Farmcología Libro

Farmacología
Prácticas de laboratorio para alumnos
universitarios
Ricardo Borges Jurado
Profesor Titular de Farmacología
y
Manuel Feria Rodríguez
Catedrático de Farmacología
Universidad de La Laguna
Tenerife. España.
© R. Borges y M. Feria
Universidad de La Laguna
La Laguna, España. 2005.
ISBN. 84-689-2100-9
http://webpages.ull.es/users/rborges
Reservados todos los derechos. Este es un libro de libre acceso.
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"The night before Easter Sunday of that year I awoke, turned
on the light, and jotted down a few notes on a tiny slip of thin
paper. Then I felt asleep again. It occurred to me at six
o'clock in the morning that I had written down something
most important, but I was unable to decipher the scrawl. The
next night, at three o'clock, the idea returned. It was the
experiment to determine whether or not the hypothesis of
chemical transmission that I had uttered seventeen years ago
was correct. I got up immediately, went to the laboratory, and
performed a simple experiment on a frog heart according to
the nocturnal design"
Extraído de Otto Loewi: An Autobiographic Sketch
(Univ. of Chicago Press, 1960)
Borges y Feria
Índice.
I.-
Objetivos actuales de las prácticas de Farmacología.
6
II.-
¿Demostraciones o prácticas?
7
III.-
Material necesario para demostraciones prácticas.
9
Prácticas
1.- Eliminación de salicilatos en el hombre.
15
2.- Control farmacológico de la glucemia.
19
3.- Acción de los diuréticos en la rata.
21
4.- Evaluación de un neurofármaco.
23
Demostraciones prácticas
5.- Evaluación de los anestésicos locales en el cobayo.
31
6.- Acción de fármacos sobre el sistema cardiovascular
de la rata anestesiada.
34
7.- Acción de los broncodilatadores en la rata anestesiada.
40
8.- Curvas concentración-respuesta en la aorta de rata.
45
9.- Bloqueantes neuromusculares.
49
10.- Crono- e inotropismo de la aurícula de rata.
53
11.- Modificación farmacológica de la motilidad uterina.
59
12.- Tono vasomotor.
63
13.- Cuantificación de antihistamínicos.
66
Apéndices.
72
Bibliografía.
81
5
Borges y Feria
I.-
Objetivos actuales de las prácticas de Farmacología
La enseñanza práctica de la Farmacología ha evolucionado según han ido
cambiando los propios objetivos de las carreras. En particular el uso masivo de
animales de experimentación, la escasez de espacio donde ubicar grandes salas de
prácticas y la dificultad para acomodar sesiones de muchas horas de duración en
programas docentes muy sobrecargados han condicionado la aparición de diversas
alternativas a las prácticas tradicionales. En los últimos años, un sin número de
programas de ordenador y vídeos explicativos han venido a sustituirlas. Por otro
lado, la desidia y la comodidad de muchos docentes ha motivado el fraude que
supone hacer pasar como prácticas a seminarios más o menos teóricos a fin de
justificar el elevado número de horas asignadas por los programas oficiales a la
enseñanza práctica. ¿Constituye la visualización de un vídeo una práctica?
¿Entenderíamos como práctica de Obstetricia a un programa de simulación de un
parto por ordenador?
Creemos, no obstante, que las prácticas tienen un valor primordial en la
formación de los futuros profesionales sanitarios, básicamente porque enseñan que
las cosas no son tan radicales y deterministas como pueda deducirse de los libros
de texto o los programas de ordenador. La prevalencia de lo aprendido en las
facultades se reduce a medida que utilizamos sistemas docentes más alejados del
“medio natural”. Existen bastantes estudios que demuestran que, finalizada la
carrera, muy pocos alumnos logran recordar cuál fue el contenido de una sesión de
ordenador. El contacto directo con los alumnos se ha mermado sensiblemente en
los últimos años, ello en gran parte se lograba a base de horas de conversación
durante las sesiones de prácticas. Una vieja guía pedagógica de la OMS
recomendaba: "hablar a los estudiantes, hablar con los estudiantes y fomentar que
los estudiantes hablen entre ellos".
La llegada de las llamadas “nuevas tecnologías” ha venido en nuestra ayuda
permitiendo realizar demostraciones experimentales antaño vedadas por razones
económicas, de espacio o de disponibilidad de equipos. Hoy es posible
implementarlas para grupos de alumnos suficientemente pequeños como para
mantener con ellos un contacto directo con un coste económico aceptable.
En este libro abordamos varias prácticas y demostraciones prácticas a las
que se les puede sacar un alto rendimiento docente. Algunas son adaptaciones de
viejas preparaciones en órgano aislado o en animal anestesiado, solo que ahora se
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Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
emplea un número muy limitado de animales lo cual reduce los problemas éticos
derivados del contacto directo de los alumnos con los animales.
Estas enseñanzas prácticas de la Farmacología deben pues ser concebidas
para satisfacer los siguientes objetivos:
- Facilitar el aprendizaje de los aspectos de difícil comprensión.
- Familiarizar a los estudiantes con el método científico.
- Enseñar técnicas y hábitos de laboratorio.
- Motivar a los futuros profesionales hacia la investigación y reclutar
vocaciones científicas.
II.-
¿Demostraciones o prácticas?
Aunque ya la masificación ha desaparecido de la mayoría de las facultades
y escuelas aun estamos lejos de reunir las cualidades idóneas para llevar a cabo una
adecuada enseñanza práctica de la Farmacología. Por un lado, la sencilla
comparación entre el número de horas legales disponibles y las necesarias para
desarrollar esta actividad arrojan un resultado descorazonador. Trate el lector de
impartir ocho o nueve prácticas, en grupos de treinta alumnos a un curso de cien,
para que compruebe la dificultad de encontrar, si quiera, fechas para llevarlas a
cabo. Por otro lado, trate de calcular el número de animales necesarios y su costo
económico (y moral) además del esfuerzo personal del profesorado para que se
comprenda la razón por la cual el número de prácticas se ha reducido, cuando no ha
desaparecido completamente, de los estudios de Farmacología.
Las demostraciones ofrecen una feliz alternativa a alguna de estas prácticas
y permiten realizar otras en la que la carencia de equipo y de personal entrenado
las hacía impracticables. Póngase por ejemplo una preparación en baño de órganos,
algunas de las demostraciones que aquí exponemos permiten en unas pocas horas
realizar curvas concentración-respuesta, enseñar cómo hemos hecho los
farmacólogos a lo largo de los años para caracterizar una sustancia con actividad
biológica. De la misma manera una demostración como el estudio del efecto de
fármacos sobre la presión arterial nos faculta para discutir efectos, normas de
administración i.v. y repasar conceptos de fisiología difícilmente explicables de
otro modo.
No obstante, se crre el riesgo de que el alumno pueda permanecer pasivo y
alejado de lo que está ocurriendo en la sala. La demostración se convierte entonces
en un "vídeo en vivo", algo que sencillamente pasa ante sus ojos. Son las prácticas
algo que motiva mucho más a los estudiantes. Incluimos aquí incluso una para
7
Borges y Feria
realizarse en ellos mismos. También incluimos dos habitualmente excluidas de los
curricula prácticos: la acción de fármacos con actividad diurética y el efecto de
sustancias hipoglucemiantes que sitúan al estudiante ante problemas que estarán
muy presentes en su futura actividad profesional. La última fase de una práctica o
de una demostración ha de ser la de ordenar, resumir y discutir lo realizado. Este
apartado se manifiesta de forma especialmente satisfactoria en la práctica sobre la
acción de fármacos sobre el SNC; en ella el alumno se enfrenta a la necesidad de
discurrir para descubrir tras unas siglas un fármaco determinado.
Podríamos concluir que la adecuada combinación de clases teóricas,
seminarios, tutorías, trabajos en equipo, demostraciones y prácticas constituyen
una sólida base docente en la enseñanza de la Farmacología de este comienzo de
siglo. Nosotros hemos ensayado la impartición simultánea de las clases teóricas
con las prácticas o las demostraciones con aparentes buenos resultados.
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Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
III.-
Material necesario para demostraciones prácticas.
Una buena parte de los docentes de Farmacología no están familiarizados
con el uso y la terminología inherente a la aplicación de los ordenadores para la
adquisición de señales biológicas. Si el lector no pertenece a este grupo de personas
puede saltarse este capítulo.
Si existe un campo del saber en vertiginosa evolución ese es el de la
informática. Los equipos, programas y sistemas se convierten en obsoletos en el
transcurso de pocos años, incluso meses. Sería muy poco práctico incluir aquí
instrucciones de uso para equipos que probablemente ya no estén en uso cuando
este libro vea la luz. No obstante, describiremos someramente los conceptos
básicos a tener en cuenta a la hora de comprar un equipo o poner en marcha alguno
con las cosas que tenemos en el laboratorio.
Equipo básico.
Para una demostración con baño de órganos o con animal entero precisamos
(además lógicamente, de la preparación) de un transductor y una unidad de
acondicionamiento. Esta última está presente en todos los polígrafos del mercado
(Grass, Gould, Letica, Harvard, Cibertec, etc...) y también puede adquirirse por
separado a cualquiera de estas casas comerciales o a otras. Nosotros nos las hemos
construido en un taller local.
Esquema electrónico de un transductor. Una fuente de alimentación (típicamente ±
5V) "alimenta" un puente de Wheatstone, una de cuyas resistencias es variable por la aplicación de
fuerza o movimiento. Dos potenciómetros (resistencias variables) permiten cambiar la sensibilidad
(ganancia) y balancear el puente. El puente genera una corriente de intensidad variable dependiente
de la magnitud de la resistencia variable. Esta corriente es "convertida" a voltaje y amplificada.
Básicamente, estas unidades "alimentan" el puente de Wheatstone del
transductor y permiten amplificar y filtrar la señal así como situar el cero. Estos
9
Borges y Feria
equipos tienen una salida analógica generalmente de ± 5 V. Es importante conocer
esta última característica a la hora de acoplar el equipo a nuestra tarjeta de
adquisición.
Aunque el ordenador dispone de salidas de ± 5V, estas no poseen
intensidad suficiente para alimentar los transductores, es por ello necesario el uso
de las unidades de acondicionamiento. El esquema de montaje quedaría como sigue:
Esquema básico de montaje de un equipo. El/los transductores son alimentados y su
señal amplificada en el acondicionador. El acondicionador puede ser un polígrafo estándar. La
señal de salida se introduce en una tarjeta de adquisición de datos. Generalmente se utiliza una caja
de conexión para unir salidas (habitualmente BNC) a la tarjeta (habitualmente mediante un cablecinta). Diversos dispositivos comerciales incorporan la tarjeta digitalizadora en un módulo externo
que se conecta al ordenador por sus puertos (paralelo, SCSI, USB).
Buena parte del material necesario para el montaje de una demostración
práctica puede ser "reciclado" a partir de viejo material existente.
Tarjetas de adquisición.
Las señales emitidas por los polígrafos o por los acondicionadores de
señales son generalmente analógicas, es decir, una señal eléctrica continua. Los
ordenadores trabajan con números, por lo que es necesario convertir la corriente
analógica en una señal digital. Para ello se utilizan las tarjetas conversoras AD
(analógico-digitales).
A la hora de escoger una tarjeta debemos conocer dos características de las
mismas: el número de bits y la velocidad de captura que permite. Además, está la
característica del "bus" que no es otra cosa que el tipo de "enchufe" para el que
está preparada. Hoy en día casi todas las tarjetas son PCI y son compatibles con
todas las plataformas (Macintosh y PC).
