UNIDAD 4: TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Módulo Profesional: Biología Molecular y Citogenética 1 ÍNDICE RESUMEN INTRODUCTORIO ................................................................. 3 INTRODUCCIÓN ................................................................................. 3 CASO INTRODUCTORIO ....................................................................... 5 1. ÁCIDOS NUCLEICOS........................................................................ 6 1.1 Pentosa ..................................................................................... 6 1.2 Bases nitrogenadas .................................................................... 7 1.3 Grupo fosfato ............................................................................ 8 1.4 ADN.......................................................................................... 9 1.4.1 Estructura primaria del ADN ................................................. 10 1.4.2 Estructura secundaria del ADN.............................................. 11 1.4.3 Estructura terciaria del ADN .................................................. 12 1.5.- ARN....................................................................................... 13 1.5.1 ARN mensajero (ARNm) ...................................................... 14 1.5.2 ARN ribosómico (ARNr) ......................................................... 16 2. PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ......................... 19 3. PROCESOS GENÉTICOS .................................................................. 22 3.1 Hibridación ............................................................................... 23 3.2 Duplicación ............................................................................... 24 3.3 Transcripción ............................................................................ 26 3.4 Traducción................................................................................ 27 4. ENZIMAS ASOCIADAS A LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ............................. 31 5. MUTACIONES Y POLIMORFISMOS .................................................... 34 5.1 Tipos de mutaciones en función de la estructura génica que altera .. 35 5.2 Tipos de mutaciones por sustitución de un nucleótido .................... 36 6. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN................................................. 37 6.1 Técnicas de extracción manual .................................................... 38 6.2 Técnicas de extracción automatizadas .......................................... 39 7. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ARN ................................................. 40 RESUMEN FINAL ................................................................................ 42 2 RESUMEN INTRODUCTORIO Mediante la lectura y el estudio de esta unidad se busca que el lector/a reconozca el ADN y el ARN como ácidos nucleicos portadores de información genética. Para ello, se identifica la estructura y arquitectura molecular además de los enlaces (químicos) que se establecen en su interior entre las moléculas que las constituyen (un azúcar en forma de ribosa o desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada: A, T (U), G y C). Del mismo modo, y para buscar una comprensión significativa del comportamiento a nivel celular de dichas biomoléculas, se identifican las diferentes propiedades físicas que las dotan de una singularidad significativa. Basándonos en dichas propiedades, se exponen y explican los procesos de Hibridación, Duplicación, Transcripción y Traducción de los ácidos nucleicos sin olvidar es estudio de los participantes en los citados procesos, tanto en condiciones experimentales como en su desarrollo normal a lo largo de la biodinámica de la célula. Por último, y buscando aplicaciones técnicas se Hace referencia a las técnicas de extracción de ADN. Todo ello, para que finalmente el lector/a sea consciente de cómo funciona el almacenamiento, la conservación en el tiempo y la codificación de la información genética. INTRODUCCIÓN Para conocer la biología de los ácidos nucleicos, especialmente del ADN, y poder manejarlos en el laboratorio, como herramienta clínica y experimental, mediante técnicas de biología molecular es necesario conocer el comportamiento de dicha molécula a lo largo de la vida de la célula. Para ello, es de importancia ver qué es el ciclo celular y qué ocurre con el material genético a lo largo de éste. El ciclo celular se describe como el proceso o la secuencia de eventos ordenada en una escala temporal que conducen a la proliferación y división celular. Se reconocen dos etapas. Una primera denominada interfase (G1, S, G2) y una segunda llamada fase M o fase mitótica (Mitosis y Citocinesis). 3 En la interfase se da la replicación del material genético, es decir, la célula se prepara para la fase de mitosis (M). Debido a esto, la célula sufre un incremento de masa y tamaño celular y el ADN va compactándose con la ayuda de proteínas que se encargan del empaquetamiento (histonas) hasta formar la estructura de mayor compactación, el cromosoma. Dicho nivel de condensación o empaquetamiento es variable y dinámico con el fin de optimizar los procesos de replicación, transcripción y reparación del material genético. Posteriormente en el tiempo, ya inmersos en la fase M, se da la división celular junto a los procesos de reparto de orgánulos citoplasmáticos y estrangulamiento de la célula (citocinesis), tras el cual el resultado son dos células completamente iguales en cuanto a dotación genética. La información genética a la que se ha hecho referencia anteriormente está inmersa en la molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico). Ésta simplemente es una cadena larga no ramificada de desoxirribonucleótidos que mediante uniones fosfodiéster constituyen un polidesoxirribonucleótido que funciona como transportador universal de la información heredable. Niveles de compactación o empaquetamiento de la cromatina (ADN + proteínas) a lo largo del ciclo celular 4 Espacialmente, el ADN es una doble cadena de polinucleótidos que se disponen