CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYTSECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYTFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA –USACINFORME FINAL “CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS AROMÁTICAS, DE USO MEDICINAL Y DE IMPORTANCIA ECONÓMICA DE GUATEMALA” Proyecto FINDECYT/FODECYT 017-2017 Juan Francisco Pérez Sabino Investigador Principal GUATEMALA, DICIEMBRE DE 2019 AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-. ii OTROS AGRADECIMIENTOS La realización del presente trabajo de investigación fue posible gracias al apoyo institucional de la Unidad de Análisis Instrumental (UAI), del Centro de Datos para la Conservación (CDC) de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USAC) y al Instituto de Pesquisas de Productos Naturales (IPPN) de la Universidad Federal de Río de Janeiro. El investigador principal agradece la participación de las siguientes personas que hicieron posible la realización del presente trabajo: Investigadores asociados Lic. Edwin Adolfo Taracena, Lic. Max Mérida Reyes, Dr. Vicente Martínez Arévalo. Auxiliares de Investigación Lic. Manuel Muñoz Wug. Investigadores colaboradores Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva, Lic. Miguel Estuardo Flores Robles, Dr. Daniel Luiz Reis Simas, Licda. Millena Santos Cordeiro, Licda. Thais Biondino Sardella, Licda. Bessie Evelyn Oliva-Hernández, Dra. Patricia Dias Fernandes, Br. Luis Alberto Rizzo, Licda. Isabel Cristina Gaitán Fernández. iii RESUMEN En la presente investigación se evaluaron los aceites esenciales de 26 plantas aromáticas y medicinales de Guatemala. Las plantas fueron colectadas en la mayor parte de los departamentos de Guatemala, realizándose viajes de campo para localizarlas tomando en cuenta la información en la literatura y caminatas de búsqueda en las regiones reportadas. Se colectaron principalmente las partes aéreas de las plantas con excepción de la Valeriana prionophylla de la cual se colectaron raíces y de Pimenta dioica de la que se colectaron hojas y frutos. Los aceites fueron extraídos en el laboratorio utilizando un hidrodestilador tipo Clevenger, obteniéndose la información de rendimiento de extracción. Los aceites extraídos fueron analizados por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en el Instituto de Pesquisas de Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil, que participó en el proyecto. Se analizaron también las actividades antioxidante y biológica de varios de los aceites obteniéndose resultados variables. Como resultado principal se cuenta con información sobre el rendimiento y composición química de los aceites esenciales de estudio, así como de propiedades antioxidantes y antimicrobianas, índices de refracción y espectros en el infrarrojo, así como la información de localización geográfica de las plantas, como base para la toma de decisiones para el desarrollo de nuevos productos con mayor valor agregado a partir de los aceites. Mención destacada por su potencial de aplicaciones en la industria merecen los aceites de Stevia serrata, Valeriana prionophylla, Abies guatemalensis, Lippia graveolens y Pimenta dioica, que presentaron actividades biológicas importantes y/o metabolitos de alto valor económico. iv ABSTRACT In the present investigation the essential oils of 26 aromatic and medicinal plants of Guatemala were evaluated. The plants were collected in most of the departments of Guatemala. Field trips were made to locate them taking into account the information provided by the literature and walks in the reported regions. The aerial parts of the plants were collected with the exception of Valeriana prionophylla from which roots were collected and Pimenta dioica from which leaves and fruits were collected. The oils were extracted in the laboratory using a Clevenger type hydrodistiller, thus obtaining the extraction yield data. The extracted oils were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry at the Natural Products Research Institute of the Federal University of Rio de Janeiro, Brazil, which participated in the project. The antioxidant and biological activities of several of the oils were also analyzed, obtaining variable results. As a main result, there is information on the extraction yield and chemical composition of the essential oils, as well as antioxidant, antimicrobial properties, refraction indexes and infrared spectra, as well as the information on geographic location of the plantas, as a basis for decision-making for the development of new products with greater added value starting from the oils. Worth noting for its potential applications in the industry are the oils of Stevia serrata, Valeriana prionophylla, Abies guatemalensis, Lippia graveolens and Pimenta dioica, which presented important biological activities and metabolites of high economic value. v ÍNDICE PARTE I ............................................................................................................................ 1 I.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................. 3 I.2.1 Antecedentes. .................................................................................................... 3 I.2.1.1 Artemisia absinthium L. (ajenjo). ............................................................. 3 I.2.1.2 Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Té de Limón). .................................. 4 I.2.1.3 Teloxys ambrosioides L. (apazote). ........................................................... 5 I.2.1.4 Tagetes lucida Cav. (pericón).................................................................... 5 I.2.1.5 Ocimum micranthum Willd. (albahaca de monte). ................................. 6 I.2.1.6 Matricaria recutita L. (manzanilla). ......................................................... 6 I.2.1.7 Phyla dulcis (Trevir) Moldenke (orozús). ................................................ 7 I.2.1.8 Lippia alba N.E. Brown ex Brit. & Wils (salvia sija). ............................. 7 I.2.1.9 Lippia graveolens HBK (orégano mexicano). .......................................... 7 I.2.1.10 Thymus vulgaris L. (tomillo). .................................................................. 8 I.2.1.11 Buddleja americana L. (salvia santa). .................................................... 8 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación. ..................................................... 9 I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS ................................................................................ 11 I.3.1 Objetivos.......................................................................................................... 11 I.3.1.1 General. ..................................................................................................... 11 I.3.1.2 Específicos. ............................................................................................... 11 I.3.2 Hipótesis. ......................................................................................................... 12 I.4 METODOLOGÍA ................................................................................................. 13 I.4.1 Localización geográfica. ................................................................................. 13 I.4.2 Colecta. ............................................................................................................ 13 I.4.3 Preparación de la muestra. ............................................................................ 13 I.4.4 Determinación de humedad. .......................................................................... 14 I.4.5 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger......................................................................................................... 14 I.4.6 Análisis cromatográfico de los aceites esenciales......................................... 14 I.4.7 Actividad antioxidante. .................................................................................. 15 I.4.8 Índice de refracción de aceites esenciales. .................................................... 15 vi I.4.9 Espectrofotometría IR. .................................................................................. 15 I.4.10 Determinación de la actividad antimicrobiana.......................................... 15 I.4.11 Análisis de resultados. .................................................................................. 16 PARTE II ......................................................................................................................... 17 II.1 MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 17 II.1.1 Las plantas aromáticas. ................................................................................ 17 II.1.2 Los aceites esenciales. ................................................................................... 18 II.1.2.1 Definición e importancia. ....................................................................... 18 II.1.2.2 Propiedades físicas. ................................................................................. 20 II.1.2.3 Composición. ........................................................................................... 20 II.1.2.3.1 Terpenoides. ...................................................................................... 21 II.1.2.3.2 Compuestos aromáticos derivados del fenilpropano. ....................... 23 II.1.2.3.3 Compuestos de orígenes diversos. .................................................... 23 II.1.2.3.4 Existencia de quimiotipos.................................................................. 25 II.1.2.3.5 Influencia del ciclo vegetativo........................................................... 25 II.1.2.3.6. Influencia de los factores extrínsecos. ............................................. 26 II.1.2.4 Distribución. ............................................................................................ 26 II.1.2.5 Localización ............................................................................................ 27 II.1.2.6 Función biológica ................................................................................... 28 II.1.2.7 Propiedades terapéuticas de los aceites esenciales. ............................... 28 II.1.2.7.1 Propiedad antiséptica. ...................................................................... 29 II.1.2.7.2 Propiedad espasmolítica y sedante. .................................................. 29 II.1.2.7.3 Propiedad irritante............................................................................ 30 II.1.2.7.4 Otras propiedades importantes. ........................................................ 30 II.1.2.8 Métodos de obtención. ............................................................................ 31 II.1.2.8.1 Métodos oficinales............................................................................. 31 II.1.2.8.2 Métodos no oficinales........................................................................ 34 II.1.2.9 Análisis de aceites esenciales.................................................................. 36 II.1.2.9.1 Determinación del rendimiento del aceite esencial de un material vegetal. .............................................................................................................. 36 II.1.2.9.2 Análisis de la composición de los aceites esenciales. ....................... 37 II.1.2.9.3 Cromatografía en fase gaseosa. ........................................................ 38 PARTE III ....................................................................................................................... 43 III.1 RESULTADOS ................................................................................................... 43 III.1.1 Información de colecta de plantas aromáticas. ........................................ 43 vii III.1.2 Rendimientos de aceite esencial y humedades de plantas aromáticas.... 46 III.1.3 Composición del aceite esencial de plantas aromáticas. .......................... 48 III.1.4 Índices de refracción de aceites esenciales. ............................................... 55 III.1.5 Determinación de la actividad antioxidante de aceites esenciales. ......... 55 III.1.6 Actividad antibacteriana de los aceites esenciales. ................................... 56 III.1.7 Discusión de resultados. .............................................................................. 57 IV.1 CONCLUSIONES .............................................................................................. 73 IV.2 RECOMENDACIONES .................................................................................... 75 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 76 IV.4 ANEXOS ............................................................................................................. 88 IV.4.1 Principales constituyentes de aceites esenciales y sus estructuras. ......... 88 IV.4.2 Cromatogramas de aceites esenciales. ....................................................... 98 IV.4.3 Espectros infrarrojos de aceites esenciales.............................................. 108 IV.4.4 Fotografías del proyecto............................................................................ 113 PARTE V ....................................................................................................................... 124 V.1 INFORME FINANCIERO................................................................................ 124 V.2 CRONOGRAMA ............................................................................................... 125 viii PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN Guatemala es un país rico en recursos naturales que no son aprovechados óptimamente para el beneficio de la población guatemalteca. Varias plantas aromáticas y medicinales son cultivadas a nivel familiar pero no son aprovechadas a una escala superior, motivado principalmente por la falta de conocimiento del valor económico de los aceites esenciales. Diferentes estudios se han realizado sobre plantas aromáticas de Guatemala, sin que se haya sistematizado la información, por lo que no se cuenta con herramientas que permitan evaluar el potencial de los aceites esenciales desde el punto de vista de sus posibles aplicaciones y comercialización en los mercados internacionales. Los aceites esenciales presentan gran valor para la industria, en vista de sus aplicaciones como aromatizantes, saborizantes, preservantes de alimentos, protección de granos básicos y como materia prima para síntesis de productos químicos. A partir de la información que se encuentra en la literatura guatemalteca, se ha obtenido una lista de plantas aromáticas, de uso medicinal y de importancia económica, que fueron estudiadas en el presente proyecto. Muchos aceites constituyen compuestos de partida para síntesis de otras sustancias útiles en las industrias química y farmacéutica. Otros componentes tienen propiedades farmacológicas y son usados como antibacterianos, analgésicos, sedantes, antiinflamatorios, expectorantes, estimulantes y estomáquicos en la composición de medicamentos. Para que un aceite esencial nuevo sea introducido en el mercado internacional, presenta diferentes niveles de dificultad, según la industria para la que se destine, así por ejemplo, para su aceptación en la industria de aromas debe cumplir con patrones complejos y rígidos, 1 exigiendo una calidad uniforme. Por esta razón, generalmente existe un gran interés en esta industria por la investigación de nuevas fuentes de aceites esenciales. Aragão et al. (1981), seleccionaron varias plantas con posibilidades económicas en cuanto a su cultivo, basándose en los siguientes criterios: a) abundancia de la planta en la región b) rendimiento de aceite esencial elevado, igual o mayor que 0.5% c) un componente principal económicamente importante en concentración superior a 30% d) un componente secundario de alto valor económico En dicho estudio, se obtuvieron resultados de análisis químico de 82 aceites esenciales de plantas del noreste de Brasil, de 14 familias botánicas diferentes. Los resultados más importantes de dicho estudio fueron los cromatogramas correspondientes a cada aceite y la relación de los constituyentes químicos identificados, así como sus fuentes alternativas. A partir de dicho estudio, se desarrollaron varias agroindustrias en el noreste brasileño, para la producción de aceites esenciales. De esta forma, el propósito de la presente investigación fue la generación de información relevante para la toma de decisiones que permita evaluar la implantación de agroindustrias para la producción de aceites esenciales, a partir de plantas que son cultivadas o nativas de Guatemala. Para ello se analizó la composición química de los aceites esenciales extraídos de las plantas de estudio, a través de la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de gases y espectrofotometría IR, la determinación de actividad antioxidante y antimicrobiana, así como las principales características fisicoquímicas, con la colaboración de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. 2 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes. Guatemala es un país con una gran biodiversidad debido a la diversidad climática que presenta en un territorio relativamente pequeño de 108 889 km 2, de manera que pueden encontrarse varias zonas de vida en un solo departamento. Esta diversidad climática es también responsable por la producción por parte de las plantas de múltiples metabolitos secundarios, entre los cuales se encuentran los aceites esenciales. Varias investigaciones sobre los aceites esenciales de plantas aromáticas de Guatemala se han realizado en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia desde la década de 2000 (Cáceres et al., 1993; Pérez et al., 2001; Pérez et al., 2011; Jayes et al., 2007). Algunos de los aceites han revelado la presencia de algunos componentes de alto valor económico mientras que en otros se ha encontrado que existe variabilidad en relación con la región de colecta de la planta (Jayes et al., 2006; Pérez, 2008: Pérez et al., 2012). A partir de dichas investigaciones se ha planteado la necesidad de evaluar el rendimiento, composición y propiedades físicas, químicas y biológicas de los aceites esenciales de plantas aromáticas de plantas nativas y cultivadas en Guatemala. A continuación se presenta información relevante sobre algunas de las plantas estudiadas en el proyecto: I.2.1.1 Artemisia absinthium L. (ajenjo). La concentración de camazuleno en el aceite esencial de Artemisia absinthium es superior a 30%, mientras que el alcanfor es otro compuesto mayoritario; ambos de gran relevancia comercial. Los aceites esenciales, extractos acetónicos y etanólicos de A. absinthium han sido analizados para determinar su actividad inhibitoria de la acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BChE), enzimas de suma relevancia en el tratamiento de Alzheimer. Los aceites esenciales y extractos etanólicos han mostrado actividad moderada de 18.02% y 17.64% respectivamente en concentraciones de 100 µg/ml. Mientras que al utilizar el test de poder antioxidante reductor férrico, el aceite 3 esencial muestra un valor elevado de 2.331 a una concentración de 1000 µg/ml; no tan alto, pero comparable con el ácido clorogénico cuyo valor fue de 3.618 (Orhan et al., 2010). I.2.1.2 Cymbopogon citratus (DC.) Stapf (Té de Limón). El té de limón también conocido como zacate de limón o limoncillo, pertenece a la familiar Poaceae. Las hojas son utilizadas en la medicina tradicional. Es nativa de la India y sur de Asia, crece en clima tropical húmedo, soleado. Ha sido naturalizada y comercializada en Asia, Centro y Sur América (Husain et al., 1988). Aunque se cultiva en el altiplano occidental de Guatemala, es en Retalhuleu, Izabal y Alta Verapaz donde más se encuentra. Existe toda una industria desarrollada a su alrededor en Guatemala, sobre todo para la obtención de su aceite esencial con fines cosméticos (INE, 2010). Es una planta perenne y de macollas densas; culmos erectos en gruesos y cortos rizomas, 1-2 m de alto (ACCT, 1985). Se puede utilizar la infusión o cocimiento en afecciones digestivas y respiratorias. El aceite se usa para tratar flatulencia y dolores espasmódicos; por vía tópica en reumatismo, lumbago, neuralgia y tinea. Presenta actividad carminativa, espasmolítica, estimulante, diaforética, efecto depresor del SNC, analgésica y antipirética. La actividad antibacteriana disminuye al oxidarse el aceite e inclusive es prooxidante en bajas dosis. El geranial y el neral tienen actividad antiséptica, antimicrobiana y cito tóxica. Se usa como saborizante y odorizante de cosméticos (Cáceres, 2003), Ha mostrado efectos cardiovasculares en ratas donde induce hipotensión por inhibición de flujo de calcio; y bradicardia por activación de receptores muscarínicos cardiacos (Moreira et al, 2009). La presencia de aceite esencial es menor al 1% pero con una alta cantidad de citral (6572%); además de mirceno (12%), acetato de geranilo, metilheptenona, geraniol y elementos como elemol, α- y β-pineno, dipenteno, β-felandreno, p-cimeno, β-cariofileno, acetato de citronelilo, limoneno, linalool y otros (Husain et al., 1988). La concentración de citral puede aumentarse significativamente de acuerdo a las condiciones en que se cultiva la planta, llegando hasta 96% para un cultivo en San Pablo, Brasil (Furlan et al., 2010). 