Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA TRABAJO PRÁCTICO N° 2: LECHE y PRODUCTOS LÁCTEOS Jefe de Trabajos Prácticos: Mgter. Silvia Benítez Britez Ayudante de 1°: Dra. Ana Eugenia Thea - 2018 - Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA TRABAJO PRÁCTICO 2: LECHE y PRODUCTOS LÁCTEOS OBJETIVOS 1) Conocer la legislación vigente en materia de leche y productos lácteos en nuestro país. 2) Estudiar los posibles mecanismos de deterioro, contaminación y adulteración de la leche y productos derivados. 3) Conocer y adquirir adiestramiento en los métodos fisicoquímicos utilizados en la valoración de los requisitos de calidad de la leche y productos lácteos. INTRODUCCIÓN La leche es un líquido de color blanco y con un tinte amarillento o azulado más o menos pronunciado. La reacción que ofrece recién admitida al papel tornasol es anfótera. Las bacterias lácticas desarrollan la fermentación láctica, lo que hace que las leches comerciales tengan reacción ácida. Constituye la leche una emulsión natural, formada principalmente por agua, materia grasa, micelas de caseína, lactosa y sales minerales, además de pequeñas cantidades de albúmina, colesterolina, lecitina, etc. y los gases oxígeno, nitrógeno y anhídrido carbónico. La materia grasa de la leche existe en estado de emulsión, formando pequeños glóbulos, mientras que las caseínas se encuentran en forma micelar y la mayor parte de las sales y los azúcares están disueltos en agua. En estado de reposo, los glóbulos grasos suben espontáneamente a la superficie formando una capa de espesor variable que recibe el nombre de crema. La leche de la cual se ha separado más o menos parcialmente esta capa (también llamada nata), recibe el nombre de leche descremada o desnatada, y como es de esperar, posee menor valor calórico. Por procedimientos especiales, haciendo pasar la leche a través de orificios pequeños a presión, se consigue reducir el tamaño de los glóbulos de grasa, obteniéndose 2 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA así una emulsión más estable (duradera en el tiempo), de la cual, no se separa la capa de crema. La leche sometida a este procedimiento recibe el nombre de leche homogeneizada. Por acción de los gérmenes que existen no sólo en la leche, sino también en el ambiente, el azúcar de la leche se va transformando en ácido láctico disminuyendo el pH del producto, lo cual facilita la agrupación de los glóbulos de grasa y de las micelas de caseína. Según el Código Alimentario Argentino (CAA), Capítulo VIII, Artículo 554: "Con la denominación de Leche sin calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación, proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatológica Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie. La leche proveniente de otros animales, deberá denominarse con el nombre de la especie productora" En el Artículo 555 del mismo Código se expresan los requerimientos fisicoquímicos de calidad con los que debe cumplir la leche para consumo humano y la leche que será destinada a la elaboración productos lácteos (véase la Tabla 1). En el artículo 556 se establecen las situaciones cuando la leche NO PUEDE SER COMERCIALIZADA. Ejemplos de estas situaciones son la presencia de caracteres organolépticos (color, olor, sabor) anormales, leches que contengan calostro o sangre, restos de desinfectantes o surfactantes utilizados para higienizar el ordeño. Tampoco podrán expenderse para el consumo leches que posean residuos de antimicrobianos (especialmente antibióticos), metales tóxicos, plaguicidas (utilizados en la industria para el control de moscas, garrapatas, malezas y otras plagas), nitritos y nitratos o cualquier otro tipo de conservantes (por ejemplo peróxido de hidrógeno, formaldehído), agentes adulterantes como el bicarbonato de sodio, toxinas de origen microbiano (aflatoxina M1) en cantidades superiores a los límites establecidos en el CAA, entre otros. 3 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Tabla 1. Requisitos fisicoquímicos de calidad de la leche según el CAA Requisitos Densidad a 15°C (g/cm3) Materia grasa* (g/100 cm3) Extracto seco no graso** (g/100g) Acidez (g de ácido láctico/100 cm3) Descenso crioscópico Proteínas totales (N x 6,38) (g/100g) Valores aceptados Métodos de análisis 1,028 a 1,034 AOAC 18th Ed. 925.22 Mín. 3 ISO 1211/IDF 001:2010 Mín. 8,2 ISO 6731/IDF 021:2010 0,14 a 0,18 AOAC 18th Ed. 947.05 Máx. -0,512 °C (equivalente a -0,530 °H) ISO 5764 – IDF 108:2009 ISO 8968 – 2 – IDF 0202:2001 Mín. 2,9 (*) En condiciones excepcionales podrá ser comercializada leche con un contenido graso inferior al 3% si la autoridad sanitaria provincial, previo estudio de evaluación, lo considera aceptable para su jurisdicción. En dicho caso el contenido de materia grasa deberá ser declarado en el rotulado con letras de buen tamaño, realce y visibilidad. 