en sentido contrario (antiparalelas) con forma de espiral que giran sobre un eje en común, constituyendo la doble hélice. Puede adoptar diferentes conformaciones, la que más predomina o prevalece en la naturaleza es la Hélice--Dextrógira, donde la doble hélice gira hacia la derecha en torno al eje común. Dentro de los protocolos de extracción de material genético siempre se incluye una etapa en la que la muestra de ADN se pone en contacto con alcoholes puros, causando la formación de una película mucosa de diferente densidad que el alcohol. CASO INTRODUCTORIO Al llegar al laboratorio bioquímico, los compañeros te comentan que hoy tendrán que realizar algunas pruebas genéticas, para lo que deberán realizar estudios de ADN o ARN. La persona que estará al mando del proceso te invita a que colabores con ellos y así aprendas cómo se realiza este trabajo en el laboratorio, una idea que te entusiasma porque te parece muy interesante comprobar cómo se aplican las diferentes técnicas que estudiaste en el ciclo formativo. Hasta ahora, has comprobado que tus compañeros se esfuerzan en que conozcas bien cuál es la forma de trabajar del laboratorio, prestando atención a que entiendas bien los fundamentos de cada rutina clínica y no solo aprendas de memoria los pasos a seguir. Al terminar el estudio de esta unidad, conocerás los diferentes ácidos nucleicos y sus propiedades físicas, los procesos genéticos y alteraciones que sufren, las enzimas asociadas a los mismos y las técnicas de extracción tanto de ADN y ARN. 5 1. ÁCIDOS NUCLEICOS Como hoy dedicarás la jornada en el laboratorio a acompañar a los compañeros en la preparación de estudios genéticos, el profesional a cargo del proceso comienza explicándote sus fundamentos desde el principio para asegurarse de que comprendes todos los conceptos que serán de utilidad. Por eso, comienza repasando contigo qué son los ácidos nucleicos y cuáles son sus tipos, diferenciando también entre las estructuras del ADN y el ARN mensajero y ribosómico, especialmente importantes. Los ácidos nucleicos son formadas por la unión de biomoléculas nucleótidos. Un nucleótido está formado por la unión de una base nitrogenada, una pentosa y un grupo fosfato. 1.1 Pentosa Es una monosacárido (azúcar) con cinco átomos de carbono. En los ácidos nucleicos es posible identificar dos tipos de pentosa: La RIBOSA. Forma parte de la molécula de ARN. Posee todos sus grupos hidroxilo completos (OH-). La DESOXIRRIBOSA. Forma parte de la molécula de ADN. Ha sufrido la pérdida de un átomo de Oxígeno (O) en el hidroxilo (OH-) del C´2. Ribosa Desoxirribosa 6 PARA SABER MÁS… El grupo fosfato es simplemente el anión (ion cargado electronegativamente) derivado de la disociación (rotura química) de una molécula de ácido fosfórico. Éste, en el ámbito de la biología molecular y la bioquímica también es llamado fosfato inorgánico o "Pi" y forma parte de gran cantidad de moléculas de gran importancia para el organismo, como las proteínas, los ácidos nucleicos y las fuentes de energía del metabolismo celular. Por último, señalar que el proceso de disociación química, anteriormente citado, se basa en una pérdida de protones por parte del ácido. 1.2 Bases nitrogenadas Son compuestos orgánicos cíclicos constituidos por dos o más átomos de nitrógeno. En el ADN se ubican en el interior de la doble hélice. La desoxirribosa y los grupos fosfatos conforman el recubrimiento externo. Pueden ser púricas y pirimidínicas: Púricas: presentan dos anillos aromáticos, y son la Adenina (A) y la Guanina (G). Pirimidínicas: presentan un único anillo aromático, y son la Citosina (C), la Timina (T) y el Uracilo (U). La timina sólo está presente en el ADN y el uracilo en el ARN 7 Estructura molecular de las purinas o bases púricas, A y G; y de las pirimidinas o bases pirimidínicas, C, T y U. SABÍAS QUÉ... Cuando hablamos de... OH-, hacemos referencia a un grupo químico funcional constituido por una molécula de Oxígeno (O) y otra de Hidrógeno (H). Es un grupo presente en alcoholes y ácidos orgánicos, además de en multitud de moléculas orgánicas. C´2, hacemos referencia a la molécula de carbono ubicada en la posición número dos de una determinada molécula orgánica cuya base molecular es el carbono. 1.3 Grupo fosfato Es el anión (ion cargado electronegativamente) derivado de la disociación (rotura química) de una molécula de ácido fosfórico. 8 RECUERDA... Un NUCLEÓSIDO está constituido por: BASE NITROGENADA + RIBOSA o DESOXIRRIBOSA Un NUCLEÓTIDO está constituido por: BASE NITROGENADA + RIBOSA o DESOXIRRIBOSA + GRUPO FOSFATO Figura de Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2014). Lehninger. Principios de Bioquímica‒6ª Edición. 1.4 ADN. El ácido desoxirribonucleico (ADN) está formado por una secuencia de nucleótidos, cuya pentosa es la desoxirribosa y sus bases nitrogenadas son la adenina, la citosina, la guanina y la timina. Es la biomolécula que contiene la información genética de un individuo, estando presente en el núcleo de todas las células eucariotas y libre en el citoplasma de las procariotas. Se identifican tres niveles de organización (primaria, secundaria y terciaria) responsables de sus propiedades físicas, así como los procesos e los que participa dicha molécula. 9 1.4.1 Estructura primaria del ADN Es la secuencia lineal de nucleótidos. Estos se encuentran unidos mediante enlaces fosfodiéster formados en sentido 5’-3’, es decir, la formación de la cadena polinucleotídica sigue una dirección 5´3´ dado que los nucleótidos se agregan en el extremo 3´terminal de la cadena de ácido nucleico que crece. Estructura primaria de una molécula de ADN 10 NOTA DE INTERÉS En las estructuras de doble cadena formadas entre ácidos nucleicos, las bases nitrogenadas son COMPLEMENTARIAS (purinas-pirimidinas). Éstas se enlazan mediante el establecimiento de puentes de hidrógeno (A=T; GC) constituyendo las llamadas PARES DE BASES (pb) de Watson y Crick. Adenina y Timina establecen entre sí 2 puentes de hidrógeno (A=T), al igual que Adenina y Uracilo (A=U). Guanina y Citosina establecen entre sí 3 puentes de hidrógeno (GC). 