea la posibilidad de usar mayores dosis del gen de IL-12 o dosis repetidas para garantizar mayor efecto antitumoral y prolongar su efectividad. Por otra parte en el grupo de ratonas con tumor y sin tratamiento, se observó claramente que hay un notable aumento en la expresión del oncogén E7, como es de esperarse. A las 24 y 48 horas se observa un aumento realmente significativo, 60 veces más, respecto al grupo control del día 0, sin embargo a las 72 horas se muestra una disminución en la expresión del oncogén. Particularmente en este tiempo (72 horas), se tuvieron algunos contratiempos metodológicos. La calidad del RNA obtenido no fue muy buena, por lo cual se detectaron ciclos de amplificación muy tardíos lo que repercute en el análisis de la expresión, bajando la expresión de todo el grupo de ratonas control a este tiempo; por lo tanto es necesario repetir experimentalmente este grupo para que de esta manera los resultados sean confiables. Sin embargo la tendencia es el aumento muy significativo de la expresión de este oncogén, en este grupo de ratonas control, detectando hasta 60 veces más la expresión del oncogén E7 comparada con el grupo de ratonas con el tumor inicial. Finalmente, en el grupo control referido como ratonas con tumor y tratadas con complejos de chitosano/pcDNA3, no se detectaron cambios aparentes en la expresión de E7 a las 24 y 48 horas posteriores al tratamiento comparado con el tiempo 0, pero si se detectó baja expresión de E7 a las 72. Los resultados en este grupo de ratonas fueron inesperados ya que se esperaba no disminuir la expresión del oncogén E7. Al analizar el plásmido pcDNA3 se encontró que presenta secuencias CpGs,32 las cuales son consideradas como secuencias inmunoreguladoras que pueden favorecer la expresión de citocinas con INF gamma. Si este efecto fue generado en el modelo tumoral, podría explicar en parte que active a esta citocina con propiedades inmunoreguladoras y ejerza actividad de la respuesta inmune y por ende reduzca el tumor. Sin embargo, esta hipótesis debe ser demostrada o simplemente se tendría que repetir este ensayo para determinar su reproducibilidad. Con estos resultados se demostró que la administración del tratamiento de chitosano/pADN-IL12 en modelos tumorales murinos en cérvix VPH 16 positivos 39 muestra una significativa disminución en la expresión del oncogén E7 por lo tanto tiene un efecto antitumoral. Lo cual concuerda con reportes en dónde se demuestra la capacidad de la IL-12 para inducir la regresión tumoral y el desarrollo de inmunidad antitumoral en estudios preclínicos en ratones.30,31 Sin embargo, no se logró abatir totalmente la expresión del oncongén E7 en el modelo tumoral, debido posiblemente a que las cantidades administradas no fueron suficientes; de esta manera se sugiere aumentar la concentración del ADN plasmídico pNGVL3mIL-12 como también aumentar el número de dosis aplicadas vía tópica o combinaciones de ambas. 9. Conclusión El tratamiento tópico de chitosano-pADN (IL-12) en un modelo tumoral en cérvix VPH 16 positivo, mostró una notoria represión del oncogén E7, revelando una respuesta antitumoral. Sin embargo, no se elimina por completo la expresión del oncogén E7, lo cual lleva a plantear aumentar la concentración de la dosis terapéutica como también la administración de dosis repetidas. 10. Perspectivas Confirmar la implantación de las células BMK-16/myc en el modelo murino de cáncer cervicouterino mediante histopatología. Medir la expresión de IL-12 en el modelo murino de cáncer cervicouterino después de la aplicación de los complejos chitosano/pADN(IL-12). Evaluar el efecto terapéutico de IL-12 en el modelo murino de cáncer cervicouterino incrementando la dosis terapéutica o el número de dosis. Repetir el grupo control de ratonas con tumor y con chitosano/pcDNA3, para determinar si tiene un efecto inmunomodulador en el modelo tumoral. 