UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERÍA ACUÍCOLA ELABORACIÓN DE ANTIBIOGRAMA APLICANDO 2 SUSTANCIAS FRENTE A VIBRIOS SP. Wilson Daniel Toro Proaño Ing. Acuac. Sorroza Ochoa Lita Scarlett, Phd Farmacología EL ORO – MACHALA 2020 Índice de Contenido I. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 4 II. OBJETIVOS ............................................................................................................... 5 2.1. Objetivos General ................................................................................................ 5 2.2. Objetivo Específicos ............................................................................................ 5 III. DESARROLLO ...................................................................................................... 6 3.1. Método del antibiograma disco-placa ................................................................... 6 3.2. VIBRIOSIS ......................................................................................................... 6 3.3. Descripción del AGAR TCBS.............................................................................. 7 3.4. PRODUCTOS ..................................................................................................... 7 3.4.1. PROTACID .................................................................................................. 7 3.4.2. FLORFENICOL ........................................................................................... 8 IV. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 10 4.1. MATERIALES .................................................................................................. 10 4.2. MÉTODOS........................................................................................................ 10 4.2.1. Preparación del AGAR TCBS ..................................................................... 10 4.2.2. Siembra de Vibrios ..................................................................................... 11 4.2.3. Aplicación de Sustancias ............................................................................ 11 V. RESULTADOS ........................................................................................................ 13 5.1. PROTACID ....................................................................................................... 13 5.2. FLORFENICOL ................................................................................................ 13 VI. DISCUSIÓN ......................................................................................................... 15 VII. CONCLUSIÓN ..................................................................................................... 16 VIII. REFERENCIAS .................................................................................................... 17 IX. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................... 18 ANEXOS ......................................................................................................................... 20 2 Índice de Figuras Figura 1. PROTACID POR GALÓN ............................................................................................. 7 Figura 2. FLORFENICOL ............................................................................................................. 8 Figura 3.Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Protacid ................................................................. 13 Figura 4. Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Florfenicol ............................................................ 14 Figura 5. Florfenicol y Protacid .................................................................................................... 20 Figura 6. Aplicación de Agar a placas petri .................................................................................. 20 Figura 7. Preparado de Florfenicol al 0,5 % .................................................................................. 20 Figura 8. Antibiograma Replica 2................................................................................................. 21 Figura 9. Antibiograma Replica 1................................................................................................. 