1.4.2 Estructura secundaria del ADN Es lo que se conoce como “modelo de la doble hélice del ADN”, propuesto por Watson y Crick. Este modelo propone que el ADN está formado por dos hebras de nucleótidos enrolladas entre sí alrededor de un eje común formando una doble hélice. Estas dos hebras de nucleótidos son antiparalelas y complementarias. - Antiparalelas. Una monocadena está orientada en un sentido (5’-3’) y la otra en el sentido contrario (3’-5’). - Complementarias. Las bases nitrogenadas están enfrentadas dos a dos (púrica-pirimidínica) y unidas mediante puentes de hidrógeno. La unión se produce entre la guanina y la citosina mediante tres puentes de hidrógeno, y mediante la adenina y la timina por dos puentes de hidrógeno. Los puentes de hidrógeno que mantienen unidas ambas cadenas, son enlaces débiles que pueden romperse mediante la aplicación de calor. Por ello, si se somete a la molécula de ADN a una alta temperatura, los puentes de hidrógeno se romperán y consecuentemente la estructura de doble hélice se desorganiza, obteniéndose dos hebras monocatenarias. A este proceso se le conoce como DESNATURALIZACIÓN del ADN. 11 Estructura secundaria de una molécula de ADN 1.4.3 Estructura terciaria del ADN La estructura terciaria del ADN presenta diferentes niveles de condensación y empaquetamiento, los cuales se consiguen gracias a que la doble hélice de ADN se asocia con proteínas histonas. - El primer nivel de condensación es el nucleosoma, el cual está formado por una proteína histona rodeada de la doble cadena de ADN, formándose una estructura denominada collar de perlas. - El segundo nivel de condensación es la fibra de cromatina de 30nm o solenoide, el cual se consigue gracias a la condensación y compactación en espiral de las proteínas histonas que se han unido al ADN formando los nucleosomas. - El tercer nivel de empaquetamiento se consigue porque continúa la formación de espirales unas sobre otras, consiguiendo un superenrollamiento del ADN, apareciendo condensación de cromatina extendida posteriormente de cromatina condensada la de de estructura de 300nm, 700nm. y Esta cromatina continúa con su empaquetamiento para alcanzar el mayor grado de condensación que presenta el ADN, que es el cromosoma. 12 Estructura terciaria o empaquetamiento de una molécula de ADN RECUERDA... La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) simplemente es una cadena larga no ramificada de desoxirribonucleótidos que mediante uniones fosfodiéster constituyen un polidesoxirribonucleótido que funciona como transportador universal de la información heredable. 1.5.- ARN. El ácido ribonucleico (ARN) está formado por una cadena de nucleótidos, con la ribosa como pentosa y adenina, uracilo, citosina y guanina como bases nitrogenadas. La secuencia de nucleótidos que constituyen el ARN se forma igual que la estructura primaria del ADN, siendo una hebra en sentido 5’-3’ unida mediante enlaces fosfodiéster. El ARN posee multitud de funciones, por ejemplo, es la molécula que hace posible la expresión de genes, ya que el resultado de la transcripción es el ARN de tipo mensajero, usado posteriormente en el proceso de traducción de la información genética en proteínas. Principalmente se identifican cuatro tipos de ARN: 1. ARN mensajero (ARNm), 2. ARN ribosómico (ARNr) 3. ARN transferente (ARNt) 4. ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). 13 Estructura molecular del ARN 1.5.1 ARN mensajero (ARNm) Es el tipo de ARN resultado del proceso de transcripción, por lo que contiene la información copiada directamente del ADN, siendo su principal función es actuar como molécula plantilla o patrón para la síntesis de proteínas, de acuerdo con la información contenida en el ADN. Se forma en el núcleo a partir de la cadena de ADN por la transcripción, originándose una cadena lineal que se transporta al citoplasma de la célula. Previamente sufre un proceso de maduración donde ocurren varios eventos. 1. Adición de la CAP. Añadir en el extremo 5´del primer nucleótido moléculas de guanina modificada (m7G). Participa en el reconocimiento del primer codón en la transcripción. 2. Adición de la cola POLI A. Añadir aprox. 200 moléculas de Adenina en el extremo 3' del ARN transcrito primario. Participa en el transporte al citoplasma desde el núcleo y es responsable de la protección de citoplasmáticas la molécula (enzimas que de ARNm rompen de y las endonucleasas degradan los ácidos nucleicos). 14 3. SPLICING. Eliminación de fragmentos de la cadena de ARNm que no intervienen en el evento de síntesis proteica. Tradicionalmente a las secuencias no codificantes se les llama intrones. Estructura molecular del ARN mensajero NOTA DE INTERÉS Cada anticodón del ARNt es complementario a un codón del ARNm, que a su vez es complementario al codógeno del ADN molde. 15 1.5.2 ARN ribosómico (ARNr) Tipo de ARN que se une a proteínas específicas para conformar los ribosomas. Principalmente se identifican tres tipos formando parte de los ribosomas eucariontes. - ARNr 23S - ARNr 5S - ARNr 16S Tipos de ARN que conforman los ribosomas A. ARN transferente (ARNt) Tipo de ARN formado por tres brazos y tres bucles. Esto es debido a la complementariedad de las bases que constituyen la misma molécula. Por ello, en zonas donde existe complementariedad se forman brazos, mientras que en zonas donde las bases no son complementarias, no hay unión de los nucleótidos y se generan bucles. En el extremo de uno de estos bucles hay una secuencia de tres nucleótidos específicos (triplete), denominada “anticodón” que se asocia a un determinado aminoácido de acuerdo con el código genético. Es decir, cada uno de los 21 aminoácidos se asocia a uno o varios tripletes con el fin de hacer posible la descodificación de la información genética, es decir, la expresión de genes. Existen un total de 21 aminoácidos más el de STOP o parada (21+STOP), que generalmente no codifica para ningún aminoácido. 16 Funcionamiento del ARN transferente y formas más comunes de ilustrar el ARN transferente B. ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) Tipo de ARN que funciona como precursor de los diferentes tipos de ARN que se pueden encontrar dentro de la célula. 