3- PRACTICA CROMATOGRAFIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA-CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE ENFERMERÍA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
Facultad de Medicina Humana
Escuela Profesional de Enfermería
PRACTICA N° 3
CURSO:
Bioquímica.
TEMA:
Métodos cromatográficos y de separación en la
determinación de aminoácidos y proteínas.
Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas.
DOCENTE:
Dr. Violeta Garrido Morín.
Dr. Carlos Holguín Mauricci.
ESTUDIANTE:
Ramírez Morales Miriam Vanessa
CICLO: II
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INTRODUCCIÓN
En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al
descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de
pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato
de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la mezcla original se separaba en
diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a diferentes
velocidades.
Por tanto, la cromatografía comprende procesos en los que los componentes de una
mezcla, disueltos en una fase móvil, se van desplazando con diferente velocidad a través
de una fase estacionaria o fija. La adecuada elección de estas fases puede permitir que
tales diferencias se traduzcan en una separación efectiva de los solutos, a la vez que
éstos pueden identificarse atendiendo a su particular velocidad de avance.
En la actualidad la cromatografía se ha convertido en un método analítico de primer
orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en muestras
líquidas o gaseosas (para muestras sólidas se requiere una etapa de disolución o
extracción).
Además, se encuentra entre los métodos de análisis modernos ocupa un lugar destacado
debido a su facilidad para la separación, identificación y cuantificación de diversas
especies químicas, ya sea por sí sola o asociada a otras técnicas instrumentales de análisis
como, por ejemplo, la espectrofotometría o la espectrometría de masas
Hoy en día casi no hay campo de la química, biología, medicina, etc. en el que no se
utilice la cromatografía en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como
en la analítica; por otra parte, el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografía con
otras técnicas analíticas, así como el desarrollo de otros tipos de cromatografía, como es
por ejemplo la de fluidos supercríticos, hace previsible una extensión aún mayor de su
uso.
Para ello la presente práctica nos ayudara a conocer el método de cromatografía, una
técnica que va a emplear diversas técnicas que aprovechan las diferencias en la
velocidad de retención de cada componente, su capacidad de separarlos, identificarlos y
cuantificarlos.
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I.
OBJETIVOS
⮚ Que el alumno utilice el método cromatográfico de capa fina para separar e
identificar las propiedades fisicoquímico de los aminoácidos en nuestros patrones
y problemas.
⮚ Conocer la técnica de cromatografía y los factores experimentales que la afectan.
⮚ Observar el efecto de diferentes fases móviles y estacionarias en la separación.
⮚ Que el alumno identifique el Pi, en el cual la ovoalbúmina puede ser separada de
una muestra biológica y explique en que se fundamenta los métodos de separación
de proteínas.
II.
BASE TEÓRICA
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas
complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de
técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades
de dichos componentes. Puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen
mutuamente:
• Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser
usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
• Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso,
las cantidades de material empleadas son pequeñas.1
 Algunos conceptos para poder entender el funcionamiento de las técnicas
cromatográficas:
 Fase estacionaria. Es una sustancia que se mantiene inmóvil mientras se
ejecuta la cromatografía.
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 Fase móvil. Es la sustancia que se mueve durante la cromatografía. Puede ser
un líquido o un gas. La muestra que contiene el analito se administra en la fase
móvil.
 Analitos. Son las sustancias que se van a separar, cuantificar y/o identificar
utilizando la cromatografía, es decir, son las sustancias que se van a analizar.
 Muestra: Es la mezcla que se va a analizar. Puede estar constituida por uno o
varios analitos, y otros componentes que pueden no ser de interés, de los que
serán separados los analitos.
 Tiempo de retención: Es el tiempo que demora un analito en pasar desde la
columna o sistema por donde pase la fase móvil, hasta el detector (equipo que
puede dar una señal de detección utilizando alguna propiedad del analito).
 Selectividad: Es la capacidad de diferenciar cada componente en la mezcla.
PARTES DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
● Fase Fija: La fase estacionaria es una de las dos fases que forman un sistema
cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel, o un líquido. Si es un líquido, puede
estar adherido sobre un sólido. Este sólido puede o no contribuir al proceso de
separación. El líquido también se puede unir químicamente al sólido (fase unida
químicamente) o inmovilizarse sobre él (fase inmovilizada). La expresión lecho
cromatográfico o solvente, se puede emplear como término general para
denominar cualquiera de las diferentes formas en las que se presenta la fase
estacionaria.2
● Fase Móvil: Es un fluido que penetra a través o a lo largo del lecho estacionario,
en una dirección determinada. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos) o
un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de
fluidos supercríticos). En cromatografía de gases se puede utilizar la expresión
gas portador para designar la fase móvil, y en cromatografía de elución se puede
utilizar la palabra eluyente para designar esta misma fase.2
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Clasificación:
Son diversos los criterios usados para la clasificación, siendo los más comunes
relacionados con:
➢ A) El tipo de técnica empleada (o soporte físico sobre el cual se lleva acabo).
➢ B) El tipo de fase móvil utilizada.
➢ C) Según el estado físico de ambas fases.
➢ D) El mecanismo que rige la separación.
A) SEGÚN EL TIPO DE SOPORTE FÍSICO SOBRE EL CUAL SE DESARROLLA
El tipo de soporte físico sobre el cual se desarrolla el análisis cromatográfico define a la
técnica en general.
La fase estacionaria puede estar dispuesta sobre una superficie plana, o ser colocada en
el interior de un tubo cilíndrico de vidrio o de acero inoxidable.