4 I.2.1.3 Teloxys ambrosioides L. (apazote). Es también conocido como Siq’uij y Suuq’an. Es una hierba con un olor fétido, ramosa, que llega a medir hasta 1.5 m de altura (Standley et al., 1946). No se cultiva de manera comercial en la mayor parte de Guatemala, se colecta en estado silvestre principalmente. Se le atribuye a la planta propiedades antisépticas, antifúngicas, antiparasitarias, cicatrizantes, colagogas y tónicas. También se utiliza para condimentar alimentos (Germosén-Robineaeu, 1996). Su aceite esencial ha presentado hasta un 90% de ascaridol, además de alcanfor, p-cimeno, geraniol, limoneno, felandreno, mirceno, entre otros (Cáceres, 2003). I.2.1.4 Tagetes lucida Cav. (pericón). También es conocido como hierba de anís. Las partes usadas medicinalmente son hojas, fruto, flores y semillas. Es nativa de Mesoamérica; en Guatemala se reporta en varios departamentos especialmente en el el altiplano (Cáceres, 2003). Es una hierba perenne aromática, 30-95 cm (House et al., 1995). Se obtiene por recolección silvestre y cultivo. Estudios demuestran que las hojas y las flores tienen actividad antimicrobiana y antifúngica (Cáceres, 2003). Se utiliza para tratar anemia, inflamación de los ojos, afecciones nerviosas y gastrointestinales (Siegel et al., 1977). Uno de los estudios más importantes para determinar la composición del aceite esencial de T. lucida fue realizado en 1997 (Bicchi et al.,1997), en el cual se analizó material cultivado por la Facultad de Agronomía de la USAC y el ICTA en Guatemala. El aceite esencial presentó un rendimiento de 0.6% por hidrodestilación y en el análisis por cromatografía de gases se encontraron 53 compuestos y una alta concentración de anetol (23.8%), metileugenol (24.3%) y estragol (33.9%). De igual manera, fue posible realizar el fraccionamiento del aceite esencial, obteniendo fracciones ricas en (E)-β-ocimeno (79%), estragol (86%), anetol (81%), metileugenol (93%) y herniarina (48%); demostrando que la ruta del ácido shikímico predomina en la biosíntesis del aceite esencial de T. lucida. 5 De igual manera, el género Tagetes es rico en fenoles, esteroides, alcaloides, flavonas, flavonoles, benzofuranos y carotenoides (Xu et al., 2012). I.2.1.5 Ocimum micranthum Willd. (albahaca de monte). El rendimiento y compuestos en el aceite esencial de Ocimum micranthum varían significativamente de acuerdo a la parte de la planta de la que se colecte. Las hojas presentan rendimientos de 1.54% y alto contenido de eugenol. Las flores y tallos presentan rendimientos de 0.63% y 0.08% respectivamente con un alto contenido de β-selineno; el cual es minoritario en las hojas. Otros compuestos reportados incluyen 1,8-cineol, βcariofileno y elemeno. El contenido sesquiterpénico de las hojas, flores y tallos pueden ser de 48.4%, 85.8% y 78.5% respectivamente (Charles et al., 1988). I.2.1.6 Matricaria recutita L. (manzanilla). También se le conoce como camomila y matricaria. Se trata de una hierba perenne de la familia Asteraceae que llega a medir hasta 60 cm de alto, glabra, ramificada (Nash et al., 1976). Se propaga por semilla y requiere de mucha luz solar para producir una cantidad apreciable de aceite esencial (Hornok, 1992). Es una de las plantas de mayor tradición medicinal a nivel mundial. Fue introducida a Guatemala probablemente cerca del siglo XVI. Las partes aéreas se pueden utilizar para tratar malestares gastrointestinales además de enfermedades degenerativas como el reumatismo (Cáceres, 2003). El aceite esencial tiene muchas aplicaciones, entre ellas las cosméticas y saborizantes además de las fitoterapéuticas. Se encuentra presente en las flores en una cantidad menor al 1% y el azuleno es su componente característico (26-46%), también contiene bisabolol, cadineno, entre otros. El azuleno, es anodino, antiinflamatorio, antiséptico, espasmolítico y vulnerario. Tiene una rica mezcla de minerales de calcio, magnesio, manganeso, zinc y selenio (Arteche, 1992; Alonso, 1998). 6 I.2.1.7 Phyla dulcis (Trevir) Moldenke (orozús). También conocida como Lippia dulcis Trev. (Enda-caribe, 1996; Fischer, 1997), es una planta herbácea y aromática (Stevens, 2001; Núñez, 1978; Morton, 1981; Ministerio de Salud de Nicaragua, 1986). Ampliamente distribuida en Mesoamérica y El Caribe, en Guatemala se encuentra entre los 0 y 1800 msnm, principalmente en lugares muy húmedos como orillas de cuerpos acuíferos. Se ha encontrado en los departamentos del altiplano occidental (Williams, 1981; Fischer, 1997). Las hojas se utilizan para el tratamiento de afecciones gastrointestinales y respiratorias (House et al., 1995; Mellen, 1974). El tamizaje fitoquímico de las hojas indica la presencia de aceite esencial, compuesto por monoterpenos y sesquiterpenos. El edulcorante es la hernandulcina, un sesquiterpeno que representa 0.004% de la hierba seca, y mil veces más dulce que la glucosa (Compadre et al., 1985; Compadre et al., 1986). I.2.1.8 Lippia alba N.E. Brown ex Brit. & Wils (salvia sija). También conocida popularmente como juanilama o salvia Santa. Es nativa de Latinoamérica. Se ha descrito en departamentos del altiplano occidental. Es un arbusto aromático de 1-2 m de alto. Las partes utilizadas medicinalmente son las hojas y las flores. El material se obtiene por recolección en los campos de crecimiento silvestre o por cultivo (Martínez et al., 2000). Se utiliza la infusión y cocimiento de hojas y flores para el tratamiento de afecciones hepáticas, gastrointestinales y respiratorias (Cáceres, 2003). La acción farmacológica observada se atribuye al aceite esencial (Da Barros et al., 2000). El aceite esencial se encuentra alrededor del 1.2% y está compuesto principalmente de geraniol (34.1%), neral (23%) y β-cariofileno (6%) (Morton et al., 1981). I.2.1.9 Lippia graveolens HBK (orégano mexicano). También se le conoce como orégano de monte y es un arbusto delgado que llega a medir 2 m de altura. Se observa ampliamente distribuida desde el sur de México hasta Panamá. En Guatemala se observa en el altiplano occidental y otras regiones (Standley et 7 al., 1970); se obtiene principalmente por recolección de especímenes silvestres o cultivos (Martínez et al., 2000). Para el tratamiento de afecciones gastrointestinales y respiratorias se utiliza la infusión o jugo de hojas frescas. El aceite esencial ha sido estudiado ya que presenta actividad antimicrobiana y ha presentado rendimientos de 1.8% en las hojas secas. Entre los principales componentes que presenta el aceite están el timol (40-60%), p-cimeno (8-9%), 1,8-cineol (5%), carvacrol, cariofileno, entre otros (Cáceres, 2003). En Guatemala se han encontrado tres quimiotipos (timol, carvacrol y mixto) en los departamentos de Zacapa, Chiquimula y El Progreso, respectivamente (Pérez, 2008). I.2.1.10 Thymus vulgaris L. (tomillo). El aceite esencial de esta especie contiene por lo menos 47 compuestos, caracterizándose por su muy elevada concentración de timol (57.7%), p-cimeno (18.7%) y carvacrol (2.8%); todos sus demás componentes se encuentran en cantidades inferiores al 2%. Especies relacionados como T. zygis y T. hyemalis también presentan rendimientos y composiciones similares. La actividad bactericida se atribuye al timol y carvacrol, la cual ha sido confirmada experimentalmente (Rota et al., 2008). I.2.1.11 Buddleja americana L. (salvia santa). Es un árbol pequeño de 6 m de altura, muy fragante, que se encuentra en Centroamérica y México. Las decocciones de hojas y corteza de esta planta se utilizan para el tratamiento de asma, dolores de cabeza e infecciones de la piel (Morton, 1977). Los extractos etanólicos son activos contra S. aureus, S. pyogenes y S. pneumoniae (Cáceres et al., 1992). También se utiliza para el tratamiento de padecimientos gastrointestinales, mostrando actividad contra S. flexneri (Cáceres et al., 1993). 8 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación. El estudio se justificó por representar la búsqueda de una alternativa para el desarrollo industrial del sector de plantas aromáticas y medicinales de Guatemala, a través de la generación de información básica para la toma de decisiones sobre el cultivo de plantas aromáticas y medicinales y la producción de aceites esenciales, para evaluar su potencial económico. Varias de las plantas de estudio se cultivan de forma familiar o para consumo local en mercados, no habiendo existido interés a la fecha, para su escalamiento para producción a nivel semi-industrial o industrial. De esta forma se espera que los resultados de los aceites esenciales de las plantas evaluados en la presente investigación sean considerados como fuentes de materias primas que permitan la incluirse en la agro-industria en Guatemala, para la producción de aceites esenciales. La práctica de la agricultura de subsistencia y la alta tasa de crecimiento de la población, dificultan a las familias el alcance de un mejor nivel de vida, por lo que el cultivo sistemático de plantas aromáticas, y la extracción del aceite esencial podría generar un mejor ingreso para los habitantes de las zonas de pobreza. A pesar que varios estudios se habían realizado sobre los aceites esenciales de plantas nativas y de cultivo en Guatemala, la información no había sido generada de forma completa y sistemática, de manera que no existía información completa sobre el potencial de la extracción de aceites esenciales para el cultivo de las plantas aromáticas en diferentes regiones del país. La deficiencia en la información consistía en: desconocimiento de la variabilidad de los aceites esenciales de plantas cultivadas en diferentes regiones geográficas, información de composición de aceites esenciales obtenida con diferentes técnicas o métodos analíticos, desconocimiento de la composición y rendimiento de los aceites esenciales de diferentes plantas medicinales y aromáticas, resultados obtenidos con diferentes metodologías de extracción. 9 El problema anterior no permitía evaluar las condiciones para favorecer el desarrollo industrial de la extracción y comercialización de aceites esenciales de plantas cultivadas en Guatemala y que podrían representar una alternativa para la generación de empleo y mejoramiento del ingreso para los habitantes de diferentes regiones agrícolas de Guatemala. A partir de los resultados se ha generado un catálogo inicial, de manera que la información básica generada: descripción botánica, región de colecta, rendimiento y composición del aceite esencial, densidad, índice de refracción, actividad antioxidante y biológica, espectro en el infrarrojo y cromatograma, permitan visualizar las ventajas en la producción de cada aceite esencial según la región agrícola del país, y sea también de utilidad como parámetro para el control de calidad de los aceites esenciales. Las principales aplicaciones de los aceites esenciales consisten en sus usos como aromatizantes y saborizantes, preservantes de alimentos, insecticidas, preservantes de granos básicos y como materia prima en la industria química. De esta forma, con base en la composición de los aceites esenciales determinada en esta investigación, se podrá evaluar el potencial uso para aplicaciones específicas. 10 I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS I.3.1 Objetivos. I.3.1.1 General. Generar información fisicoquímica básica para la producción de aceites esenciales de plantas aromáticas, medicinales y de importancia económica en Guatemala. I.3.1.2 Específicos. Cuantificar los principales componentes de los aceites esenciales de las plantas de estudio y sus variaciones en estación seca y lluviosa. Determinar el rendimiento de extracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio y sus variaciones geográficas, y en estación seca y lluviosa. Caracterizar los aceites esenciales de las plantas de estudio por medio de sus espectros infrarrojos. Determinar los índices de refracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio. Generar un catálogo con la información química básica de los aceites esenciales de las plantas de estudio como base para la evaluación de la calidad y producción. Evaluar la extracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio utilizando extracción con fluidos súper críticos a nivel de plantas piloto. Determinar la actividad antioxidante de los aceites esenciales de las plantas de estudio. 11 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación. I.3.2 Hipótesis. Las técnicas cromatográficas y espectroscópicas permiten clasificar y diferenciar los aceites esenciales de las plantas de estudio, como base para su caracterización y evaluación de su calidad. 12 I.4 METODOLOGÍA I.4.1 Localización geográfica. Las colectas de las plantas aromáticas, de uso medicinal y de importancia económica se realizaron en 12 departamentos de la República de Guatemala establecidas en cultivos (principalmente huertos familiares) y en estado silvestre. Los análisis de laboratorio se realizaron en la Unidad de Análisis Instrumental de la Escuela de Química, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, en el campus de la Universidad de San Carlos de Guatemala, zona 12, Ciudad de Guatemala y en el Instituto de Pesquisas de Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. I.4.2 Colecta. Muestras de raíces, flores, tallos, frutos y hojas de las plantas de estudio, de acuerdo a la parte que presente aceite esencial de cada planta, fueron colectadas en por lo menos dos poblaciones de cada especie. La posición geográfica de los sitios de colecta y la altitud fue registrada usando un aparato GPS. Muestras compuestas de 1 kg de material vegetal húmedo de diferentes individuos fueron colectadas en las poblaciones de estudio. En la mayoría de los casos, un espécimen para voucher fue colectado en cada población, el cual fue depositado en el Herbario de la Escuela de Biología –BIGU-, como muestras de referencia. I.4.3 Preparación de la muestra. Se separaron las hojas y los troncos suaves del material vegetal y se eliminó el resto; se mezcló el material vegetal y se secó en secador solar en el Centro Experimental y Docente de la Facultad de Agronomía –CEDA- , dejando una fracción de 25 g para determinaciones de humedad y cenizas. Se herborizaron dos ejemplares para depositar en herbario. En el caso de raíces, fueron lavadas y posteriormente secadas en secador solar. 13 I.4.4 Determinación de humedad. Se pesaron 10.00 g de material vegetal fresco y se colocaron en una cápsula de porcelana. Se colocó la muestra en el horno de convección y se secó a 95⁰C por 20 h. Se pesó la muestra en balanza analítica, determinando el contenido de humedad por diferencia con el peso original. I.4.5 Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación con aparato tipo Clevenger. En la mayoría de los casos, se pesó 50 g de material vegetal seco en un balón de 2,000 mL, 24/40. Se agregó agua hasta pasar levemente el nivel de la mitad del balón. Se acopló el balón con el aparato de extracción, y se encendió la estufa y la circulación del agua a través del refrigerante del aparato de destilación. Se destiló el aceite esencial por 3 h, contadas a partir de la hora en que se inicia la destilación. El aceite se colectó en n-pentano y se concentró en rotavapor. Se midió luego la masa del aceite destilado y se almacenó en un vial de 2 mL en refrigeración. Se almacenó la muestra en la refrigeradora, para su posterior análisis cromatográfico. I.4.6 Análisis cromatográfico de los aceites esenciales. Se realizó de acuerdo con Adams (2002), inyectando 0.1 uL de disolución de 5 mg de aceite esencial en 150 uL de CHCl3, en cromatógrafo de gases equipado con una columna HP5 (5% fenil 95% dimetilpolisiloxano) de 30 m x 0.2 mm x 0.25 um de espesor y programa de temperatura de 60 a 240ºC con rampa de 3ºC/min y temperatura del inyector de 200ºC. La identificación de los componentes de los aceites esenciales se realizó por medio da la comparación de los índices de retención experimenales con los publicados en la literatura (Adams, 2002) y por el análisis de los espectros de masas obtenidos a partri del análisis de 14 los aceites por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, en el Instituto de Pesquisas de Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil. I.4.7 Actividad antioxidante. Se realizará por medio de la adición de DPPH (radical picrilato) a una fracción de extracto etanólico y/o solución etanólica de aceite esencial, y verificación de la absorbancia en UV/VIS por quince minutos (Almeida-Doria, Regitano-Dárcey, 2000). I.4.8 Índice de refracción de aceites esenciales. Se determinó el índice de refracción de los aceites esenciales obtenidos, para la caracterización de las especies estudiadas y sus quimiotipos. Este parámetro es de utilidad para la evaluación de diferencias entre los aceites esenciales. I.4.9 Espectrofotometría IR. Los espectros IR de los aceites esenciales de estudio fueron analizados colocando una gota de aceite en las celdas de NaBr de un espectrofotómetro IR con Transformada de Fourier y los principales picos fueron asociados a los principales componentes identificados. I.4.10 Determinación de la actividad antimicrobiana. El ensayo se realizó por el método de difusión en agar recomendado por la NCCLS (método Kirby-Bauer), utilizando 10 uL de aceite esencial puro por disco. 15 I.4.11 Análisis de resultados. Los análisis de laboratorio fueron realizados por triplicado. Los resultados de rendimiento de extracción, composición química, índice de refracción, análisis de actividad antioxidante, se presentan en tablas en la sección de resultados. En anexos se presentan los cromatogramas y espectros infrarrojos de los aceites esenciales analizados. 