Universidad Industrial de Santander – Facultad de salud Escuela de Microbiología Programa de Microbiología y Bioanálisis Asignatura: Bioquímica GUÍA N° 4. PROTEÍNAS Sergio Andrés Mayorga Barragán – 2150119; Paula Andrea Monsalve Agudelo – 2150226; Eliana Marcela Mora Guevara – 2122827; Stefhany Carolina Vásquez Stella – 2111588; Efren Jair Gil Rueda – 2151376 Grupo: J1 Mesón 2 Fecha de entrega: 8 de noviembre del 2016 INTRODUCCIÓN Las proteínas son biomoléculas formadas carbono, hidrogeno, oxígeno y nitrógeno. Están constituidas por pequeñas moléculas que reciben el nombre de aminoácidos. La unión de un bajo número de aminoácidos da lugar a un péptido; si la molécula que se forma es de un máximo de 10 aminoácidos se denomina oligopéptido, si es superior a 10 se llama polipéptido y si el número es superior de 50 aminoácidos se habla ya de proteínas. Por parto las proteínas son cadenas de hasta 20 aminoácidos diferentes, que se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional permitiéndoles llevar a cabo miles de funciones. Las proteínas están codificadas en el material genético de cada organismo, donde se especifica su secuencia de aminoácidos para luego ser sintetizados en los ribosomas. Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las biomoléculas más diversas y más versátiles. Realizan una enorme cantidad de funciones, entre ellas estructurales, enzimáticas, de trasporte entre otras. En cuanto a los aminoácidos, estos son compuestos sólidos, cristalinos, que presentan un punto de fusión y una solubilidad en agua muy superiores a lo que cabría esperar dado su peso molecular. Esto se debe a que los aminoácidos existen en disolución, y cristalizan a partir de las disoluciones, en forma de iones dipolares. A pH neutro, el grupo carboxilo cede un protón y queda cargado negativamente y el grupo amino capta un protón y queda cargado positivamente. Así, los aminoácidos pueden comportarse como ácidos o como bases según el pH del medio. Por las propiedades características que tienen las proteínas, dadas principalmente por los aminoácidos que las componen, las técnicas para separar y analizar estas moléculas se basan en gran medida en sus propiedades químicas, en especial su comportamiento ácidobase. PALABRAS CLAVE Proteína: deriva del griego "proteos" (lo primero, lo principal), biomolécula más abundante después del agua. Aminoácido: molécula orgánica que contiene un grupo amino y un grupo carboxilo, presente principalmente en las proteínas. Anfótero: compuesto que puede actuar como un ácido o una base según la sustancia con la que reaccione. Punto isoeléctrico: pH al que un aminoácido tiene una carga neta igual a cero. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Solución ácido acético (0,01N; 0,1N; 1N) Agua destilada Solución de caseína Solución de proteínas Solución sulfato de cobre Solución ácido tricloroacético Solución NaOH diluido Reactivo de Biuret Muestra de suero Pipetas Micropipetas Gradillas METODOLOGÍA EXPERIMENTO 1. Precipitación de la caseína Se prepararon una serie de 6 tubos de ensayo de acuerdo a como se señala a continuación: Tubo 1: 8,85 mL de agua destilada + 0,15 mL de ácido acético 0,01N (pH s/n = 6,5) Posteriormente, se anotó la turbidez y la precipitación de cada uno de los tubos, usando una escala de 0 a 5 cruces, donde 0 es ausencia y 5 es muy turbio. Lo anterior, se realizó a los 10, 20 y 30 minutos de haber agregado la caseína. EXPERIMENTO 2. Precipitación por metales pesados En un tubo de ensayo se colocaron 2 mL de solución de proteína (albúmina de huevo 5g/L) y se añadieron unas gotas de sulfato de cobre 0,1 mol/L Tubo 2 (patrón): 1 mL de reactivo Biuret + 25 uL de patrón 8 g/dL Tubo 3 (muestra): 1 mL de reactibo Biuret + 25 uL de suero Para la obtención del suero se realizó extracción sanguínea a uno de los integrantes del mesón, por método Vacutainer, en un tubo de ensayo sin aditivos. Después, se realizó la separación de los hemocomponentes por centrifugación a 3000 rpm por 10 minutos Tubo 2: 8,38 mL de agua destilada + 0,62 mL de ácido acético 0,01N (pH s/n = 5,9) Tubo 3: 8,5 mL de agua destilada + 0,5 mL de ácido acético 0,1N (pH s/n = 5,0) Tubo 4: 8 mL de agua destilada + 1,0 mL de ácido acético 0,1N (pH s/n = 4,7) Se realizó la visualización de los tubos y no se observó ninguna diferencia de turbidez entre ellos; por lo cual, se agregó 1 mL de leche, ya que ésta posee una concentración mayor de caseína. Se describió lo observado. Luego, se añadió un exceso de sulfato de cobre 0,1 mol/L, anotando los resultados finales de la prueba. EXPERIMENTO modificado 4. Tubo 5: 1 mL de agua destilada + 8 mL de ácido acético 0,1N (pH s/n = 3,8) Tubo 6: 7,4 mL de agua destilada + 1,6 mL de ácido acético 1N (pH s/n = 3,5) Luego de haber preparado todas las soluciones, se procedió a agregar 1mL de solución de caseína a cada uno de los tubos, agitando inmediatamente. EXPERIMENTO 3. Precipitación por reactivos acídicos En un tubo de ensayo se coocaron 2 mL de albúmina de huevo 5 g/L y 5 gotas de ácido tricloroacético 20% P/V. Resgistrando lo observado. Biuret Se prepararon una serie soluciones en 3 tubos de ensayo: En seguida, se añadieron aprox. 