Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental MATERIAL 08 TEMA: COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS Y CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ÓPTICOS La espectroscopia puede ser de emisión, absorción, fluorescencia, o dispersión; según se emita, absorba, fluoresca, o disperse la radiación por una determinada sustancia. Absorción: transición desde el estado fundamental a uno o varios estados excitados de un átomo o molécula, que tiene lugar con transferencia de energía procedente de la radiación electromagnética. En la espectroscopia de absorción se requieren de una fuente externa de energía radiante; el haz de luz proveniente de la fuente y que ha pasado a través del selector de longitud de onda atraviesa la muestra. Emisión: transición desde estados excitados a estados de menor nivel de energía con emisión de radiación. La espectroscopia de emisión difiere de los otros tres tipos porqué no se necesita una fuente externa de radiación ya que la propia muestra es la emisora. La muestra, suele ser introducida en un plasma, chispa o una llama, lo que proporciona la suficiente energía térmica (se energetiza) y emite una radiación característica. Dispersión: cambio en la dirección de la luz debido a su interacción con la materia; puede ocurrir con o sin transferencia de energía. En el caso de la fluorescencia y de la dispersión, la fuente de radiación produce en la muestra contenida en un recipiente adecuado, radiación fluorescente o dispersa característica que se mide bajo un ángulo (por lo general 90°) con respecto al haz incidente de la fuente. MSc. William Sagástegui G. Página 1 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental Históricamente, el término espectroscopia se refiere a una rama de la ciencia en la que la luz, o radiación visible, se descomponía en sus longitudes de onda componentes, originándose así los espectros, que se usaban para los estudios teóricos de la estructura de la materia o para análisis cualitativos y cuantitativos. Fig 2: Descomposición de la luz blanca Con el paso del tiempo, el significado fue cambiando y se amplio para incluir la utilización de no solo la luz, sino todo el espectro de radiación MSc. William Sagástegui G. Página 2 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental electromagnética. El uso actual, amplia el significado de espectroscopia para incluir estudios con otro tipos de radiación con iones (espectroscopia de masas), electrones (espectroscopia de electrones) y ondas de sonido (espectroscopia acústica). La espectroscopia (o espectrografía) comprende el estudio, la producción e interpretación de espectros atómicos y moleculares. Estudio, en cuanto se trata de los espectros teóricos que sustenta esta disciplina. Producción, en cuanto se obtienen experimentalmente los diferentes espectros de átomos y moléculas. Interpretación, en cuanto se establecen las correlaciones entre los espectros y las estructuras atómicas y moleculares, permitiendo la identificación de elementos y sustancias químicas. Por lo tanto, la espectroscopia óptica abarca el estudio, producción e interpretación de espectros de átomos y moléculas, ya sean de emisión, absorción, fluorescencia, o dispersión; y los métodos e instrumentos necesarios para obtener información de la composición química del material en estudio, en las tres regiones importantes del espectro EM son: Ultravioleta, Visible e Infrarrojo. La región del UV de < 185 nm es llamada ultravioleta en el vacio, no es muy accesible para los análisis de rutina. Por lo tanto en la región UV de > 185 nm se verifica la espectroscopia UV. La región visible abarca el rango de 380 a 780 nm ( 400 – 800 ). La región IR va de 0.78 hasta 1000 µm, sin embargo el sector más utilizado se considera que está entre 2.5 a 15 µm. 1. COMPONENTES DE LA INSTRUMENTACIÓN PARA LOS MÉTODOS ÓPTICOS Los componentes básicos de los instrumentos analíticos utilizados en la espectroscopia, son muy semejantes en sus propiedades, aunque difieren en algo en su configuración, independientemente que estén diseñados para la radiación ultravioleta (UV), visible o Infrarroja (IR). Por lo tanto a estos se les describe como instrumentos ópticos, aunque la sensibilidad del ojo se limita solo a la región visible. Estos son cinco: 1. Una fuente estable de energía radiante; MSc. William Sagástegui G. Página 3 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental 2. Un selector de longitudes de onda, que permite utilizar una región limitada del espectro de longitud de onda restringida; 3. Uno