Basándose en esto la cromatografía se puede clasificar de la siguiente manera:
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B) SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DE LA FASE MÓVIL
La fase móvil puede ser un gas, un líquido o un fluido “supercrítico”. Un fluido
supercrítico es una sustancia sometida a presión, y calentada a una temperatura superior
a su temperatura crítica. Posee algunas características propias de un gas y algunas
correspondientes a un líquido. Por otro lado, presenta las ventajas de tener una viscosidad
menor a la de un líquido, manteniendo sus propiedades de interacción con los solutos, y
ser amigable con el ambiente.
En base a este criterio se clasifica a las distintas técnicas cromatográficas en:
➢ CROMATOGRAFÍA DE GASES
➢ CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
➢ CROMATOGRAFÍA SUPERCRÍTICA
C - D) SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DE ÁMBAS FASES Y EL
MECANISMO QUE RIGE LA SEPARACIÓN.
Se presenta el ítem D asociado con el ítem C, puesto que el mecanismo que rige la
separación de los solutos depende del estado físico de ambas fases.
Como se dijo anteriormente la fase móvil, aparte de un fluido supercrítico, puede ser
líquida o gaseosa y la fase estacionaria puede ser líquida o sólida. En base a esto las
técnicas cromatográficas se pueden clasificar de la siguiente manera teniendo en cuenta,
en primer lugar, el estado físico de la fase móvil:
c-1) Cromatografía Líquido-Sólido (LSC).
c-2) Cromatografía Líquido- Líquido (LLC )
c-3) Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
c-4) Cromatografía de gases. Se subdivide en:
Cromatografía gas – líquido (GLC): y cromatografía gas – sólido (GSC)
Sin embargo, se considera que la clasificación más importante se basa en los mecanismos
que rigen la separación de los solutos.
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Las sustancias para separar pueden interactuar con las fases móvil y estacionaria según
mecanismos de naturaleza física, química o mecánica, los cuales posibilitan tal
separación. Dichos mecanismos pueden involucrar fenómenos de intercambio iónico,
reparto, adsorción, exclusión y afinidad, cada uno de los cuales regirá la separación dando
lugar a las siguientes “sub-clases” de técnicas cromatográficas (incluidas en las
mencionadas con anterioridad):
c-1) Cromatografía Líquido - Sólido: (LSC)
En este tipo de técnica la fase móvil es líquida y la estacionaria consiste en
sólidos finamente divididos (con gran superficie específica). Los mecanismos que pueden
actuar en la separación, en este tipo de técnica cromatográfica, son los siguientes:
c-1-1. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN: la fase estacionaria sólida retiene a los
solutos, principalmente por efecto de fuerzas físicas de superficie del tipo de fuerzas de
Van der Waals. Se emplea en la separación de compuestos orgánicos diversos, tanto
líquidos como sólidos. Recordemos, en primera instancia, la diferencia entre
ADSORCIÓN y ABSORCIÓN.
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Principio que rige la cromatografía de adsorción, aplicada a la separación de una mezcla
constituida por dos sustancias.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (IEC): el sólido retiene a los solutos
gracias a atracciones electrostáticas. Por lo tanto, se usa con sustancias que se ionicen. La
fase estacionaria sólida lleva en su superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen
contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.
c-1-3. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (EC): la fase estacionaria es un material
poroso que retiene a los solutos selectivamente en función de la geometría y tamaño
molecular.
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Este método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los
polímeros, y de filtración en gel, en la bioquímica. Es muy útil en la separación de
proteínas.
c-2) Cromatografía Líquido - Líquido (LLC): en este caso la fase estacionaria es también
un líquido, inmovilizado sobre un material sólido inerte que actúa solo de soporte. Los
mecanismos que rigen la separación en este caso se deben a equilibrios de distribución de
los solutos, controlados por la diferente solubilidad de los mismos entre fase móvil y
estacionaria. Dichos mecanismos son los siguientes:
c-2-1. CROMATOGRAFÍA DE REPARTO: los solutos se separan en base a las
diferencias de las solubilidades de los mismos, entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Es la técnica más usada y, generalmente, se efectúa sobre tiras de papel de filtro, o en
placas inertes recubiertas con un material adsorbente. En los capítulos siguientes se darán
mayores detalles sobre estas técnicas. Es una cromatografía líquido-liquido porque la fase
estacionaria es el agua contenida en la celulosa del papel. Cuando la fase móvil (solvente
orgánico) pasa sobre la fase estacionaria, las sustancias se separan “repartiéndose” entre
ambas
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c-3) Cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC): Es un importante miembro dentro
de las más modernas técnicas de separación. Su empleo, y el conocimiento de sus
condiciones de funcionamiento y operación son considerados actualmente indispensables
para los profesionales de los laboratorios químicos, farmacéuticos y bioquímicos, entre
otros. Este tipo de técnica utiliza instrumentos muy sofisticados y totalmente
automatizados.
Es un tipo de cromatografía líquida que utiliza una pequeña cantidad de muestra (del
orden de los µl), la cual es eludida por la fase móvil a través de pequeñas columnas,
rellenas con materiales especialmente preparados, por el efecto de altas presiones.
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c-4) Cromatografía de gases: Los gases, o mezclas de sustancias volátiles,
pueden ser separados por esta técnica en la cual la fase móvil es un gas. De acuerdo al
estado físico de la fase estacionaria encontraremos: cromatografía gas-líquido (GLC), y
cromatografía gas-sólido (GSC). La separación se basa, como siempre, en la diferente
interacción de los componentes de la muestra con las fases móvil y estacionaria, debido
a alguno de los siguientes fenómenos físicos:
➢ Adsorción (en la Cromatografía Gas – Sólido): la fase estacionaria
es un sólido finamente dividido que retiene a los solutos por adsorción sobre su superficie.