9 gotas de NaOH 0,1N, y se registraron los resultados. Tubo 1 (blanco): 1 mL de reactivo de Biuret Posteriormente, se realizó la mezcla de cada uno de los tubos, y se incubaron a 37°C por 10 minutos; para luego, mantenerlos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se realizó la lectura de la absorción de cada uno de los tubos a 540 nm en un espectrofotómetro. Con los resultados obtenidos, se realizaron los respectivos cálculos para realizar la interpretación de los resultados finales. RESULTADOS EXPERIMENTO 1. Precipitación de la caseína Luego de preparar las soluciones indicadas sustituyendo el reactivo de la caseína por leche entera de marca alpina se obtuvo: Imagen N° 1. Presencia de precipitación y turbidez TURBIDEZ TUBO ‘’0’’ minutos ‘’10’’ minutos ‘’20’’ minutos 1 +++++ +++++ +++++ 2 +++++ +++++ +++++ 3 +++++ +++++ +++++ 4 +++ ++ ++ 5 ++++ +++ +++ 6 ++++ +++ +++ Tabla N° 1. Escala de turbidez a los 0, 10, 20 y 30 minutos. ‘’30’’ minutos +++++ +++++ +++++ ++ +++ +++ PRESENCIA DE PRECIPITADO TUBO ‘’0’’ minutos ‘’10’’ minutos ‘’20’’ minutos 1 NO NO NO 2 NO NO NO 3 NO NO NO 4 SI SI SI 5 SI SI SI 6 SI SI SI Tabla N° 2. Presencia de precipitación a los 0, 10, 20 y 30 minutos. ‘’30’’ minutos NO NO NO SI SI SI EXPERIMENTO 2. Precipitación por metales pesados Luego de realizar la mezcla de 2 mL de albúmina y sulfato de cobre al 0,1 mol/L y a medida que se iba añadiendo un exceso de éste último, se pudo observar la aparición de un precipitado azul lechoso: Imagen N° 2. Aparición de precipitado a medida que la albúmina reacciona con el sulfato de cobre. EXPERIMENTO 3. Precipitación por reactivos acídicos En la primera observación realizada al mezclarse la solución de albumina y el ácido tricloroacético, se presentó turbidez, con una coloración blanca, al cabo de unos segundos se observó una mayor turbidez en la parte media inferior del tubo de ensayo. Al subirse el pH con la solución de NaOH (0,1 N), se pudo presenciar la formación de dos fases: una translucida (superior) y la segunda (inferior) de coloración blanca; es de aclarar que cada gota de NaOH que era agregada a la solución de albúmina con el ácido provocaba una mayor precipitación. Imagen N° 3. Precipitación de la albúmina EXPERIMENTO 4. Biuret modificado Se realizó la toma de muestra, para luego hacer la separación de hemocomponentes por centrifugación, para luego colocar la muestra de suero en su respectivo tubo de ensayo y llevar al espectrofotómetro junto con el blanco y el patrón. Imagen N° 4. hemocomponentes sanguínea. Imagen N° 5. (Izquierda) Blanco, (centro) Patrón, (derecha) muestra. Separación de de la muestra Los resultados se registraron en la siguiente tabla: Absorción en el Espectrofotómetro (540 nm) Blanco 0,000 Patrón 0,486 Muestra (Suero humano) 0,371 Tabla N° 3. Lectura de la absorbancia. Tubos de Ensayo Posteriormente, se utilizaron los resultados anteriores para calcular la concentración de proteínas en la muestra problema; para esto, se utilizó la fórmula N° 1: 𝐶. 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎: 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑔 ∗ 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 (8 ⁄𝑑𝐿) 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 𝐶. 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎: 0,371 𝑔 ∗ 8 ⁄𝑑𝐿 0,486 𝑔 𝐶. 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎: 6,11 ⁄𝑑𝐿 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS EXPERIMENTO 1. Precipitación de la caseína Uno de los métodos para la purificación de proteínas es la modificación del pH, cuando el pH del medio alcanza el punto isoeléctrico de la proteína o menos se dará lugar a la precipitación. En el desarrollo de este experimento se expuso la caseína presente en la leche a soluciones de agua destila y ácido acético a diferentes concentraciones , el PI de la caseína es a un PH de 4.8 lo que explica porque la precipitación solo se presenta en los tubos 4, 5,6 que tienen pH aproximados de 4.7 , 3.8 y 3.5 respectivamente, de acuerdo con las observaciones que se realizaron a los 10, 20 y 30 minutos no se presentaron variaciones en los tubos 1,2 y 3; en los tubos 4, 5 y 6 se observó una leve disminución de la turbidez y se mantuvo el precipitado. EXPERIMENTO 2. Precipitación por metales pesados La albumina reacciona con el sulfato de crobre formadon un precipitado azul lechososo. Esto se debe a la presencia de iones metalicos que se encuentran en el sulfato de cobre que neutralizan las cargas aniconicas de los grupos esenciales