LE BIOTECNOLOGIE le tecniche avanzate di biologia molecolare e genetica che prevedono l’utilizzo di organismi viventi al fine di ottenere prodotti utili,manipolando il DNA,si dà anche il nome di ingegneria genetica. Si possono produrre inulina,ormone della crescita,vaccini,enzimi,cellule batteriche,vegetali,animali. Lo sono anche le fermentazioni,in cui si impiegono i lieviti come organismi per ricavare birra,vino,pane,yogurt..i primi furono proprio gli Egizi e da allora l’uomo agisce sulla natura tramite processi di selezione artificiale incrociando individui che manifestano determinati caratteri,piante con più frutti,più grandi,con più fiori,animali che producono di più. DNA RICOMBINANTE cioè sequenze di DNA ottenute artificialmente dalla combinazione di materiale genetico di origini differenti,tramite procedure di isolamento e manipolazione. COME OTTENERE FRAMMENTI DI DNA:ENZIMI DI RESTRIZIONE Dalle molecole di DNA estratte dalle cellule di diversi tessuti di un organismo si possono ottenere brevi sequenze nucleotide utilizzando gli enzimi di restrizione,prodotti da alcuni batteri come sistema di difesa dai virus che li infettano,possono tagliare(idrolisi) il DNA del virus distruggendolo,in punti specifici a livello di sequenze nucleotidiche chiamate siti di restrizione. Gli enzimi più comuni sono le endonucleasi di tipo II che riconoscono una specifica sequenza di DNA dette palindromiche ossia simmetriche lunga 4-8 basi catalizzando l’idrolisi del lagame fosfodiesterico tra zucchero e fosfato di due nucleotidi con la formazione di estremità 5’ e 3’. Questi enzimi effettuano un tagli simmetrici su entrambi i lati generando frammenti con estremità piatte(taglio con Smal)poichè tagliano a metà della sequenza di riconocimento,mentre gi altri tagliano i 2 filamenti in posizione sfalsata di 2 o 4 nucleotidi e i frammenti ottenuti presentano sprogenze a singolo filamento,queste estremità sono chiamate coesive (come nel caso dell’enzima EcoRi,cioè purificato con Escherichia Coli)Questo permette ai frammenti diversi ma tagliati con lo stesso enzima di essere riuniti tramite enzimi DNA ligasi,una colla molecolare per originare DNA ricombinante che cuce gli scheletri di zucchero-fosfato(grazie alla complementarietà delle estremità) CLONAGGIO MOLECOLARE Il DNA ricombinante viene ottenuto attraverso la tecnica del clonaggio che consiste nell’inserire un frammento di DNA in un vettore di clonaggio ottenendo numerose copie o cloni di un gene da studiare,sfruttando un sistema cellulare. Il DNA estraneo detto esogeno viene inserito in una molecola di DNA in grado replicarsi fungendo da vettore (come plasmidi,cioè anelli di DNA contenuti nei batteri)perchè grazie agli enzimi di restrizione DNA di origine diversa possono legarsi tramite le estremità coesive.Il vettore risultante si dice chimerico o ricombinante introdotto poi in un organismo ospite,come batteri o lieviti (eucarioti unicellulari come Saccharomyces cerevisiae). Passaggi del clonaggio molecolare: 1-Isolamento: si isolano il DNA plasmidico (del vettore,come x es.della cellula E.coli) e il DNA da clonare (cellula umana) 2-Digestione: entrambi i DNA con lo stesso enzima di restrizione 3-Ligazione: si mettono in una provetta i due DNA e grazie alla presenza dell’enzima DNA ligasi le estremità coesive si saldano generando un plasmide ricombinante. 4- Trasformazione: i plasmidi ricombinanti sono introdotti nel batterio ospite mediante metodi di trasformazione(nel caso in cui la cellula ospite sia un batterio)o di transfezione nel caso in cui il DNA inserito nella cellula ospite provenga da una specie diversa 5-Selezione e riproduzione dei batteri: crescita selettiva dei batteri in modo che solo quelli ricombinanti siano in grado di sopravvivere e moltiplicarsi generando cloni e colonie con il gene clonato. 