3 (**) Podrá ser expresado en su equivalente en g/100cm tomando para la conversión el valor de densidad (a 15°C) correspondiente. De estos puntos un gran problema que aqueja a la industria es la presencia de antibióticos utilizados en el tratamiento de enfermedades infecciosas en los animales. La presencia residual de antibióticos en la leche no solo genera un riesgo sanitario para los consumidores, sino también produce un perjucio para la industria láctea ya que interfiere en los procesos bacterianos necesarios para la elaboración de derivados de la leche como el queso y el yogur, inhibe el desarrollo del aroma de la manteca, entre otros efectos negativos. ANÁLISIS QUE SE REALIZAN A LA LECHE Las determinaciones que se realizan comúnmente en el análisis químico de la leche, permiten a) comprobar si sus valores responden a las características de composición genuina, b) poner al descubierto alteraciones del producto así como adulteraciones o fraudes y c) indicar el estado de conservación y pureza del producto y controlar el grado de conservación y grado de tratamiento térmico al que fue sometido. 4 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Un examen rutinario incluye frecuentemente las siguientes determinaciones: Control de calidad y genuinidad - Densidad - Materia Grasa - Sólidos totales - Acidez - Índice crioscópico - Contenido de Proteínas Control de contaminación microbiológica - Ensayo de Azul de Metileno o Resazurina Control de tratamientos térmicos Pasteurización - Ensayo de la fosfatasa - Ensayo de la peroxidasa Esterilización - Ensayo de turbidez Otras determinaciones que pueden requerirse en casos especiales son: - Contenido de Lactosa - Cenizas - Investigación de antibióticos - Aflatoxina M1 - Composición de ácidos grasos - Investigación de lípidos de origen vegetal - Presencia de metales pesados - Presencia de pesticidas - Presencia de nitritos y nitratos y otros conservantes - Examen microbiológico 5 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE LECHE Antes de tomar la porción para el análisis, llevar la muestra a una temperatura comprendida entre los 15 y 20 °C, mezclar por trasvase a otro recipiente limpio, repitiendo la operación hasta asegurar una muestra homogénea. Si no han desaparecido los grumos de crema, entibiar la muestra utilizando un baño de agua caliente hasta casi 38 °C, mezclar bien y luego enfriar hasta 15-20 °C. En caso de tener que medir algún volumen exacto para alguna determinación la leche debe estar a una temperatura entre los 15-20 °C antes de medir dicha porción. Observación: Como la leche se altera rápidamente por acción del tiempo, conviene proceder pronto a su análisis y si esto no fuera posible, se le añade un agente conservador. Los agentes conservadores utilizados con mayor frecuencia en el laboratorio son dicromato potásico (se añade aproximadamente 1 g por litro de leche), cloruro mercúrico* (se añade 0,03 g por litro de leche) y formol (se añaden 40 gotas por litro de leche). La leche conservada utilizando dicromato de potasio, no es apropiada para las determinaciones de acidez, peróxido de hidrógeno, nitratos y formaldehído. La adición de formol no interfiere en las determinaciones de densidad, sólidos totales, y cenizas. El uso de cloruro de mercurio (II) permite la investigación de nitratos. *Es altamente tóxico. 1. MEDIDA DE LA DENSIDAD DE LA LECHE Puede determinarse con balanza hidrostática, picnómetro o lactodensímetro a 15 °C, siendo este último el método de análisis especificado en el CAA. La medición de la densidad de la leche debe realizarse según el procedimiento y condiciones establecidos en el Método Oficial 925.22 de la AOAC ( Association of Official Analytical Chemists) (1990). La muestra de leche debe estar debidamente homogeneizada y enfriada a 15-20 °C, para que el error en la expresión de la densidad sea lo menor posible. Cuando se trate de leche recién ordeñada, la misma deberá permanecer unas 4 o 5 horas a aproximadamente 7 °C, antes de determinar la densidad. 6 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Se vierte la leche en condiciones de análisis en un recipiente cilíndrico, evitando la incorporación de aire y la formación de espuma. Una vez en el recipiente, se introduce el lactodensímetro de modo que ocupe la parte central del líquido (sin tocar las paredes ni el fondo del recipiente). Se espera a que alcance el nivel correspondiente y luego se lee la densidad cuidando de que la visual enrase con la superficie libre (menisco) de la leche. Leer la temperatura. El lactodensímetro de Quevenne es un tipo de lactodensímetro ampliamente difundido, cuyo vástago con escala graduada comprende valores entre 15 y 40 que corresponden a las milésimas de densidad por encima de la unidad. Es decir, que una lectura de 32, indica una densidad de la leche de 1,032. Este instrumento está calibrado a 15 °C y a esa temperatura por lo tanto, el número leído representa la densidad de la leche. A temperaturas diferentes, debe recurrirse a tablas especiales de corrección. Cuando la discrepancia respecto a los 15 °C no es mucha (NO MÁS de 5 °C), se puede obtener la corrección sumando o restando por cada grado de temperatura superior o inferior a 15 °C un valor de 0,0002 a la densidad hallada, según corresponda. Si la lectura se realiza a mayor temperatura se suma el factor de corrección tantas veces como °C de diferencia existan y si la medición se realiza a una temperatura inferior a los 15 °C el factor de corrección se resta. 