Número de bits. Esta característica nos indica el número de puntos en los
10
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
que una señal puede ser convertida y viene indicado en potencias de 2. Así una
tarjeta de 12 bits tendrá una resolución de 21 2 o lo que es lo mismo 4.096 puntos.
Esto significa que nuestra señal puede ser descompuesta en un rango de números
igual o menor a 4.096. Pongamos un ejemplo:
- Un acondicionador emite una señal de 1 V cuando al transductor le
aplicamos una fuerza (peso) de 1 g. Suponiendo que esté algo por encima de la
fuerza máxima que esperamos registrar y que hemos "optimizado" la tarjeta (ver
más adelante), la máxima resolución que podríamos obtener es 1/4.096 = 0,24 mV,
o lo que es lo mismo 0,24 mg de tensión mínima observable. Generalmente esta
resolución es más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones que
necesitamos en Farmacología. No obstante, es necesario ajustar la amplificación de
la tarjeta a estos valores. Esta modificación generalmente puede hacerse por
"software", es decir la propia tarjeta dispone de un pequeño programa para
acomodar sus rangos. La mayoría de las tarjetas son bipolares (es decir admiten
voltajes positivos y negativos) y se ajustan a rangos de voltaje que van desde 0,1 a
10 V.
Velocidad de adquisición. Este parámetro nos indica la cantidad máxima de
muestras que es capaz de adquirir en un segundo. Las tarjetas admiten varios
canales pero generalmente su capacidad de adquisición se divide en virtud del
número de canales de entrada utilizados. De cualquier forma, la velocidad de casi
todas las tarjetas está muy por encima de nuestros requerimientos. Por ejemplo:
Una tarjeta "lenta" de 1 KHz podría llegar a adquirir 1000 muestras por
segundo. Si recordamos que la máxima frecuencia de latido cardiaco de un roedor
está en 500 latidos / min (≈ 8 / s) vemos que este no es precisamente un factor
limitante. Una tarjeta decente en nuestros días puede adquirir a 100 KHz. El
problema viene determinado por el consumo de recursos de procesamiento y de
espacio de disco duro que representa el "sobremuestreo" es decir el tomar más
muestras de las necesarias. La gran capacidad de los modernos discos duros han
reducido la importancia del sobremuestreo. Algo similar ocurre con la "precisión"
que demos a los números que adquiramos (sencilla, doble, etc...). Pongamos un par
de ejemplos:
- Una preparación de aurícula aislada (demostración 5) "late" como máximo
a 5 latidos por segundo. Para lograr una buena resolución necesitamos unos 10
datos por latido, así bastaría con adquirir a 50 Hz, aunque generalmente es práctico
adquirir a 5 veces más velocidad.
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Borges y Feria
- Las contracciones de un anillo de aorta inducidas por noradrenalina
(demostración 3) tienen lugar en decenas de segundos. Por ello una velocidad de
adquisición de 1 Hz será suficiente.
Un "archivo" procedente de la demostración práctica 5 que durase 3 horas,
adquirido con precisión sencilla (32 bits) ocuparía un espacio de disco duro de:
32 bit x 50 Hz x 3.600 s x 3 horas = 17,28 megabits.
Dado que un bite son 8 bits ello nos arroja 2,18 Mb, algo ridículo para la
capacidad de un disco duro actual.
En el apéndice B se indican los valores de adquisición y los rangos de
calibración de algunos de los aparatos más populares.
Una alternativa muy asequible a las tarjetas de adquisición son los sistemas
basados en USB (Universal Serial Bus) o en FireWire. Estos admiten altas
frecuencias de adquisición (12 a 800 Mb/s dependiendo de los tipos). La ventaja de
estos dispositivos radica en que no precisamos un “bus” para enchufar las tarjetas
de modo que se pueden utilizar ordenadores portátiles o sin CPU (tipo iMac de
Apple). Estos dispositivos son baratos y fáciles de programar.
Programas de adquisición.
Si los ordenadores quedan obsoletos en poco tiempo, los programas de
todo tipo, incluidos los de adquisición y tratamiento de datos lo hacen en menos.
Sería inútil tratar de hacer un catálogo de ellos hoy. Existen en el mercado muchas
opciones. También podemos escribir nosotros mismos los programas, aunque
resulta una inversión notable de tiempo o encargárselo a alguien de nuestro
entorno. Una solución puede ser la de utilizar un programa de captura de datos
concebido, inicialmente, para otra función como HPLC, espectroscopía, etc..., con
la condición que admita nuestro rango de señales, nuestras velocidades de muestreo
y la duración que asignemos al experimento.
Los lenguajes de programación "orientada a objetos" Labview® (National
Instruments, USA) Visual Basic, etc… permiten implementar con cierta rapidez
programas de captación.
Productos comerciales como el PowerLab® (Maclab® ) ofrecen una
excelente solución ya que incorporan la tarjeta de adquisición y el programa lo cual
permite la conexión directa con cualquier ordenador.
Tenemos algunos programas desarrollados por nosotros de fácil manejo que
podemos enviarlos, gratuitamente, bajo pedido. Requieren tarjeta de adquisición (o
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Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
dispositivos con salida USB) y LabView® (National Instruments).
Vamos a dar una serie de orientaciones a la hora de elegir un programa. Ya
hemos mencionado que en muchas ocasiones programa y tarjeta van unidos. Un
programa de adquisición debe:
Adquirir: a la velocidad adecuada. Permitir hacer cambios de escala en la
manera que lo hacemos en un polígrafo.
Representar: Tener una buena calidad y un tamaño de gráfico que permita
sacar el mayor rendimiento al número de "pixeles" de resolución de la pantalla.
Almacenar: Es interesante que el programa permita almacenar los datos de
forma continua, ello nos facultará a utilizarlos en días posteriores en los casos de
que la demostración falle (la preparación no responda o se produzca la muerte del
animal). Los datos almacenados deberían poder ser leídos por otros programas
gráficos o estadísticos. Existen diversos formatos de grabado de datos: binario,
texto, etc...
Proyección.
La llegada de los cañones de vídeo ha resuelto gran parte los problemas de
amplificación de los registros en pantallas. Ya no son necesarios epidiáscopos,
proyectores de acetato ni siquiera grandes televisores o las pantallas de cuarzo
líquido. La gran luminosidad de estos equipos permiten operar incluso con las
luces de la sala encendidas, lo cual ayuda a la hora de tomar notas. Su precio, por
otra parte ha caído bastante en los últimos años.
La posibilidad de grabar películas en formato CD y DVD permite a los
alumnos contemplar cómo se prepara una aurícula de rata o cómo se canaliza una
carótida. En los ficheros adjuntos pueden encontrarse algunos ejemplos.
13
Borges y Feria
I.
PRÁCTICAS
14
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
1.- ELIMINACIÓN DE SALICILATOS EN EL HOMBRE
INFLUENCIA DEL pH URINARIO EN LA ELIMINACION DE ALGUNOS FÁRMACOS.
Objetivos.
- Conocer la importancia que el pH urinario tiene en el grado de ionización
de los fármacos y, por consiguiente, en su aclaramiento renal.
- Discutir las implicaciones farmacocinéticas y su potencial terapéutico.
Introducción.
Dependiendo del pH del medio y del pKa del fármaco, éste estará ionizado
en mayor o menor grado en sangre y orina. Tras la filtración glomerular sólo las
formas menos polares (menos ionizadas) tienen mayores posibilidades de ser
reabsorbidas.
Dada la presencia de grandes cantidades de tampones fisiológicos, la ingesta
de álcalis o de ácidos va a alterar muy ligeramente el pH plasmático, pero el riñón
corregirá esos pequeños cambios con grandes modificaciones en la concentración de
hidrogeniones en el flujo urinario, alterándose el pH urinario. Dichos cambios están
previstos en la ecuación de Henderson-Hasselbach:
pH=pKa+log([base]/[ácido])
[1]
- Para fármacos de naturaleza ácida (salicilatos).
pH=pKa+log([ionizado]/[no ionizado])
[2]
- Para fármacos básicos se invertirá el cociente a [no-ionizado]/[ionizado].
Desarrollo.
Los alumnos se distribuirán en grupos. Tres alumnos de cada grupo serán
voluntarios para la experiencia. No entrarán en el grupo personas con problemas
gastrointestinales (ulcus gastroduodenal, gastritis), historia de alergia o intolerancia
a salicilatos. Tampoco mujeres con problemas de hemorragias menstruales ni
sujetos que hayan tomado salicilatos en las últimas 12 horas. Tampoco tomarán
parte alumnos con problemas en su función renal. Cualquiera de estas
contingencias debe ser informada al profesor.
Cada grupo de prácticas recibirá una gradilla con tubos de ensayo de 10 ml,
una garrafa con 5 litros de agua, tres vasos calibrados, una probeta de 1l y tres
vasos de precipitados de 50 ml.
La gradilla contendrá doce tubos, cuatro por sujeto experimental. Los tubos
correspondientes al alumno "control" estarán rotulados en negro con la inscripción
15
Borges y Feria
0, 20', 40' y 60' . Los correspondientes al alumno "acidótico" se rotularán en rojo
y los del "alcalótico" en azul.
Se precisará, un peachímetro, pipetas de 5 ml, un baño de laboratorio con
capacidad para llegar a 100 °C y un espectofotómetro.
Se requiere una sobrecarga acuosa a fin de forzar la diuresis. Para no
confundir los vasos calibrados rotulen cada uno con su nombre. Anoten en la tabla
adjunta la hora en la cual les toca realizar cada una de las tareas. Los demás
alumnos de cada grupo se distribuirán las funciones de desarrollo: cronometrador,
analista, etc... En la casilla "Hecho" se anotará una marca cuando se haya llevado a
cabo.
Tiempo
0 min
60 min
100 min
120 min
140 min
160 min
180 min
Hora
Labor a realizar
Hecho
Tomar 750 ml de agua
Colectar la orina, medir su volumen
Ingerir igual volumen de agua
Colectar la orina, medir su volumen
Poner unos 30 ml en un vaso de precipitados
y medir pH.
Ingerir:
- Acidótico: Agua + 10 g de bicarbonato
sódico
- Alcalótico: Agua + 3 g de cloruro amónico
- Control: Agua
El volumen de agua ha de ser igual al orinado
Colectar la orina, medir su volumen
y medir pH
Tomar una muestra para medir salicilato en
condiciones basales (tubo rotulado como 0')
Tomar dos aspirinas de 500 mg en un
volumen de agua igual al orinado
Colectar la orina, medir su volumen , medir pH
Tomar una muestra para medir salicilato
(tubo rotulado como 20')
Colectar la orina, medir su volumen, medir pH
Tomar una muestra para medir salicilato
(tubo rotulado como 40')
Colectar la orina, medir su volumen, medir pH
Tomar una muestra para medir salicilato
(tubo rotulado como 60')
16
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Análisis de salicilato en orina.
1- Colocar 30 ml de orina en un vaso de precipitados. Bajo control del p H
y agitación, añadir una gota de amoníaco. Ajustar el pH a 7±0,5 con ClH 0,1 N.
2- Pasar 1 ml al tubo de ensayo correspondiente de la gradilla.
3- Se pone en un baño en ebullición a 100 °C.
4- Se deja enfriando la gradilla en una batea de agua.
5- Se añaden al tubo 5 ml de reactivo para salicilatos. Este reactivo
contiene: nitrato férrico 4,4%, cloruro de mercurio 4% todo ello disuelto en ácido
clorhídrico 0,1 N.