➢ Partición (en la Cromatografía Gas – Líquido): la fase estacionaria
es un líquido, retenido por impregnación o por enlaces covalentes sobre un sólido inerte.
La separación queda determinada por los diferentes comportamientos de solubilidad de
los solutos con la fase estacionaria líquida.1
CARACTERÍSTICAS PARA LA SEPARACIÓN:
▪
Paso del soluto.
▪
Polaridad del soluto y al solvente.
▪
Afinidad al soluto por la arte fija.
▪
Coeficiente de participación.
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FASES DE LA CROMATOGRAFÍA
1. Extracción: La extracción es un procedimiento que tiene el fin de separar una sustancia
del material que la contiene, en este proceso se utiliza un proceso disolvente miscible con
la sustancia deseada e inmiscible con el material. La extracción puede continua o
discontinua según sea el caso.
o Mecánicos.
o Solubilidad.
2. Concentración: Es usada como una medida en el efluente en función del volumen de
este o del tiempo. Cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en
relación con una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto.
3. Cromatograma: Es una representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del
detector, de la concentración del o los analitos en el efluente u otra cantidad usada como
una medida de concentración en el efluente en función del volumen de este o del tiempo.
En la cromatografía planar se puede usar el término, cromatograma para referirse al papel
o capa con las zonas separadas
4. Revelado: Usar sustancias patrones, densitómetro y reactivos apropiados. Existen
diferentes tipos de cromatografía entre las que tenemos:
● Cromatografía de papel (Mono y Bidimensional).
● Cromatografía de capa fina.
● Cromatografía de gas.
● Cromatografía de partición o reparto.
● Cromatografía de exclusión molecular Sphadex.
● Cromatografía de intercambio idóneo.
● Cromatografía de columna.
● Cromatografía por electroforesis.
● Cromatografía de exclusión molecular.
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Tipos de cromatografía
Dependiendo de la tecnología utilizada, de la naturaleza del soporte (fase estacionaria) y
de la sustancia móvil (fase móvil), se pueden diferenciar los siguientes tipos de
cromatografía:

Cromatografía en papel. La fase estacionaria está formada por una tira de
papel de filtro. La muestra para analizar se coloca en forma de gota sobre un
extremo del papel. Luego se sumerge la tira de papel en un recipiente donde se
encuentra la fase móvil, teniendo en cuenta que el extremo donde está colocada
la muestra quede en la parte de abajo del papel. La fase móvil asciende por
capilaridad arrastrando consigo la muestra y separando cada componente según
su afinidad por la fase estacionaria. Este tipo de cromatografía se emplea
principalmente cuando cada componente de la muestra tiene un color diferente,
entonces se puede ver el despliegue de colores sobre el papel para identificarlos.
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
Cromatografía en capa fina. El funcionamiento de esta técnica es parecido al
de la cromatografía en papel, pero en este caso la fase estacionaria se construye
depositando una resina polar (casi siempre sílica gel), sobre una placa de vidrio
o aluminio. Se coloca cierta cantidad de la muestra a 1cm del borde inferior de la
placa. Luego se sumerge esta placa, teniendo en cuenta que el extremo que
contiene la muestra debe quedar hacia abajo, en un recipiente que contiene la
fase móvil. La fase móvil asciende por capilaridad separando los componentes
de la muestra.4
PROCEDIMIENTOS DE SEPARACIÓN
Las proteínas en disolución muestran cambios profundos de su solubilidad en función de:
o El pH.
o Fuerza iónica (precipitación por salado).
o Propiedades dieléctricas del disolvente.
o Temperatura.
Estas variables que son reflejo del hecho de que las proteínas son electrolitos de peso
molecular muy grande, puede utilizarse para separar mezclas de proteínas, ya que cada
proteína posee su composición en aminoácido característicos, la cual determina su
comportamiento como electrolito.
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PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
Es uno de los métodos más fáciles para la precipitación de proteínas se lleva a cabo
ajustando el pH de la solución a uno cercano o igual al punto isoeléctrico de la proteína
de interés; este proceso es llamado también precipitación por punto isoeléctrico. El punto
isoeléctrico se alcanza cuando las cargas positivas y negativas presentes en la superficie
de la proteína se neutralizan unas con otras.
Cuando esto sucede la repulsión electrostática con otras moléculas no ocurre, dando lugar
a la atracción entre las moléculas de proteína disueltas y formando así un precipitado
El pH al que una proteína muestra un mínimo de solubilidad es su pH isoeléctrico
definido como aquel valor del pH al que la molécula no pose carga eléctrica. Ejemplo:
ovoalbúmina (huevo) pH 4.6, ureasa pH 5 en estas condiciones no existe repulsión
electrostática entre moléculas de proteínas vecina y tiende a coalecer y precipitar, sin
embargó, cuando los valores del pH está por encima o por debajo del punto isoléctronico,
todas las moléculas de proteínas poseen carga eléctrica neta del mismo signo. Por dicha
razón es repelen mutuamente impidiendo la coalescencia de moléculas para formar
agregados insolubles. Puesto que las diferentes proteínas poseen valores de pH
isoeléctrico diferente, con frecuencia pueden separase una de otra, mediante precipitación
isoeléctrica, cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de uno
de sus componentes. La mayor parte o casi todo el componente precipitará que dando
solución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctrico se hallen por encima o por debajo
de aquel, la proteína isoeléctrica precipitada permanece en su conformación nativa y
puede disolverse en un medio a pH apropiado y concentración salina adecuada.5
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III.