de la proteína causando una desestabilizacion que se reflejan como una precipitación, fue posible visualizar la reaccion al instante. EXPERIMENTO 3. Precipitación por reactivos acídicos Al realizar la comparación de los resultados y revisar el componente teórico, se puede observar que las proteínas pueden precipitar por la acción de ciertos ácidos, como el ácido tricloroacético. Los precipitantes ácidos forman sales insolubles con las formas catiónicas (de carga positiva) de la proteína, esto sucede gracias al proceso de acidificación del medio en donde se encuentra la proteína, en donde el pH es más ácido que el punto isoeléctrico de la cadena polipeptídica. De la misma forma, las bases fuertes tienen la capacidad de precipitar las proteínas, pero en medio alcalino la proteína se carga negativamente. EXPERIMENTO 4. Biuret modificado En este experimento se realizó la identificación de la presencia de proteínas en la muestra problema (suero humano), y su posterior cuantificación. Lo anterior se obtuvo mediante la reacción de Biuret, la cual contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina. Esta reacción se basa en la formación de un compuesto de color azul violáceo, debido a la obtención de un complejo entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, presentando un máximo de absorción a 540 nm. De ésta manera se obtuvieron las absorbancias tanto de la muestra como del patrón y se hicieron los respectivos cálculos (fórmula N° 1), para obtener la concentración de proteínas en el suero analizado. Con todo lo anterior, se pudo calcular que la concentración de proteínas de la muestra de suero era de: 6,11 g/dL, este valor se comparó con el rango normal de concentración de proteínas en suero humano que es de: 6,0 a 8,3 g/dL. Lo cual nos deja ver que la concentración de proteínas hallada en la muestra problema se encuentra dentro de los límites normales. CONCLUSIONES Con base en el punto isoeléctrico de una determinada molécula, es posible aislarla. Esto se observó en la caseína, la cual momento de alcanzar su punto isoeléctrico se precipita debido a que pierde la capacidad de interactuar con las demás moléculas presentes en la solución. La presencia de iones metálicos en solución tiene la capacidad de precipitar las proteínas debido a la neutralización de las cargas proteicas. Se pudo observar que el ácido tricloroacético y el NaOH poseen la propiedad de precipitar proteínas, lo cual se logró apreciar con la turbidez del tubo de ensayo. Se pudo comprobar que la reacción de Biuret, es un método eficaz y de gran ayuda en la cuantificación de proteínas en una muestra. PREGUNTAS ADICIONALES 1. ¿Por qué los dipéptidos y los alfa aminoácidos no presentan la reacción de Biuret? Porque se necesitan de 3 o mas enlaces peptídicos para que se de la coloración. Ya que este método se basa en la reacción del sulfato de cobre con compuestos que tengan 3 o mas enlaces peptídicos, en un medio alcalino. Los péptidos (a partir de los tripéptidos) y las proteínas reaccionan con el reactivo de Biuret. Los iones cúprico forman un complejo de coordinación con los pares de electrones no compartidos del N, presente en los aminoácidos de las proteínas. 2. ¿Por qué se utilizan los agentes desnaturalizantes como antisépticos?, explique. Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OH- disociados, respectivamente. En principio, su actividad es proporcional al grado de disociación, pero algunos hidróxidos son más potentes de lo sugerido por su mero grado de disociación, debido a la acción tóxica directa que puede ejercer el catión metálico. Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien la acción de bases fuertes. Tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha para aislarlo y purificarlo: se licúa un esputo de enfermo sospechoso en una solución 1M de sosa (NaOH) y se deja 30 minutos antes de sembrar. Bajo estas condiciones, prácticamente sólo sobrevive el Mycobacterium tuberculosis. 3. ¿En qué se diferencia la desnaturalización proteica e hidrolisis proteica? La desnaturalización de las proteínas es la desnaturalización bioquímica que se puede entender en el cambio estructural de las proteínas que se lleva a la perdida de la estructura nativa de las molécula de estas sustancias. La hidrolisis de las proteínas termina por fragmentarlas en a-aminoácidos. BIBLIOGRAFÍA Reacción de Biuret [en línea]. Cátedra de Introducción a la Química para Ciencias Naturales. Universidad Nacional de La Plata, Argentina. (s.f.). Recuperado el 6 de noviembre de 2016. Disponible en: <http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf>. Trabajo práctico N°2. Reconocimiento y Propiedades de las Proteínas [en línea]. Universidad Politécnica de Valencia, España. (s.f.). Recuperado el 6 de noviembre de 2016. 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