6- La reacción da un color cuantificable por fotometría a 525 nm.
7- Los valores de absorbancia obtenidos se compararán con la recta de
calibración.
8- La recta de calibración se realiza con 100, 200, 300, 400 y 500 µg/ml de
salicilato sódico disueltos en orina basal (asegurarse que la orina no contiene
salicilatos).
Los valores obtenidos se irán anotando en la tabla adjunta.
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Borges y Feria
Muestra
Volumen
pH
Absorbancia
0 min
20 min
40 min
60 min
18
Concentración
(µg/ml)
Total
acumulado
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
2. CONTROL FARMACOLÓGICO DE LA GLUCEMIA
ACCION DE LOS HIPOGLUCEMIANTES EN LA RATA.
Objetivo.
- Analizar el efecto hipoglucemiante de la insulina en ratas sin y con
sobrecarga de glucosa. Tratamiento de la hiperglucemia.
- Aprender el uso correcto de un sistema de medición de glucemia a través
de tiras reactivas.
Desarrollo.
Utilizaremos Insulina humana mono componente (Actrapid H M®) y
glucosa en ratas Sprague-Dawley. Para la cuantificación se empleará un medidor
comercial de glucemia (Reflolux®, Glucocard Memory-2®) y las tiras reactivas
correspondientes (BM-test-glycemia 20-800R, Glucocard Memory Strips).
Cada grupo dispondrá de 2 ratas en ayunas de 18 horas. Tras pesar e
identificar los animales, se procede a extraer una muestra de sangre (0,05 ml) por
punción cardíaca. En dichas muestras se determinarán los valores de glucemia
basal. A continuación, a la rata 1 se le administra una sobrecarga de glucosa (3
g/Kg) por (3g/ml en agua destilada) vía i.p. y, a la rata 2, 3 UI de insulina por vía
i.m..
Rata 1: Se procede a extraer sangre a los 15 y 60 min tras la administración
de glucosa. Anótense los valores de glucemia en la tabla. A continuación, se
administra a este animal 3 UI de insulina por vía i.m., repitiendo la extracción de
sangre y determinación de glucemia a los 30' de la administración de la insulina.
Rata 2: Se extrae la sangre a los 60 minutos de la administración de la
insulina y tras valorar la hipoglucemia, se administran 3 g/kg de glucosa. A los 30
minutos de esta administración se extrae sangre nuevamente y se valora la
glucemia.
La valoración de la glucemia se realiza por medio de un sistema rápido y
automático de lectura de tiras reactivas. Las tiras se impregnan en una zona
sensible (o se toman por capilaridad según el modelo de medidor) y tras un
contacto de 30-60 segundos (mirar las instrucciones del medidor). Tras un tiempo
máximo de 30 segundos aparece en la pantalla la glucemia en mg/dl. Para la
19
Borges y Feria
determinación de la glucemia es importante no realizar la extracción de sangre hasta
disponer de un aparato libre.
Resultados.
Glucemia
0’
15'
60'
Glucemia
0’
I+60'
G+ 30'
Rata 1
Rata 2
Adicionalmente, cada alumno podrá determinar su propia glucemia. A tal
fin, deberá limpiarse bien las manos con agua y jabón y alcohol etílico y extraer,
usando una lanceta esterilizada, una gota de sangre de la yema de un dedo,
procediendo a continuación de la forma anteriormente descrita.
20
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
3. ACCIÓN DE LOS DIURÉTICOS EN LA RATA
ESTUDIO DE LAS ACCIONES HIDROELECTROLÍTICAS DE LOS FÁRMACOS.
Objetivos.
- Analizar el efecto de dos tipos diferentes de diuréticos (de asa y
ahorradores de K+ ) sobre la eliminación urinaria de agua, Na+ y K+ .
Material.
Furosemida, diurético de eficacia elevada cuya acción fundamental
consiste en inhibir la reabsorción de Na y Cl en la porción ascendente del asa de
Henle. (Seguril® ampolla de 10 mg/ml).
Triamtereno, diurético de eficacia baja, cuya acción fundamental consiste
en inhibir la reabsorción de Na a nivel del túbulo contorneado distal y colectores.
Como consecuencia, al no producirse el intercambio con K, disminuye la
eliminación de éste. (Salidur® comprimidos; que deben desleirse y suspenderse en
suero fisiológico mediante agitación enérgica. Lo administraremos a 5 mg/ml + 15
mg/ml de furosemida).
Desarrollo.
Cada grupo dispondrá de 3 ratas, en ayunas de 24 horas. Tras pesar e
identificar los animales se procederá como sigue:
Rata 1: Administrar una sobrecarga hídrica, 40 ml/kg, de suero fisiológico
por vía i.p.. Anotar la hora de administración y colocar en una jaula de
metabolismo.
Rata 2: Administrar una sobrecarga hídrica similar y, a continuación, por
vía i.p., 25 mg/kg de furosemida. Anotar la hora de administración y colocar en una
jaula de metabolismo.
Rata 3: Administrar una sobrecarga hídrica similar y, a continuación, por
vía i.p., 5 mg/kg de triamtereno + 15 mg/kg de furosemida. Anotar la hora de
administración y colocar en una jaula de metabolismo.
Resultados.
* EUP = Excreción urinaria porcentual relativa a la sobrecarga hídrica
administrada.
EUP = (ml de orina recogida/ml de sobrecarga administrada) X 100.
Al final de la experiencia, con la ayuda del papel de tornasol, se determinará
el pH de la orina emitida y se guardará en envases debidamente identificados por
21
Borges y Feria
grupo y tratamiento. Al día siguiente se determinará, por fotometría de llama, la
concentración de Na+ y K+ . Los resultados globales se entregarán en clase.
Rata 1
Rata 2
Rata 3
Peso
Sobrecarga (ml)
Furosemida (h)
Triamtereno
+ furosemida (h)
15' (ml y EUP)
30' (ml y EUP)
45' (ml y EUP)
60' (ml y EUP)
120' (ml y EUP)
pH (orina final)
En el apéndice F, se presenta una tabla con los resultados típicos de esta práctica.
(h)= hora
22
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
4. EVALUACIÓN DE UN NEUROFÁRMACO
REALIZACION DE UN MINI "SCREENING" FARMACOLÓGICO PARA CLASIFICAR
FÁRMACOS CON ACTIVIDAD EN EL SNC.
Objetivos.
- Conocer el uso y posibilidades de algunas técnicas para la evaluación de la
actividad neurofarmacológica.
- Clasificar un fármaco en virtud de los resultados obtenidos tras analizar
su efecto en roedores.
Desarrollo.
Se utilizarán ratas y ratones en unas sencillas pruebas de laboratorio. El
alumno deberá seguir las explicaciones del profesor acerca del funcionamiento de
aparatos, entrenamiento de animales, métodos de administración de fármacos e
interpretación de los resultados.
Cada grupo de alumnos recibirá una pareja de tubos de ensayo (uno con las
soluciones para inyectar ratones, otro para las ratas) conteniendo un sólo fármaco
a evaluar. Las soluciones a inyectar han sido preparadas para adaptarlas al muy
diferente peso de ratas y de ratones. Dichos tubos estarán rotulados sólo con unas
siglas, tal y como habitualmente los envían para su caracterización farmacológica
los laboratorios de Química Farmacéutica. Por lo tanto, el alumno va a desconocer
qué es lo que está administrando (doble ciego).
Se pesarán dos ratones y, tras identificarlos con una raya azul o roja en la
base de la cola, se les inyectará, por vía i.p., la cantidad correspondiente de
fármaco según cuadro adjunto.
Pasados 10 minutos se procederá de igual forma con las ratas.
Fármaco
NO-21
PI-12B
RAB-1
KJ-458
CO-13
K2-P
QW-7
IF-2
YW-P
Dosis x peso (ml)
Ratón
1,2 x p
3xp
1xp
5xp
1xp
1,5 x p
2xp
1,3 x p
1xp
Rata
0,1 x p
0,2 x p
0,1 x p
0,4 x p
0,1 x p
0,15 x p
0,4 x p
1,2 x p
0,1 x p
23
Posología
Ratón
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio + 60'
Inicio
inicio
Rata
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio + 60'
Inicio
inicio
Borges y Feria
Advertencia. estamos trabajando con neurofármacos, cuya actividad va a
variar enormemente con el estado emotivo del animal. Es preciso manejar los
animales con exquisito cuidado, debe hablarse siempre en voz baja y sólo lo
imprescindible en el curso de la práctica. Si se ha fumado es preciso lavarse bien
las manos con un jabón no oloroso antes de volver a la sala.
A continuación comenzarán a realizarse las siguientes pruebas:
TESTS DE PORSOLT (Actividad natatoria) -RatonesDesarrollado para evaluar efectos antidepresivos de fármacos, consiste en
medir el tiempo de inmovilización de un ratón en situación de "desesperanza".
Para ello el día anterior se le introdujo en un baño de agua, a 21°C, del cual no se
puede salir, durante 15 minutos. Hoy el animal ya sabe que el nadar no le va a
servir para nada. Se crea así una situación de "desesperanza" que le lleva a dejar de
luchar. Se sabe que los fármacos euforizantes y los antidepresivos incrementan el
"tiempo de lucha".
Desarrollo. Introducir el animal en el baño durante 6 minutos y
cronometrar el tiempo de inmovilización. Se considera inmovilización al cese de
actividad natatoria acompañado de arqueado del dorso. Anotar este tiempo en el
cuadro adjunto. -El ratón no se va a ahogar-. Devolver el animal a su jaula y colocar
ésta en un lugar templado para que se seque rápidamente.
Dejar el vaso limpio para el siguiente grupo. ¡No pierdan tiempo, deben
pasar rápidamente a las siguientes pruebas!
Resultados.
Ratón con raya roja
Tiempo de inmovilización:
Ratón con raya azul
Tiempo de inmovilización:
MEDIDA DE ACTIVIDAD EN CAMPO ABIERTO -RataEn este sencillo test se evalúan: la actividad espontánea y la exploratoria así
como las defecaciones del animal en un recinto profusamente iluminado para que la
presencia del observador modifique al mínimo la conducta del animal. El campo se
halla dividido por tres círculos concéntricos y sectores a la manera que se muestra
en el dibujo. Se consideran deambulaciones externas, medias o internas a los pasos
de un sector, o círculo a otro.
24
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Deambulación interna
Deambulación media
Deambulación externa
Defecaciones
Desarrollo: colocar suavemente la rata en un borde del campo y
contabilizar las deambulaciones y defecaciones sobre el mismo, a lo largo de 2
minutos. Analizar, simultáneamente, las conductas de estereotipias según la escala
adjunta (leer antes de comenzar):
____________________________________________________________
A: Inactiva o dormida
B: Actividad normal
C: Actividad exploratoria (levantamiento, movimientos olfatorios) en un
sólo área.
D: Actividad exploratoria (levantamiento, movimientos olfatorios) en un
área amplia.
E: Lamer el suelo o pared.
F: Movimientos estereotipados de cabeza o extremidades.
G: Como en F pero de forma exacerbada.
____________________________________________________________
Resultados:
Rata con raya roja
Rata con raya azul
Deambulaciones externas:
Deambulaciones medias:
Deambulaciones internas:
Defecaciones:
Grados de estereotipias (puede
haber más de uno):
Limpiar cuidadosamente la superficie del campo antes de introducir la
segunda rata y dejar limpio el mismo para el siguiente grupo. Apagar la bombilla
al terminar.
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ESPONTANEA -RatasLos aparatos que miden la actividad espontánea se denominan actímetros.