MATERIALES
❖ REACTIVOS
-Fase móvil para cromatografía de papel Metanl-H2O Piridina (80-20-4).
-Fase fija papel de filtro.
-Solución de aminoácidos:
a. Arginina 1% en Na (OH) a PH neutro.
b. Aspártico 1% hasta disolución.
c. Hestidina 1 % hasta disolución.
-Solución de Ninhidrina:
a. Ninhidrina 0.1%.
b. Colidina 2ml.
c. Ácido acético glacial 10 ml.
d. Csp. 100 ml. En etanol.
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-Ácido acético 1 N: Tomar 60 ml de ácido acético glacial, densidad 1,06, pureza 96% y
diluir hasta 00 ml. Con agua destilada.
-Solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N.
-Sal de fenolftaleína.
-Na (OH) 10%.
IV.
PROCEDIMIENTO
1. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
1. Les será dado un papel Whatman N-l cortao en tiras de 15 x 25 cm.
Aproximadamente, manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo en lo
posible, colóquele sobre un papel limpio.
2. Engrape un hilo a la parte superior del papel Whatman.
3. Con un lápiz marque el punto de origen, trazando una línea, esta debe estar por
encima de la altura del solvente.
4. Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras según el esquema
(no toque el papel con los dedos).
Hilo
Muestra
A,
B.
C.
Patrones de HC1 de 3 aminoácidos
Nota:
❖ Para aplicar la muestra toque el papel levemente con el tubo capilar puesto
verticalmente.
❖ Repetir el tubo cuando la mancha haya alcanzado unos 3 mm., de diámetro.
❖ Una vez seca la mancha repita la aplicación dos veces más.
❖ Coloque el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede sumergido 1
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o 2 cm en el solvente.
❖ Deje el papel en la cámara dejando que el borde inferior quede de la cinta
adherida.
❖ Una vez que la muestra halla recorrido, saque el papel de la cámara.
❖ Marque el límite de migración del frente del solvente.
❖ Seque los papeles en un horno.
❖ Rocié sobre los cromatogramas la solución reveladora de Ninhidrina-colinaácido acético glacial.
❖ Caliente el papel en un horno a 100 °C hasta que aparezca las manchas de los
aminoácidos.
❖ Calcule el f de cada mancha y haga identificación tentativa de los aminoácidos,
comparado los Rf, obtenidos con la muestra problema.
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒𝑙𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑑𝑒𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛𝑎𝑙𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑑𝑒𝑙𝑎𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎
RF= 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒𝑙𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑑𝑒𝑜𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛𝑎𝑙𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒𝑑𝑒𝑙𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LAS PROTEÍNAS
1. Marcar una serie de tubos del 1 al 9.
2. En el tubo 1, medir 3.2 ml. De ácido acético 1Ny6,8 ml de agua destilada.
3. Medir 5 ml de agua destilada en cada uno de los 8 tubos.
4. Sacar 5 ml del tubo 2 y transferir al tubo 3, etc. Continuando del mismo modo
hasta completar la serie. En el tubo 9, una vez efectuada la mezcla se sacan 5 ml
de solución que se eliminan.
5. Agregar rápidamente 1 ml de solución de caseína en acetato de sodio 0.1N a cada
tubo. Mezclar al instante por inversión.
6. Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en
los diferentes tubos, anotar en el cuadro que sigue.
7. Observar después de 30 minutos, anotar en el cuadro el pH de cada tubo (ver nota
al final).
8. Calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre la
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solubilidad.
9. Agregar 1 gts. De fenolftaleína y mezclar.
10. Agregar Na (OH) al 10% gts. Agitando hasta la aparición de un color rosado y
observar el efecto sobre la solubilidad.
Así para el tubo N° 3, por ejemplo:
PH = PK+ log sal ácido
N°
SAL 1 ml.
ACIDO 5 ml.
0.4x10mts.
0.4
———— 6 ml. solo.
————
1000 ml.
0.1M
6
0.1x10 ——— 6 ml
——— 1000
6CDNC
0.1
0.1
1
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾 + 𝑙𝑜𝑔 6 =
=
0.4
0.4
4
6
𝑝𝐻 = 4.1
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V.
OBSERVACIONES
⮚ CROMATOGRAFIA
Extracción con etanol a las hojas moradas de les extrajo clorofila roja y a las hojas verdes
se les extrajo clorofila verde.
✔ Luego:
.
A
B
.
.
D (desconocido (mezcla de A y B))
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✔ Fase móvil (piridina, metanol y agua destilada).
✔ Cuando seca
El último avanza más
A
B
Calculando RF de cada caso: A,B Y D
1. Muestra A:
RF= 1.5 cm= 0.25…
5.9 cm
2. Muestra B:
RF= 0.9cm= 0.15…
5.9 cm
D
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3. Muestra C:
RF= 2.1cm = 0.35…
5.9cm
⮚ PRECIPITACION ISOELECTRICA
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VI.
CUESTIONARIO
¿Qué entiende por cromatografía?
1.
La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los
componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (lecho estacionario),
y otra móvil (fase móvil) la cual percola a través de la primera. El proceso
cromatográfico se da como resultado de repetidos procesos de sorción-desorción
durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a
lo largo del lecho estacionario (elución), produciéndose la separación debido a las
diferencias en las constantes de
distribución de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil. A la
distribución final de los componentes en función de su posición sobre el lecho
estacionario, o del tiempo en que eluden se le denomina cromatograma.3
INTERPRETACIÓN DEL CROMATOGRAMA
Como ya se ha mencionado, la cromatografía es básicamente un método de separación,
tal vez el más potente de que se puede disponer en un laboratorio, aunque debe tenerse
siempre en cuenta que la cromatografía, a efectos analíticos, es una técnica ciega.