16 PARTE II II.1 MARCO TEÓRICO II.1.1 Las plantas aromáticas. Existen innumerables especies vegetales con propiedades aromáticas que se distribuyen desde las regiones templadas hasta los trópicos. Algunas familias botánicas son tradicionalmente fuentes de productos aromáticos, como las Pináceas, Verbenáceas, Mirtáceas, Lamiáceas, Rutáceas, Lauráceas, Piperáceas, Apiáceas y Asteráceas. Es muy arriesgado fijar un valor, pero según distintos autores, el número aproximado de especies con esencia es de unas 3,000 de las cuales se comercializan entre 250 y 300. Sin embargo, el universo de las plantas aromáticas es muchísimo mayor, si se considera su origen biológico y su significación comercial (Wijesekera, s.f.; Bandoni, 2003; Bakkali, Averbeck, Averbeck, & Idaomar, 2008; Nedorostova, Kloucek, Kokoska, Stolcova, & Pulkrabek, 2009). La variabilidad genética de las plantas es una de sus más valiosas virtudes, al aportar una casi infinita riqueza de posibilidades. La naturaleza expresa con esto una libertad de creación aún no igualada por la imaginación del hombre. Como fábrica de aromas y sabores es una permanente fuente de productos volátiles. A esta variabilidad deben sumarse factores ecológicos, culturales, metodológicos, agrícolas e industriales, que relativizan casi cualquier intención de querer acotar en un número la cantidad de plantas aromáticas (Bandoni, 2003; Dembitsky, Shkrob, & Ondrej, 2008; Başer & Buchbauer, 2010). Se calcula que aproximadamente el 65% del mercado de esencias proviene de especies cultivadas, el 1% de especies silvestres (2% en valores monetarios) y el 33% de árboles, mayormente explotaciones forestales (pinos, cedros, ylang, eucaliptos, etc.). Dichos valores son altamente significativos, pues demuestran la imperiosa necesidad de la industria de disponer de productos en cantidad y calidad homogénea, algo muy difícil de lograr a través de la explotación de material silvestre. Sin embargo, en algunos casos los 17 costos de producción, el fácil acceso a materias primas o la ausencia de un desarrollo industrial o tecnológico adecuado hacen que la explotación de materiales silvestres sea una alternativa posible (Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). Las plantas aromáticas han sido utilizadas, durante siglos, en culinaria, en perfumería y como medicamentos (Edris, 2007). Las plantas aromáticas son usadas: - Directamente en culinaria, en su forma de plantas secas, especias y condimentos. - En los productos de higiene y tocador, como componentes de formulaciones, o como materia prima para el aislamiento de compuestos aromáticos de interés. - En la industria de alimentos, como agentes saborizantes, preservantes y antioxidantes. - En medicina humana y veterinaria, como componentes de formulaciones farmacéuticas. - En agricultura, como pesticidas y repelentes de insectos, y - Como agentes antibacterianos y antifúngicos. Los principales productos obtenidos de plantas aromáticas son aceites esenciales, oleorresinas (obtenidas principalmente de especias), concretos, absolutos, extractos y tinturas (Tuley De Silva, 1995; Sharapin, 2000; Edris, 2007; Nedorostova et al., 2009). II.1.2 Los aceites esenciales. II.1.2.1 Definición e importancia. Si bien existen numerosas definiciones algunas desde el punto de vista químico, otras desde la perspectiva del botánico, y aún otras desde el punto de vista industrial, ninguna de ellas abarca en su totalidad a todas las esencias. Sin embargo, como una forma de 18 generalizar al máximo el término se puede definir a los aceites esenciales, aceites etéreos o esencias como metabolitos de ciertos vegetales, compuestos generalmente por terpenos, que están asociados o no a otros componentes, la mayoría de ellos volátiles, y generan en conjunto el olor de dichos vegetales (Guenther, 1948; Wijesekera, s.f.; Bauer, Garbe, & Surburg, 1990; Secondini, 1990; Sharapin, 2000; Bandoni, 2003; Burt, 2004; Bakkali et al., 2008). La palabra esencial fue derivada del latín “quinta essentia” que significaba el quinto elemento, asignado a estos aceites, ya que la tierra, el fuego, el viento y el agua, fueron considerados los cuatro primeros elementos según la idea aristotélica (Lock, 1994; Başer & Buchbauer, 2010). Más recientemente la norma AFNOR NF T 75-006 (febrero 1998) ha dado la siguiente definición de aceite esencial: “Producto obtenido a partir de una materia prima vegetal, bien por arrastre de vapor, o bien por procedimientos mecánicos a partir del epicarpio de los Citrus, o por destilación en seco. Posteriormente el aceite esencial se separa de la fase acuosa por procedimientos físicos en los dos primeros métodos de obtención; puede sufrir tratamientos físicos que no originen cambios significativos de su composición (por ejemplo, redestilación, aireación,…)”. Esta definición según procedimiento es restrictiva: excluye tanto los productos obtenidos por extracción con ayuda de disolventes como los obtenidos por cualquier otro procedimiento (gas a presión, “enfleurage”) (Wijesekera, s.f.; Bauer et al., 1990; Bruneton, 2001; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). Actualmente, las formulaciones basadas en los aceites esenciales naturales se encuentran en productos utilizados en la vida diaria como: bebidas, perfumes, artículos de tocador, cosméticos, alimentos, pinturas, barnices, plásticos, productos farmacéuticos, etc. (Wijesekera, s.f.; Tuley De Silva, 1985; Anónimo, 1986; Sacchetti, Maietti, Muzzoli, Scaglianti, Manfredini,…Bruni, 2005). 19 II.1.2.2 Propiedades físicas. Los aceites esenciales son sustancias volátiles lo que los diferencia de los aceites “fijos” y generalmente son líquidos a temperatura ambiente, aunque algunos solidifican a baja temperatura como, por ejemplo, la esencia de anís (Pimpinella anisum L.) y la esencia de palo santo (Bulnesia sarmientoi Lorentz ex Griseb). La mayoría son prácticamente transparentes, incoloros o ligeramente coloreados (amarillentos) con excepciones como la esencia de manzanilla alemana (Matricaria recutita L.), que contiene camazuleno de un intenso color azul. Generalmente son menos densos que el agua aunque también hay excepciones como las esencias de clavo (Syzygium aromaticum Merrill & Perry), canela (Cinnamomum verum J.S. Presl.), ajo (Allium sativum L.), gaulteria (Gaultheria procumbens L.) y sasafrás (Sassafras albidum (Nutt). Nees) que son más densas (Guenther, 1948; Secondini, 1990; Lock, 1994; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Bakkali et al., 2008). Suelen ser insolubles en agua pero solubles en grasas, disolventes orgánicos apolares y alcoholes de alta graduación. Presentan un poder rotatorio característico, en razón de que poseen en su composición numerosos productos ópticamente activos y la mayoría refractan la luz polarizada, propiedad que es utilizada para su control de pureza, pues tienen por ello un índice de refracción característico. Se descomponen por la exposición a la luz por lo que es necesario guardarlos en contenedores herméticos y en la oscuridad para evitar cambios en su composición (Guenther, 1948; Wijesekera, s.f.; Bauer et al., 1990; Lock, 1994; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Burt, 2004). II.1.2.3 Composición. Los aceites esenciales son mezclas complejas y muy variables de componentes y pueden comprender entre 60 y 200 compuestos diferentes. Los compuestos principales pueden constituir hasta el 85% del aceite esencial, mientras que otros componentes están presentes únicamente en trazas. Los componentes de los aceites esenciales pertenecen de manera casi exclusiva a dos grupos caracterizados por orígenes biogenéticos distintos: el grupo de los terpenoides biosintetizados a partir de los pirofosfatos de geranilo y farnesilo por una parte y el grupo de los compuestos aromáticos derivados del fenilpropano los 20 cuales se biosintetizan a partir de la ruta shikimato, mucho menos frecuentes, por otra. Pueden también contener diversos productos procedentes de procesos de degradación que afectan a constituyentes no volátiles (Wijesekera, s.f.; Secondini, 1990; Tuley De Silva, 1995; Lock, 1994; Bruneton, 2001; Burt, 2004; Handson, 2005; Edris, 2007; Bretmaier, 2006; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.3.1 Terpenoides. En los aceites esenciales únicamente se encontrarán los terpenos más volátiles, es decir, aquellos cuya masa molecular no es demasiado elevada: mono- y sesquiterpenos (Bruneton, 2001; Bretmaier, 2006; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.3.1.1 Monoterpenos. Son compuestos orgánicos de diez carbonos y casi siempre se encuentran hidrocarburos. Éstos pueden ser acíclicos (mirceno, ocimeno) monocíclicos (α- y γterpineno, p-cimeno) o bicíclicos (pinenos, Δ3 –careno, canfeno y sabineno). A veces constituyen más del 90% del aceite esencial: (Citrus spp., Pinus spp.). La reactividad de los cationes intermediarios justifica la existencia de numerosas moléculas funcionalizadas: - alcoholes: acíclicos (geraniol, linalol, citronelol), monocíclicos (mentol, αterpineol, 1-terpinen-4-ol), bicíclicos (borneol, fenchol) (Sacchetti et al., 2005; Bakkali et al., 2008); - aldehídos: generalmente acíclicos (geranial, neral, citronelal) (Sacchetti et al., 2005; Bakkali et al., 2008); - cetonas: acíclicas (tagetona), monocíclicas (mentona, isomentona, carvona, pulegona), bicíclicas (alcanfor, fenchona, tuyonas) ( Sacchetti et al., 2005; Bakkali et al., 2008); 21 - ésteres: acíclicos (acetato o propionato de linalilo, acetato de citronelilo), monocíclicos (acetato de mentílo, acetato de α-terpinilo), bicíclicos (acetato de isobornilo) (Sacchetti et al., 2005; Bakkali et al., 2008); - éteres: 1,8-cineol (llamado también eucaliptol), éter de eneldo; igualmente éteres cíclicos, tetrahidrofuránicos o di- y tetrahidropiránicos que, para algunos, juegan un papel principal en el aroma de los frutos (óxidos de linalol, óxidos de rosa)(Bakkali et al., 2008); - peróxidos: ascaridol (Dembitsky et al., 2008; Bakkali et al., 2008); - fenoles: timol, carvacrol (Sacchetti et al., 2005; Bakkali et al., 2008). Cuando la molécula es ópticamente activa, lo que ocurre casi siempre, la proporción de los dos enantiómeros varía considerablemente según la especie vegetal considerada. Uno de los dos puede ser ampliamente mayoritario, incluso prácticamente único (i.e.> 99%): (-)-Δ3 –careno de la fracción volátil de la oleorresina de pimienta negra, (+)-Δ3 – careno del aceite esencial de trementina (Pinus spp.), (+)-(S)-linalol mayoritario del cilantro, (-)-(R)-linalol casi puro de la albahaca y la lavanda, linalol casi racémico del fruto de la pasión; (+)-(S)-terpin-1-en-4-ol casi puro de la lavanda, (-)-(R)-terpin-1-en-4-ol preponderante del eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.), etc (Secondini, 1990; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Bakkali et al., 2008). II.1.2.3.1.2. Sesquiterpenos. Son compuestos orgánicos de 15 carbonos y las variaciones estructurales en esta serie son de la misma naturaleza que en el caso precedente, siendo los más frecuentes hidrocarburos, alcoholes y cetonas. Conviene señalar que el alargamiento de la cadena aumenta el número de ciclaciones posibles por medio del pirofosfato de farnesilo (FPP), de ahí la gran variedad de estructuras conocidas (se han descrito más de una centena de esqueletos diferentes). Entre los principales sesquiterpenos característicos de aceites esenciales están: hidrocarburos mono- o policíclicos (β-bisaboleno, β-cariofileno, longifoleno), alcoholes (farnesol, corotol, β-santalol, patchulol), cetonas (nootkatona, cis- 22 longipinano-2,7-diona, β-vetivona), aldehídos (sinensales), ésteres (acetato de cedrilo) (Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Bakkali et al., 2008). II.1.2.3.2 Compuestos aromáticos derivados del fenilpropano. Los derivados del fenilpropano (C6-C3) son mucho menos frecuentes que los terpenos. Se tratan generalmente de alil-y propenilfenoles, a veces de aldehídos, característicos de determinados aceites esenciales como el de anís (P. anisum ), hinojo (Foeniculum vulgare Miller), perejil (Petroselinum sativum Hoffm.), que contienen anetol, anisaldehído, apiol, metil-chavicol, etc., pero también de los de clavo (S. aromaticum), nuez moscada (Myristica fragans Houtt), estragón (Artemisia dracunculus L.), albahaca (Ocimum basilicum L.), ácoro (Acorus calamus L.), canelas (Cinnamomum spp.) que contienen eugenol, safrol, asaronas, cinamaldehído, etc. Igualmente se pueden encontrar en los aceites esenciales en C6-C1 como la vainillina (Vanilla planifolia Andrews) o como el antranilato de metilo (Vitis labrusca Raf.). Las lactonas derivadas de los ácidos cinámicos (i.e. las cumarinas) al ser, al menos las más sencillas de ellas, arrastrables por corriente de vapor de agua, se encontrarán en algunos aceites esenciales (Wijesekera, s.f.; Bruneton, 2001; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.3.3 Compuestos de orígenes diversos. Son compuestos que resultan de la transformación de moléculas no volátiles. Estos compuestos suelen contribuir al aroma de los frutos. Teniendo en cuenta su modo de preparación, los concretos y los absolutos los pueden contener. Igual ocurre con los aceites esenciales cuando son arrastrados por vapor de agua (Bruneton, 2001). II.1.2.3.3.1 Compuestos procedentes de la degradación de ácidos grasos. La peroxidación de los ácidos linoleico y α-linolénico induce su ruptura, la formación de ácidos en C9 o C12 y, posteriormente la de alcoholes, aldehídos y ésteres de pequeña masa molecular, ej.: (3-Z)-hexen-1-ol, (2-E)-hexenales y sus isómeros responsables del olor “verde” de las hojas, octanal, decanal, acetato de hexenilo, etc. Este tipo de derivado, 23 al igual que las metilcetonas, puede originarse a través de un mecanismo clásico de βoxidación. La hidroxilación de la insaturación de un ácido graso es necesaria para justificar la existencia de γ- y de δ-lactonas, ej.: masoialactonas de la corteza del aikor (Cryptocarya massoi (Oken) Kosterm.) de Irian Jaya, tuberolactona, etc. (Bruneton, 2001). A partir de los ácidos grasos se forman también compuestos como los ácidos jasmónicos y sus ésteres o las δ-jazmín-lactonas: (-)-R- jazmín-lactona del jazmín (Jasminum grandiflorum L.) o (+)-(S) -jazmín-lactona del nardo (Polianthes tuberosa L.) (Bruneton, 2001). II.1.2.3.3.2 Compuestos procedentes de la degradación de terpenos. C13 –norisoprenoides: los principales constituyentes de este grupo – las iononasprovienen de la auto-oxidación de los carotenos. Ampliamente distribuidos, como en la violeta (Saintpaulia ionantha H. Wendl.), se encuentran con frecuencia en los aromas de los frutos. Las damascenonas en rosa (Rosa spp.) y geranio (Pelarganium spp.) y las damasconas poseen un origen semejante (carotenoides alénicos) (Bruneton, 2001). Ironas: Estas cetonas en C14 son igualmente productos de degradación. Características del absoluto del lirio (Iris florentina L., Iris pallida Lamk., Iris germanica L.), no se encuentran preformadas, sino que aparecen durante el envejecimiento del rizoma. Provienen de la oxidación de triterpenos bicíclicos, los iridales (iripalidal, iriflorentinal, irigermanal libres o esterificados por ácidos grasos) (Bruneton, 2001). II.1.2.3.3.3 Otros compuestos. Los compuestos nitrogenados o azufrados, característicos de los productos torrefactados, tostados o asados, son más bien raros en los aceites esenciales: pirazinas y butenetioatos del gálbano (Ferula spp.), 2-acetil-4-isopropenilpiridina y otras piridinas del aceite esencial de hierbabuena (Mentha spicata L.). Se pueden encontrar también aminas alifáticas volátiles (metilamina, etilamina, etc.) que tienen olor a pescado y derivados del 24 indol que tienen olor fecal (heces). Los compuestos azufrados son todavía menos frecuentes que los compuestos nitrogenados, ya que ciertas especies contienen isotiocianatos (R-N=C=S) y otras contienen sulfuros (R-S-R) o disulfuros (R-S-S-R) (Bruneton, 2001). II.1.2.3.4 Existencia de quimiotipos. Los quimiotipos -llamados también razas químicas- que se definen como individuos de una misma especie que se diferencian entre sí por una distinta composición, son muy frecuentes en plantas con aceites esenciales. Unos de los ejemplos más demostrativos es el del tomillo (Thymus vulgaris L.) del Mediterráneo occidental. Se cuentan para esta especie morfológicamente homogénea y cariológicamente estable, siete quimiotipos diferentes: seis en los carrascales del sur de Francia (con timol, carvacrol, geraniol, linalol, α-terpineol, trans-4-tuyanol y cis-8-mircenol) y en España uno con cineol (Bruneton, 2001; Bandoni, 2003). Otro ejemplo notable es el de la salvia (Salvia officinalis L.) con notables variaciones de α-tujona, β-tujona, 1,8-cineol y alcanfor entre individuos de dicha especie (Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.3.5 Influencia del ciclo vegetativo. Para una especie determinada la composición de los diferentes constituyentes de un aceite esencial puede variar a lo largo de su desarrollo. Así, en la menta (Mentha x piperita), la disminución del contenido en (-)-mentona, observada a lo largo del ciclo vegetativo, corresponde a una reducción en (-)-mentol y (+)-neomentol: el contenido en ()-mentol (libre y esterificado) aumenta, el de (+)-neomentol no aumenta; al contrario, debido a su conversión en un derivado hidrosoluble, el glucósido de (+)-neomentilo. Habitualmente se observan variaciones en otras especies, a veces muy importantes; como en el hinojo, la zanahoria, el cilantro (en esta última el contenido en linalol es un 50% más elevado en el fruto maduro que en fruto verde), etc. (Bruneton, 2001; Bakkali et al., 2008; Nedorostova et al., 2009; Başer & Buchbauer, 2010). 25 II.1.2.3.6. Influencia de los factores extrínsecos. Influyen los factores del entorno y las prácticas del cultivo. La temperatura, la humedad relativa, la duración total de la insolación y el régimen de los vientos ejercen una influencia directa, sobre todo en especies que poseen estructuras histológicas de almacenamiento superficiales (ej.: pelos secretores de las Lamiaceae). Cuando la localización es más profunda la calidad es mucho más constante. Algunos ejemplos muestran la influencia de los factores extrínsecos: - en la menta los días largos y las noches templadas dan lugar a rendimientos más elevados en aceite esencial y a un aumento del contenido en mentofurano. Al contrario, las noches frías favorecen la formación de mentol (Bruneton, 2001); - en el laurel común (Laurus nobilis L.), el contenido en aceite esencial de las hojas expuestas al sur es superior al de las hojas expuestas al norte (Bruneton, 2001); - en ciertos cítricos (Citrus spp.), el contenido es tanto más importante cuanto más elevada es la temperatura (Bruneton, 2001). Las prácticas de cultivo son también determinantes en el rendimiento y la calidad del producto final. El aporte de abonos y la influencia de las variaciones N, P, K se han estudiado en diversas especies. La experiencia demuestra que no hay reglas generales aplicables en todos los casos (Secondini, 1990; Bakkali et al., 2008). II.1.2.4 Distribución. Los aceites esenciales se encuentran principalmente en vegetales superiores, aunque también se han encontrado en musgos, hepáticas, algas y hongos (Tuley De Silva, 1995). Los géneros capaces de elaborar los constituyentes que componen los aceites esenciales están repartidos en un número limitado de familias, ej.: clavo (S. aromaticum) y eucalipto (E. globulus) de la familia Myrtaceae, canela (C. verum) de la familia Lauraceae, limón (Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle) y naranja (Citrus x aurantium L.) de la familia 26 Rutaceae, menta (M. x piperita), melisa (Melissa officinalis L.), orégano (Origanum vulgare L.) y lavanda (Lavandula angustifolia Mill.) de la familia Lamiaceae, manzanilla (M. recutita) de la familia Asteraceae, anís (P. anisum), hinojo (F. vulgare) y cilantro (Coriandrum sativum L.) de familia Apiaceae, Ciprés (Cupressus spp.) de la familia Cupressaceae, té de limón (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf.) de la familia Poaceae, Jengibre (Zingiber officinale Roscoe) de la familia Zingiberaceae, pimienta (Piper nigrum L.) de la familia Piperaceae, etc. (Bruneton, 2003; Burt, 2004; Başer & Buchbauer, 2010). Los aceites esenciales pueden almacenarse en todos los órganos vegetales: en las flores de bergamota (Citrus x bergamia Risso & Poit), nardo (Poliamtha tuberosa L.) y manzanilla (M. recutita) igualmente en hojas de melisa (M. officinalis), eucalipto (E. citriodora), laurel (Litsea glaucescens HBK), boldo (Peumus boldus Molina) y, aunque sea menos habitual, en cortezas como la canela (C. verum), leños como en el leño de rosa (Aniba rosaeodora Ducke), sándalo (Santalum album L.) y alcanfor (Cinnamomum camphora (L.) Siebold); en raíces como la del vetiver (Chrysopogon zizanioides (L.) Roberty), rizomas como en cúrcuma (Curcuma longa L.) y jengibre (Z. officinale) y en frutos como la arañuela (Nigella damascena L.), anís verde (P. anisum), anís estrellado (Illicium verum Hook.f.), enebro (Juniperus communis Lam.) y en semillas como la nuez moscada (M. fragans), cardamomo (Elettaria cardamomum (L.) Maton.) y perejil (P. sativum) (Bruneton, 2003; Bakkali et al., 2008, Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.5 Localización Aunque todos los órganos de una misma especie pueden contener aceite esencial, la composición de este puede variar según su localización. Así por ejemplo, en el caso del naranjo amargo (C. x aurantium) el pericarpio fresco del fruto, proporciona el aceite esencial de naranja amarga o esencia de Curaçao, la flor produce esencia de Neroli y la hidrodestilación de la hoja, ramitas y pequeños frutos da lugar a la esencia de petit grain. La composición de estos tres aceites esenciales es diferente (Secondini, 1990; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Burt, 2004; Başer & Buchbauer, 2010). 