Existen actímetros de muchos tipos: rotatorios, por sensores de presión plantar,
variaciones de resistencia eléctrica, análisis por vídeo, etc.. El que utilizaremos
25
Borges y Feria
Varimex® funciona contando las variaciones en el campo magnético que genera el
animal al moverse. El aparato permite contar dos grupos de animales
simultáneamente. Para reducir los factores externos el aparato se halla ubicado en
una habitación insonorizada y con un ventilador funcionando para mantener un
zumbido de fondo siempre presente.
Desarrollo. Colocar los animales en las jaulas correspondientes, colocar
los contadores en "0" y poner el mando de "counter" en posición ON. Pasados 10
minutos, poner este mando en posición OFF y anotar el número de cuentas.
Resultados.
Número de cuentas:
TEST DE LA PLACA CALIENTE -RatasEntre las pruebas para el estudio de la nocicepción en animales, ésta es una
de las más ampliamente utilizadas. El aparato consiste en un baño que envía agua
caliente a una placa de metal manteniéndola a 55 oC. La placa a esta temperatura en
contacto con la piel produce dolor, se estimulan los nociceptores de las plantas de
las patas del animal sin provocar quemaduras. (Pongan la mano sobre la placa
para experimentarlo personalmente). Se valora el tiempo que transcurre hasta que
el animal realiza conductas de evitación o alivio (escape) tales como lamerse o
agitar las patas o intentar saltar. Se considera que el lamido o la agitación se
corresponden con reflejos espinales, mientras que el salto es ya una conducta
elaborada a nivel supraespinal.
Desarrollo: Colocar al animal cuidadosamente sobre la placa y
cronometrar, con precisión, el tiempo transcurrido hasta que el animal se lame o
agita las patas y en su caso el tiempo que tarda en saltar.
Independientemente de esto, y por motivos éticos, ningún animal debe
permanecer más de 60 segundos sobre la placa.
Limpiar la placa antes de introducir el animal y dejarla limpia para el
siguiente. grupo; la orina o heces puede provocar medidas erróneas.
Resultados.
Rata con la raya roja
Tiempo de lamido o agitación:
Tiempo al salto:
26
Rata con la raya azul
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
TEST DE LA RETIRADA DE LA COLA (Tail-flick) -RatasEste es otro de los test de analgesia más frecuentemente empleado.
Consiste en un foco calórico, generado por una lámpara de cierta potencia, que se
aplica sobre el tercio distal de la cola del animal. El encendido de la lámpara pone
en marcha un cronómetro que se detendrá, de forma automática por una célula
fotoeléctrica, cuando el animal mueva la cola para evitar el dolor.
Es de vital importancia el tranquilizar al animal para evitar falsos
positivos.
Desarrollo. Introducir al animal en el cilindro de inmovilización de medida
más adecuada y una vez tranquilo activar el aparato. Tomar el tiempo. Si por
alguna razón el animal moviera la cola antes de tiempo, aplicar de nuevo el foco
sobre otro punto del tercio distal de la cola.
Resultados.
Tiempo
Rata con la raya roja:
Rata con la raya azul:
27
Borges y Feria
MEDIDA DE LA COORDINACION MOTORA (Rota-Rod) RatonesEsta es otra de las pruebas habituales en todo cribaje (screening)
farmacológico. Consiste en medir el tiempo en el que el animal es capaz de
mantenerse sobre un cilindro que gira a velocidad constante. Un fármaco que afecte
a la coordinación motora reducirá este tiempo. Estos ratones han sido previamente
entrenados y en el curso del entrenamiento se desecharon los animales más torpes.
Desarrollo. Ajustar la velocidad a 10 rpm. Colocar los ratones, de
espaldas al observador, sobre el cilindro girando. Poner en 0 el contador y levantar
la plataforma para que el cronómetro comience a contar. Repetir la operación con
cada ratón 5-10 veces y tomar el tiempo más largo. Si sobrepasa los 200 segundos
retirar el animal y apuntar "200".
Resultados.
Ratón con raya roja
Tiempo de caída
Ratón con raya azul
Tiempo de caída
ANTICONVULSIVANTES (Test del Cardiazol) -RatonesDos son las pruebas más frecuentemente utilizadas para la evaluación de
sustancias con potencial anticonvulsivante: el electrochoque y la prueba del
pentilénetetrazol (Cardiazol). El primero discrimina bastante bien la posible
actividad terapéutica sobre crisis generalizadas (gran mal) en tanto que el segundo
lo hace sobre los fármacos capaces de proteger de las crisis de ausencia y
mioclonías. Aunque se han desarrollado otras técnicas más complejas, estos test
son sencillos, rápidos y bastante discriminatorios. El mecanismo de acción del
Cardiazol no se conoce, pero parece afectar la estabilidad de las membranas.
Desarrollo. Inyectar i.p. 80 mg/Kg de pentilénetetrazol a los ratones y
registrar el tiempo de las primeras convulsiones y en su caso de muerte. No se
consideran convulsiones pequeñas sacudidas de duración inferior a 5 segundos. Las
convulsiones consisten en una serie de sacudidas con arqueamiento del dorso.
Es posible que algunos animales mueran durante la prueba, deben
recogerse en bolsas para llevarlos al incinerador. El resto de animales ya hayan
terminado la prueba y pueden ser devueltos a sus jaulas. Colocarles biberones y
comida.
28
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Resultados.
Ratón con raya roja
Número de convulsiones
Ratón con raya azul
Número de convulsiones
En el apéndice A: se indican los fármacos y dosis empleados
29
Borges y Feria
II.
DEMOSTRACIONES
PRÁCTICAS
30
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
5. EVALUACIÓN DE LOS ANESTÉSICOS LOCALES EN EL
COBAYO
Objetivos:
- Conocer el mecanismo de acción de algunos fármacos anestésicos locales
y el efecto de su co-administración con agentes vasoconstrictores.
- En concreto, utilizaremos una amida: la bupivacaína y un vasoconstrictor:
la adrenalina (Svedocain® 0,25 con y sin vasoconstrictor).
- Se resaltará el uso de distintas vías de administración y sus peligros.
- Se hará hincapié en la decisión o no de asociar vasoconstrictores.
Desarrollo.
Los nervios sensoriales son en general más sensibles a los anestésicos
locales que los motores. Una de las preparaciones más sencillas para demostrar la
profundidad de su efecto y el tiempo que tarda en perderse es el reflejo cutáneo.
Para ello se suele preferir un animal tranquilo como el conejo o el cobaya. Hoy
utilizaremos éste último.
Aunque la sensibilidad no es igual en todas las regiones de la piel, por
razones prácticas vamos a obviar este aspecto.
Disposición del equipo para realizar la demostración del efecto de los anestésicos locales.
Con el fin de incrementar la visibilidad en la pantalla, mantenemos la sala en penumbra e
iluminamos la espalda del cobaya con luz fría para no recalentar la piel del animal.
El día anterior afeitamos la región de la espalda de dos cobayas para poder
observar mejor el reflejo cutáneo. La razón de esperar 24 horas se debe a la
irritación que cualquier sistema de depilado provoca en la piel.
31
Borges y Feria
Se coloca la cámara de vídeo a una distancia de 45 cm de la espalda del
animal a fin de tener una visión global de la misma. Seleccionar el modo de autoenfocado. Lo mejor es llevar a cabo una iluminación local con una lámpara que dé
poco calor (luz fría, preferiblemente) a fin de mantener la sala ligeramente a oscuras
para seguir la demostración en la pantalla (ver esquema de preparación).
Con un rotulador indeleble dibujaremos tres círculos como se indica en la
figura. Aunque el cobaya es, en general, un animal tranquilo, intentaremos en lo
posible no hacer ruidos (hablar, golpes en las mesas, etc...) a fin de alterar lo menos
posible los resultados.
La inyección del fármaco se realiza con una jeringa de insulina penetrando
apenas 3 mm en sentido prácticamente tangencial a la piel, de manera que
inyectemos el fármaco entre la dermis y la epidermis. Es importante comprobar
que no hemos pinchado un vaso sanguíneo, tirando hacia atrás del émbolo
previamente a la inyección. El volumen de inyección será de 200 µl procurando
que la punta de la aguja alcance el punto medio del círculo. Ello va a producir un
pequeño habón.
Fármacos a estudiar.
- Vehículo: cloruro sódico al 9‰ (suero fisiológico)
- Bupivacaína (Svedocain® 0,25 sin vasoconstrictor)
- Bupivacaína + adrenalina (Svedocain® 0,25 con vasoconstrictor (5 µg/ml)
A los cinco minutos del inicio de cada inyección haremos la prueba de
anestesia. Para ello tomaremos una aguja de insulina (26 ó 28G) y la pasaremos
suavemente sobre el centro del círculo. Repetiremos la prueba seis veces sobre el
círculo y la compararemos con otra zona a la misma altura del dorso. Las
respuestas son todo-o-nada, es decir pondremos 6/3 para decir que de seis veces en
tres hallamos respuesta.
Se irán anotando en la tabla adjunta, considerando como “0 min” el
32
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
momento en el cual comenzamos el registro. Es mejor que haya un alumno
controlando los tiempos y los demás anotando los datos. Es importante
consensuar lo que se entiende por reflejo y lo que no lo es. En general se aprecia
una contracción cutánea refleja similar a un temblor local pero es preciso objetivar
lo más posible estas respuestas.
Suero
Cobaya
1
Bupivacaína
2
1
2
Bupivacaína +
Adrenalina
1
2
Zona no tratada
0 min
15 min
30 min
45 min
60 min
1h, 15 min
1h, 30 min
2h
Nótese que existen diferencias entre ambos cobayas pese a hacer la prueba
en las mismas condiciones. La variabilidad individual se valora por medio del
análisis estadístico. Si tras una hora de seguimiento se ha revertido el efecto puede
interrumpirse la demostración.
Los resultados se comentarán con el profesor.
33
Borges y Feria
6. ACCIÓN DE FÁRMACOS SOBRE EL SISTEMA CARDIOVASCULAR
DE LA RATA ANESTESIADA
EFECTO DE ALGUNOS FÁRMACOS SOBRE LA FRECUENCIA CARDIACA Y LA
PRESIÓN ARTERIAL.
Objetivos.
- Conocer el mecanismo de acción de algunos de los fármacos con actividad
sobre la presión arterial. En concreto estudiaremos la acción de:
1- Agonistas y antagonistas colinérgicos.
2- Agonistas y antagonistas adrenérgicos.
3- Vasoconstrictores y vasodilatadores de acción directa.
- Resaltar las precauciones de la administración por vías i.p. e i.v.
- Aprender algunos usos de la anticoagulación y anestesia.
- Discutir algunos problemas derivados de la experimentación en
Farmacología.
Material y métodos.
Se anestesia una rata con pentobarbital-sódico (50 mg/Kg, ip). Se canulan la
vena femoral, la arteria carótida común y se practica la traqueotomía. Utilizaremos
la vía venosa para infundir sustancias, la arteria carótida para medir la presión
arterial y frecuencia cardiaca.
Se utiliza heparina sódica (250 U/Kg) i.v. para mantener al animal
anticoagulado. De la misma manera, las cánulas están llenas de suero fisiológico
(ClNa al 0,9%) heparinizado (250 U/l).
Se mantendrá una bombilla encendida sobre el animal para evitar la
hipotermia causada por los barbitúricos.
La cánula arterial se conecta a un transductor de presión y éste a un
polígrafo. Por medio de una tarjeta de adquisición de datos sita en un ordenador
proyectaremos los registros en la pantalla. El trazo rojo corresponde a la presión
arterial y el azul a la frecuencia cardiaca.