Los métodos cromatográficos, por si mismos, pueden informar, en el mejor de los
casos, del número de compuestos químicos que están presentes en una mezcla, pero
nunca
de
proporcionar información sobre su naturaleza.16
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Diga tres ejemplos de cromatografía en muestras biológicas
2.
Cromatografía en papel : En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto
con el papel hacen que los compuestos se desplacen a velocidades diferentes.
Una pequeña mancha de disolución que contiene la muestra se aplica sobre una tira de
papel cromatográfico a una distancia aproximada de un centímetro de la base. La
muestra es adsorbida en el papel. Esto significa que la muestra entra en contacto con el
papel y puede establecer interacciones. El papel es sumergido en un disolvente
adecuado (etanol o agua) e introducido en un contenedor cerrado. A medida que el
disolvente asciende por el papel, encuentra la muestra que empieza a viajar por el papel
con el disolvente. Los diferentes compuestos de la muestra recorren distancias
diferentes dependiendo de la fuerza de sus interacciones químicas con el papel. La
cromatografía en papel requiere algún tiempo, habitualmente se necesitan
La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico cualitativo,
permite llevar a cabo la separación e identificación de iones, trabajando con cantidades
mínimas de sustancia. Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta
en que las sustancias problema, pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos
disolventes de inmiscibilidad limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel
“fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvil constituida generalmente por
una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tipos de
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cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y
de separación de zonas y sectores. varias horas para completarse.7
❖ Cromatografía en capa fina:
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un
adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante
la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen
las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con facilidad las placas preparadas
y una estufa para activarlas.
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es
más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y
la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre
papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente
reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. Al realizar
la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del
adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque
también se le puede añadir un adherente. En la elección del eluyente influyen varios
factores:
 Precio.
 Pureza.
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 No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
 No utilizar compuestos muy volátiles.
 Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).7
● Cromatografía en columna: La fase estacionaria se coloca dentro de una
columna que puede ser de vidrio o acero inoxidable, entre otros materiales. La
fase móvil puede ser líquida o gaseosa. La muestra se coloca en el extremo
superior de la columna y se deja descender con la fase móvil utilizando
la gravedad.6
❖ Cromatografía de líquidos : La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase
estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica
que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase móvil actúa de portador de la muestra.
La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la
solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos
con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los
contenidos en la muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de
la naturaleza de los compuestos a determinar.8
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❖ Cromatografía de gases:
En cromatografía de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil que es un
gas inerte, y a diferencia de la mayoría de los tipos de cromatografía, la fase móvil no
interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito
a través de la columna.
Respecto a la cromatografía líquida, la cromatografía de gases tiene la ventaja de
disponer de detectores mucho más universales (por ejemplo, el de ionización de llama).
Además, para numerosas aplicaciones, los métodos son más simples, más rápidos y más
sensibles que los correspondientes a la cromatografía líquida de alta resolución. La
instrumentación requerida para cromatografía de gases también es mucho más sencilla
y económica que la empleada en HPLC. Sin embargo, en cromatografía de gases, la
influencia de la temperatura sobre la distribución del equilibrio es considerable, a
diferencia de la cromatografía líquida. Por ello, la cromatografía de gases presenta
limitaciones en tres casos:

compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 u.m.a.

compuestos sensibles a una elevación de la temperatura incluso moderada
(determinados compuestos de interés biológico)
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
compuestos que se encuentran en forma iónica (puesto que son e n general poco
volátiles)

Aplicaciones

Medioambientales:
Análisis
de
pesticidas
y
herbicidas, análisis
de
hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire...

Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos orgánicos,
azúcares, FAMES, ésteres metílicos, triglicéridos, alcoholes...

Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos, aminas, aldehídos y cetonas,
ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas, gases inorgánicos.
❖ Cromatografía de fluidos supercríticos:
La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede
existir en la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión
de vapor de una sustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y
presiones por encima de su temperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina
fluido supercrítico. Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras
propiedades que son intermedias entre las características de esa sustancia en estado
gaseoso y en estado líquido. Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos
con las de gases y líquidos. (Los datos sólo indican el grado de magnitud).7
● Cromatografía por Permeabilidad en Gel.
La cromatografía de permeación en gel se conoce también como cromatografía de
exclusión por tamaño, porque separa las moléculas según su dimensión. Las moléculas
pequeñas entran en un medio poroso y por tanto les cuesta más salir de la columna,
dejando las partículas más grandes eluir primero. La GPC es una técnica muy empleada
para determinar la distribución del peso molecular en polímeros, aunque suele
proporcionar baja resolución.7
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Diga el fundamento de dos tipos de cromatografía.
3.
● CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: La fase estacionaria se coloca dentro
de una columna que puede ser de vidrio o acero inoxidable, entre otros materiales.
La fase móvil puede ser líquida o gaseosa. La muestra se coloca en el extremo
superior de la columna y se deja descender con la fase móvil utilizando
la gravedad
⮚ Cromatografía de Intercambio Iónico
La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que
tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos
funcionales enlazados permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta.
El mecanismo de retención más común es el intercambio simple de los iones de la
muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de la fase estacionaria.
En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies
catiónicas.
Los más comunes son los sulfónicos, los cuales son fuertemente ácidos y tiene las
propiedades de los se puede variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se
alcance el punto isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de
este modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.7
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⮚ Cromatografía de Filtración en Gel
Se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de
los poros es muy elevado y su diámetro está determinado. Cuando penetran en el lecho
de la columna dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los poros de las bolas de
gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los
poros, reduciéndose la concentración en la fase libre entre las bolas. La segunda proteína,
por tamaño, sólo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más elevado
entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto neto es el de
acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular respecto al de las de
menor peso molecular. En esta cromatografía se eluden primero las proteínas.