21 3 I. INTRODUCCIÓN La acuicultura, camaronicultura o producción de camarones en cautiverio, es una actividad de cultivo en medio acuático, con fines de producción y comercialización como meta final, industrializada por medio de la tecnología. El incremento en la producción de camarón ha provocado un detrimento en la calidad de aguas, propiciando que las condiciones presentes en los estanques pueden beneficiar el desarrollo de algunas comunidades específicas de bacterias; mismas que pueden ser causa de serios problemas patológicos para los cultivos, especialmente en los estadios larvales de los camarones. Los problemas que pueden llegar a detectarse durante el muestreo son: camarón acalambrado, deformación del rostro y cuerpo, camarón de leche, necrosis-Melanización branquial y cuticular, urópodos necrosados o dañados, antenas rotas o deformes, coloración extraña en los organismos. Se debe registrar cualquier signo anormal que se observe en los camarones. El diagnostico de las enfermedades se vuelve cada vez más en una exigencia nacional e internacional, siendo relevante lograr un diagnóstico rápido y oportuno a fin de mejorar las opciones para hacer frente a los diferentes patógenos que hay en el camarón de cultivo (virus, bacterias, parásitos, hongos, etc) (Aguilera-Díaz, 2002). Es por ello que existen diferentes tipos de sustancias para el tratamiento de dichas enfermedades como los fármacos los cuales se los puede extraer de diferentes medios y su efectividad dependerá de las pruebas de laboratorio que se realice. En este documento repasaremos el proceso de un antibiograma con respecto a sustancias para probar su efectividad contra patógenos bacterianos. 4 II. OBJETIVOS 2.1. Objetivos General Realizar un antibiograma utilizando dos sustancias contra Vibrios sp. 2.2. Objetivo Específicos Determinar la efectividad de las sustancias contra el patógeno. Discutir con diferentes autores de acuerdo a la efectividad de las sustancias 5 III. DESARROLLO 3.1.Método del antibiograma disco-placa El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición (Picazo, 2010). 3.2.VIBRIOSIS La Vibriosis es una enfermedad bacteriana, causada por cepas patógenas extracelulares de varias especies pertenecientes al género Vibrio. Estas bacterias tienen en algunos casos una patogénesis desconocida. En camarones penaeidos sólo se ha demostrado patogenicidad de unas pocas especies de vibrios, a pesar de que se ha observado la existencia de muchas bacterias en camarones enfermos. La Vibriosis como patología de etiología bacteriana, ha sido la causa de mortalidades en cultivos de camarón en países productores del mundo entero y afecta tanto en larvicultura como en fase de engorde en estanques de cultivo. Los brotes de Vibriosis suelen darse cuando hay un cambio súbito de las condiciones ambientales, produciéndose un aumento en la velocidad de la reproducción bacteriana, superándose así las cargas toleradas por el organismo de los camarones. Las Vibriosis en camarones pueden presentarse como Vibriosis Oral, Vibriosis Entérica, Enfermedad de la Concha, Vibriosis Localizadas en las Heridas, Necrosis Séptica del Hepatopáncreas, Vibriosis Cuticular y de los Apéndices, Necrosis de la Cola, Síndrome de la Concha Suelta (SLSS), Enfermedad del Intestino Blanco (WGD), Enfermedad Roja y Vibriosis Sistémica. (Cuéllar-Anjel, 2013). 6 3.3.Descripción del AGAR TCBS TCBS Agar (agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) es un medio selectivo de diferenciación para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae y otras especies Vibrio a partir de muestras clínicas y de otras clases. En BD TCBS Agar, el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrógeno y las vitaminas. El citrato sódico, el tiosulfato sódico, la bilis de buey y el colato son agentes selectivos que proporcionan un pH alcalino para inhibir los organismos gram positivos y suprimir los organismos coliformes. El pH del medio se incrementa para favorecer el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los entornos ácidos. La alta concentración de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante y de otras especies de Vibrio, cuya mayoría es halofílica. La sacarosa es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sódico estimula el crecimiento. El tiosulfato sódico es una fuente de azufre y actúa con el citrato férrico como indicador para detectar la producción de ácido sulfhídrico. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. 3.4.PRODUCTOS 3.4.1. PROTACID Figura 1. PROTACID POR GALÓN Protacid OX es un potente bactericida a base de Ácidos Orgánicos (Ácido Fórmico y Acido Lignosulfonico) que controla el pH en alimentos balanceados de uso acuícola © inhibe por contacto el desarrollo de bacterias patógenas como Vibrio sp. y Pseudomonas sp TECNOLOGIA PROTEC® 7 Protacid OX es fabricado mediante tecnología PROTEC®, que incorpora Acido Lignosulfonico y que permite reducir la corrosividad de los acidificantes. A través de este método, se logra una mayor concentraci6n de ácido fórmico, rninirnizando su corrosividad hasta en un 95% y disminuyendo su volatilidad hasta un 70%. Como resultado, Protacid OX es un acidificante altamente eficaz y de fácil manipulaci6n, en comparaci6n con otros productos compuestos por sales de ácidos orgánicos. También es una alternativa para reemplazar pre-mezclas que contengan formaldehido. Presentación de caneca de 25 Kg. La Dosis recomendada en de 5 – 8 ml por Kilo de Balanceado (AgroAndres, 2019). 