Todos los fármacos estarán disueltos en suero fisiológico.
Las dosis, concentraciones y los cuidados para su preparación se
encuentran en el apéndice B.
Advertencia preliminar.
El rendimiento que el alumno obtendrá de esta demostración se
incrementará notablemente si previamente se han repasado los temas de
34
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Farmacología del sistema nervioso vegetativo correspondientes, y participa
activamente en la demostración.
Desarrollo.
En este guión se muestran una serie de gráficas milimetradas para ir
plasmando en ellas los resultados obtenidos. Se acompañará de todas las notas que
estime procedentes.
La escala está expresada en mm de Hg y calibrada de 0 a 250. La frecuencia
cardiaca de 0 a 500 lpm. La escala temporal se ajusta a 1 cm (2 cuadros) por
minuto. Ejemplo:
Abreviaturas.
SF= Suero fisiológico
ACh= Acetilcolina
Ad= Adrenalina
Na= Noradrenalina
Ip=
Isoproterenol
Atr=
Fen=
Pro=
AII=
Atropina
Fentolamina
Propranolol
Angiotensina II
1- Acción de los excipientes y vehículos.
SUERO FISIOLÓGICO.
Se inyecta 0,05 ml de SF ni muy rápido ni muy lento (unos 2 segundos).
Esta maniobra es el control volumétrico. Si se observasen cambios en la PA o en la
FC habría que descontarlos cuando inyectemos fármacos.
35
Borges y Feria
2- Acciones de fármacos con actividad colinérgica.
ACETILCOLINA.
Se inyectarán 0,1; 1 y 10 µg/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos un
minuto y siempre que el efecto del anterior haya concluido. Tras la inyección de
cada dosis (y de aquí en adelante) se inyectarán 0,05 ml de suero fisiológico a fin
de "lavar" el contenido de la cánula.
ATROPINA.
A lo largo de 5 minutos y de forma muy lenta se administrará atropina a
una dosis muy grande (3 mg/Kg).
ACETILCOLINA EN PRESENCIA DE ATROPINA.
Se repetirá la administración de acetilcolina comenzando con 1 µg/Kg y
siguiendo con 10, 100 y 1000 µg/Kg.
En la gráfica inferior iremos representando los valores de reducción de
presión en presencia y en ausencia de atropina.
36
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
3. Acciones de fármacos con actividad adrenérgica.
ADRENALINA.
Se inyectarán 0,05; 0,5 y 5 µg/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos
un minuto y siempre que el efecto del anterior haya concluído.
NORADRENALINA.
Se inyectarán 0,05; 0,5 y 5 µg/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos
un minuto y siempre que el efecto del anterior haya concluido.
37
Borges y Feria
ISOPROTERENOL.
Se inyectará una única dosis de 1 µg/Kg. Este efecto va a durar
considerablemente más que los anteriores, por lo que habremos de esperar, al
menos, 5 min antes de pasar al siguiente fármaco.
FENOXIBENZAMINA.
Siguiendo las mismas precauciones observadas con la atropina (inyección
muy lenta a lo largo de 5 min) se administrará 1 mg/Kg de fenoxibenzamina. Tras
lo cual dejaremos otros 5 minutos de tiempo para la "impregnación" con el
fármaco.
ESTIMULACIÓN
ADRENERGICA
EN
PRESENCIA
DE
FENOXIBENZAMINA.
Se administrarán en el siguiente órden: adrenalina (5 µg/Kg); noradrenalina
(5 µg/Kg) e isoproterenol (1 µg/Kg).
38
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
PROPRANOLOL.
Siguiendo las mismas precauciones observadas con la fenoxibenzamina y
la atropina (inyección muy lenta a lo largo de 5 min) se administrará 1 mg/Kg de
propranolol. Tras lo cual dejaremos otros 5 minutos de tiempo para la
"impregnación" con el fármaco.
ESTIMULACIÓN
ADRENERGICA
EN
PRESENCIA
DE
PROPRANOLOL.
Se administrarán, como con la fenoxibenzamina, en el siguiente órden:
adrenalina (5 µg/Kg); noradrenalina (5 µg/Kg) e isoproterenol (1 µg/Kg). Es muy
probable que la rata presente una presión arterial muy baja e incluso que muera
en esta parte de la demostración.
AGENTES VASOCONSTRICTORES DIRECTOS.
Se administrará angiotensina II a la concentración de 0,1 µg/Kg ó
endotelina I a la misma concentración.
39
Borges y Feria
7. ACCION DE LOS BRONCODILATADORES EN LA RATA
ANESTESIADA.
ANALISIS DE LA RESPUESTA BRONQUIAL ANTE ESTÍMULOS
BRONCOCONSTRICTORES Y SUS ANTAGONISMOS.
Objetivos.
Se pretende que el alumno conozca el mecanismo de acción de algunos de
los fármacos broncodilatadores utilizados comúnmente en la clínica. De forma
razonada, se demostrará como se alteran la presión de insuflación y la arterial en
respuesta a broncoconstrictores y broncodilatadores, utilizando como modelo
experimental la rata anestesiada. Discutiremos igualmente:
- La administración por vías ip, iv e inhalatoria.
- La anticoagulación, anestesia, bloqueo neuromuscular.
- Los problemas derivados de la experimentación en Farmacología.
Material y métodos.
Se anestesia una rata con pentobarbital-sódico (50 mg/Kg, ip). Se canula la
vena femoral y se practica la traqueotomía. Utilizaremos la vía venosa para
infundir sustancias y la cánula de traqueotomía para conectar un respirador.
Se administran 100 µg/Kg de d-tubocurarina a fin de causar la parálisis
muscular y se conecta al animal a un respirador volumétrico para roedores. Se
ajusta el volumen de insuflación al 0,8% del peso del animal y se ajusta la
frecuencia del respirador a 70 ppm. En el circuito de entrada de gases se ha
intercalado un reservorio cuyo volumen será 9 veces mayor del flujo (en ml/min)
de mezcla anestésica administrada. Utilizaremos este reservorio para administrar
los inhaladores, según el dibujo. En el tubo de entrada (insuflante) del circuito se
intercala un transductor para registrar la presión que oponen los pulmones a la
entrada de gases.
Opcionalmente, podemos registrar, igualmente, la presión arterial y la
frecuencia cardiaca mediante una cánula insertada en la carótida común y
conectada a un transductor de presión (ver práctica de presión arterial).
40
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Esquema de un respirador para roedores. Al animal anestesiado se le practica
traqueotomía. A la cánula traqueal se le conectan las mangueras del respirador. Para reducir
espacio muerto los tubos de llegada y de retirada del aire se conectan en Y justo al extremo de
cánula. Un reservorio de agua se intercala en el circuito a fin de actuar como válvula y evitar
sobrepresión. No se muestra la cámara-reservorio donde se administran los aerosoles.
la
el
la
la
El registro debe mostrar las señales correspondientes a la presión de
insuflación, la aparición de artefactos indicarían la presencia de "lucha contra el
respirador" que debe ser tratada con más anestesia y/o tubocurarina.
Todos los fármacos estarán disueltos en suero fisiológico.
Las dosis, concentraciones y los cuidados para su preparación se
encuentran en el Apéndice D.
Advertencia preliminar.
El rendimiento que el alumno obtendrá de esta demostración se
incrementará notablemente si previamente se han repasado los temas de
Farmacología correspondientes, y se participa activamente en la demostración.
Desarrollo.
En este guión se muestra una serie de gráficas milimetradas para ir
plasmando en ellas los resultados obtenidos. La escala temporal se ajusta a 1 cm
(2 cuadros) por minuto.
1- Acción de los excipientes y vehículos.
SUERO FISIOLÓGICO.
Se inyecta 0,05 ml de SF ni muy rápido ni muy lento (unos 2 segundos).
Esta maniobra es el control volumétrico. Si se observasen cambios en la PA o en
la FC habría que descontarlos cuando inyectemos fármacos.
41
Presión de insuflación
(cm H2O)
Borges y Feria
20
10
0
.
2- Acción broncoconstrictora colinérgica.
METACOLINA.
Presión de insuflación
(cm H2O)
Se inyecta 0,05 ml de una solución de metacolina 1, 3 y 10 µg/mL.
20
10
0
42
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
.
METACOLINA TRAS NEBULIZAR CON SALBUTAMOL.
Se administran dos breves dispensaciones con un aerosol dosificador de
salbutamol (Ventolín®), separadas 30 segundos, en el reservorio de la bomba de
respiración. A continuación se inyecta 0,05 ml de una solución de metacolina 1, 3
y 10 µg/mL. Comparamos el efecto con los registros anteriores.
Estamos evaluando dos fármacos con efectores diferentes (antagonismo
fisiológico). Estúdiese con especial cuidado el efecto del salbutamol sobre la
Presión de insuflación
(cm H2O)
frecuencia cardiaca, especialmente tras la segunda aplicación.
20
10
0
METACOLINA
TRAS
NEBULIZAR
CON
BROMURO
DE
IPRATROPIO.
Se administran dos breves dispensaciones con un aerosol dosificador de
bromuro de ipratropio (Atrovent®), separadas 5 segundos, en el reservorio de la
bomba de respiración. A continuación se inyecta 0,05 ml de una solución de
metacolina 1, 3 y 10 µg/mL. Comparamos el efecto con los registros anteriores.
Nótese que el efecto del ipratropio se restringe al árbol respiratorio,
mientras los efectos de la metacolina siguen siendo similares sobre la presión
arterial y la frecuencia cardiaca.
43
Presión de insuflación
(cm H2O)
Borges y Feria
20
10
0
44
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
8. CURVAS CONCENTRACION-RESPUESTA EN LA AORTA DE RATA
ANALISIS DE LA RESPUESTA CONTRACTIL DE LOS AGONISTAS α1 SOBRE UNA
PREPARACION DE AORTA DE RATA AISLADA.
Objetivos.
-Conocer el uso y posibilidades de las técnicas de órgano aislado. Baño de
órganos, transductores. Contracción isométrica, isotónica y auxotónica.
-Aprender cómo se construyen las curvas concentración-respuesta para
agonistas y para antagonistas.
-Recordar los mecanismos de acción de los agonistas α 1 sobre el tono
vasomotor.
O2
+
CO2
Esquema de un baño de órganos "clásico"
Baño de órganos.
Consiste en una copa de vidrio en la cual se aloja un tejido (en nuestro caso
contráctil) en condiciones de temperatura, pH, oxigenación y
nutrientes
controladas. Permite el cambio rápido de solución nutricia y el registro de las
contracciones del tejido.
A lo largo de la Historia de la Farmacología se han ido desarrollando y
caracterizando diversas preparaciones para el estudio de receptores para fármacos
y sistemas de transducción intracelular.
Las preparaciones se encuentran "bañadas" en un líquido fisiológico
isotónico cuya composición intenta remedar al fluido intersticial y que varía de una
preparación (o autor) a otra. Así se han ido desarrollando las soluciones de Ringer,
Locke, Krebs, Jalón, etc... Nosotros emplearemos la solución de Krebsbicarbonato:
45
Borges y Feria
NaCl
KCl
MgSO4
KPO4 H2
CaCl2
NaCO3H
Glucosa
[en mM]
119
4,7
1,2
1,2
2,5
25
11
La solución se burbujea continuamente con carbógeno (95% O2 + 5% CO2 ),
ello asegura la oxigenación y el mantenimiento del pH. Con frecuencia añadimos
rojo de fenol como indicador de pH. La preparación se mantiene a 37°C.