Algunos ejemplos cotidianos de la aplicación de la cromatografía son:

Vino derramado sobre un mantel blanco. Un accidente a la hora de la cena
nos permitirá observar, al secarse el vino por contacto con el aire, las diversas
sustancias que lo componen. Cada una teñirá de distinto tono o color el blanco
de la tela, y se podrán identificar por separado, cosa que normalmente resultaría
imposible.
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
Análisis de sangre. La cromatografía de muestras de sangre se lleva a cabo a
menudo para identificar las sustancias contenidas en ella, imperceptibles
normalmente dado que se trata de una mezcla muy compleja. Para ello se
observa el color que la sangre refleja en un soporte o sometida a
una luz específica.

Exámenes de orina. Del mismo modo que la sangre, la orina es una mezcla de
diversos compuestos, algunos sólidos y otros líquidos, cuya presencia o ausencia
puede revelar detalles sobre el funcionamiento del organismo. Se puede llevar a
cabo una separación cromatográfica para detectar residuos inusuales, como
sangre, sales, glucosa o sustancias ilegales.

Revisión de una escena del crimen. Algo que vemos a menudo en las
películas: los investigadores toman telas, fibras, tejidos u otros soportes y
observan la separación por adherencia de las distintas sustancias derramadas
sobre ellos, como pueden ser el semen o la sangre, incluso cuando a simple vista
podrían pasar desapercibidas.

Comprobaciones sanitarias de alimentos. Partiendo de que los especialistas
en alimentos conocen la reacción de los componentes de la comida al ser
sometidos a un espectro cromatográfico, esta técnica puede emplearse para
detallar en una muestra si existe en ellos algún tipo de sustancia indebida,
producto de agentes microbianos o de algún tipo de contaminación, antes de que
el producto salga al mercado y ponga en riesgo la salud de la gente.
Diga dos importancias de la separación de proteínas desde el punto de vista de
4.
aplicación biológica.
El mecanismo de separación está basado en las relaciones carga / masa de los analitos. Su
utilidad está en la separación de proteínas y péptido entre otras sustancias. Entre las
ventajas que ofrece la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones
con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL), en contraste
con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra en el
orden de los µL, con una elevada resolución y rapidez. Ofrece además mayor facilidad y
velocidad que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
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¿Qué entiende por punto isoeléctrico de las proteínas?
5.
El punto isoeléctrico (pI) de una sustancia se puede interpretar como la concentración
de iones de hidrógeno en que se ioniza igualmente como ácido y como base.
El concepto de punto isoeléctrico es particularmente importante para las moléculas de
ion híbrido, tales como aminoácidos, péptidos y proteínas.
El punto isoeléctrico es fundamental en bioquímica como característica diferenciadora
de las proteínas. Para un aminoácido, el punto isoeléctrico es el promedio de los valores
de pKa para la amina y el grupo carboxilo.
En el caso de aminoácidos con múltiples grupos ionizables en solución. Por ejemplo la
lisina, con dos grupos amino o ácido aspártico con dos grupos ácidos.
El punto isoeléctrico viene dado por el promedio de los dos pKa del ácido y la base. Se
origina porque pierden o ganan un protón de la forma neutra del aminoácido. Esto
puede extenderse a la definición de pI de péptidos y proteínas.
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El punto isoeléctrico es el PH en que cualquier proteína tiene el 50% de sus cargas básicas
y el 50% de sus cargas acidas.El punto isoeléctrico es el pH al que una sustancia anfótera
tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y
también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.
Para calcularlo se deben utilizar los pKa.
6.
¿Qué entiende por coagulación, precipitación y desnaturalización de las
proteínas?
▪
Coagulación: La sangre circula por el sistema vascular, el cual está compuesto
por el corazón y los vasos sanguíneos. El corazón bombea la sangre a través de
los vasos. Esta se compone de diversas células, las cuales son transportadas en
un líquido llamado plasma. Las células rojas transportan oxígeno. Las células
blancas forman parte del sistema inmunitario.
Los factores de coagulación son proteínas de la sangre que controlan el sangrado.
Cuando un vaso sanguíneo se lesiona, sus paredes se contraen para limitar el flujo
de sangre al área dañada. Entonces, pequeñas células llamadas plaquetas se adhieren
al sitio de la lesión y se distribuyen a lo largo de la superficie del vaso sanguíneo.
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Al mismo tiempo, pequeños sacos al interior de las plaquetas liberan señales
químicas para atraer a otras células al área y hacer que se aglutinen, a fin de formar
lo que se conoce como tapón plaquetario.
En la superficie de estas plaquetas activadas muchos factores de coagulación
diferentes trabajan juntos en una serie de reacciones químicas complejas conocidas
como cascada de la coagulación.9
▪
Desnaturalización
Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden
superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida
a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.
Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional
(conformación química) y así el característico plegamiento de su estructura. Si la forma
de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo, aplicándole calor, ácidos
o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular. Éste es el proceso llamado
desnaturalización.10
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▪
Precipitación
Es el proceso o fenómeno de formación de un segundo estado o fase de la materia, dentro
de una primera fase (véase Regla de las fases). Si por ejemplo, el aire que contiene vapor
de agua se enfría por debajo del punto en que se forma el rocío, se crea un precipitado de
agua
líquida dentro de la
fase
gaseosa.