17 Se observan los brazos y bucles, además del extremo 3´ (aceptador) donde se da la unión con el aminoácido correspondiente al anticodón. Del mismo modo se plasma la complementariedad entre el anticodón del ARNt y el codón del ARNm. Imagen de Hib, J. (1998). Fundamentos de biología celular y molecular de De Robertis. PARA SABER MÁS… Enlaces que se forman en el interior de los ácidos nucleicos. Enlace FOSFODIÉSTER. Sirve de unión entre los desoxirribonucleótidos de un ácido nucleico. El mismo FOSFATO se une al –OH en posición 3´ (C3) de un nucleótido y al –OH en posición 5´de otro nucleótido.n este elemento se introducirán aquellas ideas clave incluyendo detalles que amplían lo que se ha estudiado en el contenido o algunos aspectos destacables y adicionales a la información aportada en la unidad. ENLACE N-GLUCOSÍDICO. Une las bases nitrogenadas con la molécula de azúcar (Ribosa o Desoxirribosa). Se forma entre el C 1 de la pentosa y N1 de las bases pirimidínicas y N9 de las púricas. 18 2. PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Una vez que el compañero del laboratorio ha repasado contigo los ácidos nucleicos, te pregunta si conoces cuáles son sus propiedades y sabrías definirlas, algo muy importante para poder trabajar con ellos. Efectivamente, tú sí que las absorbancia, desnaturalización y recuerdas perfectamente: renaturalización. Te densidad, costó un poco memorizarlas cuando las estudiaste, así que confirmas con tu compañero que recuerdas bien en qué consiste cada una de las propiedades físicoquímicas de los ácidos nucleicos. Estudiando los ácidos nucleicos se observa una serie de propiedades físicoquímicas. Densidad La densidad de un ácido nucleico se puede definir como el contenido en pares guanina-citosina que presenta. Esto es debido a que existe una relación lineal entre la densidad de un ácido nucleico (medida en forma de gradiente de densidad) y el contenido en pares guanina-citosina que presenta dicho ácido nucleico. Existe una ecuación cuadrática que relaciona la densidad del ácido nucleico y el contenido en pares guanina-citosina expresado en moles por ciento. Densidad = 1,66 + 0,00098 × (G+C) 19 Absorbancia Los ácidos nucleicos presentan una absorbancia característica de luz ultravioleta a 260nm. Dicha absorbancia está relacionada directamente con el estado físico del ácido nucleico. Por ello, el valor de absorbancia a 260nm: - Es menor (bajo) cuando el ácido nucleico se encuentra en estado de doble hélice. - Es mayor (alto) cuando se el ácido nucleico está desnaturalizado, debido a que éste pasa al estado de hélice sencilla. - Es aún mayor (más alto) si se da la degradación de la hélice sencilla de a nivel de nucleótidos libras. Cada uno de estos aumentos de absorbancia, se observarán como un aumento de coloración al hacer pasar las muestras por un espectrofotómetro. Por lo tanto, en condiciones estándar se podría usar el valor de absorbancia (260nm) para medir el estado físico de las moléculas de ácido nucleico. 20 Curva de absorbancia de dos muestras genéticas, una con fragmentos de doble hélice y otra con fragmentos de hélice sencilla Desnaturalización Consiste en separar la doble cadena de un ácido nucleico mediante la exposición a una determinada temperatura. El proceso de desnaturalización depende de la proporción de pares adenina-timina y guanina-citosina (A+T/G+C) que componen la molécula de ácido nucleico. Ya que, dicha proporción se relaciona con la estabilidad de la doble hélice de una determinada molécula. A mayor cantidad de pares G+C, mayor cantidad de puentes de hidrógeno presentará la molécula, y por ello será necesario aplicar una mayor temperatura para separar las dos hebras que forman esa doble cadena de ácido nucleico. Renaturalización. La renaturalización (hibridación) de un ácido nucleico consiste en unir dos cadenas simples que presentan complementariedad, y que generalmente han sufrido un proceso de desnaturalización previo. La velocidad de dicho proceso depende de determinados factores como la longitud de la cadena, el grado de complementariedad, las condiciones ambientales (pH, temperatura, concentración de sales-solubilidad), etc. NOTA DE INTERÉS Los ácidos nucleicos son solubles en agua, por su carácter polar, e insolubles en disolventes orgánicos como alcoholes. A pH celular los grupos fosfato que forman parte de la molécula de ácido nucleico se encuentran cargados negativamente. - Polaridad: separación de cargas eléctricas en una misma molécula. 21 3. PROCESOS GENÉTICOS Una vez que has confirmado con el profesional del laboratorio todo lo que sabes acerca de los ácidos nucleicos y sus propiedades, debéis profundizar en otro tema especialmente importante: los procesos que sufren en relación con la información genética. Te está sirviendo de gran ayuda repasar todos los conceptos que ya estudiaste, pero ahora a través de un compañero y ya en un laboratorio, donde puedes comprobar su aplicación real. Sientes que es una suerte que la dirección del laboratorio se preste a que podáis aprender de compañeros con tanta experiencia y eso te ayuda a no sentir tanta presión en esta experiencia profesional. Cuando hablamos de procesos genéticos hacemos referencia al conjunto de eventos en torno a los ácidos nucleicos en el marco de la información genética. Se estudiarán: la hibridación, la duplicación, la transcripción y la traducción. ¿SABÍAS QUE...? Una de las aplicaciones más extendidas en biología clínica es la hibridación “in situ”, con la cual se puede localizar un segmento concreto de ADN, como por ejemplo un gen o una parte de éste, en la posición exacta en un determinado cromosoma eucariótico. Existen varios métodos para poder realizar este marcaje, el método más extendido es el marcaje con fluorescencia de la secuencia conocida que se pretende localizar. A las técnicas de hibridación “in situ” que utilizan fluorescencia se les denomina FISH (Fluorescent in situ hybridation). 