2. CONTENIDO DE MATERIA GRASA DE LA LECHE La grasa que contiene la leche se encuentra en estado de emulsión lo que impide que pueda extraerse directamente mediante disolventes. Todos los procedimientos para la determinación de la misma exigen un tratamiento previo que permita que finalmente el éter, al ser agitado junto con la leche, disuelva fácilmente la grasa contenida en ella. Si bien los procedimientos para la determinación del contenido de grasa en leche son numerosos, se describirán los que dan buenos resultados y son más prácticos. 7 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA a) Método de Rösse-Gottlieb (MÉTODO DE REFERENCIA – ISO 1211 – IDF 001:2010) Es el método de referencia para la determinación del contenido de materia grasa de la leche entera, leches descremadas, dulce de leche, leche condensada, crema, leche en polvo, entre otros productos. El contenido en materia grasa se determina por previa acción una solución amoniacal-alcohólica que la libera la materia grasa de la muestra (por desagregación de las proteínas) y posterior extracción de la misma con ayuda de éter etílico y de éter de petróleo, evaporación de los disolventes, pesada de los residuos y cálculo en porcentaje del contenido graso de la leche, según el método gravimétrico que se describe a continuación. Reactivos: 1) NH4OH (δ=0,91) 2) Etanol 96° 3) Éter etílico (libre de peróxidos) 4) Éter de petróleo (punto de ebullición inferior a 65°C) 5) Agua destilada Procedimiento: 1) Transfiéranse 10 g de leche* a un tubo de extracción de Mojonnier (Figura 1) o tubo de Roehring. Si se utiliza una pipeta gravimétrica, la leche debe estar a 20 °C). *Pesos recomendados de muestra para la realización de la determinación Producto lácteo Peso en gramos Leche entera en polvo 1-1,1 Leche descremada en polvo 1,5-1,6 Nata, nata batida 2-3 Leche condensada azucarada 3-3,5 Leche condensada sin azucarar 4-5 Leche entera, leche desnatada 10-11 8 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Figura 1. Esquema del Tubo de extracción de Mojonnier 2) Adicionar 1,25 mL de NH4OH (2 mL si la muestra esta ácida) y mezclar bien. 3) Adicionar 10 mL de etanol y mezclar bien. 4) Agregar 25 mL de éter etílico, tapar con un tapón de caucho sintético y agitar vigorosamente durante un min. 5) Añadir 25 mL de éter de petróleo y repetir la agitación vigorosa. Nota 1: Puede adicionar unas gotas de solución de fenoltaleína si se desea para visualizar fácilmente la separación de las capas líquidas. 6) Centrifugar el tubo si es de Mojonnier, a aproximadamente 600 rpm, hasta que se aclare la porción superior del líquido o dejarlo en reposo hasta obtener el mismo resultado (el reposo también es válido cuando se utiliza el tubo de Roehring). 7) Decantar la fase etérea en una cápsula metálica o en un matraz adecuado. 8) Repetir la extracción de la fase acuosa remanente lavando el tubo de extracción, utilizando una mezcla a partes iguales de los disolventes orgánicos y decantando siempre la capa etérea, la cual se deja caer sobre la cápsula metálica o matraz 9 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA conteniendo el primer extracto. Repítase dos veces más la extracción, utilizando en cada caso, uno de los disolventes. 9) Evaporar los disolventes del extracto obtenido, a una temperatura que evite la proyección o derramamiento de la grasa y permita una evaporación eficiente (utilizando una placa calefactora o baño de agua termostatizado). 10) Secar el extracto en estufa hasta peso constante, enfriar y pesar. Calcular el % de grasa de la muestra. b) Método de Gerber Este método volumétrico muy difundido en el control de rutina de la leche y productos lácteos en general, consiste en la separación de la materia grasa por solución en ácido sulfúrico de todos los otros componentes de la leche, seguida de centrifugación en tubos especialmente calibrados. El método emplea también alcohol amílico que ayuda a romper la emulsión de las grasas y previene la carbonización de las mismas. Reactivos: 1) H2SO4 para Gerber (δ= 1,813 - 1,817 a 20 °C, aproximadamente 90%) 2) Alcohol amílico puro (δ= 0,809 - 0,813 a 20 °C, libre de grasas comprobado por un ensayo en blanco) Procedimiento: 1) Medir con pipeta 10 mL de H2SO4 para Gerber y colocarlos en el butirómetro, evitando mojar las paredes internas del cuello. 2) Agregar suavemente con pipeta aforada 11 mL de leche, cuidando que forme un estrato encima del ácido y no se mezcle con él. 3) Agregar 1ml de alcohol amílico inmediatamente. 4) Tapar el butirómetro con el tapón de caucho correspondiente y agitar en forma efectiva pero con mucha precaución (tener en cuenta que la temperatura se eleva drásticamente*). 10 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA 5) Sumergir el butirómetro en un baño de agua a 65 °C – 70 °C por 5 a 10 min, con el tapón hacia abajo. 6) Retirar el butirómetro del baño de agua, secar su superficie exterior y centrifugar por 3-5 min. La centrífuga consiste en un plato chato con el cual, mediante tubos metálicos, se adaptan los butirómetros dispuestos de forma tal que los tapones de cierre queden dirigidos hacia afuera, y la porción graduada, hacia el eje de la centrífuga. 