Señale tres métodos de fraccionamiento de las proteínas y fundamente en forma
7.
breve.
MÉTODOS DE ROTURA CELULAR Y EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente
poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende
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de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así
como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:
1. Lisis celular: Válido para células sin pared celular como las células de tejidos
animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Es el proceso por el
cual una célula se desintegra o es destruida a través de la ruptura de su membrana
plasmática y/o pared celular.
El resultado de la lisis de una o más células se conoce como el “lisado”, término muy
utilizado en la biología experimental para referirse a la mezcla de la membrana plasmática
“rota” y a todos los componentes citosólicos que son liberados tras dicha ruptura.11
 Tipos de lisis:
 Lisis osmótica
La lisis osmótica o “citólisis” es la rotura de la membrana plasmática debida a un flujo
exagerado de agua desde el medio extracelular hasta el citosol.
Este tipo de lisis es bastante común en las células animales. El motivo es que carecen de
una pared celular como las de las células vegetales, las de los hongos o las de las bacterias,
que les ayude a controlar el volumen celular tras el ingreso de líquido por diferencias
osmóticas entre el citosol y el medio circundante.
 Lisis química
La lisis química es aquella por la cual la membrana celular es rota o desintegrada por
acción de alguna sustancia química específica. Puede ocurrir en un medio natural, si se
consideran las células de un tejido o algún organismo unicelular que es expuesto
accidentalmente a algún compuesto químico capaz de afectar la integridad de la
membrana plasmática.
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También es típicamente utilizada en el contexto experimental, donde se emplean
detergentes con distintas propiedades para afectar la estructura fundamental de la
membrana, ocasionando la lisis. Se aplica directa o indirectamente, dependiendo del
tipo de célula de que se trate y con qué propósito
 Lisis mecánica o por métodos físicos
La membrana plasmática de una célula puede romperse experimentalmente con métodos
mecánicos o físicos. Este tipo de lisis también puede ocurrir, bajo ciertas condiciones,
en los ambientes naturales, pero experimentalmente se consigue mediante el empleo de:
– Homogeneizadores de cuchillas para el procesamiento de tejidos o de cultivos
celulares
– Sonic adores, que rompen las células por medio de ondas de ultrasonido de alta
frecuencia que somete a dicho proceso.
 Lisis enzimática
La lisis enzimática es un “método” biológico de lisis que puede ser artificial o natural.
En el contexto natural, esta puede ocurrir por diferentes factores, pero ha sido
especialmente reseñada respecto a algunas proteínas con actividad enzimática
secretadas por bacterias, hongos y otros organismos o células de los mismos para
combatir infecciones11
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2. Destrucción mecánica: Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer
pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler
en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que
hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación
(someter las células a vibraciones de ultrasonido).
3. Congelación-descongelación: La rotura se produce al someter las células a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y
pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).
¿Cómo se clasifican las proteínas?
8.
La clasificación de las proteínas se realiza desde varios puntos de vista, así:
>SEGÚN SU COMPOSICIÓN
▪
Proteínas simples: Por hidrolisis dan solo aminoácidos
▪
Proteínas conjugadas: Por hidrolisis, dan otros compuestos además de los
aminoácidos. Pueden ser:
✔ Glicoproteínas.
✔ Lipoproteínas.
✔ Nucleoproteínas.
✔ Metaloproteínas.
✔ Hemoproteínas o Cromoproteínas.
>DE ACUERDO A SU FORMA TRIDIMENSIONAL
1. Proteínas fibrosas: - forman fibras largas, se utilizan en la naturaleza para formar
materiales estructurales:
- músculos
-tendones
- uñas
- cuernos
- pezuñas
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2. Proteínas Globulares: están enrolladas en formas compactas y casi esféricas.
Solubles en agua y se mueven dentro de las células
✔ Enzimas
✔ Hormonas
✔ De transporte
>DE ACUERDO CON SU FUNCIÓN BIOLÓGICA:
Proteínas estructurales (querastina, elastina. colágeno)
Proteínas de transporte (hemoglobina)
Proteínas protectoras (anticuerpos: inmunoglobina)
Proteínas hormonales (insulina)
Proteínas enzimáticas (quimotripsina: catalizadores biológicos)12
ESTRUCTURA:
Nivel
Estructura
Descripción
1
Primaria
Se le llama así a la secuencia de aminoácidos en una
proteína.
2
Secundaria
Describe la orientación, en un patrón regular, de los
diferentes segmentos de una proteína
3
Terciaria
Describe el enrollamiento total de la proteína en una
forma general tridimensional.
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4
Cuaternaria
Se refiere a la reunión de varios péptidos o proteínas en
grandes estructuras agregadas.
Diga ocho funciones de las proteínas. (solo funciones)
9.
Las proteínas determinan la forma y la estructura de las células y dirigen casi todos los
procesos vitales. Las funciones de las proteínas son específicas de cada una de ellas y
permiten a las células mantener su integridad, defenderse de agentes externos, reparar
daños, controlar y regular funciones, etc. Todas las proteínas realizan su función de la
misma manera: por unión selectiva a moléculas. 13
ENTRE SUS FUNCIONES TENEMOS:
▪
FUNCIÓN ESTRUCTURAL
Este tipo de proteínas tienen la función de dar resistencia y elasticidad que permite formar
tejidos, así como la de dar soporte a otras estructuras. Este es el caso de la tubulina que
se encuentra en el citoesqueleto.
-Otras proteínas confieren elasticidad y resistencia a órganos y tejidos:
o El colágeno del tejido conjuntivo fibroso.
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o La elastina del tejido conjuntivo elástico.
o La queratina de la epidermis.