Antiguamente se registraban las contracciones sobre tambores giratorios de
papel ahumado o con tinterillos como los mostrados en el dibujo. Hoy se recurre a
transductores y a equipos informáticos. Los transductores son aparatos que
transforman la respuesta (contráctil en nuestro caso) en corriente eléctrica. De esta
forma permiten amplificar y registrar la contracción. Existen tres tipos
fundamentales: isométricos, isotónicos y
auxotónicos o mixtos. Ningún
transductor es isométrico o isotónico puro.
Transductores. Los transductores se denominan isotónicos cuando operan contra una
fuerza constante: registran movimiento; auxotónicos cuando operan contra una fuerza gradualmente
mayor: registran fuerza y movimiento. Los transductores isométricos trabajan sin desplazamiento:
registran fuerza. Generalmente estos últimos transductores requieren de un sistema piezoeléctrico
para mantener las condiciones isométricas.
Preparación del tejido. Se sacrifica una rata. Se desangra y se extrae la
aorta torácica. En una placa de Petri, llena de solución de Krebs, se limpia el tejido
cuidadosamente y se cortan segmentos de unos 2-3 mm de largo. Los segmentos se
46
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
montan en la copa de baño como se indica en la figura y se le conecta a un
transductor isométrico aplicándole una pretensión de 2 g.
Al transductor
4 ml
Llave de paso
Anillo de aorta
Baño de órganos, detalle.
Aplicación de fármacos. Se utilizan habitualmente dos métodos para la
aplicación de fármacos, dosis repetidas y dosis acumulativas. En la primera es
necesario "lavar" la preparación tras cada dosis y esperar hasta que la arteria se
relaje. En la segunda, el método que utilizaremos hoy, las concentraciones se
aplican de forma creciente y acumulativa. Para lograr una nueva concentración es
necesario tener en cuenta la concentración de fármaco presente en el baño.
Para una copa de baño con un volumen de 4 mL. Vamos a comenzar con
concentraciones muy bajas de fenilefrina, un agonista α1 , 10-9 (1 nM).
Disponemos de una batería de tubos de ensayo de fenilefrina concentrada. Para
alcanzar 1 nM en 4 ml de volumen de baño, añadimos 40 µl de solución 10-7, es
decir diluimos 100 veces una solución 100 veces más concentrada. Ahora hay 10-9
M de fenilefrina en el baño. Para incrementar la concentración a 10-8, añadiremos
36 µl de la solución 10-6 y así sucesivamente. Cuando la aorta haya alcanzado una
contracción estable incrementaremos la concentración diez veces y así hasta
alcanzar una contracción que ya no se incrementará por más que añadamos más
fármaco.
Se pueden administrar concentraciones intermedias. En estos casos debe
recordarse que el punto equidistante entre 10-7 y 10-6 M no es 5x10-7 sino
3,33x10-7, ya que 5x10-7 es 5 veces 10-7 y sólo 2 veces 10-6.
Una vez alcanzado el efecto máximo lavaremos generosamente las
preparaciones y repetiremos la curva transcurridos unos 30 ó 40 minutos.
47
Borges y Feria
Estudio del antagonismo competitivo por prazosina de la contracción
inducida por fenilefrina.
La prazosina es un antagonista competitivo selectivo α1. Para analizar este
antagonismo incubaremos una de las preparaciones con 10-6 M de prazosina
durante 15 minutos antes de repetir la curva con fenilefrina.
En la gráfica en papel milimetrado adjunto se irán anotando los resultados
de las primeras y segundas curvas en ausencia (control) y en presencia de
prazosina.
Estudio del antagonismo no-competitivo por fenoxibenzamina de la
contracción inducida por fenilefrina.
La fenoxibenzamina comienza a comportarse como un antagonista
competitivo no selectivo α. Sin embargo su bloqueo se torna irreversible si
dejamos suficiente tiempo de incubación. Para analizar este antagonismo
incubaremos una de las preparaciones con 10-6 M de fenoxibenzamina durante 15
minutos antes de repetir la curva con fenilefrina.
En la gráfica en papel milimetrado adjunto se irán anotando los resultados
de las primeras y segundas curvas en ausencia (control) y en presencia de
fenoxibenzamina.
Con la ayuda del profesor analizaremos los resultados.
48
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
9. BLOQUEANTES NEUROMUSCULARES.
ANALISIS DE LA ACCIÓN DE LOS FÁRMACOS BLOQUEANTES NODESPOLARIZANTES Y DESPOLARIZANTES, ASÍ COMO SU REVERSIÓN POR
AGENTES INHIBIDORES DE LA ACETIL-COLINESTERASA EN LA PREPARACIÓN
NERVIO FRÉNICO-DIAFRAGMA.
Objetivos: Hoy estudiaremos algunos fármacos que ejercen su acción
bloqueando los receptores nicotínicos de la placa motora. Utilizaremos una
preparación clásica: nervio frénico-diafragma de rata. Esta preparación reproduce
“in vitro” lo esperable tras la infusión “in vivo”.
Como se explicará en su momento en clase, existen dos grandes familias de
bloqueantes:
No
despolarizantes
(también
llamados
curares,
paquicurares
o
competitivos) el prototipo es la d-Tubocurarina.
Despolarizantes (también llamados leptocurares o no competitivos) el
prototipo es la Succinilcolina.
La demostración incluirá también un
agente antagonista
de
la
acetilcolinesterasa. La lista de estos agentes es larga y los clasificamos en
reversibles (fisostigmina, neostigmina, edrofonio) y los irreversibles (paratión,
malatión, DFP). Los primeros tienen usos clínicos, los segundos interés
toxicológico por su uso como insecticida y como gases de guerra. Hoy utilizaremos
la neostigmina:
49
Borges y Feria
Desarrollo: Como dijimos utilizaremos la preparación nervio frénicodiafragma mantenida en baño de órganos de manera similar a lo explicado para el
útero de rata en la última sesión.
Utilizaremos un transductor isométrico y una tensión basal de 1 g. El hemidiafragma izquierdo se inserta en una varilla de soporte y aireación, el nervio se
pasa por unos electrodos de platino para realizar su estimulación eléctrica. La
porción dorsal del músculo se ata al transductor. La solución se baña en una
solución de Krebs (una solución salina tamponada con bicarbonato) cuya
composición es [mM]: ClNa, [119]; ClK, [4,7]: SO4Mg, [1,2]: PO4H2K, [1,2];
Cl2Ca, [2,5]; CO3HNa, [25]; Glucosa [11] y se burbujea con carbógeno (95% O2 +
5% CO2) para que se estabilice el pH en 7,4. La estimulación la realizaremos con
un voltaje supramaximal 50% y pulsos cuadrados de 1 ms de duración siguiendo el
patrón siguiente:
Esquema del montaje de la preparación nervio frénico-diafragma de rata. El nervio es
pasado por un electrodo bipolar conectado a un estimulador. La costilla que define el ángulo
inferior se inserta en la varilla soporte. La solución se burbujea con carbógeno.
50
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
- Contracciones simples. 0,1 Hz
- Tren de cuatro (t/4): cuatro estímulos a 0,5 Hz
- Tétano: 5s a 50 Hz
Esquema de la aplicación de los estímulos eléctricos a la preparación. Para evaluar el tren
de cuatro (t/4) se haya la razón entre el primero y el cuarto de los pulsos. En el tétano se haya,
igualmente, el “decaimiento” observable en la onda tetánica típico del bloqueo por curares. La
potenciación postetánica, observada en el primer pulso tras el tétano es también característica del
bloqueo por curares. En la parte inferior se muestran las frecuencias de aplicación.
Estudiaremos el efecto sobre estos parámetros y
valoraremos la
sensibilidad de los mismos, la potenciación post-tetánica y la reversión o no por
antagonistas.
Los registros se proyectarán en la pantalla. Para dejar suficiente espacio en
el registro, los trazos de las contracciones simples aparecerán muy unidos unos a
otros.
Las concentraciones a utilizar son:
d-Tubocurarina: 0,1; 0,3;1; 3, 10 y 30 µM (de forma acumulativa).
Suxametonio: 1; 3; 10; 30 y 100 µM (de forma acumulativa).
Neostigmina: 10 µM (en presencia de 3 µM de d-Tubocurarina).
El alumno deberá ir rellenando las gráficas que se muestran a continuación.
51
Preparación 2
Preparación 1
Preparación 2
Preparación 1
Borges y Feria
52
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
10. CRONO- E INOTROPISMO EN LA AURÍCULA DE RATA
ACCIONES DE DIVERSOS FÁRMACOS EN UNA PREPARACIÓN DE MÚSCULO
CARDIACO AISLADO.
Objetivos.
- Conocer el uso y las posibilidades de las técnicas de órgano aislado en
baño de órganos para cuantificar las acciones cardiacas de los fármacos.
-Estudiar los efectos sobre el crono y el inotropismo de agonistas y
antagonistas adrenérgicos y colinérgicos. También utilizaremos un glucósido: la
ouabaína.
Desarrollo.
Se sacrifica la rata, se abre el tórax cortando las costillas al lado izquierdo
del esternón. Se toma el ápex cardiaco con unas pinzas y se cortan los grandes
vasos. Se extrae el corazón lo más rápidamente posible y se introduce en un vaso
de precipitados, de unos 20ml, conteniendo solución de Ringer atemperada y
recién oxigenada con carbógeno (95% O2 + 5% CO2):
[mM]
NaCl
125
KCl
5,6
CaCl2
1.1
MgCl2
1.2
NaCO3H
25
Glucosa
11
El corazón continua latiendo bombeando la sangre y reemplazándola por la
solución de Ringer. Después se pasa a una placa de Petri llena de Ringer y se
procede a retirar todo el tejido excepto las dos orejuelas que quedan unidas, por su
parte central, por un pequeño fragmento de tejido. Con rapidez las atamos y las
colocamos en la copa del baño de órganos, atemperada a 30ºC.
El montaje se explica en la figura inferior. Se tensa la preparación hasta
alcanzar 1 g. La preparación late de forma espontánea. Aunque también se aprecian
cambios en la fuerza de contracción, esta preparación se utiliza básicamente para
evaluar el efecto cronotrópico de los fármacos. Recordemos que el corazón es
particularmente rico en receptores adrenérgicos β 1, muscarínicos M 2 e histamínicos
H2.
53
Borges y Feria
Los fármacos se aplicarán con una micropipeta. Dado que el volumen de
Ringer en la copa es de 4 mL, para obtener la concentración deseada pipetearemos
40 µl de una solución 100 veces más concentrada. La aplicación de fármacos ha de
hacerse procurando no tocar la preparación para no estropear el registro.
Ligadura de las orejuelas para su colocación en el baño (reproducido de ref #1).
Los resultados se irán anotando en la gráfica. Utilícese la superior para
registrar la tensión y valorar el inotropismo y la inferior para la frecuencia y valorar
el cronotropismo.
Disposición de la aurícula de rata en el baño de órganos. El extremo correspondiente a la
aurícula derecha se ata a la varilla soporte (que también conduce la oxigenación) y el izquierdo al
transductor isométrico bajo una tensión basal de 1 g. El volumen de la copa queda fijado en 4 ml
por el rebosamiento de la misma. La copa está atemperada a 30ºC.