40 11. Literatura citada 1. López S. A. y Lizano S. M. (2006). Cáncer cérvicouterino y el virus del papiloma humano: La historia que no termina. Cancerología, 1:31-35. 2. Montalvo E. G., Coronel M. J. A., Alvarado Z. A., Cantú de León D. F., Flores A. D., Ortega R. A., González E. A., Isla O. D., Muñoz G. D. E., Robles F. J. U., Solorza L. G., Mota G. A. L., Gallardo R. D., Morales V. F., Cetina P. M. L. y Herrera G. A. (2011). Oncoguia. 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Cenizas 2.3% Calcio 0.31% Magnesio 0.12% Hierro 0.018% Nitrógeno 0.15% Concentración recomendada 0.8-1.5% Punto de Fusión 84-98°C Punto de Gelificación 32-33°C pH (1.5% a 20°C) 7.0 ±0.5 Dureza del gel (1.5% PN) ≥700 g/cm2 45 Procedimiento Cultivo de E. coli DH5α transformada (con pNGVL3-mIL-12 o pcDNA3) en medio LB sólido. 1. Pesar 6.25 g de medio LB y 3.75 g de medio agar-agar, colocar en un matraz Erlenmeyer y disolver en 250 ml de agua miliQ. con ayuda de un agitador magnético 2. Esterilizar por autoclave. 3. Dejar enfriar y agregar el antibiótico de selección (Kanamicina para pNGVL3mIL-12 y ampicilina para pcDNA3, 50 mg/ml) 4. Distribuir el medio en cajas petri, en presencia de un mechero de bunsen. 5. Incubar a 37°C las cajas Petri con el medio, durante 24 horas (prueba de esterilidad). 6. Estriar las cajas Petri con E.coli DH5 α e incubar 24 horas a 37°C. 7. Seleccionar una colonia y resembrar en una caja nueva. Incubar a 37°C por 24 horas. 8. Almacenar a 4°C la caja estriada con E.coli DH5 α. Preparación de medio LB líquido 1. Pesar 25 g del medio LB y colocar en un matraz Erlenmeyer con 1 litro de agua miliQ, mezclar con un agitador magnético. 2. Distribuir en dos matraces Erlenmeyer y etiquetar. 3. Esterilizar por autoclave. 46 2. Purificación del plásmido pNGVL3-mil-12 y pcDNA3 2.1. Plásmido pNGVL3-mIL-12. 2.2. Plásmido pcDNA3 Estos plásmidos fueron obtenidos del Centro de Vectores de la Universidad de Michigan. 47 2.3. Purificación de los plásmido pNGVL3-mIL-12 y pcDNA3 a través de QIAfilterplasmid mega kit. Reactivos (proporcionados por el kit de Qiagen) Buffer Buffer P1 (buffer de resuspención) Buffer P2 (buffer de lisis) Buffer P3 (buffer de neutralización) Buffer FWB2 (buffer de lavado QIAfilter) Buffer QBT (buffer de equilibrio) Buffer QC (buffer de lavado) Buffer QF (buffer de elución) Buffer QN (buffer de elución) TE STE Composición 50 mM Tris-Cl, pH 8.0; 10mM EDTA; 100 µg/ml RNase A 200 mMNaOH, 1% SDS (w/v) Acetato de potasio 3.0 M, pH 5.5 Acetato de potasio 1 M, pH 5.0 750 mMNaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol (v/v); 0.15% Triton® X-100 (v/v) 1.0 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol (v/v) 1.25 M NaCl; 50 Mm Tris-Cl, pH 8.5; 15% isopropano (v/v) 1.6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol (v/v) 10 mMTris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA 100 mMNaCl; 10 Mm Tris-Cl, pH 8.0; 1mM EDTA. Procedimiento: 1. Seleccionar una sola colonia de una placa selectiva recién estriada e inocular en un pre-cultivo, de 5 a 10 ml de medio LB, conteniendo el antibiótico de selección apropiado. Incubar aproximadamente 8 horas a 37°C con agitación vigorosa (aproximadamente 150 rpm). 2. Diluir el pre-cultivo en 500 ml de medio selectivo LB. Crecer a 37 °C durante 1216 horas con una agitación vigorosa (150 rpm aproximadamente). 3. Extraer las células bacterianas por centrifugación, a 6 000 x g por 15 minutos a 4°C. 48 4. Colocar el cartucho Mega QIAfilter en un frasco de vidrio de 45 mm de diámetro del cuello y conectarlo a una fuente de vacío. 