o varios recipientes transparentes para colocar la muestra; 4. Un detector de radiación o transductor que convierte la energía radiante en una señal utilizable, por lo general eléctrica, y 5. Un dispositivo de procesamiento de la señal y de lectura, que habitualmente consiste en un equipo electrónico y un computador en los Procesador instrumentos más modernos. Selector de longitudes de onda de señales y de lectura Detector Fuente Cubeta para muestra Fig 3: Alineación de los componentes de un Instrumento para medidas de absorción. La fuente de radiación de longitud de onda seleccionada se envía a través de la muestra, y la radiación transmitida se mide por la unidad de detección, procesamiento de la señal y lectura. Dispositivo de procesamiento de señal y de lectura Fig 4: Esquema de un espectrofotómetro El diseño también depende del uso primario del instrumento; según sea para MSc. William Sagástegui G. Página 4 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental análisis cualitativo o cuantitativo, o si se utiliza para espectroscopia molecular o atómica. La fuente general y los requerimientos de utilización de cada tipo de componente son semejantes, independientemente de la longitud de onda, de la región del espectro o de su aplicación. 1.1. FUENTES DE RADIACIÓN: CARACTERÍSTICAS: 1° Debe producir un haz de radiación cuya potencia sea suficiente para facilitar la detección y medida. 2° La señal de salida (el voltaje de salida) de la fuente de radiación debe ser estable. Esto requiere un suministro de energía bien regulado que le proporcione energía a la fuente. Lo característico es que la potencia de la energía radiante de una fuente varíe exponencialmente con la potencia eléctrica proporcionada; por lo que muchas veces debe utilizarse una fuente de poder regulada para alcanzar la estabilidad requerida. En otros instrumentos la señal de salida se divide en dos haces, uno de referencia y el otro para la muestra y dos transductores apareados uno para recibir directamente el haz de referencia y el otro para recibir el haz emergente de la muestra. El parámetro analítico es entonces la relación de las dos señales de salida de los dos transductores. En esta forma se anula casi por completo el efecto de las fluctuaciones en la salida de la fuente. En otros instrumentos se utiliza sólo un transductor que recibe en forma alternada el haz de la muestra y el de referencia. 1.1.1. Tipos de fuentes de radiación En espectroscopia óptica se utilizan: a. Fuentes continúas, que emiten una radiación cuya intensidad varía de manera gradual en función de la longitud de onda. Empleadas en los procedimientos de absorción molecular. b. Fuentes lineales, que emiten un número limitado de líneas espectrales, cada una de las cuales abarca un rango de longitudes de onad muy limitado. Empleadas en la espectroscopia de fluorescencia y absorción atómica. MSc. William Sagástegui G. Página 5 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental A1) Fuentes continúas de radiación ultravioleta, visible e infrarroja cercana: La potencia de la radiación no varía bruscamente entre longitudes de onda adyacentes. a.1. Lámpara de deuterio (llamadas también de Hidrógeno): se utilizan mas a menudo para proporcionar una radiación continua en la región ULTRAVIOLETA (UV). Una lámpara de deuterio consta de un tubo cilíndrico que contiene hidrógeno o deuterio a baja presión, con una ventana de cuarzo por la que sale la radiación. Producen átomos de deuterio o hidrógeno más un fotón ultravioleta a un espectro continuo desde 160 a 375 nm (hasta inicio de la región visible). Deben emplearse ventanas de cuarzo en los tubos, porque el vidrio absorbe fuertemente en esta región de longitud de onda. a.2. Lámpara de filamento de tungsteno: La fuente más común de radiación visible e infrarroja cercana es la lámpara de filamento de tungsteno. Una lámpara de filamento de tungsteno es útil para la región de longitudes de onda comprendida entre 320 y 2500 nm; y funcionan generalmente a una temperatura de 2900 K. a.3. Lámpara de tungsteno/halógeno: llamadas también lámparas de cuarzo/halógeno, contienen una pequeña cantidad de yodo dentro de la cubierta de cuarzo donde está alojado el filamento. El cuarzo permite que el filamento funcione a una temperatura próxima a 3500 K, lo que produce mayores intensidades y amplía el rango de la lámpara hasta parte de la región UV (240 – 2500). Una Lámpara de tungsteno/halógeno tiene una vida útil de más del doble que una lámpara de tungsteno común, porqué la vida útil de esta última está limitada