22 3.1 Hibridación La hibridación de un ácido nucleico se puede definir como una reasociación de bases complementarias o como una renaturalización por variación de temperatura, es decir, volver a unir sus dos hebras. La hibridación depende de diferentes factores: Longitud de la cadena. Se sugiere que a mayor longitud mayor dificultad para la hibridación, ya que la complementariedad de la totalidad de la cadena se hace más improbable. Temperatura. El incremento de temperatura causa desnaturalización. La temperatura de hibridación de una determinada cadena de ácido nucleico es descrita por la denominada Temperatura de fusión (Tm). Ésta se describe como la temperatura que delimita el punto medio de la transición de doble cadena (2c) a cadena simple, y donde el 50% del ADN estás desnaturalizado. Es decir, la temperatura a la que el 50% de la cadena de ácido nucleico son híbridos completamente formados y el 50% disociados. Complementariedad. Hace referencia al número de pares de bases complementarias. La calidad de las uniones y el rigor de la hibridación se mide mediante el número mínimo de pares de bases complementarias que puede “tolerar” un híbrido, en inglés stringency. Ambiente químico. Incide directamente sobre la solubilidad del ácido nucleico. COMPRUEBA LO QUE SABES: ¿A qué es debido que el %G+C de una cadena de ácido nucleico influya directamente sobre la temperatura de fusión (Tm)? De acuerdo con el profesor/a, coméntalo en el foro de la unidad. 23 3.2 Duplicación El proceso de duplicación o replicación del ADN, consiste en copiar el material genético de una célula con el objetivo de posibilitar la mitosis o división celular. De acuerdo con el modelo de Watson y Crick, y posteriormente demostrado por Meselson y Stahl, “las nuevas moléculas de ácido nucleico formadas a partir de una molécula previa, tienen una hebra de la molécula original y otra hebra de nueva creación”. Es decir, la replicación es semiconservativa y bidireccional. Semiconservativa, porque cada hebra hija conserva la mitad del material genético de la hebra original y bidireccional porque ocurre en las dos direcciones que presentan las hebras del ácido nucleico. Esquema de los distintos modelos de duplicación: semiconservativa, conservativa y dispersiva PARA SABER MÁS… Existen tres ADN polimerasas: - ADN polimerasa I, se encarga de la síntesis y corrección de errores durante la replicación. - ADN polimerasa II, se encarga de la corrección de daños en el ADN causados por agentes físicos. - ADN polimerasa III, se encarga de la síntesis y corrección de errores durante la replicación. 24 El proceso de REPLICACIÓN ocurre en tres etapas: 1ª Etapa. Ocurre el desenrrollamiento y la apertura de la doble hélice del ácido nucleico. Durante esta etapa participan: - Helicasas: facilitar el desenrrollamiento de la doble hélice). - Girasas y topoisomerasas: suavizar la tensión generada en la molécula de ácido nucleico debido al desenrrollamiento. - Proteínas SSBP (Single-Stranded DNA Binding): Se unen a las hebras molde para evitar que vuelvan a enrollarse. 2ª Etapa: Síntesis de dos nuevas hebras de ácido nucleico (ADN). Esta síntesis se lleva a cabo con la actuación de la ADN polimerasa, que realizan la síntesis de las nuevas hebras en sentido 5’-3’, ya que la lectura de las hebras moldes se hace en sentido 3’-5’. La ADN polimerasa por sí sola no es capaz de iniciar la síntesis de las nuevas hebras, sino que necesita de un cebador para hacerlo, ese cebador normalmente es un pequeño fragmento de ARN que será eliminado una vez que haya finalizado el proceso de duplicación del material genético. Este cebador es sintetizado por la enzima ARN polimerasa, o también denominada primasa. 3ª Etapa: Corrección de errores cometidos durante el proceso. La principal enzima que interviene en la corrección es la ADN polimerasa III. Del mismo modo, participan endonucleasas (cortar el segmento que presenta el error), ADN polimerasas I (rellenar el hueco que han dejado las endonucleasas) y las ADN ligasas (unir los extremos corregidos). 25 Esquema del mecanismo de duplicación del ADN, indicando las diferentes enzimas que intervienen 3.3 Transcripción Proceso mediante el cual se obtiene un ARN mensajero (ARNm) a partir del ADN. Es decir, es el proceso de síntesis de nucleótidos complementarios de una sola hebra de ADN, conocida como hebra molde. Consta de tres fases: Iniciación. Tiene lugar el reconocimiento de la región promotora por la ARN polimerasa. La región promotora es una zona en la cadena de ADN con características especiales, la cual determina el punto exacto de unión de la ARN polimerasa II para que dé comienzo la transcripción de un determinado gen. Posteriormente ocurre el desenrrollamiento de la doble hélice de ADN. Elongación. Sobre la hebra molde de ADN comienza la síntesis de una cadena de ARN, donde en lugar de Timina se incorpora Uracilo. La ARN polimerasa II es la enzima responsable de este proceso. Tal y como se citó anteriormente el ARNm sufre un proceso de maduración, éste ocurre de manera simultánea a la transcripción. Terminación. Se produce el splicing o maduración, que implica la eliminación de fragmentos no codificantes y la formación del ARNm definitivo, con la adición de una cola poli A y una caperuza CAP de guanina. Tras el splicing, el ARNm está preparado para desplazarse al citoplasma para participar en la síntesis de proteínas. 26 Esquema del inicio de la transcripción 3.4 Traducción La traducción sería el último paso de la expresión génica. Es el proceso de formación de proteínas a partir de la información contenida en los ARNm. Es un proceso de gran complejidad en el cual intervienen una gran cantidad de elementos como: - ARNm. Sirve como plantilla o patrón de información. - ARNt. Con la intervención de la aminoacil-ARNt sintetasa se asocia a un aminoácido específico de acuerdo con la información contenida en el anticodón, formando lo que se denomina aminoacilARNt - ARNr. Forma parte de los ribosomas. En el proceso intervienen las subunidades mayor (60S) y menor (40S). - Peptidasas. Catalizan la formación del enlace peptídico entre dos aminoácidos. Colaborando en la formación del peptidil-ARNt (polipéptido unido a un ARNt) - Translocasas. Facilita el desplazamiento del ribosoma a lo largo del RNAm (translocación). 