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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
PROGRAMA INTERINSTITUCIONAL PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA INVESTIGACION Y EL
POSGRADO DEL PACÍFICO
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
ESTUDIO DE LA BIOGÉNESIS Y REGULACIÓN DE LA ADHESINA LONGUS
EN LA CEPA DE Escherichia coli ENTEROTOXIGENICA (ETEC) E9034A A
PARTIR DE TÉCNICAS MOLECULARES
América Itzallana Salgado Martínez U.A. de Ciencias Químico Biológicas Universidad
Autónoma de Guerrero, [email protected]; Asesores: Dr. Juan Xicohtencatl Cortes
[email protected] y Coasesor cDR. Zeus Saldaña Ahuactzi [email protected]
Laboratorio de Bacteriología Intestinal, Hospital Infantil de México Federico Gómez;
Responsable: Dra. Graciela Castro Escarpulli Departamento de Bacteriología Medica
Instituto Politécnico Nacional [email protected]
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En México como en otros países en vías de desarrollo, Escherichia coli
enterotoxigénica (ETEC) es uno de los principales agentes etiológico causales de
diarrea infantil y del viajero. La patogenicidad de ETEC esta mediada por dos
enterotoxinas (LT y ST) causantes de la secreción masiva de electrolitos al lumen
intestinal provocando una diarrea acuosa. Para que la bacteria pueda infectar al
huésped necesita colonizar a través de adhesinas conocidas como factores de
colonización (CFs). Longus es un pili de tipo IV (T4P) que se ha demostrado ser
un CFs a células intestinales; fue identificado en la cepa de ETEC E9034A
(O8:H9), la cual presenta un clúster de 14 genes (lngR, lngS, lngT, lngA, lngB,
lngC, lngD, lngE, lngF, lngG, lngH, lngI, lngJ, y lngP) que se cree están
involucrados en la biogénesis y regulación de longus. Para demostrar esto se
generaron mutantes en los genes lngR, lngS, lngA, lngB, lngC, lngD, lngH, lngJ y
lngP por la técnica de inactivación en un paso de Datsenko KA et. al., 2000 y las
mutantes generadas fueron complementadas con vectores de expresión como
pEXT22, pUC19 y pET-28a. Lo importante de llevar acabo estas técnicas
moleculares es para hacer hincapié a los postulados moleculares de Robert Koch,
en donde explica como un gen o su producto, presente en una cepa virulenta, se
introduce a una avirulenta para expresar el gen in vivo durante la infección para
inducir una inmunidad protectora contra el producto del gen.
METODOLOGÍA
La cepa silvestre E9034A de ETEC se creció en Luria Bertani (LB) y caldo PPLO
(Pleuropneuminie-Like organism) para la propagación y expresión de longus
respectivamente. Se genero mutantes en los genes lngR, lngA, lngB, lngH y lngP
complementadas con los vectores de expresión. Técnicas moleculares como PCR
(reacción en cadena de la polimerasa), digestión, ligación y transformación
mediante electroporación fueron empleadas para clonar los genes lngR, lngB,
lngH y lngP en vectores de expresión con el fin complementar las mutantes
respectivas y caracterizarlas mediante Western-blot, inmunofluorescencia y
ensayos de adherencia a células intestinales HT-29.
CONCLUSIONES
A través de técnicas moleculares como mutación y clonación es posible identificar
genes involucrados en la biogénesis y regulación de la adhesina Longus de ETEC.
LngA, LngB, LngD, LngH y LngP son proteínas involucradas en el ensamble de
longus y LngR un regulador negativo de la expresión de longus.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014