7) Una vez centrifugado, volver la muestra al baño de agua por 4-5 min (butirómetro con el tapón hacia abajo). 8) Retirar del baño y leer inmediatamente el espesor de la capa grasa de leche acumulada en la parte superior calibrada del butirómetro. Por ajuste adecuado del tapón de cierre, se puede hacer coincidir la base de la columna de grasa, obteniéndose directamente el % de grasa de la leche. Si no es posible ajustar la superficie inferior de la columna de grasa a cero, se ajusta a la marca de % completo más próxima y se tiene en cuenta al efectuar la lectura del menisco superior. *Para proteger las manos del calor conviene tomar el butirómetro con un trapo o repasador, sujetando con el dedo pulgar el tapón de goma de manera firme. Los tres líquidos se mezclarán tras voltear varias veces el butirómetro. En algunos casos se forman coágulos persistentes que se eliminan agitando fuertemente, aunque siempre con precaución, un tiempo prudencial. Nota 1: Siendo dificultosa la separación de los pequeños glóbulos de grasa en las leches “homogeneizadas”, se recomienda volver a centrifugar después de calentar en el baño a 65-70 °C, procediendo así hasta que la lectura alcance un máximo constante. Nota2: Se recomienda la realización de este ensayo por duplicado simultáneo sirviendo, cada butirómetro, como contrapeso para el equilibrio de la centrífuga. 11 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA 3. EXTRACTO SECO NO GRASO Se determina por diferencia de los valores porcentuales de extracto seco y de contenido de grasas de la muestra (véase el punto 2). Constituye un valor constante para todas las leches, debido a que lo que más varía es el conjunto de sustancias que conforman los sólidos totales son las grasas de la leche. Determinación de Sólidos Totales (Extracto seco) (ISO 6731:2010 - IDF 21:2010) El extracto seco o contenido de sólidos totales de la leche está constituido por el residuo de la evaporación de las materias volátiles de la leche a la temperatura de ebullición del agua. Para el ensayo se agregan 7 a 8 g de arena calcinada a un cristalizador de diámetro no menor a 5 cm, quedando una capa fina de arena en el fondo del mismo. El conjunto se seca en estufa a 100 °C hasta peso constante. Se agregan al cristalizador 5 mL de leche mediante pipeta aforada y se lleva a evaporación a Baño María durante 10-15 min., exponiendo a la acción del vapor la máxima superficie del fondo del recipiente. Una vez producida la evaporación, se lleva el recipiente a una estufa a 98-100 °C hasta peso contante (3 horas o más). Enfriar en un desecador y pesar el residuo. Referir el residuo a % en volumen de muestra, reportándolo como sólidos totales. 4. pH y ACIDEZ DE LA LECHE (AOAC 947.05, 1990) El pH es una medida de la concentración de H+ en el medio. En numerosos alimentos el pH es un factor importante para su estabilidad, ya que es determinante en el crecimiento de grupos de microorganismos específicos. El pH de la leche se encuentra entre 6,6 y 6,8. La leche fresca, en estado normal, prácticamente no contiene ácido láctico y su acidez natural es debida a la presencia de CO2 disuelto y a los fosfatos, proteínas (principalmente caseínas) y citratos ácidos contenidos en la misma. Los valores normales de acidez de la leche oscilan entre 16 y 19 °D, que expresados en % de ácido láctico corresponde a 0,16 - 0,19 %. 12 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA La acidez de la leche puede verse afectada frente a un aumento en la concentración de ácido láctico en el producto (agriado), o bien ante ciertas adulteraciones como ser el aguado y la neutralización (agregado de bicarbonato de sodio) que pueden rebajarla considerablemente. Si la leche proviene de vacas con mastitis también puede presentar valores de acidez inferiores a 16 °D. El ácido láctico producido durante el agriado se debe fundamentalmente a la acción de ciertos microorganismos sobre la lactosa (fermentación ácido láctica). La medición potenciométrica del pH se raliza con un instrumento conocido como pHmetro el cual mide la diferencia de potencial entre dos electrodos: un electrodo de referencia (generalmente de plata; cloruro de plata) y un electrodo de vidrio que es sensible a los H+. Los resultados obtenidos utilizando estos aparatos representan una medida muy exacta, tanto en la valoración del pH de una solución, como también en la búsqueda del punto final de la titulación en la determinación de la acidez. En la práctica, hay que saber que antes de cada uso, el pH-metro debe ser calibrado. Para ello se utilizan soluciones tampón de pH conocido (pH 7 y pH 4). La medida potenciométrica del pH de la leche presenta un inconveniente. Como hemos mencionado con anterioridad, la leche es una emulsión de glóbulos de grasa dispersos en una solución acuosa. La grasa láctea puede depositarse sobre el electrodo del equipo, aislándolo del medio y haciendo que no se registre ninguna respuesta. Por este motivo, es importante diluir la leche con suficiente agua destilada para evitar la formación de la película grasa. Otro método para medir pH es el uso de papeles o cintas indicadoras impregnadas con una mezcla de indicadores que cambian de color según el pH de la solución ensayada. Cabe destacar que los resultados obtenidos mediante el uso de cintas reactivas son menos exactos y que este tipo de métodos, a diferencia del potenciométrico, constituyen medidas semi-cuantitativas. 