5. Resuspender el pellet bacteriano en 50 ml del buffer P1. 6. Agregar 50 ml del buffer P2, mezclar invirtiendo de 4 a 6 veces, e incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. 7. Agregar 50 ml del buffer P3 frio y mezclar invirtiendo de 4 a 6 veces. Mezclar bien hasta que un material esponjoso blanco haya sido formado y el lisado ya no sea viscoso. Manterner a temperatura ambiente. 8. Colocar el lisado en el cartucho Mega QIAfilter e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. 9. Encender la fuente de vacío. Después de que todo el líquido haya sido recuperado, apagar la fuente de vacío. Dejar unido el cartucho QIAfilter. 10. Agregar 50 ml de buffer FWB2 a el cartucho QIAfilter y mezclar el precipitado usando una espátula estéril. Encender la fuente de vacío hasta que el líquido haya pasado completamente. 11. Colocar el QIAGEN-tip 2500 y colocar 35 ml de buffer QBT y dejar que la columna se vacié por goteo. 12. Aplicar el filtrado del lisado del paso 10 en QIAGEN-tip . 13. Lavar el QIAGEN-tip con 200 ml de buffer QC. 14. Eluir el ADN con 35 ml de buffer QF. 15. Precipitar el ADN, agregando 24.5 ml de isopropanol a temperatura ambiente. Mezclar y centrifugar inmediatamente a ≥15,000 x g por 30 minutos a 4°C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante. 16. Lavar el pellet de ADN con 7 ml de etanol al 70% a temperatura ambiente, centrifugar a ≥15 000 x g por 10 minutos. Cuidadosamente decantar el sobrenadante sin alterar el precipitado. 17. Secar el pellet durante 10 – 20 minutos, y redisolver el ADN en 500 µl de agua ultrapurificada. 49 3. Gel de agarosa 0.9 % Reactivos Agarosa TBE 1%. TBE 10x (para 1 000 ml) Tris base 108 gr Ácido bórico 55 gr Solución EDTA pH: 8.3 Loading buffer 6x. Urea 7.2 mg Azul de bromofenol 10 mg Xilen cianol 10 mg Agua 20 ml Marcador de alto peso molecular (Fermentas Cat. No. SM0111). Bromuro de etidio. Preparación 1. Pesar 0.36 g de agarosa y mezclarlo con 40 ml de buffer TBE 1%. 2. Calentar 1 minuto. 3. Colocar la mezcla en la base de la cámara de electroforesis y esperar a que solidifique. 4. Cubrir el gel con buffer TBE 1%. 5. Cargar las muestras en el gel, previamente mezcladas con el loading buffer 6x, en el siguiente orden: marcador de alto peso molecular, plásmido, complejos de chitosano/ADN. 6. Correr el gel a 120 V durante 35 minutos. 7. Teñir el gel con bromuro de etidio, durante 5 minutos. 8. Observar en el fotodocumentador. 50 4. Complejos de chitosano acoplados al plásmido pNGVL3-mIL-12 y pcDNA3. Reactivos Agua desionizada (H20di). Ácido acético al 2% (CH3COOH) (Sigma –Aldrich). Sulfato de sodio al 20% (Na2SO4) (Merck). Chitosano de bajo peso molecular (C12H24N2O9) (Aldrich). Procedimiento 1. Preparar chitosano al 0.50% en ácido acético al 2% (p/v). 2. Colocar en agitación media por 1h. 3. Colocar 100 µl de chitosano en solución en un vial de 4 ml. 4. Preparar pADN a una concentración de 33 µg en Na 2SO4 en un volumen de 100 µl. Colocar los 100 µl de esta mezcla en el vial de 4 ml que contiene el chitosano en solución. 5. Colocar en agitación media por 1 hora. 6. Transferir todo el contenido a un tubo eppendorf de 0.6 ml y centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. 7. El sobrenadante transferirlo en un tubo eppendorf nuevo y rotularlo con la letra S. 8. Resuspender el precipitado con 100 µl de agua desionizada. 9. Centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante transferirlo en un tubo eppendorf rotulado con la letra L 1. 10. Resuspender el precipitado con 100 µl de agua desionizada. 11. Centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante colocarlo en un tubo eppendorf rotulado con la letra L2. 