27 Hib, J. (1998). Fundamentos de biología celular y molecular de De Robertis. ENLACE DE INTERÉS Se plasma una dirección web donde se habla del proceso de traducción. En esta se aporta contenido teórico además de un vídeo explicativo. Idioma del texto: Español Idioma del vídeo: Inglés http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/traduc/traduccionprocar.html Idioma del vídeo: Español Ver a partir del segundo 43. https://www.youtube.com/watch?v=YoyFpumWtHo 28 Debido a la complejidad que presenta el proceso, el mismo se divide en cuatro atapas: Activación de los aminoácidos. Etapa en la que los distintos ARNt se asocian con su aminoácido específico, según el triplete que presente el ARNt en el anticodón. El proceso está catalizado por la aminoacil-ARNt sintetasa, con gasto de energía en forma de ATP. Iniciación. Comienza con la formación del complejo ARNm- ribosomas. Primero se produce la unión entre ARNm y subunidad mayor (60S) y posteriormente con la subunidad menor (40S). En los ribosomas se identifican tres lugares en los cuales se posicional los ARNt a lo largo del proceso. 1. Lugar A o lugar aminoacil. Es donde se da el reconocimiento del aminoacil-ARNta con su codón correspondiente. 2. Lugar P o lugar peptidil. Es donde se forma el enlace peptídico para constituir el peptidil-ARNt. 3. Lugar E. Sitio de salida de los ARNt sin aminoácido, ya que se desprendieron de su aminoácido durante el proceso. El primer codón del ARNm siempre codifica para el aminoácido METIONINA (codón: 5´-AUG-3´). Al comienzo del proceso se sitúa un ARNt unido al aminoácido Metionina en el lugar peptidil del ribosoma. Un segundo ARNt, unido al aminoácido correspondiente al segundo codón, ocupa el lugar aminoacil del ribosoma. Seguidamente se forma un enlace peptídico, y todo el complejo se desplaza un lugar hacia el próximo codón en la cadena de ARNm. De tal forma que el dipéptido (Met-aax) se sitúa en el lugar peptidil quedando libre de nuevo el lugar aminoacil. Elongación. Comienza cuando hay un peptidil-ARNt en el lugar peptidil del complejo ARNm-ribosoma y el lugar aminoacil está libre para que llegue un nuevo aminoacil-ARNt. Una vez llega se forma un enlace peptídico entre el peptidil-ARNt (lugar P) y el nuevo aminoacilARNt (lugar A), desplazándose de todo al lugar peptidil y quedando 29 otra vez libre el lugar aminoacil, para la llegada de otro aminoacilARNt correspondiente al codón que queda libre ubicado en el lugar A. Este proceso se repite tantas veces como codones con sentido contenga el ARNm. Terminación. Ocurre cuando se sitúa en el lugar aminoacil un codón sin sentido o de terminación (codón de STOP). No se situará ningún aminoacil-ARNt en ese lugar, ya que generalmente dicho codón no corresponde a ningún aminoácido. Se desprende la cadena polipeptídica del peptidil-ARNT al que está unida y se desmonta todo el complejo formado para la traducción quedando libre en el citoplasma la nueva cadena polipeptídica y las subunidades ribosomáticas. Esquema de la fase de elongación de la traducción 30 4. ENZIMAS ASOCIADAS A LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Aunque te está resultando muy interesante repasar los conceptos que ya estudiaste en el ciclo formativo y que son de gran utilidad en el laboratorio bioquímico, también tienes ganas de practicar técnicas de citogenética y biología molecular lo antes posible. El compañero que te está acompañando en la jornada de hoy comprende tu interés, pero quiere asegurarse de que conoces todo lo necesario para trabajar en el laboratorio. Por eso, continúa repasando las enzimas que actúan en los procesos genéticos y se utilizan en las técnicas de laboratorio. Existen enzimas que además de actuar en los procesos genéticos son de especial interés debido a que se utilizan en diferentes técnicas de biología molecular y de citogenética. 1. Las ADN polimerasas. Participan en la duplicación o replicación del material genético. Desempeñan funciones de síntesis a través de su actividad polimerasa y funciones de corrección y reparación durante la replicación debido a su actividad exonucleasa 3´. Se identifican 3 tipos de ADN polimerasas, la ADN polimerasa I, la II y la II, cuya funciones (de síntesis y/o corrección). 2. Las ADN ligasas. Enzimas encargadas de unir diferentes nucleótidos para crear una cadena, o para unir dos cadenas de polinucleótidos. Para ello forman enlaces covalentes entre el extremo 5’ de una cadena polinucleotídica y el extremo 3’ de otra. 3. La Transcriptasa inversa. También se denomina retrotranscriptasa. Enzima que cataliza la síntesis de ADN a partir de ARN. Por ello, se tiene la función de sintetizar ADN de doble cadena (2c) a partir de un molde de ARN de cadena sencilla. 4. Endonucleasas. Las endonucleasas, también conocidas como enzimas de restricción, son las enzimas que tiene la capacidad de cortar cadenas polinucleotídicas tras el reconocimiento de una secuencia concreta de nucleótidos. El lugar de corte es conocido 31 como sitio de restricción. Específicamente rompe los enlaces fosfodiéster formados entre nucleótidos en dicha región del ADN, estos son reconocidos por el centro de acción de la enzima como lugar de corte. Otra de las funciones de las endonucleasas es la actividad de modificación de fragmentos polinucleotídicos. Dicha modificación es realizada por metilación (adicción de un grupo metilo (-CH3) a un determinado nucleótido perteneciente a la secuencia reconocida) con la finalidad de evitar que dicho fragmento de ácido nucleico sea diana del proceso de restricción. Son usadas en biología molecular ya que tienen gran cantidad de aplicaciones en el campo del estudio del material genético o de la ingeniería genética. PARA SABER MÁS… Cuadro resumen de actividad y función de las distintas polimerasas. Enzima ADN polimerasa I ADN polimerasa II ADN polimerasa III SI SI SI SI SI SI SI NO NO Actividad/Función Polimerasa 5´-->3´ ELONGACIÓN Exonucleasa 3´-->5´ CORRECCIÓN Exonucleasa 5´-->3´ REPARACIÓN 32 Se conocen tres tipos de enzimas de restricción: Endonucleasas tipo I: son las enzimas de restricción que cortan las dos cadenas de ADN, en una posición aleatoria, a cierta distancia del sitio de restricción. Por ello estas enzimas no suelen utilizarse en Ingeniería Genética, debido a que el sitio de corte de la enzima no es preciso. Endonucleasas tipo II: son las enzimas de restricción que reconocen una secuencia específica de nucleótidos y cortan