13 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Medición potenciométrica del pH de la leche Procedimiento: Colocar en un Erlenmeyer 25 mL de la muestra y diluirlos con 25 mL de agua destilada. Homogeneizar correctamente. Dejar estabilizar y calibrar el pH-metro de acuerdo a las instrucciones del aparato (para la calibración usar soluciones buffer pH 7 y 4). Los electrodos deben mantenerse sumergidos en agua destilada y lavarse cuidadosamente, antes y después de cada uso, con agua destilada (secar el exceso con papel tissue, cuidando no frotar el electrodo). Realizar la lectura del pH de la muestra (agitar la muestra después de la primera lectura y repetir las mediciones hasta que dos lecturas coincidan cercanamente; la precisión entre los resultados de dos determinaciones consecutivas debe ser de 0,10 de pH) Determinación de la acidez titulable de la leche Reactivos: 1) Solución alcohólica de Fenoftaleína al 1 % 2) NaOH 0,1 N (disolver 4 g de hidróxido sódico en 500 mL de agua destilada y agitar hasta la disolución total. Llevar la solución hasta 1000 mL en un matraz aforado. Homogeneizar bien. Valorar la solución.) Procedimiento: Colocar en un Erlenmeyer 25 mL de leche, agregar 1 mL de solución de fenolftaleína y titular con una solución de NaOH 0,1 N hasta obtener coloración rosada de forma permanente (que perdure por 30 s). Utilizar 25 mL de leche colocados en un Erlenmeyer como blanco de referencia. El punto final de la valoración ácido base también puede ser evaluado utilizando un medidor digital de pH (medición potenciométrica). En este caso, previo a la titulación diluir la muestra de leche con agua destilada (50:50) para evitar la formación de una capa grasa en el electrodo que impida realizar la medición. 14 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Cálculos: La acidez se expresa en g % ácido láctico en 100 mL de leche (% ácido láctico p/v) Nota 1: Un mL de NaOH 0.1 N es igual a 0,0090 g de ácido láctico. Nota 2: Para expresar la acidez en grados Dornic (°D) (forma común en la industria láctea), se multiplica el resultado en % ácido láctico por 100. 5. DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE CRIOSCÓPICO DE LA LECHE: Método crioscópico (ISO 5764 – IDF 108:2009) El método crioscópico es el método más rápido y más exacto para detectar la adición de agua a la leche. Este método se basa en el hecho que, a condiciones normales de presión, el agua pura se congela a los 0 °C. Si al agua pura le agregamos algún soluto, el punto de congelación de esa solución será inferior a los 0°C. La diferencia entre los puntos de congelación de la solución y el solvente puro se denomina descenso crioscópico y es directamente proporcional a la concentración de soluto en la solución. La leche, por poseer diversas sustancias en solución, tiene un punto de congelación inferior al del agua pura. La adición de agua a la leche diluye a las sustancias presentes en la porción acuosa (suero), produciéndose un aumento en el punto de congelación del producto. Generalmente la temperatura a la cual se congela la leche ronda los -0,550 °C y se considera una constante fisiológica que varía dentro de límites muy reducidos ya que depende de la presión osmótica de la secreción láctea, la cual depende a su vez de la presión osmótica de la sangre del animal del cual proviene la leche. El punto de congelación de la leche varía notablemente sólo cuando a la leche se le adiciona agua. Así, el punto de congelación de una leche con 10% de agua está en -0,495 °C y una leche con 20% de agua está en -0,440°C. El Código Alimentario Argentino establece un índice crioscópico máximo de -0,512 °C (-0,530 °H, grados Horvet) para la leche. Valores superiores indican que el producto ha sido adulterado por adición de agua. 15 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Como ya hemos mencionado, el descenso crioscópico normal de la leche se debe a la presencia de lactosa y sales minerales, mientras que las grasas y las proteínas no influyen de manera significativa sobre esta propiedad. Sin embargo, la acidificación debida a la fermentación de la lactosa aumenta el descenso crioscópico por la formación de moléculas de soluto en el medio. Por esta razón, si la acidez titulable de la muestra supera 0,18 g% ácido láctico/100 mL de leche, el resultado puede subestimar la cantidad real de agua agregada a la muestra. Por encima de ese valor de acidez titulable es necesario aplicar un factor de corrección. La determinación del punto de congelación puede realizarse con crioscopios de diferentes tipos. Anteriormente, el crioscopio de Horvet-Beckman que utiliza éter y una mezcla de hielo y sal, era ampliamente utilizado. Actualmente se utilizan instrumentos con equipos de refrigeración más compactos y sofisticados que indican de manera digital el punto de congelación (en °C o °H) y/o % de agua añadida a la muestra, adecuándose a las normas internacionales ISO 5764 IDF 108:2009. 