por la sublimación del tungsteno del filamento. A2). Fuentes continúas de radiación INFRARROJA (IR): Las fuentes continuas de radiación IR se obtienen calentando sólidos inertes. Una fuente denominada Globar consta de una varilla de carburo de silicio; la radiación infrarroja se emite cuando el Globar se calienta a unos 1500ºC mediante el paso de electricidad. La intensidad radiante máxima a estas temperaturas se produce en 1.7 a 2.0 µm (6 000 a 5 000 cm-1). En longitudes de onda más larga la intensidad desciende continuamente hasta que llega a ser de 1 % del máximo de MSc. William Sagástegui G. Página 6 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental 15 m (665 cm-1). En el lado de longitudes de onda corta la reducción es mucho más rápida, y una reducción similar en intensidad se observa en 1 m ( 10 000 cm-1). La lámpara de Nernst (emisor incandescente de Nernst), es un cilindro de óxidos de circonio y de itrio (tierras raras) con un diámetro de 1 a 2 mm y una longitud de 20 mm, en los extremos del cilindro hay alambres de platino para el paso de la corriente. Emiten radiación IR cuando es calentado a alta temperatura por el paso de una corriente eléctrica. B. Fuentes de líneas En espectroscopia de absorción atómica, espectroscopia Raman, refractometría y polarimetría, se utilizan fuentes cuya radiación es en forma de unas pocas líneas de longitud de onda definida. b.1. Lámparas de vapor metálico: Las dos fuentes de líneas más comunes son las lámparas mercurio y de sodio. Una lámpara de vapor consiste en una envoltura transparente que contiene un elemento gaseoso a baja presión. Cuando se aplica un potencial a través de dos electrodos colocados en el interior de la envoltura, se excita la línea espectral característica del elemento correspondiente. Existe conducción debido a que se forman electrones y iones como consecuencia de la ionización del metal. Por lo general, se requiere un calentamiento inicial para producir suficiente vapor metálico; una vez logrado esto, la CORRIENTE SE MANTIENE. La lámpara de mercurio produce varias líneas cuya longitud de onda varía entre 254 y 734 nm. En la lámpara de vapor de sodio predomina el par de líneas de 589.0 y 589.6 nm. b.2. Lámparas de cátodo hueco: Estas lámparas producen un espectro de líneas para un gran número de elementos. Su empleo se limita a los instrumentos de absorción atómica y de fluorescencia atómica. b.3. Láseres La palabra láser es una sigla inglés que significa light amplification by stimulated MSc. William Sagástegui G. Página 7 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental emission of radiation (amplificación de luz por medio de la emisión estimulada de radiación). Debido a su propiedad de amplificación de la luz los láseres producen haces de radiación estrechos y sumamente intensos. El proceso de EMISION estimulada produce un haz de radiación altamente monocromático (ancho de banda de 0.01 nm o menos (y notablemente coherente). Debido a estas características los láseres se han transformado en una importante fuente de radiación para las regiones ultravioleta, visible e infrarroja del espectro. 1.2. Un selector de longitudes de onda, (dispositivo que permite utilizar una región de longitud de onda restringida): Los instrumentos espectroscópicos para la regiones UV y visible suelen estar provistos de uno o varios dispositivos para que la radiación medida quede restringida a una estrecha banda absorbida o emitida por el analito. Estos dispositivos refuerzan tanto la selectividad como la sensibilidad de un instrumento. Además en el caso de las medidas de absorción, las bandas de radiación estrechas reducen en alto grado la posibilidad de desviación de la ley de Beer debida a la radiación policromática. Los dispositivos utilizados son el monocromador o filtro y el espectrógrafo. Monocromador: Es un dispositivo que dispersa la radiación policromática en bandas que abarquen un intervalo de valores restringido de longitud de ONDA. Permiten aislar la banda de longitud de onda deseada. Tienen generalmente una rejilla de difracción para dispersar la radiación en sus longitudes de onda. Cuando se hace girar la rejilla se logra que diferentes longitudes de onda pasen a través de la rendija de salida. En los instrumentos más antiguos se utilizaban Prismas. El intervalo de longitudes de onda que pasan por un monocromador, denominadas paso de banda espectral o ancho de banda efectiva, puede ser menor que 1 nm en los instrumentos más caros o mayor de 20 nm en los sistemas baratos. Los monocromadores para la radiación ultravioleta, visible e infrarrojo, son todos semejantes entre si en cuanto a su construcción mecánica en el sentido de que en ellos se emplean RANURAS, LENTES, ESPEJOS, VENTANAS Y PRISMAS o REDES DE DIFRACCIÓN. MSc. William Sagástegui G. Página 8 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental Los materiales con los que se construyen estos componentes, se escogen de acuerdo a los intervalos de longitudes de onda para los cuales se utilizan. Componentes de un monocromador 1. Ranura de entrada 2. Una lente o espejo colimador para producir un haz de radiación paralela. 