las dos cadenas de ADN con absoluta precisión dentro del sitio de restricción. Además, estas enzimas, a diferencia de los otros dos tipos no necesitan ATP (energía) para moverse a través de la molécula de ADN, sino que solamente es necesario a la intervención de un cofactor, que en este caso sería el ión magnesio (Mg2+). Este tipo de enzimas reconoce como sitio de restricción secuencias palindrómicas, es decir, áreas que se leen igual en un sentido que en el otro. Por ello, se puede realizar el corte simultáneo en las dos cadenas del ADN. Endonucleasas tipo III: son las enzimas de estricción que cortan la secuencia entre 5 y 8 bases antes o después del sitio de restricción. Por ello, estas enzimas presentan una especificidad intermedia entre las endonucleasas tipo I y tipo II. Diferencias entre cortes abruptos y cortes cohesivos 33 Las endonucleasas se nombran a partir del nombre de la bacteria o microorganismo del cual han sido aisladas. El nombre utiliza un código alfanumérico que indica primeramente el género y la especie de la cual se ha aislado el enzima, seguido de la cepa y del número de orden en el cual se ha aislado una determinada enzima, contando el total de enzimas aisladas en esa cepa. Por ejemplo la enzima EcoRI se ha aislado del género Escherichia (E), de la especie coli (co), de la cepa RV13 (R), siendo la primera endonucleasa (I) que se aísla de esa cepa. ENLACE DE INTERÉS Dirección web donde se aportan datos resumen y de interés práctico en el laboratorio de las ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. Se destaca la síntesis de la actividad, lugar de corte, y necesidad de energía en el movimiento de los diferentes tipos de enzimas de restricción. http://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA.htm 5. MUTACIONES Y POLIMORFISMOS Está siendo una jornada intensa de aprendizaje, recordando los conceptos que aprendiste en el ciclo formativo y que se necesitas dominar para el trabajo que se desarrolla de forma habitual en el laboratorio. Tu compañero te anima diciéndote que en breve abordaréis de forma práctica las técnicas de extracción de ADN y ARN necesarias para el estudio que debe realizar. Sin embargo, antes quiere detenerse en explicarte las alteraciones genéticas que podréis detectar o no en el fenotipo. Las mutaciones se pueden definir como cualquier alteración de la secuencia normal de un gen que pueden generar alteraciones fenotípicas. En cambio, los polimorfismos son mutaciones que no tienen efectos adversos sobre la función del gen y por tanto no se expresan en el fenotipo. 34 Estas mutaciones pueden ser: Germinales: Mutaciones que afectan a las células germinales, es decir, óvulos y espermatozoides. Por ello, se sugiere que existe posibilidad de trasmisión a la descendencia. Somáticas: Mutaciones que se producen en cualquier otra célula del individuo, y que por tanto no son transmitidas a la descendencia. De novo: Mutaciones que aparecen por primera vez en un individuo de la familia. Pueden ser el resultado de una mutación germinal en alguno de los gametos que han originado el nuevo individuo, o pueden deberse a alguna alteración ocurrida durante el proceso de formación del propio individuo. 5.1 Tipos de mutaciones en función de la estructura génica que altera Las mutaciones se clasifican dependiendo de la estructura génica que altera en: Genómicas: Mutaciones que afectan a la totalidad del genoma. No suelen producir organismos viables ni aptos para la vida. Cromosómicas: Mutaciones que afectan a cromosomas completos. Por ejemplo, la trisomía por cromosoma 21. Génicas: Mutaciones que afectan a un solo gen o fragmento de un cromosoma. Son las más comunes. A su vez, atendiendo a los mecanismos genéticos y a su naturaleza pueden clasificarse en: 35 - Transiciones: En la secuencia génica una base nitrogenada es sustituida por otra, concretamente se sustituye pirimidina por pirimidina, o bien, purina por purina. - Transversiones: En la secuencia génica una base nitrogenada es sustituida por otra, concretamente una pirimidina es sustituida por una purina. - Deleciones: En la secuencia génica se eliminan uno o más nucleótidos, sin que sean reemplazados ni sustituidos por otros. - Inserciones: En la secuencia génica se insertan uno o más nucleótidos, sin que se hayan eliminado previamente otros. 5.2 Tipos de mutaciones por sustitución de un nucleótido Por último, se destaca la clasificación de las mutaciones debidas a la sustitución de un nucleótido: Silenciosas: El cambio de un único nucleótido no provoca ninguna modificación en la secuencia de aminoácidos resultado de la traducción de ese gen. Sin sentido: El cambio de un único nucleótido provoca la conversión de un codón específico para un aminoácido en el codón de parada, por lo que se provoca una alteración fenotípica grave. De cambio de sentido: El cambio de un único nucleótido provoca el cambio de un codón específico para un aminoácido en otro codón, por lo que no se genera la proteína deseada. Este tipo de mutaciones también suelen provocar alteraciones fenotípicas, pero menos graves. 36 6. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN Por fin, tras repasar con el profesional del laboratorio que dominas todos los conceptos básicos que necesitarás para llevar a cabo los trabajos requeridos al laboratorio en relación con la extracción de ácidos nucleicos, le asistirás en la extracción de una muestra de ADN. En el laboratorio en el que trabajas se emplean habitualmente técnicas de extracción automatizadas, aunque tu compañero te cometa que él ha tenido que realizar extracciones manuales en muchas ocasiones, y te explicará cómo se lleva a cabo el proceso para que puedas practicarlo. En los laboratorios de Biología Molecular y Citodiagnóstico, el trabajo del técnico especialista es fundamental para el diagnóstico clínico de posibles patologías, sobre todo en la fase preanalítica de preparación de muestras. El ADN puede ser extraído prácticamente de cualquier muestra. Aun así, en el laboratorio clínico principalmente encontraremos muestras de sangre periférica en presencia del anticoagulante (EDTA), suero o el plasma sanguíneo destacando que son muestras de las cuales no se obtiene ADN de buena calidad, tejido fresco o congelado, muestra a partir de la cual se 37 puede obtener gran cantidad de ADN y de buena calidad y bloques de parafina con tejido tumoral incluido. Estas, son un tipo de muestra que puede contener gran cantidad de ADN y no de buena calidad, ya que lo más normal es que el ADN se haya degradado y solo se pueda extraer en fragmentos. 