6-Isolamento del gene clonato: la colonia batterica si fa crescere in un mezzo di coltura liquida cellulare in terreno antibiotico ottenendo un numero elevato da cui si estrae il DNA plasmidico. VETTORI DI CLONAGGIO I tipi di vettori che possono essere utilizzati per il clonaggio sono diversi MA tutti devono avere dimensioni inferiori al genoma della cellula ospite e possedere alcune caratteristiche: -un tratto contenente siti unici di taglio o siti di clonaggio multiplo. E’ presente un’unica sequenza di riconoscimento per un certo enzima di restrizione e il vettore si adatta al taglio. -origine di replicazione,sito riconosciuto dall’enzima DNA polimerasi della cellula ospite che fotocopia anche il DNA estraneo. -un gene o marcatore di selezione,che permette il riconoscimento delle cellule ospiti in cui è stato inglobato il vettore. Uno dei principali tipi di vettori è il plasmide,molecole di DNA di piccole dimensioni presenti nel citoplasma di moli batteri,e non nel cromosoma.Infatti non sono essenziali per la vita della cellula. Essi si replicano autonomamente e in essi è possibile inserire solo piccoli frammenti di DNA esogeno.In questo caso sono necessari i cromosomi eucariotici del lievito artificiali perché permettono l’inserimento di geni più lunghi e sono detti YAC. Si possono impiegare come vettori anche alcuni virus grazie alla loro capacità di infettare cellule procariotiche ed eucariotiche,e inserire il patrimonio genetico modificato nella cellula ospite. TECNICHE DI CLONAGGIO E TRASFORMAZIONE Com’è possibile introdurre artificialmente DNA dall’esterno di una cellula ospite?Il DNA attraversa facilmente pareti e membrane cellulari. I principali metodi sono: -shock termico, che crea dei pori nelle membrane cellulari permettendo l’accesso -elettroporazione,scarica elettrica in una provetta contenente le cellule da trasformare e molecole di DNA -il metodo biolistico,tramite l’uso di una pistola dei microproiettili rivestiti di DNA vengono sparati contro un bersaglio permettendo al DNA di passare attraverso -infezione della cellula ospite con virus modificati in modo da contenere il DNA esogeno -microiniezione per cellule di mammifero in cui si inietta direttamente DNA nel nucleo della cellula ospite Il DNA deve essere mantenuto all’internoe deve essere integrato in un’unità di replicazione funzionante,in grado di duplicarsi. Selezione delle cellule geneticamente modificate Per distinguere le cellule in cui è avvenuto l’ingresso del vettore ricombinante con DNA esogeno si utilizzano geni marcatori di selezione come i geni reporter,che determinano un carattere facilmente riconoscibile attraverso la resistenza a un antibiotico o una colorazione. Le cellule ospiti sono poste su un terreno di coltura selettivo,su cui sono in grado di crescere solo quelle che hanno inglobato il vettore ricombinante. AMPLICAZIONE DNA TRAMITE PCR Per produrre molte copie di un frammento di DNA si può ricorrere alla sua amplificazione utilizzando la tecnica della reazione a catena della polimerasi( polymerase chain reaction) e permette di amplificare un tratto di DNA di interesse di cui si conoscono le sequenze nucletodiche alle due estremità,fino a ottenere un numero elevato di copie.La reazione riproduce ciò che avviene nelle cellule durante la fase di duplicazione del DNA: i desossiribonucleotidi trifosfato presenti vengono polimerizzati grazie all’enzima DNA polimerasi per formare nuovi filamenti partendo da due inneschi detti primer (20-25 nucleotidi e complementari alle estremità 3 dei filamenti da amplificare),cioè innesti o piccoli frammenti DNA a singolo filamento corti 15-20 basi,un oligonucleotide RNA. Avviene attraverso 3 fasi principali: 1-Denaturazione: le proteine si denaturano con variazioni di ph e calore,la miscela di reazione contenente il DNA da amplificare,i desossiribonucleotidi,la DNA polimerasi,un buffer salino ossia una soluzione salina che crea condizioni favorevoli per il funzionamento degli enzimi, e i primer riscaldata a 94gradi. Ciò permette l’apertura della doppia elica di DNA tramite rottura dei legami a idrogeno tra le basi azotate dei filamenti appaiate per complementarietà. 