3. Un prisma o red de difracción (rejilla) como elemento dispersor. 4. Un elemento de enfoque que proyecta una serie de imágenes rectangulares de la ranura de entrada sobre una superficie plana (EL PLANO FOCAL). Fig 5: Monocromador de prisma Fig 6: Monocromador de rejilla. La 1 es más larga que la 2. Además la mayoría de los monocromadores tienen ventanas de entrada y salida que se colocan para proteger los componentes, del polvo y los vapores corrosivos MSc. William Sagástegui G. Página 9 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental del laboratorio. Rejillas: La mayoría de monocromadores tienen rejillas de réplicas. Esta consta de una superficie dura, pulida y ópticamente plana, en la que mediante herramienta de diamante con forma adecuada se hace un buen número de surcos paralelos muy cercanos entre si. Comúnmente una rejilla para la región ultravioleta y visible contiene entre 300 y 2000 surcos/mm, siendo entre 1 200 y 1 400 de éstos el número más común. Los instrumentos que utilizan monocromador son: Los espectrómetros, espectrofotómetros, fotómetros, espectrógrafo (utiliza rejilla), etc. - Espectrofotómetros: Es un espectrómetro que contiene un dispositivo FOTOELECTRICO para cuantificar la potencia de la radiación que sale de la ranura. - Espectrómetro: instrumentos que poseen una ranura de salida fija, localizada en el plano focal, puede variar en forma continua si se gira el elemento dispersor. - Fotómetro: También utiliza un detector FOTOELECTRICO, pero no posee monocromador, en su lugar utiliza filtros que permiten obtener bandas de radiación que abarcan un intervalo limitado de longitudes de onda. Con un fotómetro no es posible obtener una banda de radiación variable en forma continua. Tipos de Filtros: 1. Absorción: Sólo para la región visible del espectro. Estos limitan la radiación absorbiendo ciertas porciones del espectro. El tipo más común consiste en un vidrio coloreado o un colorante suspendido en gelatina y colocado entre placas de vidrio. Los filtros de vidrio de color tienen la ventaja de su mayor estabilidad térmica. Los filtros de absorción poseen anchos de banda efectivos que varían de 30 a 250 nm. Estos tienen un rendimiento significativamente inferior si se comparan con los filtros de interferencia: ANCHOS DE BANDA MAYORES Y FRACCION DE LUZ TRANSMITIDA MENOR. MSc. William Sagástegui G. Página 10 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental Fig: Filtros de absorción 2. Filtros de Interferencia: se utilizan con las radiaciones ultravioleta, visible e infrarroja, con de hasta 14 µm. Se basan en un fenómeno de interferencia óptica para producir bandas relativamente estrechas de radiación que suele tener de 5 a 20 nm de ancho. Un filtro de interferencia consta de una capa muy delgada de material dieléctrico transparente (frecuentemente fluoruro de calcio o de magnesio) revestida por ambas caras con una película metálica semitransparente delgada para transmitir casi la mitad de la radiación que incide sobre ella y para reflejar la otra mitad. Este conjunto está encerrado entre dos placas de vidrio que lo protegen de la atmósfera. El espesor de la placa dieléctrica se controla cuidadosamente, y determina la longitud de onda de la radiación transmitida. Policromador: tiene varias rendijas de salida y múltiples detectores. Esto permite la medida simultánea de muchas longitudes de onda. Se utilizan en la espectroscopía de emisión. 