6. CONTENIDO DE PROTEÍNAS DE LA LECHE. Método de Kjeldahl (ISO 8968:1 – IDF 020:1, 2014) Es el método de referencia para la determinación de proteínas en leche de vaca entera, descremada, parcialmente descremada, quesos duros, semi duros y blandos, leche en polvo, fórmulas para lactantes e infantes, entre otros productos lácteos. El método de Kjeldahl mide el nitrógeno orgánico total y se basa en la digestión de la materia orgánica de la muestra utilizando ácido sulfúrico concentrado caliente. Para elevar el punto de ebullición del ácido se añade una mezcla catalizadora, que normalmente contiene un verdadero agente catalítico (mercurio, cobre o selenio) junto con sulfato de potasio o sulfato de sodio. Todo el nitrógeno orgánico se convierte en amoníaco, que se suele medir mediante titulación. Este método no dosa nitratos ni nitritos pues, en las condiciones del ensayo, se volatilizan como ácidos nítrico y nitroso. 16 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Los detalles de la técnica y su realización se desarrollan en la Guía de TP SUSTANCIAS NITROGENADAS. 7. MÉTODOS PARA DETERMINAR EL GRADO DE CONTAMINACIÓN DE LA LECHE Ensayo del azul de metileno Constituye una prueba química que indica, dentro de ciertos límites, el grado de contaminación de la leche y sus condiciones para la conservación. El ensayo puede considerarse como complementario del examen microbiológico o sustitutivo del mismo en primera instancia, siendo más rápido que el recuento en placa y sus resultados más reproducibles. La prueba se basa en que cuando se añade una pequeña cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37 °C, se produce una decoloración debida al metabolismo bacteriano (reducción del azul de metileno); la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al número de gérmenes presentes. Reactivos: 1) Solución acuosa de azul de metileno diluida. Se prepara disolviendo azul de metileno en alcohol 96 ° hasta saturación, y diluyendo luego, 5 mL de esta solución saturada en 195 mL de agua estéril. Una vez preparada, la solución debe guardarse al abrigo de la luz y puede ser utilizada hasta por 2 meses. Procedimiento: En un tubo de ensayo de boca ancha (30 - 40mm de d) estéril se vierten 40 mL de leche previamente tratada como se indicó en el apartado PREPARACIÓN DE LA MUESTRA, tratando de no mojar las paredes interiores del tubo. Se agrega con una pipeta estéril 1 mL de la solución de azul de metileno. Con precauciones asépticas, se tapona el tubo con un tapón o una torunda de algodón estéril y se lo coloca en un baño de agua termostatizado a 37 – 38 °C, cuidando que el nivel del agua del baño exceda al de la leche en el tubo y al abrigo de la luz (especialmente la luz solar directa). Obsérvese el tiempo necesario para que se 17 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA produzca la decoloración (tiempo en que se decolora la totalidad de la leche del tubo o bien, tiempo en que se decolora hasta unos 5 mm de la superficie). Las trazas de color que suelen producirse en el fondo del tubo de ensayo, pueden ser ignoradas mientras no se extiendan hacia arriba más de 5 mm. Como criterio de comparación que indique cuando puede considerarse completa la decoloración puede utilizarse un tubo de control. El tubo control puede prepararse sumergiendo en agua hirviendo durante 3 min, un tubo de ensayo del tipo utilizado en la prueba conteniendo 40 mL de leche. En base al tiempo transcurrido hasta la decoloración, se puede concluir sobre el estado de conservación y pureza de la muestra: LECHE MUY MALA: si no se conserva el color por más de 20 min. LECHE MALA: Si el color se conserva de 20 min a 2 h. LECHE MEDIOCRE: Si el color se conserva de 2 a 5 h. LECHE BUENA: Si el color se conserva por más de 5 h. 8. CONTROL DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS ENSAYOS DE CONTROL DE LA PASTEURIZACIÓN a) Ensayo de la Fosfatasa Las fosfatasas se encuentran invariablemente en la leche cruda y las mismas son destruidas o inactivadas a la combinación de temperatura y tiempo aceptados como satisfactorios para la pasteurización de la leche, ya que son enzimas bastante sensibles a la acción del calor. Se ha demostrado así mismo que las fosfatasas son más difíciles de destruir que los microorganismos patógenos más resistentes al calor que pudieran estar presentes en la leche (por ejemplo el bacilo de la tuberculosis). El test de la fosfatasa involucra la incubación de la muestra de leche con un sustrato, en condiciones de temperatura y pH convenientes para la acción enzimática. Si la leche contiene fosfatasa, ésta catalizará la liberación de fenol del sustrato. El fenol liberado por reacción química con un reactivo específico, producirá una coloración que resultará 18 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA proporcional a la concentración de fosfatasa presente en la leche, la que no fue destruida durante el proceso de pasteurización u otro tratamiento térmico, si lo hubo. Las técnicas