2-Appaiamento o annealing: si abbassa la temperatura a 55/65 gradi per permettere loro di legarsi alle estremità dei 2 filamenti di DNA. 3-Estensione: la DNA polimerasi permette la sintesi di nuovi filamenti a partire dai primer 5’-3’.La temperatura dipende dal tipo di polimerasi:è di 72 gradi per la Taq polimerasi (enzima batterico termostabile/termofilo e resiste a temp.elevate). Al termine del primo ciclo si ottengono 2 copie del frammento,una x filamento.Questi 3 passaggi sono ripetuti per 25-35 cicli e avvengono automaticamente grazie ai termociclatori,macchinari programmati per effettuare cicli a temp. diverse. Inoltre si effettua in vitro,è rapido,con un elevato specificità. *polimerizzazione=degli acidi nucleici della cellula prevede l’utilizzo di nucleotidi trifosfati e enzima DNA polimerasi che catallizza il legame fosfodiestere 5’ fosforilato e 3’ ossidrile. ORGANIZZAZIONE GENI IN LIBRERIE Il genoma di un organismo è un insieme di molecole di DNA di grandi dimensione. Come fare a individuare e isolare un gene per amplificarlo o clonarlo e studiarne le sequenze? Sono stati creati degli archivi detti genoteche o librerie genomiche, insiemi di molecole di DNA ricombinante che contengono tutti i frammenti di DNA del genoma dell’organismo. Possono essere ridondati quando contengono più copie dello stesso frammento,o rappresentative quando contengono almeno una copia di tutti i frammenti. Come vettori si utilizzno plasmidi o alcuni tipi di fagi (come i virus che infettano i batteri)poichè possono contenere DNA più grande. Per il clonaggio di frammenti con dimensioni maggiori si possono utilizzare come vettori i cromosomi artificiali del lievito (YAC) o batterici (BAC,una molecola di DNA batterico modificata) LE LIBRERIE DI cDNA Le librerie raccolgono tutte le sequenze di un genoma,geniche codificanti con info per la sintesi di proteine(esoni) e quelle non codificanti come gli introni,che regolano l’espressione genica (per questo i geni eucarioti sono detti interrotti)però esistono anche librerie che contengono solo quelle codificanti ottenute a partire dall’mRNA convertito in DNA complementare:dette librerie di cDNA o di espressione. La trascrizione dell’RNA è data da 3 processi prima che sia tradotto: 1-trascrizione e RNA immaturo 2-splicing dell’mRNA,per renderlo maturo si eliminano gli introni 3-isolamento dell’mRNA e sintesi di cDNA,si utilizza l’enzima trascrittasi inversa dei retrovirus per sintetizzare filamenti di DNA a partire dall’RNA. 4-Demolizione parziale dell’mRNA tramite ribonucleasi e sintesi del 2 filamento di cDNA grazie alla DNA polimerasi. Lo screening delle librerie Conoscendo almeno una parte della sequenza nucleotidica del gene ricercato è possibile individuare in una genoteca la molecola con il gene di interesse.Si utilizzano molecole con sostanze radioattive o fluorescenti,dette sonde oligonucleotidiche ,costruite complementari al gene di interesse e da potersi legare tramite ibridazione,o tramite PCR o anticorpi che riconoscono quelle specifiche proteine di interesse. MAPPE DI RESTRIZIONE E IMPRONTA GENICA Per ottenere queste mappe si utilizzano enzimi di restrizione e rappresenta la prima forma di caratterizzazione di un gene del DNA e visualizzarne quindi l’impronta genetica (DNA fingerprint). In questa procedura il DNA viene digerito con più enzimi tramite digestioni singole e multiple e i frammenti sono analizzati mediante la tecnica dell’elettroforesi su gel di agarosio,cioè le molecole cariche come acidi nucleici e proteine migrano quando viene applicato un campo elettrico.Le molecole di DNA hanno una carica negativa e migrano verso il polo positivo. La velocità di migrazione dipende dalla sua dimensione. Procedimento: una miscela di frammenti di DNA,i campioni, viene inserita in gel di agarosio racchiuso in due lastre di vetro,poi viene immerso in una soluzione salina collegato ad elettrodi pos e neg,le separazione è visualizzata attraverso bande. Solitamente si ottengono lughezze diverse di frammenti dovuto al polimorfismo genetico,sequenze diverse nei cromosomi, e queste differenze producono profili di restrizione diversi: RFLP o polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione,un tipo di marcatori molecolari e permettono di confrontare genomi di organismi diversi e per stabilire la presenza di geni difettosi che causano malattie ereditarie.