6.1 Técnicas de extracción manual Para llevar a cabo la extracción de ADN mediante técnicas manuales, se deben seguir una serie de pasos secuenciales, como se muestra a continuación: 1. Lisis celular. Se puede llevar a cabo mediante métodos químicos, físicos y enzimáticos. o Químicos: se incluye el uso de detergentes que solubilizan las proteínas y los componentes de las membranas plasmáticas, para liberar el ADN nuclear. o Físicos: se incluyen la temperatura, la sonicación, el empleo de bolitas de vidrio o la destrucción mecánica en mortera en homogeneizadores mecánicos. o Enzimáticos: Es el uso de enzimas específicas, con funciones proteasas que rompen todos los enlaces de las membranas plasmáticas. 2. Digestión proteica. Consiste en romper o eliminar todas las enzimas que lo recubren y protegen, para ello se emplea principalmente una enzima proteinasa, que digiere dichas proteínas liberando el ADN. 38 3. Eliminación de péptidos. Una vez digeridas las proteínas que rodean al ADN hay que eliminar todos los péptidos que han quedado libres en el medio. La técnica más empleada para ello es la extracción orgánica de péptidos. 4. Recuperación de los ácidos nucleicos. Se realiza mediante la precipitación de los mismos con etanol y/o con cloruro sódico. Por último, destacar que las dos técnicas manuales más comunes para la extracción de ADN son la técnica de extracción salina (salting-out) y la técnica del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Aunque hoy día, existen kits comerciales, en los cuales están todos los reactivos preparados a las concentraciones óptimas para la extracción dependiendo del tipo de muestra. Ejemplo de método de extracción manual de ADN 6.2 Técnicas de extracción automatizadas En los laboratorios de biología molecular y citogenética, sobre todo en el ámbito hospitalario, el proceso de extracción se encuentra automatizado, debido al elevado volumen de muestras que se tienen que procesar cada día. Para ello, se cuenta con equipos automatizados y robotizados, en los 39 cuales se introduce la muestra y se obtiene el ADN puro con una alta calidad. La única peculiaridad que presentan estos equipos, es que trabajan únicamente con muestras de sangre periférica con EDTA, por ello es con el único tipo de muestras que se podría realizar la extracción. El funcionamiento y manejo de los equipos es sencillo y suele estar regido por protocolos estándar y de fácil seguimiento. 7. TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ARN Tras llevar a cabo las extracciones automáticas de las muestras de ADN requeridas para el estudio y practicar con la extracción manual, asistirás a tu compañero de laboratorio en la extracción de ARN. El profesional te explica que se trata de un procedimiento algo más complejo que el anterior, pero te será muy fácil de llevar a cabo siguiendo los pasos que te va a explicar y evitando que se degrade el ribonucletido. La extracción de ARN es un proceso más complejo que la extracción de ADN, debido a que el ARN se degrada muy rápidamente además de que en la célula existen tres tipos de ARN: el ARN mensajero (ARNm), el ARN ribosómico (ARNr) y el ARN transferente (ARNt), encontrándose cada uno de ellos a distinta concentración. De forma genérica se puede concretar que el ARNm representa el 10% del total del ARN presente en una célula, el ARNr supone un 75% y el ARNt un 15%. Generalmente se requiere la obtención de ARNm. 40 Los tres procesos principales que se llevan a cabo en las técnicas de extracción de ARN son los siguientes: - 1º. Eliminar las moléculas de ARNr y ARNt presentes en las células de un determinado tejido. - 2º. Mantener la integridad de la estructura del ARNm presente en las células de un determinado tejido. - 3º. Obtener una gran cantidad de ARNm de buena calidad. En el marco de la extracción, lo más importante es evitar la degradación de ribonucletido. Para ello, se procede a la inactivación y eliminación de la ribonucleasas presentes en el interior de las células. Las ribonucleasas son las enzimas que se encargan de degradar el ARNm una vez que se ha producido la traducción. Para optimizar el proceso se suelen usar kits comerciales. Ejemplo del procedimiento empleado para la extracción de ARN 41 RESUMEN FINAL A largo de esta unidad hemos descubierto el ADN como biomolécula responsable de la herencia, haciendo parada en el concepto de ácido nucleico como biomolécula y en su estructura molecular, citando los elementos y enlaces que se identifican en el interior de esta molécula. Del mismo modo, se han discutido las propiedades físico-químicas de dichas moléculas y los procesos moleculares en los que participan con un rol principal (Hibridación, replicación, transcripción y traducción). Todo ello, con el fin de contextualizar el contenido presente en la unidad en torno al manejo bioclínico de la molécula (ADN y ARN), buscando la comprensión de los procedimientos llevados a cabo en dicho ámbito. Además, se ha hecho referencia a las diferentes enzimas que participan con un rol principal en dichos procesos (ligasas, polimerasas, etc.) haciendo especial hincapié en las endonucleasas de restricción. Ya que, estas desempeñan un papel fundamental en las técnicas llevadas a cabo en el laboratorio de biología molecular. Por último, se han citado los diferentes eventos de mutación (con repercusión en el fenotipo) y polimorfismo (sin consecuencia fenotípica), para acabar describiendo brevemente las técnicas de extracción de ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN. En conclusión, hemos visto cómo funciona la codificación de la información genética, identificando los participantes y describiéndose ésta como variaciones en el orden o posición física de los diferentes nucleótidos que forman parte de una determinada monocadena de ácido nucleico. 42