presentadas a continuación son oficiales y se encuentran totalmente estandarizadas, permitiendo obtener resultados cuantitativos por comparación con estándares permanentes de fenol. En el TP se realizará un método rápido adaptado para ensayo de rutina, que consiste en una modificación del clásico método AOAC. PRECAUCIONES QUE DEBEN TOMARSE PARA LA REALIZACIÓN DEL ENSAYO: - Todo el material de vidrio deberá limpiarse adecuadamente inmediatamente antes de realizarse en ensayo. - Para cada muestra de leche deberá utilizarse una pipeta diferente, evitando además la introducción de saliva (contiene la enzima). Usar una pipeta con algodón en su extremo superior. - No realizar el test con exposición a la luz solar directa. - Evitar en todo momento el contacto del material con sustancias que puedan contener fenol (ej. tapones plásticos fenólicos). - Para tomar la muestra, la leche deberá mezclarse previamente hasta que no se observe la separación de crema en su superficie. Si el ensayo no se efectúa inmediatamente, guardar la muestra en el refrigerador y entibiar antes de la prueba, para poder homogeneizarla bien. Reactivos: 1) Solución al 0,3 % de 2,6-dicloroquinonclorimida (CQC) ó 2,6- dibromoquinoncloroimida (BQC) en etanol. 2) Solución reguladora de CO3Na2 CO3NaH 3) Solución sustrato de fenilfosfato disódico. Procedimiento: 1) Colocar 5 mL de leche en un tubo de ensayo y dejarlos a 37-44 °C durante 10 min. 19 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA 2) Agregar 5 mL de la solución sustrato reguladora, tapar el tubo y mezclar por inversión varias veces. Incubar por 10 min a 37-44 °C. 3) Hervir el contenido del tubo y dejar enfriar. 4) Una vez enfriado agregar 6 gotas de la solución al 0,3 % de 2,6dicloroquinonclorimida, agitar bien y a los 5-10 min realizar una observación del color. El ensayo realizado de la manera descrita constituye una determinación cualitativa que permite distinguir entre leche sometida a un correcto tratamiento térmico de pasteurización y la leche no tratada. Una reacción negativa (leche sin fosfatasa, es decir, pasteurizada o tratada térmicamente) da como resultado un color pardo gris. Una reacción positiva (color azul), que acuse actividad de la enzima fosfatasa, puede indicar: -Leche cruda - Leche sometida a tiempo y/o temperatura inferior a los requeridos para una correcta pasteurización. - Leche pasteurizada mezclada con leche cruda (detecta pequeñas cantidades). Junto con las muestras deben procesarse un control positivo y un control negativo. Control positivo: agregar 0,1 mL de leche cruda a 100 mL de leche hervida. Sino disponemos de leche cruda, agregar una gota de fenol 0,005 % por mL de leche hervida. Control negativo: colocar 5 mL de leche en un tubo e introducir un termómetro. Calentar como mínimo un minuto en baño caliente luego que el termómetro indique temperaturas entre 80-90 °C. Agitar el contenido para garantizar la inactivación en todo el volumen de leche. Nota 1: El aguado y el descremado influyen sobre los resultados de este ensayo. En la leche aguada, a mayor dilución, menor es la intensidad del color azul en los casos positivos. En las leches descremadas los positivos son más débiles debido a mayor concentración de las fosfatasas en la porción cremosa. 20 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA b) Ensayo de la Peroxidasa Es un método cualitativo, capaz de poner en evidencia la presencia de la enzima peroxidasa mediante la aparición de color tras una reacción química. La enzima peroxidasa presente en la leche descompone el H2O2 produciendo H2O y O2. El O2 liberado reacciona con el reactivo bencidina (compuesto incoloro) y la convierte en una sustancia de color azul, siendo la intensidad de la coloración proporcional a la concentración de la enzima en la leche. La enzima peroxidasa, por ser más termorresistente que la fosfatasa alcalina (se inactiva a temperaturas superiores a los 80 °C), permanece activa tras los procesos de pasteurización del tipo LTLT (Low Temperature Long Time). Cuando la leche es pasteurizada mediante procesos de alta temperatura, la enzima se inactiva no apareciendo color tras 30 s de la reacción con bencidina. Reactivos: 1) Solución de bencidina al 4 % p/v en alcohol 96° 2) Agua oxigenada de 10 vol. 3) Ácido acético glacial p.a. Procedimiento: 1) Colocar 5 mL de leche en un tubo de ensayo. 2) Agregar 1 mL de la solución alcohólica de bencidina y 2 a 3 gotas de ácido acético glacial (cantidad suficiente como para coagular las caseínas). 3) Agitar y añadir por las paredes del tubo 1 mL de agua oxigenada. 