3.4.2. FLORFENICOL Figura 2. FLORFENICOL Florfenicol, es un bacteriostático que inhibe la síntesis de proteínas mediante la unión a subunidades ribosomales de bacterias susceptibles que conduce a la inhibición de la peptidil transferasa y evitando de este modo la transferencia de aminoácidos a las crecientes cadenas peptídicas y la formación posterior de proteínas, incluyendo muchos organismos gram 8 negativas y gram positivas, sin embargo, el florfenicol no tiene riesgo de inducir anemia aplásica humana. Almacenamiento Florfenicol seguirá siendo viable para su uso por un período de 2 años a partir de la fecha de fabricación. Conservar en un lugar fresco y seco. Evitar la exposición directa y prolongada de la luz solar. Manténgase fuera del alcance de los niños. Aplicación Dosifique 3 a 5 kg del producto por tonelada de balanceado. La dosis de uso puede variar con la directa recomendación de su técnico acuícola. Importante: Periodo de retiro 30 días desde la última administración del producto (Prilabsa, 2018). 9 IV. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1.MATERIALES Agua destilada Vaso precipitación Erlenmeyer Mandil Guantes Mascarilla Cinta Gramera digital Aluminio Alcohol Cocineta Eléctrica Florfenicol Protacid Hisopos esterilizados Encendedor Discos Medio de cultivo: Agar TCBS Caja Petri 4.2.MÉTODOS 4.2.1. Preparación del AGAR TCBS 1. Esta práctica se realizó a las 13:00 el día jueves, 12 de noviembre en el Laboratorio de microbiología a cargo del Dr. Mario Loaiza. 2. Cabe recalcar que para la elaboración del antibiograma se debe realizar con el medio de cultivo Mueller Hinton pero por otros factores se desarrolló con este medio de cultivo. 3. Para realizar el medio de cultivo se utiliza 89,9 gr por Litro de Agua Destilada, se hizo una relación por 30 ml es decir se usó 2,7 g de Agar. 10 4. Utilizamos el Erlenmeyer manteniéndolo en constante agitación para evitar lo grumos y que la solución realice ebullición ya hecho esto se colocó en 2 cajas Petri del Medio TCBS y se dejó solidificar abriendo un poco la tapa. 4.2.2. Siembra de Vibrios 1. Anteriormente ya tenían cepas de Vibrios sembrados en una placa de las cuales hicimos uso de los hisopos previamente esterilizados. 2. Utilizando estos y ya el medio TCBS solidificado con delicadeza se procedió a tomar una buena cantidad del patógeno. 3. Se utilizó la técnica del rayado por duplicado es decir una en cada placa. 4.2.3. Aplicación de Sustancias PROTACID 1. Con la ayuda de una pinza extraemos dos discos para el antibiograma en el producto Protacid directamente por un tiempo corto. 2. Esto se hace para que el disco absorba la mayor cantidad de sustancia posible 3. Debido a que su aplicación fue directa al producto no se diluyo o preparo una solución con la sustancia. 4. Luego se extrajo del producto y con la pinza se colocó en la placa con cuidado 5. Con el lado opuesto se presionó para que quede sujeta al medio de cultivo 6. Se procedió a hacer lo mismo en la segunda placa FLORFENICOL 1. Para la preparación de esta solución nos basamos en su dosificación de 3-5 kg/T de balanceado. 2. Realizamos la dosis de 5 kg/T lo mismo que comprimimos para 100 ml de la siguiente manera: 5 kg 1T 1000 g g 1L x x =5 x x100ml = 0,5 % T 1000 L 1 Kg L 1000ml 3. Procedimos a utilizar la Gramera para pesar y una vez obtenido el grameaje colocamos en los 100 ml de agua destilada 4. Homogenizamos bien y realizamos el mismo proceso de los discos sumergidos en la solución para posteriormente colocarlos en ambas placas 11 5. Como último paso utilizamos un marcador para dividir las placas donde se habían aplicado varias soluciones y proceder con el etiquetado 6. Se cubrió con papel de aluminio y se dejó las placas a temperatura ambiente por 24 horas para observar los primeros resultados. 12 V. RESULTADOS 5.1.PROTACID # Réplica Diámetro de Halo 1 29, 8 mm 2 33 mm Figura 3.Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Protacid 5.2.FLORFENICOL # Réplica Diámetro de Halo 1 32,5 mm 2 32,7 mm 13 Figura 4. Diámetro de halo de réplica 1 y 2 de Florfenicol Debido a que ambas placas se observó un halo de inhibición mayor de 20 mm se comprueba la efectividad de Protacid y Florfenicol contra el patógeno. 