27 Cuantitativamente, los contenidos en aceite esencial son más bien bajos, frecuentemente inferiores a 10 ml/Kg. Contenidos elevados como en los botones florales del clavero (150 ml/Kg o más en la droga seca) son excepcionales (Bruneton, 2001). Generalmente la síntesis y la acumulación de los aceites esenciales se asocian a la presencia de estructuras histológicas especializadas, a menudo localizadas sobre o en la proximidad de la superficie de la planta: células de la epidermis foliar con aceites esenciales de las Lauraceae o las Zingiberaceae, pelos secretores de las Lamiaceae, glándulas secretoras de las Myrtaceae o las Rutaceae, canales secretores de las Apiaceae o las Asteraceae (Bruneton, 2001; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.6 Función biológica En general, la función biológica de los aceites esenciales sigue estando poco clara. No obstante, es probable que tengan un papel ecológico. Apoya esta hipótesis el haber establecido experimentalmente el papel de algunos de ellos tanto, en el campo de las interacciones vegetales (agentes alelopáticos, especialmente inhibidores de la germinación) como en el de las interacciones vegetal-animal: protección contra los depredadores (insectos, hongos), y atracción de polinizadores. Otros autores sostienen que desempeñan una función de barniz para prevenir la evaporación excesiva del agua, entretanto que otros opinan que podrían constituir el soporte de una “comunicación” y tanto más en cuanto que su variedad estructural permite la transmisión de “mensajes biológicos” selectivos (Guenther, 1948; Bruneton, 2001; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.7 Propiedades terapéuticas de los aceites esenciales. Se debe tener en cuenta, que a veces se confunde la actividad terapéutica de un aceite esencial con la actividad terapéutica de la planta de la cual procede. Es preciso saber que tal superposición solo es posible en raras ocasiones: así el aceite esencial del romero (Rosmarinus officinalis L.) es antibacteriano mientras que la infusión de dicha especie se utiliza tradicionalmente en el tratamiento sintomático de diversos trastornos digestivos, en 28 base a las propiedades antiespasmódicas y coleréticas probablemente debidas a la presencia de compuestos fenólicos (Bruneton, 2001). II.1.2.7.1 Propiedad antiséptica. La propiedad antiséptica se manifiesta frente a diversas bacterias patógenas (Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Shigella dysenteria y Bacillus cereus), incluso cepas habitualmente resistentes a los antibióticos. Algunos aceites esenciales también son activos sobre hongos responsables de micosis, sobre levaduras (Candida albicans, Rhodotorula glutinis y Saccharomyces cerevisiae) y sobre virus de ADN y ARN, atribuyéndose la actividad citotóxica a la presencia de fenoles (timol, carvacrol) aldehídos (citral, citronelal) y alcoholes (mentol, linalol) (Bruneton, 2001; Burt, 2004; Saccheti et al., 2005; Edris, 2007; Bakkali et al., 2008). Generalmente las dosis activas son bajas y las que se determinan por experimentación in vitro se pueden transponer directamente para su uso por vía externa o, a fortiori, como conservador. Entre los aceites más antisépticos se encuentran el de ajedrea (Satureja spp.), canela (C. verum), tomillo (T. vulgaris), clavo (S. aromaticum), lavanda (L. angustifolia) o eucalipto (E. globulus). Compuestos como el linalol, citral, geraniol o timol son respectivamente 5; 5.2; 7.1 y 20 veces más antisépticos que el fenol (Bruneton, 2001; Burt, 2004; Warnke, Sherry, Russo, Açil, Wiltfang, Sivananthan,…Springer, 2006; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.7.2 Propiedad espasmolítica y sedante. Numerosas drogas con aceites esenciales son reputadas como eficaces para disminuir o suprimir los espasmos grastrointestinales. Es frecuente que estimulen la secreción gástrica por lo que se han calificado como “digestivas” y “estomáquicas”, con todas las consecuencias que puedan resultar de esta “eupepsia”: mejora de determinados insomnios y trastornos psicosomáticos diversos, disminución del “nerviosismo”, etc. Estos diversos efectos beneficiosos explican sin duda que las medicinas populares y las terapéuticas “suaves” y “domésticas” utilicen ampliamente estas drogas. In vitro, gran cantidad de 29 aceites esenciales (angélica, albahaca, manzanilla, clavo, melisa, menta y tomillo) ejercen una actividad espasmolítica marcada sobre el íleon aislado de cobaya (y, en menor medida, sobre la tráquea del mismo animal). Rara vez (anís, hinojo) se observa por el contrario un aumento de las contracciones fásicas de este órgano. Según trabajos realizados sobre el aceite esencial de menta, es posible que este tipo de actividad se deba a una inhibición de la entrada de calcio en las células (Bruneton, 2001; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.7.3 Propiedad irritante. Productos como la esencia de trementina, empleados por vía tópica, provocan aumento de la microcirculación, importante rubefacción, sensación de calor y, en ciertos casos, ligera acción anestésica local: esto es lo que se buscaba antiguamente en las embrocaciones y ungüentos. En la actualidad, son aún numerosas las pomadas, cremas o geles o base de aceites esenciales destinadas a aliviar esguinces, agujetas, distensiones y otras algias articulares o musculares (Bruneton, 2001; Başer & Buchbauer, 2010). Administrados por vía interna, los aceites esenciales desencadenan fenómenos de irritación a diferentes niveles. Por ejemplo, los de eucalipto, pino y niaulí estimulan las células con mucus y aumentan los movimientos del epitelio ciliado a nivel del árbol bronquial; otros favorecen la eliminación renal de agua por efecto local directo (enebro). La mayoría de las afirmaciones de este tipo carecen de argumento farmacológico (Bruneton, 2001). II.1.2.7.4 Otras propiedades importantes. Muchos aceites esenciales (E. globulus, L. angustifolia, C. verum, T. vulgaris, S. aromaticum, A. sativum, Melaleuca alternifolia Cheel, M. fragans, O. vulgare, Cymbopogon martini (Roxb.) Will.Watson, O. basilicum) han mostrado efectividad en el tratamiento de distintos tipos de cáncer, demencia, ansiedad, agitación en niños y ancianos, diabetes y actividad antioxidante (Burt, 2004; Warnke et al., 2006; Williams, 2006; Edris, 2007; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). 30 En recientes investigaciones se ha demostrado que los principales constituyentes de aceites esenciales que han presentado potente actividad biológica son: eugenol, timol, carvacrol, carvona, limoneno, miristicina, citral, 1,8-cineol, linalol, γ-terpineno, βbisabolol, terpinen-4-ol y geraniol (Burt, 2004; Edris, 2007; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.8 Métodos de obtención. Para la obtención de los aceites esenciales existen diferentes métodos que se utilizan en la actualidad (Bruneton, 2001). II.1.2.8.1 Métodos oficinales. Son los métodos contemplados en la Farmacopea para obtener los aceites esenciales de uso farmacéutico (Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.8.1.1 Destilación con agua. Este método también denominado “hidrodestilación”, tiene como principio llevar a estado de ebullición una suspensión acuosa de un material vegetal aromático, de tal manera que los vapores generados arrastren la esencia y luego sean condensados y colectados. El aceite esencial, que es inmiscible en agua, es posteriormente separado (Wijesekera, s.f.; Secondini, 1990; Sharapin, 2000; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Edris, 2007; Bakkali et al., 2010). Algunas especies vegetales tienden a formar suspensiones mucilaginosas al someterse a calentamiento en medios acuosos, lo cual dificulta severamente la extracción del aceite esencial y la consecución del proceso. Por ello es importante realizar pruebas preliminares a nivel de laboratorio antes de efectuar destilaciones a gran escala. 31 El equipo recomendado para realizar estas pruebas preliminares es el aparato tipo Clevenger descrito en la última edición de la Farmacopea Europea (Tuley De Silva, 1995, p. 15; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Nedorostova et al., 2009; Başer & Buchbauer, 2010). El tiempo total de destilación es función de los componentes presentes en al aceite esencial. Si el aceite contiene compuestos de alto punto de ebullición, el tiempo de destilación deberá ser mayor (Bandoni, 2003). Sin embargo, se ha determinado que el producto obtenido por hidrodestilación, es generalmente diferente de la mezcla de constituyentes inicialmente presentes en los órganos secretores del vegetal, debido a la labilidad de los constituyentes del aceite esencial (Bandoni, 2003). Durante la hidrodestilación, el agua, la acidez y la temperatura pueden inducir la hidrólisis de los ésteres pero también inducir reagrupamientos, isomerizaciones, racemizaciones, oxidaciones, etc. (Wijesekera, s.f.; Bruneton, 2001). II.1.2.8.1.2 Destilación por arrastre con vapor de agua. La extracción por arrastre con vapor de agua, puede considerarse el más sencillo, seguro e inclusive, el más antiguo, ya que se menciona en textos tan antiguos como la Biblia. Está basado en que la mayor parte de las partes olorosas que se encuentran en un material vegetal pueden ser arrastradas por el vapor de agua producido por una caldera separada del alambique y empujado a través de un tubo dentro del fondo del alambique (Secondini, 1990; Bauer et al., 1990; Bandoni, 2003; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). La destilación por arrastre con vapor que se emplea para extraer la mayoría de los aceites esenciales y consiste, en resumen, en una vaporización a temperaturas inferiores a las de ebullición de cada uno de los componentes volátiles por efecto de una corriente 32 directa de vapor de agua, la cual ejerce la doble función de calentar la mezcla hasta su punto de ebullición y disminuir la temperatura de ebullición por adicionar la tensión de vapor del vapor que se inyecta, a la de los componentes volátiles de los aceites esenciales (Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). En este método, la droga se coloca sobre unas rejillas dentro del alambique, a través de las cuales se hace pasar una corriente de vapor de agua que arrastra los aceites esenciales y luego los vapores que salen del cuello de cisne se enfrían en un condensador donde regresan a la fase líquida y entonces los dos productos inmiscibles, agua y aceite esencial, se separan por sus diferencias en densidades en un decantador o vaso florentino (Wijesekera, s.f.; Lock, 1994; Bandoni, 2003; Edris, 2007; Başer & Buchbauer, 2010). La destilación por arrastre con vapor de agua, es el método más comúnmente utilizado para la producción comercial de aceites esenciales y no ha podido ser sustituida por la extracción con solventes orgánicos o con calentamiento directo por la gran cantidad de ventajas que tiene en relación a estos dos últimos sistemas y que pueden resumirse en: - el vapor de agua es muy económico en comparación al costo de los disolventes orgánicos; - asegura que no se recaliente el aceite esencial; - no requiere el uso de equipos sofisticados; - resulta en un mayor rendimiento en aceite esencial y en pérdidas menores por hidrólisis; - existen pérdidas menores de sustancias polares (Sharapin, 2000; Bandoni, 2003; Burt, 2004). 33 II.1.2.8.1.3 Métodos de expresión aplicados a los cítricos. Este método consiste en exprimir los frutos para que liberen los aceites esenciales de las cavidades donde se localizan. Se aplican principalmente a los cítricos (Citrus spp.) y su aplicación se conoce desde el año 1776. Mecánicamente se punza o ralla la corteza del fruto y se hace pasar una corriente de agua que arrastra el zumo. Posteriormente los aceites esenciales se separan del agua por decantación o por centrifugación (Wijesekera, s.f.; Secondini, 1990; Bauer et al., 1990; Lock, 1994; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Edris, 2007; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.8.2 Métodos no oficinales. II.1.2.8.2.1 Extracción con disolventes. La extracción con disolventes es el proceso más avanzado en cuanto al aspecto técnico y produce olores verdaderamente característicos, pero es más costoso que la destilación (Secondini, 1990; Bauer et al., 1990; Edris, 2007). Los disolventes más utilizados, con la salvedad de legislaciones restrictivas especiales, son los hidrocarburos alifáticos: éter de petróleo, pentano, hexano y propano o butano líquidos a presión (Compadre, Hussain, Lopez de Compadre, Pezzuto, & Kinghorn, 1987; Souto-Bachiller, De Jesús-Echeverría, Cárdenas-González, Acuña-Rodriguez, Meléndez, & Romero- Ramsey, 1997; Bruneton, 2001). II.1.2.8.2.2 Obtención de oleorresinas. Aunque el término “oleorresina” se utiliza para designar a los exudados naturales ricos en aceites esenciales, también se utiliza para nombrar a los extractos de especias, que se obtienen por tratamiento de la droga seca con disolventes no acuosos. Los disolventes empleados son eliminados casi completamente por procesos de destilación al vacío, destilación azeotrópica, o ambas (Anónimo, 1986; Tuley De Silva, 1995; Sharapin, 2000). 34 Las oleorresinas contienen los aceites esenciales, los aceites fijos, los colorantes y los principios activos de la planta, por lo que, posteriormente, se pre a una purificación del extracto obtenido, según el fin que se quiera alcanzar (Anónimo, 1986; Sharapin, 2000). II.1.2.8.2.3 Obtención de concretos. Los concretos se obtienen de plantas aromáticas frescas por extracción con solventes apolares (hidrocarburos), principalmente hexano y éter de petróleo. Están constituidos por compuestos apolares y no contienen compuestos hidrosolubles. Generalmente se obtienen de flores y de los cogollos florecidos, aunque pueden también obtenerse de hojas y de las partes aéreas de las plantas herbáceas. En la práctica habitual se habla preferentemente de esencia concreta o, más sencillamente, de esencia (Anónimo, 1986; Bauer et al., 1990; Lock, 1994; Tuley De Silva, 1995; Sharapin, 2000; Bruneton, 2001). II.1.2.8.2.4 Obtención de absolutos. Los absolutos son productos de conversión de oleorresinas o concretos por la extracción con etanol absoluto. Una vez completa la disolución, los absolutos se refrigeran a temperaturas de -5°C a -10°C. A estas temperaturas las ceras se precipitan y pueden ser removidas por filtración. El rendimiento de concretos a partir de absolutos varía de 10 a 65% (Anónimo, 1986; Bauer et al., 1990; Tuley De Silva, 1995; Sharapin, 2000; Bruneton, 2001). II.1.2.8.2.5 Extracción con fluidos supercríticos. Los fluidos supercríticos presentan ventajas en los procesos de extracción, ya que al comportarse como un líquido facilita la disolución de los solutos, a la vez que, su comportamiento como gas permite una fácil separación de la matriz. Aunque en teoría se pueden utilizar varios gases, el interés se centra casi exclusivamente en el dióxido de carbono lo que se explica si se consideran sus ventajas: producto natural, químicamente inerte, no inflamable, estrictamente atóxico, fácil de eliminar totalmente, fácilmente disponible, selectivo, poco reactivo químicamente y poco costoso. 35 Aunque los inconvenientes tecnológicos no sean despreciables (el punto crítico se sitúa a P= 78.3 bares y T= 31.1°C) las ventajas son numerosas: capacidad de proporcionar extractos de composición muy próxima a la de los productos naturales, posibilidad de hacer variar la selectividad, la viscosidad, etc. variando la temperatura y la presión (extracción y fraccionamiento simultáneos), ausencia de hidrólisis y de reagrupamientos (Wijesekera, s.f.; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Edris, 2007; Bakkali et al., 2008; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.9 Análisis de aceites esenciales. Para la utilización de los aceites esenciales es necesario conocer su composición detallada, y sus características fisicoquímicas y organolépticas, como parámetros imprescindibles para establecer las normas que determinen sus requisitos mínimos de calidad. A estas determinaciones habrá que agregarles los ensayos que aseguren su eficacia y la inocuidad de su uso (Bandoni, 2003). II.1.2.9.1 Determinación del rendimiento del aceite esencial de un material vegetal. El método más tradicionalmente utilizado para realizar la determinación del rendimiento del aceite esencial la materia vegetal es el que prescriben la mayoría de las farmacopeas, como la Farmacopea Europea. Se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso conocido de material vegetal con aparato tipo Clevenger y recoger el aceite esencial en el tubo graduado que se encuentra en el colector de destilación especialmente diseñado para este tipo de análisis. El colector se acopla a un matraz que contiene el material vegetal a investigar y un cierto volumen de agua, que se calienta mediante un sistema de potencia regulable para provocar la destilación y regular su velocidad (Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). 