54
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
PRIMERA COPA DEL BAÑO
SEGUNDA COPA DEL BAÑO
55
Borges y Feria
PRIMERA COPA DEL BAÑO
SEGUNDA COPA DEL BAÑO
56
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
En la tabla inferior iremos recogiendo los resultados, primero en términos
absolutos y en la segunda tabla en porcentajes del control sin fármacos:
PRIMERA COPA
Fuerza
Frecuencia
Control
Metacolina 1µM
Atropina 0,1 µM
+ Metacolina 1µM
Isoproterenol
0,1 µM
Isoproterenol
0,1 µM
Fentolamina
0,1 µM
+ Isoproterenol
0,1 µM
+ Isoproterenol
1 µM
Atenolol 0,1 µM
+ Isoproterenol
0,1 µM
+ Isoproterenol
1 µM
Ouabaína 100 nM
57
SEGUNDA COPA
Fuerza
Frecuencia
Borges y Feria
PRIMERA COPA
Fuerza
Frecuencia
100
100
Control
SEGUNDA COPA
Fuerza
Frecuencia
100
100
Metacolina 1µM
Atropina 0,1 µM
+ Metacolina 1µM
Isoproterenol
0,1 µM
Isoproterenol
0,1 µM
Fentolamina
0,1 µM
+ Isoproterenol
0,1 µM
+ Isoproterenol
1 µM
Atenolol 0,1 µM
+ Isoproterenol
0,1 µM
+ Isoproterenol
1 µM
Ouabaína 100 nM
Con la ayuda del profesor se analizarán los datos.
58
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
11. MODIFICACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA MOTILIDAD UTERINA
ACCIONES DE DIVERSOS FÁRMACOS EN UNA PREPARACIÓN DE ÚTERO DE RATA.
Objetivos.
- Conocer el uso y las posibilidades de las técnicas del órgano aislado y la
forma de cuantificar sus respuestas contráctiles.
- Diferenciar las contracciones isométricas, isotónicas y auxotónicas.
- Recordar las acciones farmacológicas de los agonistas y antagonistas
muscarínicos y simpáticos sobre la motilidad uterina.
- Estudiar las acciones fisiológicas y farmacológicas de la oxitocina sobre el
útero y su mecanismo íntimo de acción.
- Estudiar la acción de otros agentes sobre la motilidad uterina (alcaloides
del cornezuelo y prostaglandinas).
Baño de órganos.
(ver demostración práctica número 8)
Preparación del animal
A una rata joven de 120-150 g se le inyecta i.p. en el día anterior al
experimento 0,1 mg/Kg de estilbestrol (diluido en aceite vegetal) para inducirle el
estro. Recordar que el ciclo de la rata es de cinco días. Un farmacólogo español,
García de Jalón, descubrió en los años cuarenta que, reduciendo el calcio
extracelular diez veces se abolían las contracciones espontáneas. Hoy emplearemos
una solución de Krebs con bajo contenido de calcio y cuya composición, por otro
lado, intenta remedar al fluido intersticial.
- Solución salina (en mM):
[mM]
NaCl
119
KCl
5
CaCl2
0,25
MgCl2
2
NaCO3H
25
Glucosa
11
59
Borges y Feria
Situación de los cuernos uterinos en la rata.
- Se sacrifica al animal, se abre el abdomen y se extraen ambos cuernos
uterinos. En una placa de Petri con solución salina se limpian de grasa y se cortan
segmentos de 2 cm.
- La piezas se montan en una copa de baño de órganos. Uno de los
extremos se ata a la varilla de soporte y otro al transductor. Los tejidos, inmersos
en solución salina, se burbujean con carbógeno (95% O2+5% CO2) y se les aplica
una tensión de 0,5 g. El carbógeno, además de oxigenar, mantiene el pH en 7,4 al
equilibrar el bicarbonato. La temperatura se ajusta a 31ºC y la preparación se deja
estabilizando durante media hora.
Aplicación de fármacos.
La concentración de fármaco a alcanzar en el líquido que baña a la
preparación se logra añadiendo una solución concentrada del mismo, generalmente
unas 100-1000 veces con una micropipeta. El burbujeo contribuye a la adecuada
dilución del fármaco.
Si se va a aplicar un antagonista este se deja “impregnando” la preparación
durante unos minutos. Si se trata de un agonista suele retirarse “lavarse” tras ser
alcanzado el efecto máximo. En algunas preparaciones, no es el caso del útero, la
contracción es tónica y pueden administrase dosis crecientes de fármaco de forma
acumulativa.
60
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Tipo de registro ante dos estímulos sucesivos con oxitocina
Desarrollo de la práctica.
El alumno deberá ir rellenando los gráficos que se encuentran al final del
guión en la manera que se ilustra en la figura anterior. Para ello se irán plasmando
los registros que aparecen en la pantalla. Se anotarán las concentraciones junto a la
abreviatura. Cuando se “lave” la preparación dibuje una flecha con una “L”.
Fármacos a estudiar
Metacolina
Atropina
Concentración
100 nM y 1 µM
1 µM
Abreviatura
Meta
Atrop
0,0001 u.i.
1 µM
100 nM
Oxit
PGF
BAY
100 nM
Nitr ó nif
Se incubará 5 min y se repetirá la administración de
metacolina hasta llegar a 10 µM
Oxitocina
Prostaglandina F2α
BAY-K-8644
Si no se observa efecto “per se” puede añadirse oxitocina
a la dosis anterior
Nitrendipina ó Nifedipina
61
Borges y Feria
62
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
12. TONO VASOMOTOR
ACCIONES DE DIVERSOS FÁRMACOS
PERFUNDIDO DE RATA.
EN UNA PREPARACIÓN
DE
RIÑÓN
Objetivos.
- Conocer el uso y las posibilidades de las técnicas de perfusión de órganos
aislados.
- Estudiar las especiales características farmacológicas vasculares de la
perfusión renal.
Desarrollo.
Se sacrifica el animal y se abre la cavidad abdominal por la línea media
(alba). Se expone el riñón izquierdo (pueden extraerse ambos riñones). Se localiza
la arteria renal (es mucho más fina y dura que la vena) y se canaliza con un catéter
de plástico de 0,5 mm de diámetro interno. Se fija el catéter con dos ligaduras para
evitar que se suelte.
A continuación el riñón se extrae y se perfunde en el sistema descrito en la
figura a 4 ml/min con una solución de Krebs atemperada a 35ºC. El riñón se coloca
sobre una cámara de perfusión también atemperada. En la figura no se muestra,
pero las mangueras de perfusión están dentro de otro tubo atemperado.
El sistema produce una presión retrógrada de aproximadamente 80 mm de
Hg, que se monitoriza continuamente con el transductor. En el sistema se ha
intercalado una conexión en T provista de una membrana de goma para infundir los
fármacos.
Los fármacos se aplican en bolos de 10 µl por medio de una jeringa de
precisión (Hamilton®).
El alumno irá completando las gráficas adjuntas.
63
Borges y Feria
Perfusión renal para el estudio de la presión de infusión.
Fármacos a estudiar en este orden.
Fenilefrina 10 µM
Dopamina 1, 10 y 100 µM
Angiotensina II 100 nM
A continuación aplicar
BAY-K-8644 100 nM (disuelto en el Krebs de perfusión)
Y de nuevo:
Fenilefrina 10 µM
Dopamina 1, 10 y 100 µM
64
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Angiotensina II 100 nM
Cambiar de nuevo la perfusión a Krebs normal
Concluir con:
Endotelina I 10 nM
Nitroprusiato Na+ 10 µM
65
Borges y Feria
13. CUANTIFICACIÓN DE ANTIHISTAMÍNICOS
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA EN ILEON DE COBAYA.
Objetivos.
- Aprender a evaluar la actividad farmacológica analizando un efecto
biológico y cuantificar dicho efecto comparándolo con un fármaco conocido.
Desarrollo.
En primer lugar, vamos a construir una curva concentración-respuesta con
histamina. Luego, observando la curva, escogeremos la concentración a la que se
alcanza el 90% de la contracción. Lavamos la preparación y administraremos
repetidamente esa concentración hasta encontrar respuestas estables. Luego en uno
de los tejidos administraremos concentraciones crecientes del antagonista H1
difenhidramina comenzando con 10-11, 3x10-11 , etc… hasta llegar a inhibir
completamente la contracción.
El ileon de cobaya es una preparación muy rica en receptores muscarínicos
e histamínicos. Por esta razón se ha utilizado clásicamente para evaluar fármacos
con actividad antagonista H1. Para ello, utilizaremos un baño de órganos con una
solución de Tyrode:
g/l
mM
NaCl
8
143
KCl
0,2
2,3
MgCl2
0,1
2,1
CaCl2
0,2
2,5
KPO4H2
0,05
0,4
1
0,084
1,98
11
NaCO3H*
Glucosa
Esta solución está preparada para burbujearse con aire, si se utiliza
carbógeno (95% 02 + 5% CO2) es necesario reducir el ClNa a 119 e incrementar el
NaCO3H a 25 mM.
Se sacrifica al cobaya y se abre el abdomen por la línea alba exponiendo el
paquete intestinal.
66
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Aspecto del paquete intestinal. Se levanta el ciego y se localiza la unión íleo-cecal.
Se corta en ese punto y se transfiere desde ahí hacia atrás a una placa de Petri conteniendo
solución atemperada de Tyrode recientemente oxigenada (Reproducido de ref. 1).
Se cortan porciones de 2 cm de largo y se limpian con cuidado pasándoles
suavemente un poco de Tyrode limpio con una pipeta de Pasteur de plástico. Se
monta en el baño sin cerrar los extremos aplicando una tensión de 0,5 g. Aunque se
describió esta preparación con transductores isotónicos, puede utilizarse cualquier
tipo de transductor (ver demostración número 8).
Copa de baño con íleon. Nótese que los extremos están abiertos
La temperatura será de 37ºC y para la oxigenación puede usarse tanto aire
como carbógeno (ver tabla anterior).
Cálculo de la EC50 y EC90. El fármaco se aplica y se mantiene presente
hasta alcanzarse la contracción máxima, entonces lavamos la preparación. Cuando
67
Borges y Feria
la preparación se ha relajado completamente dejamos transcurrir un minuto antes
de aplicar la dosis siguiente. Nuestra copa tiene un volumen de 4 ml. Con una
micropipeta (0-100 µl) añadiremos 40 µl del fármaco disuelto 1:100 en Tyrode con
cuidado de no tocar la preparación. Para ello será necesario que las concentraciones
iniciales estén, lógicamente, 100 veces más concentradas de la que esperamos
alcanzar. Prepararemos las siguientes concentraciones de histamina (en
concentraciones molares):
3x10-6; 10-5 ; 3x10-5; 10-4 ; 3x10-4; 10-3 ; 3x10-3; 10-2 ; 3x10-2.
En la gráfica inferior recogeremos los datos de la administración
Curva concentración-respuesta de histamina. Nótese que el punto medio entre los valores
corresponde a 3x 10-n, dado que nos movemos en una escala logarítmica decimal.
De esta gráfica obtendremos la EC50, o la concentración a la cual se produce
el 50% del efecto máximo. Para ello trazaremos una línea vertical desde el punto
que represente el 50% de la curva para buscar la dosis correspondiente. En el caso
de que no caiga en una dosis fijada se calculará ésta por interpolación. También
calcularemos la concentración más cercana a la EC90 que utilizaremos en la segunda
parte de la práctica.
68
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Curva concentración-respuesta de antagonistas histamínicos
Cálculo de la IC50. Prepararemos las siguientes concentraciones de
difenhidramina y del fármaco problema:
10-9 ; 3x10-9; 10-8 ; 3x10-8; 10-7 ; 3x10-7; 10-6 ; 3x10-6; 10-5 ; 3x10-5; 10-4 ;
3x10-4; 10-3 ; 3x10-3.