12. Almacenar el complejo chitosano/pADN a -20°C. 13. Determinar la cantidad de pADN libre (S +L1+L2). 14. Determinar el porcentaje de retención. 15. Correr los complejos de chitosano/ADN en gel de agarosa al 0.9%. 51 5. Cultivo de la línea celular BMK-16/myc Reactivos PBS 1x (1000 ml) 8 g de cloruro de sodio (NaCl). 0.2 g de cloruro de potasio (KCl). 1.15 g de fosfato ácido de sodio (Na2HPO4). 0.2 g de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4). Medio DMEM (500 ml) (Gibco). 6.75 g DMEM. 1.87 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3). 25 ml de suero bovino fetal (BYproductos). 5 ml de estreptomicina (Caisson) 1 ml de fungizona (Gibco). Tripsina al 0.25 % (p/v) 100 ml de PBS 0.25 g de tripsina. EDTA 0.004%. Procedimiento Actividades previas: temperar el PBS y medio DMEM a 37 °C. 1. Retirar perfectamente el medio DMEM de las cajas de cultivo celular. 2. Agregar 10 ml de PBS, lavar y retirar. Repetir. 52 3. Colocar 1 ml de PBS con 200 µl de tripsina e incubar a 37°C durante 10 minutos. 4. Agitar enérgicamente las cajas y verificar que la mayor parte de las células se encuentren desprendidas. 5. Colocar 10 ml de medio DMEM en dos cajas de cultivo celular nuevas, 6. Transferir el contenido del paso 4 a las cajas de cultivo con medio DMEM. 7. Incubar las cajas en una incubadora a 37°C con atmosfera de 5% CO 2 y una humedad relativa del 95 %. 6. Separación de células para la implantación tumoral Reactivos Tripsina al 0.25% (Caisson). PBS 1x. Medio DMEM. (Gibco). Azul de tripano. Procedimiento Actividades previas: temperar el PBS y el medio DMEM a 37 °C. 1. Retirar perfectamente el medio DMEM de las cajas. 2. Agregar 10 ml de PBS, lavar y retirar. Repetir. 3. Colocar 1 ml de PBS con 150 µl de tripsina durante 10 minutos. 4. Agitar enérgicamente las cajas y verificar que la mayor parte de las células se encuentren desprendidas. 5. Transferir la mezcla a un tubo falcón estéril de 15 ml. 6. Centrifugar a 2 000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante. 7. Agregar 5 ml de PBS y resuspender el precipitado por pipeteo. 8. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante. 53 9. Agregar 5 ml de PBS y resuspender el precipitado por pipeteo. 10. Centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante. Mezclar el pellet con 1 ml de PBS. 11. Colocar 100 µl de células en un tubo eppendorf de 0.6 ml y agregar 100 µl azul de tripano (relación 1:1), mezclar, y colocar 100 µl en la cámara de neubauer. Contabilizar los cuatro cuadrantes externos. 12. Hacer los cálculos, para administrar 250 000 células por ratón. 13. Después de 24 horas de la lesión cervical, inocular las células. Formula del conteo celular: No. de células = ∑1,2,3,4 x 2x104= número de células/ ml 4 1,2,3 y 4= El conteo de células en los cuatro cuadrantes de la cámara de Neubauer 7. Extracción de ARN Reactivos Trizol (Roche). Cloroformo (JT Baker). Isopropanol (Herschi Trading). Etanol 75% (Dibar). Agua DEPC (DAIGGER). 54 Procedimiento: 1. Adicionar 1 ml de trizol a los raspados de cérvix. 2. Agitar vigorosamente e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Agregar 200 µl de cloroformo por ml de trizol. 4. Homogenizar en un vortex en incubar 3 minutos a temperatura ambiente. 5. Centrifugar a 12 000 rpm durante 15 minutos a 4° C. 6. Transferir el RNA a otro tubo (es la fase incolora superior). 7. Añadir 500 µl de isopropanol. 8. Incubar -20°C durante 20 minutos. 9. Centrifugar a 12 000 rpm durante 10 minutos a 4°C 10. Eliminar el sobrenadante, lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 75 %. 11. Centrifugar a 10 000 rpm durante 5 minutos a 4°C. 12. Eliminar el sobrenadante. 13. Secar 14. Resuspender en 20 µl de agua c/DEPC. 15. Cuantificar. 55