36 Tras la destilación, se puede medir el volumen de esencia destilado y fácilmente calcular el contenido, que se expresa en porcentaje volumen/peso (ml de aceite esencial por 100g de material vegetal) (Bandoni, 2003). II.1.2.9.2 Análisis de la composición de los aceites esenciales. Los aceites esenciales son mezclas que pueden llegar a ser muy complejas, por lo tanto, la identificación de sus componentes no es una tarea simple. Antiguamente, esta identificación se convertía en una larga y tediosa operación, que consumía mucho tiempo, ya que requería el aislamiento y purificación de cada componente y su posterior determinación estructural por métodos químicos tradicionales (Bandoni, 2003). Por ello, el control de aceites esenciales se limitaba en buena parte a la determinación de sus constantes físicoquímicas o algunos índices químicos. La evaluación de estas constantes se mantiene todavía en las tareas de control de calidad a nivel industrial, por la sencillez del método y la rapidez de obtención de resultados (Bandoni, 2003). En las últimas décadas, el desarrollo de diferentes técnicas instrumentales de análisis y su acoplamiento a sistemas informáticos y bases de datos, ha cambiado sustancialmente el panorama, agilizando de forma notable la identificación de los componentes de las esencias. Han contribuido especialmente a este cambio, el desarrollo de: - técnicas cromatográficas de alta resolución, principalmente la CG con columnas capilares; - técnicas espectroscópicas, particularmente la espectrometría de masas (EM), la espectroscopía infrarroja (IR) y la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) (Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). 37 II.1.2.9.3 Cromatografía en fase gaseosa. La CG es una técnica de separación de exigencia farmacopéica basada principalmente en fenómenos de partición entre una fase móvil gaseosa (helio, argón, hidrógeno, nitrógeno) y una fase estacionaria constituida por un líquido muy viscoso retenido en el interior de una columna cromatográfica. La distinta afinidad por esta fase estacionaria por parte de cada uno de los componentes que constituyen la mezcla en análisis determina la separación de los mismos: podrán algunos compuestos ser fuertemente afines a la fase estacionaria, por lo que son retenidos en la misma y saldrán de la columna cromatográfica después de un largo período de tiempo. En el otro extremo podrán existir componentes que sean muy poco afines a la fase estacionaria, y saldrán de la columna casi inmediatamente. En la medida que existan componentes con distintas afinidades, se irán desperdigando dentro de la columna, por lo que se logrará finalmente su separación en un espacio de tiempo relativamente corto (Tuley De Silva, 1995; Skoog, Holler, & Nieman, 1998; Sharapin, 2000; Bruneton, 2001; Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). La columna se coloca en un horno con temperatura regulable y programable, lo que nos permite influir de forma decisiva en la separación de los componentes de la mezcla. El cromatógrafo se completa con un sistema de inyección, que nos permite introducir la muestra en la columna, y un detector que acusa la presencia de las diferentes sustancias a medida que van saliendo de la columna, una vez separadas. La salida de las sustancias de la columna es registrada bajo la forma de picos que deben ser simétricos y sin superposición. La asimetría y la superposición indican una separación defectuosa. Los picos asimétricos pueden indicar fallas en la inyección, un exceso de la muestra, o pérdida de la eficiencia de la fase estacionaria. El análisis con temperatura programada da como resultado una mejor simetría de los picos y una mejor detección de sustancias de alto peso molecular y un mejor análisis de muestras con sustancias cuyos componentes presentan grandes variaciones de peso molecular (Tuley De Silva, 1995; Skoog et al., 1998; Sharapin, 2000; Bandoni, 2003). 38 Las columnas cromatográficas utilizadas actualmente son de tipo capilar: están constituidas por un tubo de cuarzo flexible (sílice fundido) normalmente de 0.25 mm de diámetro y de 25 a 60 m de largo incluso hasta 200 m. Proporcionan alta resolución y permiten separar las mezclas multicomponentes de sustancias de diversa polaridad y / o peso molecular (monoterpenos, sesquiterpenos, etc.). Para el análisis de aceites esenciales suelen emplearse dos tipos de fases estacionarias: polietilenglicol de peso molecular 20,000 (Carbowax 20 M®), que es una fase polar, y polidimetilsiloxano (OV-101®, Ultra 1®, HP-1®, DB-1®, etc.), que es una fase apolar (Bandoni, 2003; Skoog et al., 1998; Başer & Buchbauer, 2010). La CG no sólo es útil para estudiar la composición de un aceite esencial, sino que también es una herramienta indispensable en el control de calidad (Bandoni, 2003). Existen dos tipos de CG de acuerdo con la fase estacionaria: la cromatografía gas-sólido y la cromatografía gas-líquido. El mecanismo de separación en la cromatografía gas-sólido se lleva a cabo por adsorción física y química en una fase estacionaria sólida. Esta cromatografía presenta una mayor estabilidad de los adsorbentes y se pueden utilizar temperaturas más elevadas. El proceso es adecuado para el análisis de gases, complejos polares y sustancias de bajo peso molecular pudiendo ser utilizados para sustancias con la misma capacidad de adsorción pero con volatilidad diferente (Skoog et al., 1998; Sharapin, 2000). Por su parte, la cromatografía gas-líquido consiste en un sistema en que la fase estacionaria es un líquido poco volátil que recubre un soporte sólido o las paredes de la columna. El mecanismo de separación se produce mediante partición de las moléculas de la muestra entre la fase estacionaria y la fase móvil (líquida y gaseosa). Esta modalidad se utiliza en más del 95% de las aplicaciones de la CG y su aplicación abarca todos los campos de la ciencia (Skoog et al., 1998; Sharapin, 2000). 39 Para una mayor eficiencia en el análisis, la fase líquida debe solubilizar selectivamente las sustancias de la muestra, debe ser termoestable, presentar una baja volatilidad a la temperatura en la cual se realiza el análisis y ser químicamente inerte en relación con los componentes de la muestra (Skoog et al., 1998; Sharapin, 2000). II.1.2.9.3.1 Detector de ionización por llama. El detector del cromatógrafo de gases puede ser de dos tipos: universal o selectivo. El más utilizado en el caso de los aceites esenciales es el de ionización por llama (FID, por su nombre en inglés: Flame Ionization Detector), que es de tipo universal y posee una alta sensibilidad. Las moléculas de la muestra, que están presentes en el gas de arrastre, llegan al detector y son quemadas por la llama producida por la combustión de aire e hidrógeno, dando como resultado la formación de iones los cuales son reunidos en un electrodo colector que genera una corriente, que es convertida en voltaje, y posteriormente amplificada para ser captada por el registrador (Sharapin, 2000; Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). II.1.2.9.3.2 Índices de retención. Para la identificación de los componentes de un aceite esencial mediante CG se ha utilizado frecuentemente la comparación de sus tiempos de retención (tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición del pico cromatográfico) con los patrones. Sin embargo, los tiempos de retención están fuertemente influenciados por numerosas variables, como la técnica de inyección, las variaciones de temperatura o flujo de los gases, el diseño del equipo, etc. Por este motivo ha sido necesaria la introducción de parámetros relativos como son los tiempos de retención relativos y los índices de retención. Estos se calculan a partir de los tiempos de retención y por comparación con una serie de sustancias a las cuales se les asignan valores arbitrarios de índices de retención. Los más utilizados son los Índices de Kováts, introducidos por Kováts en 1958 y definidos respecto a una serie de n-alcanos. 40 A veces, para el cálculo de los índices de retención se emplean series de ésteres metílicos o etílicos de ácidos orgánicos alifáticos y series de hidrocarburos sesquiterpénicos (Tuley De Silva, 1995; Bandoni, 2003; Başer & Buchbauer, 2010). La identificación de los componentes de un aceite se realiza a través de comparación de los índices de retención de las sustancias patrones en dos fases estacionarias, polar y apolar, con los índices obtenidos para los componentes del aceite esencial. Existen recopilaciones muy importantes de estos índices, realizadas por Jennings y Shibamoto en 1980, Davies en 1990 y Adams en 1995 y 2001, entre otros, y varias bases de datos comerciales (Adams, 2001; Bandoni, 2003). Si bien la información que proporcionan los índices de retención respecto a la identidad de los componentes de la esencia es muy valiosa, la identificación de los mismos no puede basarse exclusivamente en ellos, ya que muchos componentes tienen índices coincidentes o muy similares en ambas columnas. Por ello, es necesario aplicar otras técnicas, entre las cuales se destaca la CG acoplada a la espectrometría de masas y la resonancia magnética nuclear de carbono 13 (13 C-RMN) (Bandoni, 2003). II.1.2.9.3.3. Cuantificación de componentes. Por lo general, la cuantificación de los componentes de un aceite esencial se efectúa por normalización de las áreas de los picos del cromatograma obtenido con un detector FID. No suelen utilizarse factores de corrección. Esta simplificación, que supone que todos los componentes de la esencia son volátiles y tienen el mismo grado de respuesta al detector, es comúnmente aceptada dada la dificultad para disponer de los patrones necesarios para otros tipos de análisis más exactos, como por ejemplo con un patrón interno (Bandoni, 2003). 41 II.1.2.9.3.4 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Durante las dos últimas décadas se ha demostrado que uno de los métodos más eficientes para el estudio de la composición de los aceites esenciales es la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (CG-EM). Es un método muy adecuado para la identificación debido a que los componentes del aceite son compuestos volátiles y de bajo peso molecular (< 300 dalton). La esencia se inyecta directamente en el cromatógrafo, sin ningún tratamiento previo, lo cual elimina posibles modificaciones en la composición de la muestra o en la estructura de sus constituyentes debidas a pretratamiento. No se eliminan las alteraciones debidas a la temperatura de análisis, que puede afectar componentes termosensibles. En el cromatógrafo, los componentes de la esencia se separan, tras lo cual penetran en el espectrómetro de masas, que permite registrar el correspondiente espectro de cada una de las sustancias separadas. Los constituyentes del aceite esencial se identifican gracias a los diferentes patrones de fragmentación que se observan en sus espectros de masas (Bandoni, 2003; Skoog et al., 1998; Başer & Buchbauer, 2010). La CG-EM permite realizar en una sola operación, para una muestra del orden de 1µl, un análisis cualitativo junto con una indicación de las proporciones en las que se encuentran los componentes. Cuando se dispone de sustancia patrón, la calibración del equipo permite un análisis cuantitativo exacto de la muestra (Bandoni, 2003). Es posible determinar índices de retención en la CG-EM, pero éstos pueden no ser comparables con los bibliográficos, que generalmente se han obtenido con cromatógrafos no acoplados a un espectrómetro (Bandoni, 2003). 42 PARTE III III.1 RESULTADOS III.1.1 Información de colecta de plantas aromáticas. Se detalla la información de colecta de las plantas aromáticas colectadas en diferentes sitios de la República de Guatemala (Tabla 1). Se realizó la colecta de 26 especies vegetales aromáticas las cuales representan a 12 familias botánicas diferentes. Se colectaron tanto plantas silvestres como plantas cultivadas, principalmente en huertos familiares. De un considerable número de las especies colectadas, fue posible el depósito de especímenes de herbario en el Herbario de la Escuela de Biología –BIGU- de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. Tabla 1. Datos de campo de las especies vegetales colectadas en diferentes sitios de la República de Guatemala. Especie Código Órgano colectado Localidad de colecta Coordenadas geográficas /Altitud Número de herbario Fecha de colecta Estado de colecta Satureja viminea L. (Lamiaceae) Sv Hojas Aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango N 14° 41̍ 28.1 ̎ O 090° 57̍ 04.8 ̎ 2,179 mnsm BIGU 72835 10/07/2014 Huerto familiar Agastache rugosa Ar Partes aéreas Caserío Xejuyú, San Andrés Semetabaj, Sololá N 14° 44 ̍ 20.20 ̎ O 091° 07 ̍ 31.60 ̎ 2,012 msnm BIGU 72841 15/10/2014 Huerto familiar Pd-f Fruto Comunidad de Barra Lampara, Livingston, Izabal N 15° 46 ̍ 56.9 ̎ O 088° 47 ̍ 29.9 ̎ 13 msnm -- 10/08/2014 Huerto familiar Pd-h Hoja Comunidad de Barra Lampara, Livingston, Izabal N 15° 46 ̍ 56.9 ̎ O 088° 47 ̍ 29.9 ̎ 13 msnm BIGU 72838 10/08/2014 Huerto familiar Lg Hoja Mercado de Sololá -- -- 27/08/2014 -- Ag Acículas N 14° 47 ̍ 54.8 ̎ O 090° 58 ̍ 59.2 ̎ 2,538 msnm Pendiente 26/08/2014 Plantación comercial (Fisch. & C.A. Mey.) Kuntze (Lamiaceae) Pimenta dioica (L.) Merr. (Myrtaceae) Pimenta dioica (L.) Merr. (Myrtaceae) Litsea guatemalensis Mez (Lauraceae) Abies guatemalesnsis Rehder (Pinaceae) Finca Chichavac, Tecpán Guatemala, Chimaltenango 43 Foeniculum vulgare Mill. (Apiaceae) Salvia microphylla Kunth (Lamiaceae) Cedrela odorata L. (Meliaceae) Ocimum micranthum Willd. (Lamiaceae) Valeriana prionophylla Willd. (Caprifoliaceae) Tagetes filifolia Lag. (Asteraceae) Valeriana prionophylla Willd. (Caprifoliace ae) Artemisia ludoviciana Nutt. (Asteraceae) Tagetes lucida Cav. (Asteraceae) Tagetes tenuifolia Cav. (Asteraceae) Lippia graveolens Kunth (Verbenaceae) Lippia graveolens Kunth (Verbenaceae) Piper peltatum L. (Piperaceae) Piper martensianum C.DC (Piperaceae) Fv Partes aéreas Aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango N 14° 41̍ 28.3 ̎ O 090° 57̍ 04.8 ̎ 2,179 msnm BIGU 72844 10/07/2014 Huerto familiar Sm Partes aéreas Aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango N 14° 41̍ 28.3 ̎ O 090° 57̍ 04.6 ̎ 2,179 msnm BIGU 72843 10/07/2014 Huerto familiar Co Hojas N 16° 59ˈ 54.0 ̎ O 089° 42ˈ05.58 ̎ 135 msnm Pendiente 14/09/2018 Silvestre Om Partes aéreas Frente a hotel Camino Real, El Remate, Petén Aldea Creek Caliz, Livingston, Izabal N 15° 42 ̍ 36.9 ̎ O 088° 54 ̍ 24.9 ̎ 34 msnm BIGU 72840 24/06/2014 Silvestre Vp-SJO Raíces Aldea Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos N 15° 12̍ 45̎ O 091° 57̍ 29̎ 3, 350 msnm Pendiente 04/07/2014 Silvestre Tf Partes aéreas Aldea La Brea, Quesada, Jutiapa N 14° 20ˈ 23.3" O 090° 04ˈ 24.4" 1,392 msnm -- 19/09/2018 Silvestre Aldea Ciénaga grande, Santa Lucía Utatlán, Sololá N 14° 47ˈ 13.5" O 091° 15ˈ 20.6" 2,347 msnm Pendiente 21/03/2019 Silvestre Vp-SLU Raíces Al Partes aéreas Aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango N 14° 41̍ 28.6 ̎ O 090° 57̍ 04.3 ̎ 2,179 msnm BIGU 72833 10/07/2014 Huerto familiar Tl Partes aéreas Aldea Estanzuela, Joyabaj, Quiché N 14° 59ʻ 17.7 ̎ O 090° 52ʻ 23.4 ̎ 1,557 msnm BIGU 72845 19/06/2014 Silvestre Tt Partes aéreas Planta de Tratamiento Los Cebollales, Panajachel, Sololá Aldea San José, Teculután, Zacapa N 14° 44 ̍ 10.91 ̎ O 091° 09 ̍ 22.10 ̎ 1,570 msnm BIGU 72837 16/10/2014 Silvestre N 14° 59ʻ 03.6 ̎ O 089° 41ʻ 39.9 ̎ 233 msnm BIGU 72834 23/06/2014 Silvestre Lg-TZ Hojas Lg-ES Hojas Aldea El Subinal, Guastatoya, El Progreso N 14° 51ʼ 21.1 ̎ O 090° 08ʼ 01.0 ̎ 536 msnm BIGU 72836 18/11/2014 Silvestre Pp-SLP Partes aéreas Aldea Quebrada Seca, San Luis, Petén N 15° 58ʼ 46.4 ̎ O 089° 16ʼ 47.9 ̎ 131 msnm Pendiente 21/11/2018 Silvestre Pm Hojas Carretera de terracería hacia Cerro Brujo, Concepción Las N 14° 28ʼ 15.9 ̎ O 089° 26ʼ 34.0 ̎ 932 msnm Pendiente 27/09/2018 Silvestre 44 Minas, Chiquimula Carretera de terracería hacia Cerro Brujo, Concepción Las Minas, Chiquimula Carretera entre San José Chacayá y Santa Lucía Utatlán Comunidad de Cayo Quemado, Livingston, Izabal N 14° 28ʼ 17.2 ̎ O 089° 26ʼ 57.1 ̎ 932 msnm Pendiente 27/09/2018 Silvestre N 14° 46 ̍ 40.66 ̎ O 091° 13 ̍ 56.41 ̎ 2, 341 msnm BIGU 72832 12/09/2014 Silvestre N 15° 46 ̍ 35.4 ̎ O 088° 49 ̍ 14.0 ̎ 11 msnm BIGU 72846 10/08/2014 Huerto familiar La Cumbre de El Chol, El Chol, Baja Verapaz N 14° 58ʻ 57.8 ̎ W 090° 28ʻ 18.7 ̎ 1,372 msnm BIGU 72831 16/06/2014 Silvestre Hojas Carretera entre aldea la Ruidosa y Río Dulce, Izabal N 15° 32ˈ 15.0 ̎ W 088° 50ˈ 29.5 ̎ 149 msnm Pendiente 16/03/2019 Silvestre Ps-RD Hojas Carretera entre Río Dulce y Poptún, Izabal N 15° 43ˈ 49.0 ̎ W 089° 03ˈ 44.1 ̎ 50 msnm Pendiente 16/03/2019 Silvestre Piper sp. (Piperaceae) Ps-CLM Hojas Concepción Las Minas, Chiquimula N 14° 28ˈ 06.3 ̎ W 089° 25ˈ 25.2 ̎ 1,225 msnm Pendiente 09/03/2019 Silvestre Piper sp. (Piperaceae) Ps-ER Hojas Aldea El Remate, Flores, Petén N 16° 59ˈ 38.7 ̎ W 089° 43ˈ 06.5 ̎ 126 msnm Pendiente 14/09/2018 Silvestre Orbignya co hune (Mart.) Dahlgren ex Standl. (Arecaceae) Stevia serrata Cav. (Asteraceae) Stevia serrata Cav. (Asteraceae) Oc Inflorescencias Mercado de La Florida, zona 19, ciudad de Guatemala -- Pendiente 18/03/2019 Silvestre Ss-SQ Partes aéreas N 14⁰ 51ˈ50.2" O 091⁰ 28ˈ19.9" 2,352 msnm Pendiente 11/07/2108 Silvestre Ss-SLU Partes aéreas Salcajá, cerca de paso a desnivel, Quetzaltenango Carretera de San José Chacayá a Santa Lucía Utatlán, Sololá Carretera entre Santa Cruz del Quiché y Chiché, Quiché N O 14⁰ 46ˈ40.4" 091⁰ 14ˈ41.5" 2,430 msnm Pendiente 11/09/2018 Silvestre N 15⁰ 01ˈ 42.5" O 091⁰ 06ˈ 04.1" 2,075 msnm Pendiente 10/09/2018 Silvestre Piper patulum Bertol. (Piperaceae) Pp-CLM Hojas Stevia serrata Cav. (Asteraceae) Ss Partes aéreas Cymbopogon citratus (Poaceae) Cc Hojas Lippia salamensis (Verbenaceae) Ls Hojas Piper jacquemontianum Kunth (Piperaceae) Pj Piper sp. (Piperaceae) Stevia Ss-CH Partes serrata Cav. aéreas (Asteraceae) Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 45 III.1.2 Rendimientos de aceite esencial y humedades de plantas aromáticas. Se detallan los rendimientos de aceite esencial y humedades de material vegetal fresco de las plantas aromáticas colectadas en diferentes sitios de la República de Guatemala (Tabla 2). Tabla 2. Rendimientos de aceite esencial y humedades de material vegetal fresco de plantas aromáticas de diferentes sitios de la República de Guatemala. Especie vegetal Sv Ar Pd-f Pd-h Lg Ag Fv Sm Co Om Vp-SJO Tf Vp-SLU Humedad material fresco (%) 82.65 84.46 83.65 78.68 76.34 77.23 42.52 46.23 44.28 72.34 69.67 71.12 34.45 42.13 37.89 82.26 83.12 84.20 88.84 91.43 92.48 84.26 87.11 86.98 82.69 84.41 -88.23 89.41 88.72 75.34 72.78 72.41 84.23 --68.86 69.21 68.12 Peso seco material vegetal (g) 50.00 50.00 30.10 50.00 50.00 30.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 30.00 30.00 50.00 90.00 90.00 50.00 50.00 95.00 50.00 50.00 200.00 50.00 160.00 -50.00 50.00 50.00 50.00 70.00 110 34.60 --300.00 150.00 150.00 Peso del aceite esencial (g) 1.63 1.53 0.94 0.32 0.25 0.19 0.77 0.71 0.79 0.47 0.37 0.70 0.31 0.18 0.20 0.09 0.13 0.17 0.44 0.38 0.69 0.18 0.15 0.68 0.19 0.77 -0.33 0.29 0.31 0.06 0.11 1.71 0.02 --0.17 0.06 0.10 Rendimiento aceite esencial (%) 3.25 3.05 3.13 0.64 0.49 0.64 1.53 1.42 1.58 0.93 0.73 1.40 0.62 0.59 0.68 0.17 0.14 0.19 0.88 0.76 0.72 0.36 0.30 0.34 0.38 0.48 -0.65 0.57 0.62 0.11 0.15 1.55 0.06 --0.06 0.04 0.07 X ± DE rendimientos de aceite esencial 3.14±0.10 Peso total del aceite esencial (g) 4.10 0.59±0.09 0.76 1.51±0.08 2.27 1.02±0.34 1.54 0.63±0.05 0.69 0.17±0.03 0.39 0.79±0.08 1.51 0.33±0.03 1.01 0.43±0.07 0.96 0.61±0.04 0.93 0.60±0.82 1.88 0.06±0.00 0.02 0.06±0.02 0.33 46 Al Tl Tt Lg-TZ Lg-ES Pp-SLP Pm Pp-CLM Ss Cc Ls Pj Ps-RD Ps-CLM Ps-ER Oc Ss-SQ Ss-SLU Ss-CH 84.23 82.23 81.02 84.32 82.32 82.89 78.32 81.23 -82.32 79.89 81.03 86.34 85.09 -88.93 87.38 -88.36 89.74 -87.02 87.86 -77.45 75.23 76.89 82.36 79.32 83.78 78.23 76.35 77.56 74.92 76.23 -73.02 --68.73 --76.23 72.34 -88.23 --69.24 71.37 -69.40 --67.46 -- 100.00 100.00 25.40 100.00 100.00 50.00 100.00 100.00 -100.00 50.50 50.50 100.50 100.50 -100.00 100.00 -100.00 100.00 -100.50 75.10 -100.00 100.