4) Observar la coloración dentro de los 30 segundos siguientes. Resultados: - Desarrollo de un color azul intenso dentro de los 30 s posteriores a la mezcla de los reactivos: LECHE CRUDA O TRATADA A BAJA TEMPERATURA. - No desarrollo de color azul dentro de los 30 s posteriores a la mezcla de reactivos: LECHE CALENTADA A 80 °C O MÁS. 21 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA Nota 1: Si aparece coloración azul luego de transcurridos 30 s a partir de la mezcla de reactivos, la reacción es inespecífica. CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN DE LA LECHE a) Ensayo de Turbidez de Aschanfenburg-Pien Las albúminas presentes en la leche se desnaturalizan al alcanzar una temperatura de 80 °C. Esto, hace que precipiten junto con las caseínas cuando se adicionan sales o ácidos inorgánicos a la leche. Si luego de precipitar las proteínas de la leche por adición de sulfato de amonio hasta saturación, el sobrenadante presenta turbidez visible al calentarse, la esterilización fue deficiente. Reactivos: 1) Sulfato de amonio Procedimiento: 1) Agregar a 10 mL de leche hidróxido de amonio hasta saturación (aproximadamente 2 g de la sal). 2) Agitar bien y dejar en reposo durante 5 min. 3) Filtrar el contenido del tubo y recoger aproximadamente 5 mL del filtrado en un tubo de ensayo. 4) Llevar el tubo a Baño María por 5 min. Resultados: - Si se observa floculación tras el calentamiento, se trata de una leche que no ha sido esterilizada. - Si no se observa turbidez, se trata de una leche que fue esterilizada. Nota 1: Esta determinación no es útil para leches UHT ya que puede dar falsos positivos (leve turbidez). 22 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA 9. RECONOCIMIENTO DE SUSTANCIAS AÑADIDAS A LA LECHE PARA SU CONSERVACIÓN La leche abandonada a si misma experimenta la fermentación láctica, coagulándose espontáneamente o por acción del calor si la alteración no es aún muy pronunciada. Para evitar este fenómeno se añaden a la leche diferentes sustancias, siendo las más corrientes: el bicarbonato y el carbonato de sodio, el ácido bórico, el ácido salicílico, el ácido benzoico, el aldehído fórmico, el agua oxigenada, etc. Todas estas adiciones están prohibidas en la leche destinada a consumo público pues de los estudios realizados sobre el tema se dedujo que los antisépticos químicos si bien impiden la fermentación láctica o la retardan, dando a la leche un aspecto análogo al de la leche fresca, no impide la propagación y desarrollo de otros gérmenes. En esta guía se describirán sólo tres determinaciones: a) Investigación de la presencia de bicarbonato y carbonato de sodio A la leche no se le puede agregar grandes cantidades de estas sustancias sin que adquiera un sabor alcalino o jabonoso desagradable. La leche adicionada con bicarbonato sódico ofrece reacción alcalina sensible que puede ponerse de manifiesto utilizando: a) Una solución alcohólica de ácido rosálico al 1 % b) Una solución de alizarina en alcohol 90 ° al 2%. Para operar con el primer reactivo, se añaden 10 mL de leche, volumen igual de alcohol y unas gotas de la solución de ácido rosálico. Si la leche tiene álcali, se forma una coloración rosada. La leche pura da un color amarillento. Si se usa la solución de alizarina, que es muy sensible, se añaden a 10 mL de leche 20 gotas de reactivo. La leche con adición de carbonatos alcalinos, toma una coloración rosada y la leche pura se colorea en amarillento. En caso de dudas el método más recomendado consiste en determinar la cantidad de anhídrido carbónico presente en las cenizas de la leche (las cenizas de la leche pura nunca exceden un 2 % de anhídrido carbónico). 23 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA b) Investigación de la presencia de formaldehído Ensayo de Hehner Reactivos: H2SO4 90-94 % con vestigios de Cl3Fe Procedimiento: Se diluyen 10 mL de leche con igual volumen de agua en un tubo de ensayo ancho. Luego, con una pipeta se deja deslizar por las paredes lentamente y evitando la mezcla el reactivo. Se realiza esto de manera que se formen 2 capas y en la superficie de contacto de las mismas se producirá una coloración violeta (con apariencia exterior de anillo) si existe formaldehído en la leche. Nota 1: También se suele detectar la presencia de formaldehído en la leche realizando el método para grasas de Gerber utilizando H2SO4 con trazas de Cl3Fe. Nota 2: La coloración violeta no aparece ante grandes cantidades de formaldehído. c) Investigación de la presencia de peróxido de hidrógeno Método 1 (Gluco-cinta): Agregar una gota de leche sobre un trozo de 1-1,5 cm de Gluco-cinta (posee o-toluidina, glucosa oxidasa y peroxidasa). La presencia de H2O2 da lugar a la formación de un compuesto coloreado. Debe observarse la coloración de la gluco-cinta luego de unos minutos. Si permanece amarilla, no hay H2O2 en la leche. Método 2: Colocar 10 mL de muestra en un tubo de ensayo. Adicionar de 10 a 20 gotas de reactivo de vanadio. Agitar. Si la muestra posee H2O2 aparecerá una coloración rosada o roja. Reactivo de vanadio: disolver 1 g de óxido de vanadio (V) (V2O5) en 100 mL de una solución diluida de ácido sulfúrico (6 mL de H2SO4 94% en 94 mL de agua). 24 Universidad Nacional de Misiones Cátedra de Bromatología y Nutrición BIOQUÍMICA Y FARMACIA BIBLIOGRAFÍA RECOMEDADA Código Alimentario Argentino (2014). Artículos: 553 al 642 - Alimentos Lácteos. AOAC Official Methods of Analysis (1990) AOAC Official Methods Volumen 2. Dairy Products. Hart, E.L. y Fisher, H.J. 1971. Análisis Moderno de los Alimentos. (traducción). Ed. Acribia. Zaragoza, España. Kirk R.S., R. Sawyer y H. Egan. 2000. Composición y Análisis de los Alimentos de Pearson. 2da Edición. C.E.C.S.A. México. 25