14 VI. DISCUSIÓN En cuanto a la utilización de ácido fórmico (Mine y Boopathy, 2013) expresa El ácido fórmico es el ácido órganico con mayor inhibición de bacterias V. alginolyticus, V. cholearae, V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. vulnificus. En el resultado obtenido del antibiograma se ve reflejado la efectividad, aunque desconozco la concentración de ácido fórmico del producto debido a que se colocó directamente en la sustancia, una idea en cuanto a la concentración se observa en el estudio de (Adams & Boopathy, 2013) que indican la Concentración efectiva para Vibrios es de 0,04%. (Reyes, 2018) trabajaron con 7 especies de Vibrios, predominando V. harveyi y V. alginolyticus con un 33 y 29% respectivamente, seguido de V. owensii, V. campbellii, con un 10% y V. sp, V. natriegens y V. inhibens con un 5%, donde el MIC de florfenicol en el 81% de las cepas analizadas en este estudio varió entre 5 y 10 ppm. La sensibilidad de los aislados fue del 100% de las cepas a 30 μg. Al contrario de (Rosado Salazar, 2018) donde con cepas de la misma especie usando 30 ug de Florfenicol hubo sensibilidad del 71.9 %. (SotoRodríguez, Armenta & Gomez-Gil, 2006) probaron concentraciones de Florfenicol 5-60 ug/ml en Zoea 1 y 2 de Penaeus vannamei resultaron efectivas contra Vibrios, pero con un CL50 a partir de 20 ug/ml. En nuestro estudio reflejo la efectividad a concentraciones de 5000 ppm lo cual contrasta con la mayoría de los autores lo cual indica la aplicación excesiva. 15 VII. CONCLUSIÓN De acuerdo al proyecto realizado concluyo que se deben realizar análisis más detallados de las Concentraciones mínimas inhibitorias ya que esto se ve detallado en la mala dosificación de antibióticos a los piensos o al medio de cultivo lo que genera resistencia de los patógenos, de manera que una alternativa usada son los tratamientos con ácidos orgánicos aunque de una u otra manera también se debe de controlar adecuadamente la dosificación de estos, los efectos que causa a las enfermedades en camarones y el impacto ambiental que puede causar. 16 VIII. REFERENCIAS Mover constantemente el Agar mientras se prepara para evitar la formación de grumos, así como la precipitación del mismo Evitar aplicar mucha fuerza al sembrar el patógeno en el agar ya que este puede desintegrarse. Esterilizar las pinzas cada vez que se colocó un disco con distinta sustancia Lavarse las manos ya que se trabaja con patógenos directamente 17 IX. BIBLIOGRAFÍA AgroAndres. (2019). Obtenido de PROTACID: https://agroandres.com.ec/productoagropecuario/acidos-organicos/protacid/ Adams, D., & Boopathy, R. (2013). Use of formic acid to control vibriosis in shrimp aquaculture. Biologia, 68(6), 1017-1021. Obtenido de https://www.degruyter.com/view/journals/biolog/68/6/article-p1017.xml Aguilera-Díaz, M. M. (2002). Los cultivos de camarón en la Costa Caribe colombiana. Capítulo 5. Los cultivos de camarón en la Costa Caribe colombiana. Pág.: 198-233. Obtenido de https://www.researchgate.net/publication/5007450_Los_cultivos_de_camarones_en _la_Costa_Caribe_Colombiana Mine, S., & Boopathy, R. (2013, Julio). Effect of Organic Acids on Shrimp Pathogen, Vibrio harveyi. Current Microbiology, 63, 1-7. doi:10.10007/s00284-011-9932-2 Picazo, J. (2010). Procedimientos en Microbiología Clínica. Obtenido de Metodos básicos para el estudio de la sensibilidad antimicrobiana: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiol ogia/seimc-procedimientomicrobiologia11.pdf Prilabsa. (2018). Obtenido de Florfenicol: https://prilabsa.com/productos/aditivos/florfenicol/ Reyes Delgado, J. K. (2018). Sensibilidad bacteriana a agentes terapéuticos utilizados para controlar problemas bacterianos en larvicultura de Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Bachelor's thesis, La Libertad: Universidad Estatal Península de Santa Elena, 2018.). Obtenido de https://repositorio.upse.edu.ec/xmlui/handle/46000/4432 Rosado Salazar, A. A. (2018). Resistencia Antimicrobiana de bacterias del género Vibrio en langostino blanco (Litopenaeus vannamei) en centros de cultivo de la región Tumbes. Obtenido de http://repositorio.urp.edu.pe/handle/URP/1686 Soto-Rodríguez, S., Armenta, M., & Gomez-Gil, B. (2006). Effects of enrofloxacin and florfenicol on survival and bacterial population in an experimental infection with luminescent Vibrio campbellii in shrimp larvae of Litopenaeus vannamei. 18 Aquaculture, 255(1-4), 48-54. Obtenido https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848605007362 19 de ANEXOS Figura 5. Florfenicol y Protacid Figura 6. Aplicación de Agar a placas petri Figura 7. Preparado de Florfenicol al 0,5 % 20 Figura 9. Antibiograma Replica 1 Figura 8. Antibiograma Replica 2 21