A continuación añadiremos la histamina a la concentración correspondiente
a la EC90 varias veces, lavando entre ellas, hasta encontrar una respuesta estable y
reproducible. Para valorar a los antagonistas se añadirá la difenhidramina a una de
las copas y el fármaco problema a la otra. Esta adición se realizará un minuto antes
que la histamina a fin de permitir que la preparación se impregne bien. Lavaremos
la preparación después de cada dosis. Dejaremos de añadir nuevas dosis cuando las
contracciones se hayan inhibido completamente.
Los resultados se normalizarán al efecto máximo y se dibujarán en la gráfica
inferior.
69
Borges y Feria
De estos datos vamos a calcular la IC50 o la concentración a la cual la
respuesta cae a la mitad del efecto inicial. Procederemos a trazar las líneas hasta el
eje de las abscisas, como hicimos antes para calcular la EC50. Esta vez obtendremos
la concentración teórica a la cual se inhibe el 50% de la contracción. De aquí
podemos afirmar que el fármaco problema es tantas veces más o menos potente
que la difenhidramina.
Discutiremos los resultados con la ayuda del profesor.
70
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Apéndices
71
Borges y Feria
APENDICE A
Fármacos y dosis empleadas en la práctica nº 4.
"Evaluación de un neurofármaco"
Fármaco
NO-21
PI-12B
RAB-1
KJ-458
CO-13
K2-P
QW-7
IF-2
YW-P
Dosis x peso
Ratón
Rata
1,2 x p
0,1 x p
3xp
0,2 x p
1xp
0,1 x p
5xp
0,4 x p
1xp
0,1 x p
1,5 x p
0,15 x p
2xp
0,4 x p
1,3 x p
1,2 x p
1xp
0,1 x p
Posología
Fármaco
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio
Inicio + 60'
Inicio
inicio
Diacepam
Anfetamina
Clonacepam
Etanol
Control
Clorimipramina
Fentanilo
Haloperidol
Control
APENDICE B
Fármacos y concentraciones empleadas en la práctica nº 13.
"Cuantificación de antihistamínicos”
Antagonistas H1
d-Clorfeniramina
Mepiramina
Triprolidina
Prometacina
Astemizol
Rango de concentraciones
1-3000 nM
1-1000 nM
30-10000 nM
10-3000 nM
30- 30000 nM
72
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
APENDICE C
Velocidades de adquisición recomendadas para las
demostraciones.
Demostración práctica
Acción de fármacos sobre el
sistema cardiovascular de la
rata anestesiada
Acción de los
broncodilatadores en la rata
anestesiada
Curvas concentraciónrespuesta en la aorta de rata
Bloqueantes
neuromusculares
Crono- e inotropismo de la
aurícula de rata
Modificación farmacológica
de la motilidad uterina
Tono vasomotor
Cuantificación de
antihistamínicos
73
Hz
20
20
5
50-100
50
10
20
10
Borges y Feria
APENDICE D
Disolución y estabilidad de los fármacos mencionados en este
libro.
Fármaco
Acetilcolina (P6)
Solvente
Suero salino
Adrenalina (P6)
Suero salino
Anfetamina (P4)
Angiotensina II (P6, P12)
Suero salino
Suero salino
Aspirina (P1)
Astemizol (P13)
Agua
Agua
Atenolol (P10)
Agua
Atropina (P6, P10, P11)
Suero salino
BAY-K-8644 (P11)
Alcohol
Bicarbonato Na+ (P1)
Bupivacaína
Agua
Clonacepam (P4)
Suero salino
Clorimipramina (P4)
Cloruro amónico (P1)
d-Clorfeniramina (P13)
Suero salino
Agua
Agua
Diacepam (P4)
Difenhidramina (P13)
Suero salino
Agua
Notas
Muy inestable, pesar y diluir hasta
2, 20, 200 µg/ml., 2 y 20 mg/ml.
Corregir ACh base/ sal. Utilizar en el
día
Conservar la solución madre en
congelador diluida en ácido
perclórico al 0,05 N. Las diluciones
posteriores en salino no son
estables
Pueden desleirse los comprimidos
Bastante estable en congelador.
Dado que es muy cara la hemos
utilizado sin problemas de un año
para otro. Lo mejor es hacer
pequeñas alícuotas de 20 µ
Relativamente estable en nevera. Las
diluciones posteriores se harán en
Tyrode.
Relativamente estable en congelador.
Las diluciones posteriores se harán
en Ringer.
74
O directamente de la ampolla
(Sulfato de atropina). Las diluciones
posteriores se harán en la solución
correspondiente (Krebs, Tyrode,
etc…)
Fotosensible, mantener en un envase
completamente opaco. De la
solución madre 1 mM, diluir hasta
0,1 mM y aplicar 1:1000 para
obtener 100 nM
Directamente de la ampolla
(Svedocain®)
Puede desleirse el contenido de la
cápsula
Bastante estable en nevera
Relativamente estable en nevera. Las
diluciones posteriores se harán en
Tyrode
O directamente de la ampolla
Bastante estable. Las diluciones
posteriores se harán en Tyrode
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Fármaco
Dopamina (P12)
Solvente
Ácido
perclórico
0,05 N
d-Tubocurarina (P7, P9)
Suero salino
Endotelina 1 (P6)
Suero salino
Etanol (P4)
Fenilefrina (P8, P12)
Suero salino
Agua
Fenoxibenzamina (P6, P8)
Suero salino
Fentanilo (P4)
Suero salino
Fentolamina (P10)
Agua
Furosemida (P3)
Glucosa (P2)
Haloperidol (P4)
Histamina (P13)
Insulina (P2)
Bastante estable en congelador.
Las diluciones posteriores se harán
en la solución correspondiente
(Krebs, Tyrode, etc…)
Directamente de la ampolla
(Fentanest®)
Muy estable. Las diluciones
posteriores se harán en la solución
correspondiente (Krebs, Tyrode,
etc…)
Directamente de la ampolla
comercial
Agua
Suero salino
Guardar en nevera
Agua acidulada Se conserva en congelador varias
con ClH
semanas. Las diluciones posteriores
se harán en Tyrode
Directamente de la ampolla
comercial
Ipratropio (P7)
Isoproterenol (P6, P10)
Notas
Conservar la solución madre en
congelador diluida en ácido
perclórico al 0,05 N. Las diluciones
posteriores en salino no son estables
y se harán Krebs
Puede diluirse también desde las
ampollas (Tubocurarina
Wellcome®).
Las diluciones posteriores se harán
en la solución correspondiente
(Krebs, Tyrode, etc…). Estable por
muchos años
Bastante estable en congelador.
Dado que es muy cara la hemos
utilizado sin problemas de un año
para otro
Guardar en envase bien cerrado
Las diluciones posteriores se harán
en la solución correspondiente
(Krebs, Tyrode, etc…)
Suero salino
Directamente del nebulizador
(Atrovent®)
Conservar la solución madre en
congelador diluida en ácido perclórico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables y se
harán en la solución correspondiente
(salino, Krebs, Tyrode, etc…)
75
Borges y Feria
Fármaco
Mepiramina (P13)
Solvente
Agua
Metacolina (P7, P10,
P11)
Suero salino
Neostigmina (P9)
Krebs
Nitrendipina (P11)
Alcohol
Noradrenalina (P6)
Suero salino
Ouabaína (P10)
Agua
Oxitocina (P11)
Jalón
Pentilénetetrazol
Pentobarbital (P6, P7)
Suero salino
Prazosina (P8)
Agua
Prometacina (P13)
Agua
Propranolol (P6)
Suero salino
Prostaglandina F2α (P11)
Salbutamol (P7)
Jalón
Suero salino ( fisiológico)
Suxametonio (P9)
Agua
Krebs
Triamtereno (P3)
Triprolina (P13)
Agua
76
Notas
Relativamente estable en nevera.
Las diluciones posteriores se harán
en Tyrode
Estable en congelador durante 2-4
semanas. Diluir la solución madre
en agua acidulada (ClH 0,05 N)
Las diluciones posteriores se harán
en la solución correspondiente
(Krebs, Tyrode, etc…)
Puede diluirse directamente de la
ampolla (Prostigmine®)
Fotosensible, mantener en envases
completamente opaco. De la
solución madre 1 mM, diluir hasta
0,1 mM y aplicar 1:1000 para
obtener 100 nM
Conservar la solución madre en
congelador diluida en ácido perclórico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables
Relativamente estable en
congelador. Las diluciones
posteriores se harán en Ringer.
Diluir desde la ampolla
(Syntocinon®)Guardar en nevera
80 mg/ml
50 mg/ml en dial 1:4 etanol/agua.
Puede incrementarse su estabilidad
añadiendo 0,5 ml de propilénglicol
Las diluciones posteriores se harán
en la solución correspondiente
(Krebs, Tyrode, etc…)
Relativamente estable en nevera.
Las diluciones posteriores se harán
en Tyrode
Bastante estable, puede utilizarse la
forma racémica para esta práctica.
Poco estable, guardar en nevera.
Directamente del nebulizador
(Ventolín®)
9 ‰ (9 g/l)
Puede diluirse directamente de la
ampolla (Anectine®)
Disolver el comprimido de Salidur®
en salino
Relativamente estable en nevera.
Las diluciones posteriores se harán
en Tyrode
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
APENDICE E
Algunos registros obtenidos en las prácticas mencionadas en este
libro.
Los archivos están también disponibles en las direcciones web que aparecen
escritas en azul. Para abrir estos archivos se necesita un programa compatible (Igor
Pro, IDI, etc…).
Anillos de aorta (Práctica 8)
Nervio frénico-diafragma (Práctica 9)
77
Borges y Feria
Nervio frénico-diafragma (Práctica 9)
Nervio frénico-diafragma. Trenes de 4 con 1µM d-Tubocurarina (Práctica 9)
78
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Útero de rata en estro (Práctica 11)
Útero de rata en estro (Práctica 11)
79
Borges y Feria
APENDICE F
Ejemplo de resultados obtenidos de la práctica número 3 (Acción
de los diuréticos en la rata).
Control
EUP
Media 31,5
δn
15
Est
3,9
n
15
Furosemida
Furosemida +
Triamtereno
pH Na+ K+ EUP pH Na+ K+ EUP pH Na+ K+
6,9 0,42 0,06 153 6,4 2,9 0,12 97 6,8 2,1 0,04
0,9 0,2 0,03 202 0,5 0,4 0,02 22,2 0,8 0,47 0,01
0,2 0,05 0,01 4,5 0,1 0,1 0,00 5
0,2 0,11 0,00
15 15
15
20 20 20
20
20
20 20
20
EUP= Porcentaje de orina emitida con respecto a la sobrecarga administrada.
Los valores de Na+ y K+ se expresan como mEq en la orina emitida en 2 horas.
δn= Desviación estándar; Est= Error estándar; n= Número de datos.
80
Farmacología: Prácticas de laboratorio para alumnos universitarios
Bibliografía.
1- Staff of the Department of Pharmacology, University of
Edinburgh. Pharmacological Experiments on Isolated preparations.
2nd Ed. E&S Livingstone. Edinburgh. 1971.
2- Staff of the Department of Pharmacology, University of
Edinburgh. Pharmacological Experiments on Intact preparations. 2nd
Ed. E&S Livingstone. Edinburgh. 1970.
3- Borges, R.; Grafenstein, HV. and Knight, DE. (1989).Tissue
selectivity of endothelin.
Eur. J. Pharm. 165, 223-230.
81