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 50.00 38.00 50.00 50.00 -43.60 --50.00 --50.00 50.00 -151.5 --50.00 50.00 -50.00 --50.00 -- 0.39 0.42 0.28 0.36 0.32 0.16 0.04 0.06 -0.87 2.07 1.65 0.93 0.42 -0.04 0.05 -0.20 0.21 -0.75 0.74 -0.20 0.19 0.11 0.55 0.58 0.50 0.56 0.57 0.42 0.45 0.55 -0.05 --0.18 --0.18 0.17 -0.0016 --0.10 0.09 -0.06 --0.04 -- 0.39 0.42 1.10 0.36 0.32 0.32 0.04 0.06 -0.87 4.11 3.27 0.93 0.42 -0.04 0.05 -0.20 0.21 -0.75 0.99 -0.20 0.19 0.21 1.10 1.15 1.00 1.11 1.14 1.11 0.89 1.10 -0.12 --0.37 --0.36 0.33 -0.001 --0.20 0.18 -0.12 --0.08 -- 0.64±0.40 1.09 0.33±0.02 0.84 0.05±0.01 0.10 2.75±1.68 4.59 0.68±0.36 1.35 0.05±0.01 0.09 0.21±0.01 0.41 0.87±0.17 1.49 0.20±0.01 0.50 1.08±0.08 1.63 1.12±0.02 1.55 1.00±0.15 1.00 0.12±0.00 0.053 0.37±0.00 0.18 0.35±0.02 0.35 0.001±0.00 0.0016 0.19±0.01 0.19 0.12±0.00 0.06 0.08±0.00 0.04 47 ------Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 ---- ---- III.1.3 Composición del aceite esencial de plantas aromáticas. Se presentan los índices de Kovats (IK) y las concentraciones de los constituyentes del aceite esencial de plantas aromáticas colectadas en diferentes sitos de la República de Guatemala, obtenidos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (Tabla 3). Tabla 3. Composición del aceite esencial de plantas aromáticas colectadas en diferentes sitios de la República de Guatemala IK Compuesto 930 α-thujene 939 α-pineno 954 975 979 985 990 999 Camfeno Sabineno β-pineno 6-metil-5-hepten-2-ona Mirceno Alcohol yomogi 1017 1024 1029 1031 1037 1050 1059 α-terpineno p-cimeno Limoneno Eucaliptol (Z)-β-ocimeno Trans-ocimeno γ-terpineno 1072 1088 1096 1169 1177 1188 1205 3,8-p-mentadieno Isoterpinoleno Linalol Borneol Terpinen-4-ol α-terpineol Verbenona 1237 Pulegona 1250 1294 Chavicol 2-etil-isomentona Sv Ar Pd-f Pd-h Lg 0.01 0.24 4.01 1.25 0.09 0.33 2.73 10.03 10.73 1.04 28.2 1.49 0.69 0.71 0.12 6.2 1.56 1.05 1.75 1.17 1.5 38.58 3.68 1.1 0.31 0.04 0.82 0.62 0.57 0.79 10.06 2.79 4.78 14.63 0.62 50.26 37.64 3.05 2.24 38.43 48 1359 1375 1376 1408 1419 Eugenol α-ylangeno α-copaeno (Z)-cariofileno (E)-cariofileno 1436 1454 1460 1481 1493 1512 1523 γ-elemeno α-humuleno Allo-aromadendreno Germacreno D cis-β-guaieno δ-amorfeno δ-cadineno 1532 (Z)-nerolidol 1578 1583 1608 Espatulenol Óxido de cariofileno β-atlantol 1623 1644 1650 10-epi-γ-eudesmol Selina-3,11-dien-6-α-ol β-eudesmol 71.37 0.74 76.17 0.49 1.54 4.75 1.21 0.24 4.18 0.79 5.18 4.17 1.11 0.82 0.55 0.6 0.88 0.58 1.27 1.26 0.66 0.5 0.69 0.67 1.28 2.2 1653 Pogostol Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 0.65 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto 930 939 α-thujene α-pineno Ag Fv Sm 0.98 0.66 3.98 952 954 α-fencheno Camfeno 975 979 985 990 Sabineno β-pineno 6-metil-5-hepten-2-ona Mirceno 0.73 2.35 0.88 0.76 1011 δ-3-careno 6.21 3.12 1024 1026 1029 1031 1037 1059 1086 p-cimeno o-cimeno Limoneno Eucaliptol (Z)-β-ocimeno γ-terpineno Fenchona 1096 1146 Linalol Alcanfor 10.14 Co Om 2.37 1.1 13.8 0.87 3.55 0.63 0.47 0.7 1.03 6.59 1.84 6.18 5.4 1.66 1.63 2.99 1.08 8.05 49 1169 1177 1188 1196 1284 Borneol Terpinen-4-ol α-terpineol Metil chavicol (E)-anetol 1285 1285 1351 1359 1375 1388 1390 Acetato de isobornilo Acetato de bornilo α-cubebeno Eugenol α-ylangeno β-cubebeno β-elemeno 1400 Sibireno 1403 1408 1417 Metil eugenol (Z)-cariofileno α-santaleno 1419 1442 1446 (E)-cariofileno (Z)-β-farneseno Seycheleno 1450 1454 1456 1456 1481 1492 1494 cis-muurola-3,5-dieno α-humuleno (E)-β-farneseno α-patchuleno Germacreno D δ-selineno epi-cubebol 1505 1505 β-bisaboleno (E,E)-α-farneseno 1509 1512 1515 1518 1522 Germacreno A δ-amorfeno Cubebol Nootkateno β-sesquifelandreno 1550 1575 1583 1590 1600 1608 1650 α-agarofurano Germacreno D-4-ol Óxido de cariofileno Globulol Guaiol Epóxido de humuleno II β-eudesmol 2057 Manool Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 0.54 0.6 0.81 0.97 0.52 3.19 75.16 3.36 0.86 1.49 32.42 0.87 2.94 10.26 6.78 1.4 1.03 10.07 30.44 1 4.89 5.01 5.37 0.7 1.03 8.54 3.94 5.29 1.81 1.18 2.95 9.81 2.86 2.5 1.1 6.51 13.29 0.76 5.77 0.54 28.8 4.67 0.94 7.59 2.02 2.42 0.93 5.38 10.83 7.69 3.18 11.35 1.7 1.38 6.56 50 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto Vp-SJO 835 939 Ácido isovalérico α-pineno 43.08 946 954 975 990 1024 1031 1037 3-metil-ácido valérico Camfeno Sabineno Mirceno p-cimeno Eucaliptol (Z)-β-ocimeno 37.59 1065 1096 1144 1146 1152 Acetofenona Linalol (E)-tagetona Alcanfor (Z)-tagetona 0.29 1169 1177 Borneol Terpinen-4-ol 1188 1196 1237 1284 1285 1290 1299 α-terpineol Metil chavicol Pulegona (E)-anetol Acetato de isobornilo Timol Carvacrol 1359 1403 1408 1419 1481 1492 1578 Eugenol Metil eugenol (Z)-cariofileno (E)-cariofileno Germacreno D (E) -metil isoeugenol Espatulenol Tf Vp-SLU Al Tl 60.44 0.53 24.39 1.46 3.25 0.79 1.16 21.66 1.14 1.98 1.02 11.64 11.49 8.67 1.44 2.35 0.16 0.3 7.2 11.43 73.4 4.39 1.71 1.04 0.16 0.64 0.17 2.74 0.81 66.72 2.96 0.55 3.78 1583 Óxido de cariofileno 1650 β-eudesmol Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 0.83 1.11 4.25 1.22 8.32 3.62 1.49 Pp-SLP Pm 1.02 0.53 1.11 0.84 1.31 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto 939 α-pineno 954 979 Camfeno β-pineno Tt Lg-TZ Lg-ES 0.58 51 990 1011 1017 1026 1029 Mirceno δ-3-careno α-terpineno o-cimeno Limoneno 1031 1037 1052 1059 1070 1088 1096 Eucaliptol (Z)-β-ocimeno Dihidrotagetona γ-terpineno cis-hidrato de sabineno Isoterpinoleno Linalol 1098 trans-hidrato de sabineno 1146 1169 1177 Alcanfor Borneol Terpinen-4-ol 1188 1238 1248 α-terpineol (E)-ocimenona Car-3-en-2-ona 1263 1290 1299 1351 1375 1388 1388 cis-oxido carvona Timol Carvacrol α-cubebeno α-ylangeno β-bourboneno β-cubebeno 1390 1414 β-elemeno β-funebreno 1419 1454 1456 1476 1480 (E)-cariofileno α-humuleno (E)-β-farneseno trans-cadina-1(6),4-dieno ar-curcumeno 1481 1489 1493 1494 1500 1505 1515 Germacreno D Aniso hidroxi butilado α-zingibereno epi-cubebol Biciclogermacreno β-bisaboleno Cubebol 1522 1522 1523 β-sesquifelandreno trans-calameneno δ-cadineno 2.18 1.75 11.55 4.79 5.72 1.27 7.29 2.47 0.76 5.77 4.27 5.44 5.98 4.77 3.88 2.71 0.86 25.27 8.29 1.02 10.13 1.86 2.65 2.17 10.45 44.54 0.91 7.69 55.41 6.56 6.76 1.26 2.53 0.62 5.16 2.14 1.35 7.43 22.46 1.75 7.71 2.92 1.65 7.55 14.98 2.56 7.74 0.61 7.2 16.43 1.45 5.57 11.73 1.3 0.51 52 1542 1563 1578 1583 1608 Laciniata furanona E (E)-nerolidol Espatulenol Óxido de cariofileno Epóxido de humuleno II 1628 1-epi-cubenol 1650 β-eudesmol 1943 Fitol Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 0.77 0.53 0.64 1.6 7.95 3.05 4.49 2.05 1.41 4.68 0.82 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto Pp-CLM 939 975 979 985 990 1002 1011 α-pineno Sabineno β-pineno 6-metil-5-hepten-2-ona Mirceno α-felandreno δ-3-careno 1026 1029 1031 1096 1098 1169 1195 o-cimeno Limoneno Eucaliptol Linalol trans-hidrato de sabineno Borneol Mirtenol 1238 1252 1267 1284 1285 1287 1359 Neral Geraniol Geranial (E)-anetol Acetato de bornilo Safrole Eugenol 1375 1390 1403 1408 1419 1454 1481 α-ylangeno β-elemeno Metil eugenol (Z)-cariofileno (E)-cariofileno α-humuleno Germacreno D 1.99 1500 1505 Biciclogermacreno β-bisaboleno 3.39 2.73 Ss Cc 3.08 Ls 1.6 3.76 1.53 2.89 0.24 9 3.21 2.31 6.84 0.63 0.8 0.9 14.27 3.53 6.23 2.31 36.82 0.5 41.8 64.83 4.32 1.05 0.3 0.4 2.9 7.33 0.61 0.4 5.4 0.9 0.29 4.43 2.48 1 53 1563 1578 1583 1608 1669 (E)-nerolidol Espatulenol Óxido de cariofileno Epóxido de humuleno II 14-hidroxi-9-epi-(E)-cariofileno 0.58 0.82 0.7 1731 Camazuleno Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 7.3 4.3 6.3 0.4 1.5 60.1 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto 939 954 α-pineno Camfeno 3.75 979 1037 1096 1390 1417 1419 1433 β-pineno (Z)-β-ocimeno Linalol β-elemeno α-santaleno (E)-cariofileno β-gurjuneno 6.22 4.67 42.29 1454 1480 1481 1505 1561 1563 1575 α-humuleno ar-curcumeno Germacreno D β-bisaboleno Germacreno B (E)-nerolidol Germacreno D-4-ol 1.03 1578 Espatulenol 1583 Óxido de cariofileno 1743 2E, 6E-farnesol 2100 n-heneicosano 2200 n-docosano 2500 n-pentacosano 3400 Tetratriacontano Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 Pj Ps-RD Ps-CLM Ps-ER Oc 0.55 1.1 8.58 2.08 2.91 1.52 12.73 1.97 10 12.33 19.47 4.84 7.15 10.83 15.85 10.69 29.54 3.02 4.18 13.13 25.95 11.57 8.2 67.07 4.06 Tabla 3. Continuación … IK Compuesto Ss-SQ Ss-SLU Ss-CH 1.55 3.11 1419 (E)-cariofileno 5.54 1432 1490 β-copaeno β-selineno 13.32 2.18 1.97 54 δ-cadineno Germacreno B (E)-nerolidol Espatulenol Óxido de cariofileno 1523 1561 1563 1578 1583 1731 Camazuleno Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 1.41 2.39 5.56 8.94 7.64 12.53 5.05 7.36 5.19 8.75 16.06 47.45 63.15 41.98 III.1.4 Índices de refracción de aceites esenciales. Se presentan los índices de refracción de los aceites esenciales de plantas aromáticas colectadas en diferentes sitios del interior de la República de Guatemala (Tabla 4). Tabla 4. Índices de refracción de aceites esenciales de plantas aromáticas Especie vegetal Índice de refracción Ls 1.4790 Pd-f 1.5255 Pd-h Tl Lg-TZ Sm Cc Om Al Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 1.5260 1.5220 1.5085 1.4825 1.4850 1.5125 1.4755 III.1.5 Determinación de la actividad antioxidante de aceites esenciales. Se determinó la actividad antioxidante y porcentaje de inhibición de los aceites esenciales de plantas aromáticas (Tabla 5) y se contrastó con la actividad antioxidante y porcentaje de inhibición de antioxidantes sintéticos (Tabla 6). Tabla 5. Actividad antioxidante y porcentaje de inhibición de aceites esenciales Especie vegetal Pd-h Lg Ag Actividad antioxidante (µl/ml DPPH [1.5 mM]) 5.5% 4.7% 5.5% Porcentaje de inhibición (%) 82% 70% 82% 55 Fv 4.0% Sm 5.4% Co 3.3% Om 5.8% Vp-SLU 2.3% Al 5.8% Tl 5.6% Tt 4.4% Lg-TZ 5.4% Lg-ES 5.9% Pp-SLP 2.8% Pm 2.7% Pp-CLM 2.4% Ss 3.1% Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 60% 81% 50% 88% 34% 87% 84% 65% 81% 88% 42% 41% 35% 46% Tabla 6. Actividad antioxidante experimental y porcentaje de inhibición de antioxidantes sintéticos Nombre del compuesto Concentración del compuesto (mM) Butilhidroxitolueno 1.4 (BHT) Butilhidroxianisol 1.7 (BHA) Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 Actividad antioxidante (µl/ml DPPH [1.5 mM]) % de inhibición (%) 1.4% 22% 4.9% 74% III.1.6 Actividad antibacteriana de los aceites esenciales. Se evaluó la actividad inhibitoria de ocho aceites esenciales contra bacterias Gram positivo (Staphylococcus aureus y Bacillus cereus), bacterias Gram negativo (Escherichia coli y (Pseudomonas aeruginosa) y una cepa de levaduras (Candida albicans) (Tabla 7). Las bacterias Gram positivo fueron inhibidas por mayor cantidad de aceites esenciales que las bacterias Gram negativo. Staphylococcus aureus fue inhibido por casi todos los aceites del ensayo (excepto el aceite Ss y Tl). Los aceites del Lg-ES, Vp-SJO, Lg-TZ y Ls inhibieron el crecimiento del Bacillus cereus. Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa fueron inhibidos por el aceite Vp-SJO y solamente Escherichia coli inhibida por los aceites Lg-TZ y Ls. 56 La levadura Candida albicans fue inhibida por los mismos aceites esenciales que Echerichia coli. Tabla 7. Actividad antibacteriana de aceites esenciales Aceite esencial S. aureus B. cereus E. coli P. aeruginosa C. albicans Lg-ES + + Vp-SJO + + + + + Lg-TZ + + + + Ls + + Pd-h + Ag + Ss Tl (+): actividad positiva (-): actividad negativa La actividad positiva se midió por la presencia de un halo de inhibición alrededor del disco impregnado con aceite esencial (Tabla 8). Los mayores halos de inhibición se evidenciaron para el aceite esencial Lg-TZ. Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 Tabla 8. Inhibición bacteriana de aceites esenciales Aceite esencial S. aureus B. cereus Lg-ES 9 15 Vp-SJO 25 29 Lg-TZ 40 47 Ls 15 22 Pd-h 22 Ag 12 Ss Tl Halo de inhibición: milímetros (mm) Fuente: FINDECYT/FODECYT 017-2017 E. coli 19 29 - P. aeruginosa 21 - C. albicans 13 35 - III.1.7 Discusión de resultados. En total se logró la colecta de material vegetal de 26 especies de plantas aromáticas y medicinales de Guatemala, siendo tres de ellas colectadas en diferentes regiones (Lippa graveolens, Valeriana prionophylla y Stevia serrata) y una de la cual se extrajeron los aceites de dos órganos diferentes, hojas y frutos (Pimenta dioica). Para casi la totalidad de las plantas de estudio no pudieron realizarse colectas en estación lluviosa y en estación seca, porque no presentaban suficiente follaje en la estación seca, realizándose las colectas principalmente en estación lluviosa, por lo que no fue posible realizar la comparación de la extracción de los aceites en las dos estaciones. 57 Por otra parte, para varias plantas no se pudieron realizar ensayos de actividad biológica o antioxidante, ni obtener los índices de refracción o espectros en el infrarrojo, ya que el material que se logró colectar o bien el rendimiento de extracción, no permitireron obtener suficiente volumen de aceite esencial para poder realizar los ensayos. En cuanto a la evaluación de la extracción con fluidos supercríticos, no se logró una selectividad adecuada en la extracción para obtener solo la fracción volátil del material vegetal, por lo que no se pudieron extraer los aceites esenciales por esta técnica, quedando pendiente la evaluación de condiciones para mejorar la selectividad necesaria. A continuación se analizan los resultados correspondientes a los aceites esenciales obtenidos en este estudio considerando el potencial de utilización en la industria. Satureja viminea L. La planta S. viminea, perteneciente a la familia Lamiaceae, fue colectada en 2014 en la aldea El Carmen, Patzicía, Chimaltenango a una altitud de 2,170 msnm (Tabla 1). Un voucher se depositó en el herbario BIGU de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, correspondiendo al código BIGU 72835. El rendimiento de aceite esencial fue de 3.14% (Tabla 2) el cual es elevado, presentando como componente principal la pulegona con 50.4% de área (Tabla 3) la cual es un componente importante en la perfumería y presenta propiedades insecticidas, por lo que la planta presenta potencial para la extracción del aceite y su uso en cosméticos o bien, para el aislamiento de la pulegona para buscar otras aplicaciones. Agastache rugosa (Fisch & C.A. Mey.) Kuntze El agastache es una planta perteneciente a la familia Laimaceae de usos medicinales conocidos. El material vegetal de esta planta se colectó en un huerto familiar en terrenos del Caserío Xejuyú, San Andrés Semetabaj, Sololá, en 2014, a una altitud de 2,012 msm. Un voucher de la planta se depósito en el herbario BIGU con el código BIGU 72841. La planta presentó un rendimiento de extracción del aceite esencial de 0.59%, considerándose ligeramente bajo pero aceptable. 58 El aceite presentó como componentes principales la 2-etilisomentona (38.43%) y la pulegona (37.64%), por lo que se podría considerar para el aislamiento de ambos componentes, aunque debe evaluarse agronómicamente si el rendimiento de extracción permitiría la obtención de valor agregado suficiente para considerar su agroindustrialización. Pimenta dioica (L.) Merr. La P. dioica, comúnmente conocida como pimienta del reino, es una planta nativa de Guatemala perteneciente a la Familia Myrtaceae. La planta fue colectada en 2014 en la comunidad Barra Lámpara, Livingston Izabal a una altitud de 13 msnm, habiendo sido depositada una muestra de voucher en el herbario BIGU con código BIGU 72838 (Tabla 1). El material vegetal colectado se separó en hojas y frutos, los cuales fueron extraídos por separado. El rendimiento de extracción del aceite esencial de las hojas fue de 1.02 % y el de los frutos de 1.51 % (Tabla 2) e índices de refracción de 1.5260 y 1.5255, respectivamente (Tabla 4). El principal componente de ambos aceites fue el eugenol con 76.2 y 71.37 %, respectivamente, presentando mirceno en segundo lugar con 10.73 y 10.03%, respectivamente. La actividad antioxidante se determinó solo para el aceite de hojas, obteniéndose un porcentaje de inhibición de 82%, que se encuentra entre los mayores valores obtenidos para los aceites esenciales evaluados en este estudio. La actividad antibacteriana se evaluó también para el aceite esencial de las hojas, presentando actividad únicamente contra Sataphylococcus aureus de los cinco microorganismos evaluados, con un halo de inhibición de 22 mm (el aceite de frutos no fue analizado por presentar composición similar al aceite de hojas) (Tablas 7 y 8). El aceite esencial del fruto de P. dioica es aprovechado económicamente en otros países por ser un fruto comercializado como especia para el condimento de alimentos, sin embargo, de las hojas no se encontró información y siendo aceites esenciales de similar composición, podría considerarse el aprovechamiento de las hojas para la producción de aceite esencial, en vista que la planta presenta un follaje abundante. 59 Litsea guatemalensis Mez La planta, conocida como laurel en Guatemala, es una planta nativa del país perteneciente a la familia Laureaceae. El material vegetal fue colectado en el mercado de Sololá en 2014. Por la cantidad de material no pudo depositarse voucher en el herbario. El rendimiento de extracción del aceite esencial de esta planta fue de 0.63% considerándose aceptable. En cuanto a la composicón del aceite, los principales componentes encontrados fueron eucaliptol (1,8-cineol) con 38.58%, -terpineol con 14.63% y linalol con 10.06%, siendo estos monoterpenoides muy comunes en los aceites esenciales y de escaso valor para proponer su aislamiento a partir del aceite, sin embargo, como condimento de alimentos, el aceite esencial puede ser atractivo. El aceite presentó actividad antioxidante alta con un 70% de inhibición, lo cual aumentaría su posible utilización en la preservación de alimentos. Abies guatemalensis Rehder Esta planta, perteneciente a la familia Pinaceae, es conocida en Guatemala como pinabete y es una planta que se encuentra en los departamentos del occidente a alturas mayores de 2,000 msnm. El material vegetal fue colectado en la finca Chichavac, Tecpán, Chimaltenango, a una altitud de 2,518 msnm en 2014 (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en herbario estando pendiente de asignación de código. El rendimiento de aceite esencial de esta planta fue de 0.17% que puede considerarse como bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son (Z)-cariofileno con 30.44%, limoneno con 13.8% y -thujeno con 10.14% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante elevada con 82% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT y BHA (Tabla 6) y presentó actividad antibacteriana solo contra Staphylococcus aureus (halo de inhibición de 12 mm) (Tablas 7 y 8). De esta forma, pese al bajo rendimiento, se considera que el aceite esencial presenta potencial económico como tal, ya que puede ser extraído del material que se desecha en la época postnavideña, para obtener un aceite que puede utilizarse para uso en desinfectantes o aromatizante ambiental, por el aroma característico del pinabete. 