▪
CATÁLISIS
Está formado por enzimas proteicas que se encargan de realizar reacciones químicas de
una manera más rápida y eficiente. Procesos que resultan de suma importancia para el
organismo. Por ejemplo la pepsina, ésta enzima se encuentra en el sistema digestivo y se
encarga de degradar los alimentos.
▪
FUNCIÓN DEFENSIVA
Son las encargadas de defender el organismo. Glicoproteínas que se encargan de producir
inmunoglobulinas que defienden al organismo contra cuerpos extraños, o la queratina que
protege la piel, así como el fibrinógeno y protrombina que forman coágulos.
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▪
FUNCIÓN REGULADORA
Las hormonas son un tipo de proteínas las cuales ayudan a que exista un equilibrio entre
las funciones que realiza el cuerpo. Tal es el caso de la insulina que se encarga de
regular la glucosa que se encuentra en la sangre.
▪
FUNCIÓN RECEPTORAS
Este tipo de proteínas se encuentran en la membrana celular y llevan a cabo la función de
recibir señales para que la célula pueda realizar su función, como acetilcolina que recibe
señales para producir la contracción.
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▪
FUNCIÓN DE TRANSPORTE
La función de estas proteínas es llevar sustancias a través del organismo a donde sean
requeridas. Proteínas como la hemoglobina que lleva el oxígeno por medio de la sangre.
▪
FUNCIÓN HORMONAL
Las hormonas son sustancias producidas por una célula y que una vez secretadas ejercen
su acción sobre otras células dotadas de un receptor adecuado. Algunas hormonas son
de naturaleza proteica, como la insulina y el glucagón (que regulan los niveles de
glucosa en sangre) o las hormonas segregadas por la hipófisis como la hormona del
crecimiento, o la calcitonina (que regula el metabolismo del calcio).
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▪
FUNCIÓN DE RESERVA
o La ovoalbúmina de la clara de huevo, la gliadina del grano de trigo y la hordeina
de la cebada, constituyen la reserva de aminoácidos para el desarrollo del embrión.
o La lactoalbúmina de la leche.13
¿En que se fundamenta la electroforesis?
10.
La electroforesis, lo que supone es una parte importante del procedimiento sistemático
del análisis (separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las
proteínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud
depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden
desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de
la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o
negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de
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fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo
positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas, que suelen ser de carga neutra,
se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que
les confiere carga negativa; con ello se homogeneizan las proteínas de la muestra y
todas migrarán hacia el polo positivo; sólo se separarán por tamaño.
El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a
través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño;
movimiento generado por el campo eléctrico.14
11.
¿En qué se fundamenta el método cromatográfico de exclusión?
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La cromatografía de exclusión es un tipo de cromatografía líquida en la cual la fase
estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida. Se utiliza el término de “Cromatografía
de exclusión por tamaño”. También se denomina “cromatografía de permeabilidad
sobre gel” (GPC) o de permeación en gel. Su principal aplicación es la separación de las
moléculas en función de su tamaño con la finalidad de estudiar el peso molecular y
distribución de los polímeros3). El inicio de esta técnica se estableció a partir de la
preparación de microesferas de geles de compuestos orgánicos y biológicos solubles en
agua, los cuales se aplicaron a la separación de polímeros disueltos en disolventes
orgánicos utilizando un relleno de poliestireno. En consecuencia, la técnica se denominó
permeabilidad en gel (GPC). Actualmente esta tecnología es rápida y permite trabajar a
presiones elevadas mediante el empleo de nuevos rellenos con una distribución de poros
muy precisa y una resistencia mecánica apropiada para altas presiones. Las principales
características de esta técnica cromatográfica son: ‐ Fase estacionaria es inerte, por lo
que la columna no se desactiva. ‐ La muestra no interacciona químicamente con la fase
estacionaria, ni con la fase móvil. ‐ Los solutos son generalmente sustancias de peso
molecular elevado (mayores de 2000). Dependiendo de su medida y estructura, éstos se
retienen o se eluden a través de la columna. No se pueden emplear gradientes de elución
en la fase móvil.
En la figura se muestra el esquema típico de un equipo GPC.15
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12.
¿En qué se fundamenta la cromatografía líquida de alta precisión?
▪
Elución por alta presión (hasta 500 atmósferas).
▪
Alta resolución, rapidez y reproducibilidad.
▪
Purificación de moléculas biológicas de gran variedad de Propiedades y tamaños.
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La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más
ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a
la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta
técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre
todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en
muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos
materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies
organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas.16
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VII. CONCLUSIONES
▪
Por tanto, la cromatografía comprende procesos en los que los componentes de
una mezcla, disueltos en una fase móvil, se van desplazando con diferente
velocidad a través de una fase estacionaria. La adecuada elección de estas fases
puede permitir que tales diferencias se traduzcan en una separación efectiva de los
solutos, a la vez que éstos pueden identificarse atendiendo a su particular
velocidad de avance.
▪
Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse según diferentes criterios:
atendiendo al modo como las fases se ponen en contacto y atendiendo a
fundamento del proceso de separación
▪
Hemos podido recoger el concepto de punto isoeléctrico siendo este el PH en que
cualquier proteína tiene el 50% de sus cargas ácidas y el 50% de sus cargas
básicas.
▪
Cada proteína posee su composición en aminoácidos característicos, la cual
determina su comportamiento como electrolito.
▪
En general, todos los tipos de cromatografía dependen de una serie de
instrumentos, compuestos químicos y determinada tecnología. Debido a ello, es
importante conocer algunos conceptos para poder entender el funcionamiento de
las técnicas cromatográficas
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