1.3. Recipientes para la muestra: A excepción de la espectroscopia de emisión, en todas las técnicas espectroscópicas, se requiere recipientes para colocar la muestra, llamadas: Celdas o cubetas. Deben ser construidas de un material que permite el pasaje de la región espectral que interesa. El cuarzo o sílice fundido son necesarios para la región ultravioleta ( menores que 350 nm); y pueden emplearse en la región visible y hasta aproximadamente 3 m (3000 nm) en el infrarrojo. - Los vidrios de silicatos se emplea para la región entre 350 y 2000 nm porqué MSc. William Sagástegui G. Página 11 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental su costo es bajo comparado con el cuarzo. - También se emplean celdas de plástico para la región visible. - El cloruro de sodio cristalino es el material más común en ventanas de las celdas para la región del infrarrojo, que es soluble en agua y en algunos otros disolventes. - Hay materiales que pueden ser útiles en la fabricación de celdas para muestras por ser transparentes en el infrarrojo. - Las mejores celdas tienen ventanas perpendiculares a la dirección del haz (rayo), para reducir al mínimo las pérdidas por reflexión. - La longitud más común en la trayectoria de las celda para estudios en las regiones ultravioleta-visible, es 1 cm, también existen las de 0.1 cm (o menos) hasta de 10 cm. - Las celdas para líquidos y soluciones para el infrarrojo tienen por lo general trayectorias menores de 1 mm. Cubetas o celdas 1.4. Detectores y medida de la energía radiante: Un detector es un dispositivo que indica la existencia de algún fenómeno físico. Algunos ejemplos muy conocidos son las películas fotográficas (para indicar la presencia de radiación electromagnética o radiactiva), el fiel de una balanza (que indica diferencias de masa) y el nivel de mercurio en un termómetro (para indicar la temperatura). El ojo humano también es un detector: convierte la radiación visible en una señal eléctrica que es enviada al cerebro por una cadena de neuronas localizadas en el nervio óptico y se produce la visión. En los instrumentos modernos, la información buscada se codifica invariablemente y se procesa como una señal eléctrica. El término transductor se emplea para indicar el tipo de detector que convierte cantidades, tales como intensidad luminosa, pH, masa y temperatura, en señales MSc. William Sagástegui G. Página 12 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental eléctricas, que después pueden ser amplificadas finalmente en números proporcionales a la magnitud de la cantidad original. Son transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica. Propiedades de los detectores: - Debe responder rápidamente a los niveles bajos de energía radiante en un amplio intervalo de longitudes de onda. - Debe ser sensible a bajos niveles de potencia radiante. - Responder rápidamente a la radiación. - Debe producir una señal eléctrica que pueda amplificarse fácilmente y tener un nivel de ruido eléctrico relativamente bajo (para estabilidad). - Es esencial que la señal eléctrica producida por el transductor debe ser directamente proporcional a la potencia radiante P del haz que incide en el detector. Tipos de detectores (o Transductores): 1. Detectores de fotones (Respuesta a fotones) 2. Detectores térmicos (Respuesta al calor) Todos los detectores de fotones se basan en la interacción de radiación con una superficie reactiva que produce electrones (Fotoemisión) o para promover electrones a estados energéticos en los que puede conducir la electricidad (fotoconducción). Sólo la radiación ULTRAVIOLETA, VISIBLE o INFRARROJA CERCANA poseen energía suficiente para hacer que se produzca una fotoemisión; por eso los detectores de fotones están limitados a longitudes de onda inferiores a 2 µm (2000 nm). Los fotoconductores pueden emplearse en las regiones del IR cercano, medio y lejano del espectro. Detectores comunes para espectroscopía de absorción Tipo Rango de , nm Detectores de Fotones Fototubos 150 – 1000 Tubos fotomultiplicadores 150 – 1000 MSc. William Sagástegui G. Página 13 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica Análisis Instrumental Fotodiodos de silicio 350 - 1100 Células fotoconductoras 1000 – 50, 000 Detectores térmicos Termopares 600 – 20, 000 Bolómetros 600 – 20, 000 Celdas neumáticas 600 – 40, 000 Celdas piroeléctrica 1000 – 20, 000 1.5. Procesadores de señal e indicadores: Un procesador de señal es generalmente un dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica procedente del detector; además puede modificar la señal de cc a ca (o a la inversa), cambiar la fase de la señal y filtrarla para suprimir los componentes no deseados. El procesador de señales se puede utilizar también para realizar operaciones matemáticas sobre la señal, ya sea diferenciación, integración o conversión a un logaritmo. En los instrumentos modernos se encuentran diversos tipos de dispositivos indicadores. Algunos ejemplos son medidores digitales, escalas de potenciómetros, registradores, tubos de rayos catódicos y monitores de microcomputadores. MSc. William Sagástegui G. Página 14