60 Foeniculum vulgare Mill. F. vulgare es una planta pertenediente a la familia Apiaceae que es cultivada en huertos en Guatemala. El material vegetal fue colectado en 2014 en la aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango, a una altitud de 2,179 msnm y un ejemplar fue depositado en el herbario BIGU con código de herbario BIGU 72844 (Tabla 1). El rendimiento de extracción de aceite esencial identificado por el código Fv fue de 0.79% (Tabla 2), el cual puede considerarse como aceptable. Los principales componentes encontrados en el aceite esencial fueron (E)-anetol con 75.16% y limoneno con 6.59% (Tabla 3). Debido al escaso volumen, no se realizó la determinación de actividad antibacteriana con este aceite esencial, realizándose la de actividad antioxidante, en cuyo ensayo se obtuvo 60% de inhibición (Tabla 5) superior al BHT pero inferior a la del BHA (Tabla 6). De esta forma una posible utilidad del aceite esencial de esta planta podría ser el aislamiento del anetol, para usos como materia prima en la industria química o bien en la industria de alimentos. Salvia microphyla Kunth La planta fue colectada en 2014 en la aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango, a una altitud de 2,179 msnm depositándose un espécimen de voucher en el herbario BIGU con código BIGU 72843 (Tabla 1). La planta presentó un bajo rendimento de extracción (0.33%) de aceite esencial, identificado por el código Sm (Tabla 2). El índice de refracción del aceite es de 1.4825 (Tabla 4). Los principales componentes del aceite esencial de S. microphyla fueron guaiol (10,83%), alcanfor (8.05%) y epóxido de humuleno (7.69%) con varios compuestos en porcentajes cercanos, evidenciando que es un aceite con alta diversidad de componentes sin que se diferencie ninguno notoriamente por su cantidad. El aceite presentó actividad antioxidante elevada (81%), no habiéndose realizado ensayo antibacteriano por el escaso volumen de aceite obtenido. Por el bajo rendimiento del aceite y que no presenta componentes valiosos con elevada concentración, este aceite no se considera promisorio para su producción a partir de cultivos de la planta en Guatemala. 61 Cedrela odorata L. Es un árbol de madera preciosa de la familia Meliaceae conocido como cedro en Guatemala. Las hojas de C. odorata se colectaron en 2018 en El Remate, Petén, a una altitud de 135 msnm (Tabla 1). Se depositó una muestra de voucher en el herbario BIGU con código pendiente. El aceite esencial, identificado con el código Co, presentó un rendimiento de extracción de 0.43 % (Tabla 2). El componente principal encontrado en el aceite fue el cubebol con 28.8%, seguido del cubebeno con -cubebeno 10.26% y humuleno con 8.54%, siendo un aceite esencial constituido por sesquiterpenoides. El aceite esencial de cedro presentó actividad antioxidante intermedia con 50% de inhibición, superior al BHT pero inferior al BHA (Tablas 5 y 6). No se analizó actividad antibacteriana en vista del escaso volumen que se obtuvo de aceite esencial. Ocimum micranthum Willd. Esta planta pertenece a la familia Lamiaceae. El material vegetal fue colectado en agosto de 2018 en la aldea Creek Cáliz, Livingston, Izabal a una altitud de 34 msnm habiéndose depositado una muestra de voucher en el herbario BIGU con código BIGU 72840 (Tabla 1). El aceite esencial identificado como Om presentó un rendimiento de extracción de 0.61% que puede considerarse aceptable (Tabla 2). El aceite presentó un índice de refracción de 1.5125 (Tabla 4). Los principales componentes presentes en el aceite esencial son -cubebeno (32.42%), -bisaboleno (13.29%) y óxido de cariofileno (11.5%). El aceite presentó la actividad antioxidante más alta entre los aceites estudiados con 88% de inhibición. El aceite tiene potencial su producción a partir de la planta, al tener eugenol en porcentaje importante y un rendimiento aceptable, aunque habría que realizar un estudio agronómico para evaluar la factibilidad económica. 62 Valeriana prionophylla Standl. La planta es conocida como valeriana comúnmente, es nativa de Guatemala creciendo a altitudes mayores a 2,000 m. Las raíces de la planta fue colectadas en dos localidades, en la aldea Choanlá, San José Ojetenam, San Marcos en 2014 (muestra Vp-SJO) a una altitud de 3,350 msnm y en la aldea Ciénaga Grande, Santa Lucía Utatlán, Sololá (muestra VpSLU) en marzo de 2019, a 2,347 msnm. Muestas de voucher fueron depositados en el herbario BIGU, estando pendientes los códigos correspondientes (Tabla 1). El rendimiento de aceite esencial fue de 0.60 % para la muestra Vp-SJO y 0.06% para la muestra Vp-SLU, observándose una diferencia grande en el rendimiento de las dos procedencias. Los principales componentes del aceite esencial fueron ácido isovalérico con 43.08 y 60.44% y ácido 3-metilvalérico con 37.59 y 24.39%, respectivamente, encontrándose el resto de componentes en un porcentaje mucho menor. La muestra Vp-SLU presentó una actividad antioxidante moderada con 34% de inhibición, superior al BHT pero inferior al BHA. Por su parte, la muestra de aceite Vp-SJ presentó actividad biológica contra los cinco microorganismos ensayados, con halos de inhibición de 25 mm para S. aureus, 29 mm, para B. cereus, 19 mm para E. coli, 21 mm para P. aeruginosa y 13 mm contra C. albicans. Es importante mencionar que se habían realizado estudios previos con los extractos de V. prionophylla no así con el aceite esencial. En vista del espectro amplio que presenta este aceite esencial, podría ser considerado por la industria farmacéutica y de alimentos para evaluar posibles aplicaciones. Tagetes filifolia Lag. La planta perteneniente a la familia Asteraceae, fue colectada en septiembre de 2018 en la Aldea La Brea, Quesada, Jutiapa, a una altitud de 1,392 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado el herbario BIGU estando pendiente de asignación de código. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Tf fue de 0.06% que puede considerarse como muy bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son (E)-anetol con 73.4 % y metilchavicol con 7.2%. Por la escasez del material colectado, ya que la planta no se encontró en abundancia y presentaba poco follaje, no se realizaron 63 ensayos de actividad antioxidante ni de actividad biológica. Este es el primer reporte de la composición del aceite esencial de esta planta en Guatemala, por lo que la información es valiosa desde el punto de vista quimiosistemático. Por su rendimiento la planta no presenta potencial para cultivo y producción de aceite esencial, aunque la presencia de un componente activo mayoritario, permite recomendar realizar estudios sobre las actividades antioxidante y biológica del aceite, para evaluar posibles aplicaciones y la posibilidad de aislar el (E)-anetol. Artemisia ludoviciana Nutt. Esta planta, perteneciente a la familia Asteraceae, fue colectada en julio de 2014 en la aldea El Caman, Patzicía, Chimaltenango, a una altitud de 2,179 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU con código BIGU 72833. El rendimiento del aceite esencial de esta planta identificada como Al fue de 0.64% que puede considerarse como aceptable o intermedio (Tabla 2). El aceite presentó un índice de refracción de 1.4755. Los principales componentes que presentó el aceite fueron eucaliptol o 1,8-cineol con 21.66%, alcanfor con 11.64% y borneol con 8.67% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante elevada con 87% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT y BHA (Tabla 6). Debido a la escasez del material obtenido no fue posible realizar ensayos de actividad biológica con el aceite esencial de esta planta. Los componentes de este aceite esencial son bastante comunes y de poco valor económico, y dado que el rendimiento de extracción del aceite no es alto, se considera que la planta no presenta un potencial aceptable para su cultivo y producción del aceite. Tagetes lucida Cav. Esta planta, conocida como pericón en Guatemala, pertenece a la familia Asteraceae y es ampliamente usada en Guatemala para el tratamiento de enfermedades estomacales. El material vegetal de la planta fue colectado en junio de 2014 en la aldea Estanzuela, Joyabaj, a una altitud de 1557 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU con código BIGU 72845. 64 El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificada como Tl fue de 0.33% que puede considerarse como bajo (Tabla 2). El aceite presentó un índice de refracción de 1.5220 (Tabla 4). Los principales componentes que presentó el aceite son metileugenol con 66.72%, (Z)-tagetona con 11.49% y metilchavicol con 11.43% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante elevada con 84% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT y BHA (Tabla 6), aunque no presentó actividad contra ninguno de los cinco microorganismos ensayados (Tablas 7 y 8). De esta forma, se considera que este aceite no presenta potencial para su uso como bactericida, siendo una posible aplicación como fuente de metileugenol. Es conocido que el principio activo de este aceite es la 7-metoxicumarina, la cual no se encontró en el aceite esencial por ser una sustancia poco volátil. Tagetes tenuifolia Cav. Esta planta, perteneciente a la familia Asteraceae, fue colectada en Los Cebollales, Panajachel, Sololá en octubre de 2014, a una altitud de 1,570 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU con el código BIGU 72837. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Tt fue de 0.05% que puede considerarse como muy bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son car-3en-2-ona con 44.54%, (E)-ocimenona con 10.45% y dihidrotagetona con 5.44% (Tabla 3). Debido a la escasez del material colectado no se pudieron realizar los ensayos de actividad antioxidante ni biológica. Debido al bajo rendimiento de extracción del aceite, no se considera que tenga potencial el cultivo de esta planta para producción de aceite esencial. Lippia graveolens Kunth La planta es conocida en Guatemala como orégano y es ampliamente utilizada como condimento en alimentos y para el tratamiento de algunas enfermedades estomacales y respiratorias. En Guatemala se le encuentra principalmente en los departamentos de El Progreso, Chiquimula y Zacapa. El material vegetal fue colectado en la aldea San José, Teculután, Zacapa en junio de 2014 a una altitud de 233 msnm e identificado como Lg-TZ y en la aldea El Subinal, Guastatoya, El Progreso, en noviembre de 2014 a una altitud de 65 536 msnm e identificado con el código Lg-ES (Tabla 1). Especímenes de ambas procedencias fueron depositados en el herbario BIGU con códigos BIGU 72834 y BIGU 72836 respectivamente. El rendimiento de extracción del aceite esencial fue de 2.75% para Lg-TZ y de 0.68% para Lg-ES, considerándose elevado el primero y aceptable el segundo (Tabla 2). El aceite Lg-TZ presentó un índice de refracción de 1.5085 (Tabla 4). Los principales componentes que presentaron los aceites fueron carvacrol con 55.41%, ocimeno con 11.55% y timol con 11.39% para Lg-TZ y terpinen-4-ol con 10.13%, hidrato de trans-sabineno con 8.29% y -elemeno con 7.29%, con varios compuestos con porcentajes similares a estos últimos, para Lg-ES (Tabla 3). Los aceites presentaron elevada actividad antioxidante con 82% de inhibición para Lg-TZ y 88% para Lg-ES (Tabla 5), superiores ambos a BHT y BHA (Tabla 6). Los dos aceites presentaron actividad biológica aunque diferentes magnitudes, así el aceite Lg-Tz presentó halos de inhibición de 40 mm contra S. aureus, 47 mm contra B. cereus y 29 mm contra E. coli, mientras que el aceite Lg-ES presentó halos de inhibición de 9 mm contra S. aureus y 15 mm contra B. cereus (Tablas 7 y 8). La alta actividad anbibacteriana del aceite Lg-TZ se atribuye al contenido de carvacrol y timol en este aceite. Esta planta, especialmente la correspondiente al quimiotipo carvacrol (Lg-TZ), presenta potencial para cultivo y producción de aceite esencial, el cual puede ser utilizado en la preservación de alimentos o incorporándolo en recipientes de alimentos de manera que el aceite se libere gradualmente. Piper peltatum L. La planta pertenece a la familia Piperaceae la cual es muy abundante en Guatemala. El material vegetal fue colectado en noviembre de 2018 en la aldea Quebrada Seca, San Luis, Petén, a una altitud de 131 msnm (Tabla 1). Un especimen fue depositado en el herbario BIGU estando pendiente de asignación de código. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Pp-SLP fue de 0.05% que puede considerarse como muy bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son-elemeno con 22.46 %, germacreno D con 14.98% y trans-calameneno con 11.73% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante moderada con 42% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT pero menor a BHA (Tabla 6). 66 Debido al bajo rendimiento de aceite esencial, no se obtuvo suficiente volumen para realizar ensayos de actividad antimicrobiana. Por lo anterior, debido al bajo rendimiento de extracción de este aceite y por no contar con sustancias de alto valor económico en concentraciones elevadas, no se considera que la planta tenga potencial económico para cultivo y producción de aceite esencial. Piper martensianum C.DC. Esta planta pertenece a la familia Piperaceae. El material vegetal fue colectado en septiembre de 2018 en terrenos aledaños a la carretera hacia Cerro Brujo, Concepción Las Minas, Chiquimula, a una altitud de 932 (Tabla 1). Un especimen fue depositado en el herbario BIGU estando pendiente de asignación de código. El rendimiento del aceite esencial de esta planta identificada como Pm fue de 0.21% que puede considerarse como bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite fueron linalol con 25.27 %, -bisaboleno con 16.43% y (E)-nerolidol con 7.95% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante moderada con 41% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT pero inferior a BHA (Tabla 6) no habiéndose realizado ensayos de actividad antimicrobiana por no haberse obtenido suficiente aceite. A pesar que el rendimiento del aceite esencial de P. martensianum no es alto, la composición con alto contenido de linalol y otros componentes de alto valor y utilizados en la industria de perfumería, hacen interesante a este aceite. Es recomendable analizar cuál de los isómeros de linalol es más abundante por medio de cromatografía quiral, para determinar el potencial de uso de este aceite, principalmente en la industria cosmética en la cual podría presentar aplicaciones. Piper patulum Bertol. Esta planta, perteneciente a la familia Piperaceae, fue colectada en septiembre de 2018 en terrenos aledaños a la carretera hacia Cerro Brujo, Concepción Las Minas, Chiquimula, a una altitud de 932 (Tabla 1). Un especimen fue depositado en el herbario BIGU estando pendiente de asignación de código. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificada como Pp-CLM fue de 0.87% que puede considerarse como relativamente 67 elevado (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son (E)-anetol con 64.83%, (E)-cariofileno con 7.33% y biciclogermacreno con 3.39% (Tabla 3). El aceite presentó actividad antioxidante relativamente baja con 35% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT pero muy inferior al BHA (Tabla 6). Debido a que no se logró extraer suficiente volumen de aceite, no pudieron realizarse los ensayos de actividad antimicrobiana. Debido al elevado rendimiento y a contar con un componente valioso en alto porcentaje (el (E)-anetol), puede considerarse que esta especie presenta potencial para su aprovechamiento en la producción de aceite esencial, debiendo realizarse estudios sobre su actividad biológica para evaluar su posible uso en la industria cosmética o farmacéutica. Stevia serrata Cav. Esta planta, perteneciente a la familia Asteraceae crece en los departametnos del occidente de Guatemala a altitudes mayores a los 2,000 msnm. El material vegetal de esta fue colectado en septiembre de 2014 en Santa Lucía Utatlán, Sololá a una altitud de 2,341 msnm (Ss) y en el mismo municipio a una altura de 2,430 msnm en 2018 (Ss-SLU), en Salcajá, Quetzaltenango a una altitud de 2,352 msnm en 2018 (Ss-SQ) y en terrenos aledaños a la carretera entre Santa Cruz del Quiché y Chiché, Quiché a una altitud de 2,075 msnm en septiembre de 2018 (Ss-CH). Un especimen fue depositado en el herbario BIGU con código BIGU 72832. El rendimiento de aceite esencial de esta planta se encontró en el rango de 0.08-0.20% que puede considerarse como bajo (Tabla 2). El aceite esencial presentó una intensa coloración azul causada por su componente mayoritario, el camazuleno que se encontró en un rango entre 41.98 y 63.15%, seguido de (E)-nerolidol entre 5.56 y 12.53% y óxido de cariofileno entre 1.20 y 16.06% (Tabla 3). El aceite Ss presentó actividad antioxidante moderada con 46% de inhibición (Tabla 5), superior a BHT pero menor a BHA (Tabla 6). El aceite no presentó actividad antimicrobiana contra ninguno de los cinco microorganismos evaluados (Tablas 7 y 8), sin embargo si presentó una elevada actividad antinociceptiva en un estudio efectuado como parte del proyecto con el aceite Ss (Reis Simas et al., 2019). De esta forma, se considera que aunque el rendimiento del aceite esencial es bajo, la planta presenta un alto potencial de aprovechamiento para la producción de antiinflamatorios, ya sea utilizando el propio aceite 68 esencial o bien, aislando el camazuleno a partir del aceite, para lo cual se sugieren nuevos estudios. Cymbopogon citratus (DC.) Stapf La planta pertenece a la familia Poaceae, es conocida en Guatemala como té de limón y es utilizada como medicina tradicional. El material vegetal fue colectado en 2014 en la comunidad de Cayo Quemado, Livingston, Izabal, a una altitud de 11 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU con código BIGU 72846. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado con el código Cc fue de 1.08% que puede considerarse como alto (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son geranial con 41.8%, neral con 36.82% y mirceno con 9.0% (Tabla 3). El aceite presentó un índice de refracción de 1.4850 (Tabla 4). No se realizaron ensayos de actividad antioxidante ni biológica con este aceite por no haberse obtenido suficiente volumen para dicho propósito. La planta es culivda en diferentes países para la obtención de aceite esencial el cual es comercializado mundialmente. Lippia salamensis Loes. Esta planta, perteneciente a la familia Verbenaceae, crece principalmente en el departamento de Baja Verapaz. El material vegetal fue colectado en 2014 la cumbre de El Chol, El Chol, Baja Verapaz, a una altitud de 1372 (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU con el código BIGU 72831. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Ls fue de 1.12% que puede considerarse como alto (Tabla 2). El aceite presentó un índice de refracción de 1.3790 (Tabla 4). Los principales componentes que presentó el aceite son eucaliptol o 1,8-cineol con 14.27%, o-cimeno con 6.84% y borneol con 6.23% (Tabla 3). No fue evaluada la actividad antioxidante de este aceite, que presentó actividad antibacteriana contra S. aureus (halo de inhibición de 15 mm) y contra B. cereus (22 cm) (Tablas 7 y 8). Por lo anterior, el aceite presenta rendimiento y composición que podría hacerlo atractivo para la industria cosmética. L. salamensis es un árbol que crece hasta los 3 m, por lo que su cultivo no presentaría rendimento en muy corto 69 plazo, pero podría considerarse en combinación con otros cultivos, ya que al ser una planta nativa, se podría reproducir con el fin de aprovechar el aceite esencial. Piper jacquemontianum Kunth Esta planta, perteneciente a la familia Piperaceae es de amplia distribución en Guatemala, encontrándose en zonas bajas de la región norte y sur de Guatemala. El material vegetal fue colectado en septiembre de 2018 en el municipio de San Luis, Petén, en la carretera que conduce hacia Río Dulce, Izabal, a una altitud de 149 msnm (Tabla 1). Un espécimen fue depositado en el herbario BIGU estando pendiente de asignación de código. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Pj fue de 1.00% que puede considerarse como alto (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son linalol con 42.29%, (2E, 6E)-farnesol con 25.95% y (E)-nerolidol con 7.15% (Tabla 3). No fue posible realizar ensayos de actividad antioxidante ni biológica, debido a que el material que se logró obtener fue escaso. Por el rendimiento y composición, en que se encontró al linalol en alto porcentaje, se considera que esta planta presenta un alto potencial para su utilización en la industria cosmética. Es recomendable evaluar la proporción de los isómeros del linalol por cromatografía quiral y realizar ensayos de actividad biológica y antioxidante para evaluar el aprovechamiento de la planta para la producción de aceite esencial. Piper sp. Una planta perteneciente al género Piper de la familia Piperaceae, fue encontrada y colectada en marzo de 2019 en el municipio de San Luis, Petén, en la carretera que conduce hacia Río Dulce, Izabal, a una altitud de 50 msnm (Tabla 1). La identificación de la especie está en proceso en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Ps-RD fue de 0.12% que puede considerarse como bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son espatulenol con 29.54 %, linalol con 8.58% y germacreno B con 4.84% (Tabla 3). No fue posible realizar ensayos de actividad antioxidante ni biológica, debido a que el 70 material que se logró obtener fue escaso. El bajo rendimiento de aceite esencial no hace atractivo a este aceite, sin embargo, el alto contenido de espatulenol hace considerarlo como una fuente para el aislamiento de este compuesto. Es recomendable evaluar la actividad biológica y antioxidante para evaluar el aprovechamiento de la planta para la producción de aceite esencial. Piper sp. Esta planta perteneciente al género Piper de la familia Piperaceae, fue encontrada y colectada en marzo de 2019 en el municipio de Concepción Las Minas, Chiquimula, a una altitud de 1225 msnm (Tabla 1). La identificación de la especie está en proceso en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Ps-CLM fue de 0.37% que puede considerarse como relativamente bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son (E)nerolidol con 15.85%, (E)-cariofileno con 12.73% y germacreno D con 12.33% (Tabla 3). No fue posible realizar ensayos de actividad antioxidante ni biológica, debido a que el material que se logró obtener fue escaso. El rendimiento de aceite esencial de 0.37% no descarta el aprovechamiento de este aceite, compuesto principalmente por sesquiterpenoides. Es recomendable evaluar la actividad biológica y antioxidante para evaluar el aprovechamiento de la planta para la producción de aceite esencial. Piper sp. Esta planta perteneciente al género Piper de la familia Piperaceae, fue encontrada y colectada en marzo de 2019 en la aldea El Remate, Flores, Petén, a una altitud de 126 msnm (Tabla 1). La identificación de la especie está en proceso en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la USAC. El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Ps-ER fue de 0.35% que puede considerarse como relativamente bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son -bisaboleno con 19.47%, óxido de cariofileno con 13.33% y ar-curcumeno con 10.00% (Tabla 3). 71 No fue posible realizar ensayos de actividad antioxidante ni biológica, debido a que el material que se logró obtener fue escaso. El rendimiento de aceite esencial de 0.35% no descarta el aprovechamiento de este aceite, compuesto principalmente por sesquiterpenoides, con el bisaboleno en alta concentración. Es recomendable evaluar la actividad biológica y antioxidante para evaluar el aprovechamiento de la planta para la producción de aceite esencial. Orbignya cohune (Mart.) Dahlgren ex Standl Esta planta perteneciente a la familia Arecaceae, es conocida en Guatemala como corozo y es utilizada en las tradiciones de la Semana Santa. El material vegetal, consistente en inflorescencia de la planta fue colectada en marzo de 2019 en el mercado de La Florida, zona 19 de Guatemala (Tabla 1). El rendimiento de aceite esencial de esta planta identificado como Oc fue de 0.001% que puede considerarse como muy bajo (Tabla 2). Los principales componentes que presentó el aceite son n-pentacosano con 67.07%, nheneicosano con 11.57% y n-docosano con 8.2% (Tabla 3), siendo todos hidrocarburos de alto peso molecular. No fue posible realizar ensayos de actividad antioxidante ni biológica, debido a que el material que se logró obtener fue muy escaso. El rendimiento de aceite esencial de 0.001% es muy bajo para considerar la producción de aceite a partir de cultivos de la planta. Los hidrocarburos encontrados en el aceite funcionan como feromonas para varios insectos, por lo que es recomendable investigar la aplicación del aceite para el control de insectos, ya que para estas aplicaciones se necesitan cantidades sumamente bajas. 72 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES La diversidad de componentes identificados y cuantificados en los aceites esenciales de las 26 plantas aromáticas y medicinales de estudio refleja la gran biodiversidad de la flora de Guatemala y representan información para evaluar los posibles usos de los aceites esenciales. Aproximadamente el 40% de los aceites esenciales de las plantas de estudio presentaron rendimentos de extracción que pueden considerarse como altos al superar el 0.8% de rendimiento, y un 70% arriba de 0.5%, siendo asi atractivos para su producción. Algunos aceites, como el caso de la Stevia serrata presentaron rendimientos de extracción bajos (menores a 0.5%) pero presentaron metabolitos con elevado valor lo que los hace atractivos para su aprovechamiento. Otros aceites que presentan potencial para su producción son los de Valeriana prionophylla, Abies guatemalensis, Lippia graveolens y Pimenta dioica, que presentaron actividades biológicas importantes y/o metabolitos de alto valor económico. Los espectros en el infrarrojo obtenidos de aceites esenciales de plantas medicinales y aromáticas de Guatemala, permiten su caracterización así como son un recurso importante para el control de calidad de los aceites. Los índices de refracción obtenidos de aceites esenciales de plantas medicinales y aromáticas de Guatemala, permiten su caracterización así como son un recurso importante para el control de calidad de los aceites. La información sobre las procedencias, rendimientos de extracción, composición química, índices de refracción, espectros infrarrojos y actividad antioxidante y antimicrobiana, constituyen un catálogo de los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales de Guatemala que puede orientar hacia la toma de decisiones sobre cultivo de 73 las plantas para producción y aprovechamiento de los aceites esenciales para diferentes usos en la industria. No fue posible evaluar la extracción de los aceites esenciales de las plantas de estudio por medio de extracción con fluidos súper críticos ya que no se logró la selectividad adecuada para la separación de sustancias no volátiles no correspondientes a aceites esenciales por medio de dicha técnica. Los valores de actividad antioxidante y antimicrobiana para los aceites esenciales evaluados son primosorios en su mayor parte, para el desarrollo de nuevos productos para las industrias de alimentos, cosmética y farmacéutica. La mayor parte de los aceites presentó actividad antioxidante superior a la del antioxidante artifical BHT y ocho aceites presentaron actividad antioxidante superior a la del antioxidante artificial BHA. 74 IV.2 RECOMENDACIONES Evaluar por medio de investigaciones de mayor profundidad la aplicación de los aceites esenciales de las plantas L. graveolens, S. serrata, V. prionophylla, A. guatemalensis, P. dioica y plantas del género Piper, ya que presentan rendimientos altos o aceptables, o bien actividades biológicas importantes, siendo recursos que por ser nativos de Guatemala, pueden reproducirse sin dificultad en Guatemala. Investigar metodología que brinde selectividad en la extracción con fluidos supercríticos de aceites esenciales, ya que es una técnica que permite su escalamiento a nivel industrial y permitiría un aprovechamiento ambientalmente amigable de los productos naturales. 75 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACCT. (1985). 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Recolectada en Barra Lámpara, Livingston, Izabal. Pimenta dioica 3.05 Área (%) 10.03 1.75 Compuesto Myrcene trans-ocimene Chavicol 71.37 5.18 Eugenol Caryophyllene <(E)-> Estructura Tabla 10. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Litsea guatemalensis recolectada en el mercado de Sololá. Área (%) 4.01 Compuesto Pinene <α-> Litsea guatemalensis 38.58 10.06 Cineole <1,8-> Linalool 4.78 14.63 Terpinen-4ol Terpineol <α-> Estructura 88 Tabla 11. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Abies guatemalensis. recolectada en Finca Chichavac, Tecpán Guatemala, Chimaltenango. Área (%) 10.14 6.21 Compuesto Thujene <α-> Carene <δ-3-> Abies guatemalensis 13.80 30.44 Limonene Caryophyllene <(E)-> 4.89 6.56 Humulene <α-> Manool Estructura Tabla 12. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Foeniculum vulgare. Recolectado en Centro Experimental y Docente de la Facultad de Agronomía, campus central USAC, zona 12, Ciudad de Guatemala. Área (%) 3.12 Compuesto Carene <δ-3-> Foeniculum vulgare 6.59 2.99 Limonene Fenchone 3.19 75.16 Methyl chavicol Anethole <(E)-> Estructura 89 Tabla 13. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Salvia michophylla. Recolectado en Patzicía, Chimaltenango. Salvia michophylla 7.59 Área (%) 6.18 8.05 Compuesto Cineole <1,8-> Camphor Agarofuran <α> 10.83 7.69 Guaiol Humulene epoxide II Estructura Tabla 14. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Cedrela odorata L. Recolectada en El Remate, Petén. Cedrela odorata L. 8.54 Área (%) 10.26 6.78 Compuesto Cubebene <β-> Elemene <β-> Humulene <α-> 6.51 28.80 Cubebol <epi-> Cubebol Estructura 90 Tabla 15. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Ocimum micranthum. Recolectada en Creek Caliz, Livingston, Izabal. Área (%) 32.42 10.07 Ocimum micranthum 9.81 13.29 11.35 Compuesto Eugenol Methyl eugenol Caryophyllene <(E)-> Bisabolene <β-> Caryophyllene oxide Estructura Tabla 16. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Valeriana prionophylla. Recolectada en Santa Lucía Utatlán, Sololá. Área (%) Compuesto Valeriana prionophylla 60.44 Isovaleric acid 24.39 Valeric acid <3-methyl-> Estructura 91 Tabla 17. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Artemisia ludoviciana Recolectada en Patzicía, Chimaltenango. Área (%) 21.66 Compuesto Cineole <1,8-> Artemisia ludoviciana 11.64 Camphor 8.67 8.32 Borneol Caryophyllene oxide Estructura Tabla 18. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Tagetes lucida. Recolectada en la aldea Estanzuela, Joyabaj, Quiché. Área (%) 11.43 Compuesto Methyl chavicol Tagetes lucida 4.39 Anethole <(E)-> 66.72 4.25 Methyl eugenol Methyl isoeugenol <(E)-> Estructura 92 Tabla 19. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Tagetes tenuifolia. Recolectada en la planta de tratamiento Los Cebollales, Panajachel, Sololá. Área (%) 5.44 Compuesto Dihydrotagetone Tagetes tenuifolia 11.49 10.45 cistagetone transocimenone 44.54 5.16 Car-3-en-2-one Funebrene <β-> Estructura Tabla 20. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Lippia graveolens. Recolectada en Teculután, Zacapa. Área (%) 2.18 Compuesto Myrcene Lippia graveolens 11.55 5.98 Cymene <ο-> Terpinene <γ-> 55.41 2.14 Carvacrol Caryophyllene <(E)-> Estructura 93 Tabla 21. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Lippia graveolens. Recolectada en la aldea El Subinal, El Progreso. Área (%) 7.29 8.29 Compuesto Cymene <ο-> Sabinene hydrate <trans-> Lippia graveolens 10.13 Terpinen-4-ol 7.43 6.29 Caryophyllene <(E)-> Caryophyllene oxide Estructura Tabla 22. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Piper peltatum. Recolectada en San Luis, Petén. Área (%) 22.46 Compuesto Caryophyllene <(E)-> Piper peltatum 14.98 Germacrene D 7.20 11.73 Bicyclogermacrene Calamenene <trans-> Estructura 94 Tabla 23. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Piper sp. Recolectada en El Remate, Petén. Piper sp. 23.53 Área (%) 12.60 Compuesto Germacrene D Zingiberene <α-> 21.71 8.29 Bisabolene <β-> Sesquiphellandrene <β-> Estructura Tabla 24. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Piper sp. Recolectada en Dolores, Petén. Caracterizada por presentar hojas ásperas. Área (%) 9.35 Compuesto Ocimene <(Z)-β-> Piper sp. (Hojas ásperas) 6.68 13.78 18.24 Ocimene <(E)-β-> Linalool Bicyclogermacrene 10.82 Spathulenol Estructura 95 Tabla 25. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Piper martensianum. Recolectada en Concepción Las Minas, Chiquimula. Caracterizada por presentar hojas pubescentes. Área (%) 25.27 Compuesto Linalool Piper sp. (Hojas pubescentes) 7.71 7.55 7.74 16.43 7.95 Caryophyllene Curcumene Zingiberene Bisabolene <(E)-> <α-> <α-> <β-> Nerolidol <(E)-> Estructura Tabla 26. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Piper patulum. Recolectada en Concepción Las Minas, Chiquimula. Caracterizada por presentar hojas anisadas. Área (%) 3.08 2.89 Compuesto Pinene <α-> Pinene <β-> Piper patulum 64.83 7.33 Anethole Caryophyllene <(E)-> <(E)-> 3.39 Bicyclogermacrene Estructura 96 Tabla 27. Compuestos mayoritarios presentes en la especie Stevia serrata. Recolectada en carretera entre Chichicastenango y Santa Cruz del Quiché, Quiché. Área (%) 8.72 Compuesto Germacrene D Stevia serrata 4.10 6.04 Nerolidol <(E)-> 9.01 Germacrene Caryophyllene D-4-ol oxide 56.06 Chamazulene Estructura 97 IV.4.2 Cromatogramas de aceites esenciales. Imagen 1. Cromatograma (GC/MS) de la especie Pimenta dioica colectada en Barra Lámpara, Livingston, Izabal. Imagen 2. Cromatograma (GC/MS) de la especie Litsea guatemalensis colectada en el mercado de Sololá. 98 Imagen 3. Cromatograma (GC/MS) de la especie Abies guatemalensis colectada en Finca Chichavac, Tecpán Guatemala, Chimaltenango. Imagen 4. Cromatograma (GC/MS) de la especie Foeniculum vulgare colectada en Centro Experimental y Docente de la Facultad de Agronomía, campus central USAC, zona 12, Ciudad de Guatemala. 99 Imagen 5. Cromatograma (GC/MS) de la especie Salvia michophylla colectada en Patzicía, Chimaltenango. Imagen 6. Cromatograma (GC/MS) de la especie Cedrela odorata L. colectada en El Remate, Petén. 100 Imagen 7. Cromatograma (GC/MS) de la especie Ocimum micranthum. Recolectada en Creek Caliz, Livingston, Izabal. Imagen 8. Cromatograma (GC/MS) de la especie Valeriana prionophylla. Recolectada en Santa Lucía Utatlán, Sololá. 101 Imagen 9. Cromatograma (GC/MS) de la especie Artemisia ludoviciana Recolectada en Patzicía, Chimaltenango. Imagen 10. Cromatograma (GC/MS) de la especie Tagetes lucida. Recolectada en la aldea Estanzuela, Joyabaj, Quiché. 102 Imagen 11. Cromatograma (GC/MS) de la especie Tagetes tenuifolia. Recolectada en la planta de tratamiento Los Cebollales, Panajachel, Sololá. Imagen 12. Cromatograma (GC/MS) de la especie Lippia graveolens. Recolectada en Teculután, Zacapa. 103 Imagen 13. Cromatograma (GC) de la especie Lippia graveolens. Recolectada en la aldea El Subinal, El Progreso. Imagen 14. Cromatograma (GC/MS) de la especie Piper sp. Recolectada en El Remate, Petén. 104 Imagen 15. Cromatograma (GC/MS) de la especie Piper sp. Recolectada en Dolores, Petén. Caracterizada por presentar hojas ásperas. Imagen 16. Cromatograma (GC/MS) de la especie Piper sp. Recolectada en Concepción Las Minas, Chiquimula. Caracterizada por presentar hojas pubescentes. 105 Imagen 17. Cromatograma (GC/MS) de la especie Piper patulum colectada en Concepción Las Minas, Chiquimula. Caracterizada por presentar hojas con aroma anisado. Imagen 18. Cromatograma (GC/MS) de la especie Stevia serrata colectada en carretera entre Chichicastenango y Santa Cruz del Quiché, Quiché. 106 Imagen 19. Cromatograma (GC/MS) de la especie Stevia serrata colectada en carretera a Santa María Chiquimula, Totonicapán. Imagen 20. Cromatograma (GC/MS) de la especie Stevia serrata colectada en aldea San José Ixcaniche, San Miguel Ixtahuacán, San Marcos. 107 IV.4.3 Espectros infrarrojos de aceites esenciales. Espectro 1. Espectro infrarrojo (IR) de aceite esencial de Ocimum micranthum de Livingston, Izabal. Espectro 2. Espectro IR del aceite esencial de Tagetes lucida de Joyabaj, Quiché. 108 Espectro 3. Espectro IR del aceite esencial de Lippia salamensis de La Cumbre de el Chol, Baja Verapaz. Espectro 4. Espectro IR del aceite esencial de Piper martensianum de Concepción Las Minas, Chiquimula. 109 Espectro 5. Espectro IR del aceite esencial de Cedrela odorata de aldea El Remate, Petén. Espectro 6. Espectro IR del aceite esencial de Piper sp. de Dolores, Petén. 110 Espectro 7. Espectro IR del aceite esencial de Stevia serrata de San Miguel Ixtahuacán, San Marcos. Espectro 8. Espectro IR del aceite esencial de Piper sp. aldea El Remate, Petén. 111 Espectro 9. Espectro IR del aceite esencial de Piper sp. “hoja suave” de Dolores, Petén. 112 IV.4.4 Fotografías del proyecto. Fotografía 1. Inyección de estándares en cromatógrafo de gases. Fotografía 2. Pobladores de Aldea Barra Lámpara, en Rio Dulce, Izabal, quienes colaboraron en la colecta de Pimienta dioica en el área. 113 Fotografía 3. Colecta de manzanilla en Sololá. Fotografía 4. Colecta de té de limón en Suchitepéquez. 114 Fotografía 5. Inyección de aceites esenciales en el cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama (FID). Fotografía 6. Inyección de muestras de aceites esenciales de plantas aromáticas de Guatemala en el IPPN de la UFRJ. 115 Fotografía 7. Espectrofotómetro IR con dispositivo ATR utilizado para la determinación de espectros ATR de aceites esenciales de plantas aromáticas de Guatemala. Fotografía 8. Colecta de té de limón en la finca Bulbuxyá, departamento de Suchitepéquez. 116 Fotografía 9. Medición de índices de refracción de aceites esenciales obtenidos en el proyecto. Fotografía 10. Personal del proyecto en participación en el VIII Simposio Brasileño de Aceites Esenciales en noviembre de 2015, en que se presentaron resultados del proyecto. 117 Fotografía 11. Extracción de aceites esenciales por hidrodestilación. Fotografía 12. Inyección de fracción volátil de plantas aromáticas, extraída por SPME. 118 Fotografía 13. Ejemplar de Abies guatemalensis en población en el departamento de Chimaltenango. Fotografía 14. Colecta de una muestra de hojas de Lippia substrigosa en el departamento de Sololá. 119 Fotografía 15. Stevia serrata de una población localizada en Santa Cruz del Quiché. Fotografía 16. Cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de masas del Instituto de Pesquisas de Productos Naturales de la Universidad Federal de Río de Janeiro, en el cual se inyectaron muestras de aceites esenciales en junio. 120 Fotografía 17. Aceite esencial de Stevia serrata obtenido por hidrodestilación. Fotografía 18. Presentación de poster en Simposio Internacional de Aceites Esenciales, en Niza, Francia, en septiembre de 2016. 121 Fotografía 19. Colecta de plantas del género Piper en el departamento de Petén. Fotografía 20. Fotografía de una población de Piper jacquemontianum en el municipio de Sayaxché, Petén. 122 Fotografía 21. Colecta de una planta del género Piper en el municipio de Dolores, departamento de Petén. 123 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO 124 V.2 CRONOGRAMA Actividad Trim Trim Trim 1 2 3 1. Investigación X bibliográfica 2. Cotización y X presentación de pedidos de compra de material y equipo 3. Compra de material y X equipo 5. Implementación de métodos analíticos en el laboratorio 6. Preparación de X material para colectas de campo 7. Colecta de material X vegetal y cultivo 8. Extracción de las X muestras 9. Análisis de Aceites X Esenciales por IR, refractometría y actividad antioxidante. 10. Análisis de X Aceites Esenciales por CG-EM, IR em UFRJ. 11. Evaluación de X resultados 12 Preparación de X informes parciales 13. Preparación del informe Final del proyecto 14. Publicación divulgación resultados y de Trim 4 Trim 5 Trim Trim 6 7 Trim 8 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Trim Trim 9 10 X X X X X X X X 125
