SEMANA 10 LOGRO A MEDIR Describir las concentraciones de las fracciones lipídicas en sangre y sus alteraciones. Resultado de la prueba de colesterol Nombre de la prueba En el rango Colesterol total Fuera de rango Rango de referencia 207 125- 200mg\dl Hdl colesterol 81 >or=40mg\dl Triglicéridos 76 <150mg\dl Ldl colesterol 101 <130mg\dl MARCO TEÓRICO: El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos. Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolémicos. ARTERIOSCLEROSIS ARTERIA NORMAL FLUJO SANGUÍNEO ARTERIA OBSTRUIDA PLACA ARTERIOSCLERÓTICA actualmente es necesario conocer la distribución de las lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad), considerada como el “factor protector” LDL (lipoproteínas de baja densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones biológicas inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y los resultados de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como índices predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL. LDL vs HDL MALO (LDL) Se acumula en las artrias bloquea el flujo sanguíneo BUENO(HDL) Regula el almacenamiento del LDL y promueve su excreción ARTERÍA PLACA ATEROSCLERÓTICA (acumulación ldl) COMIDA COLESTEROL - LDL HIGADO HECES COLESTEROL - HDL ARTERIAS MATERIAL DIDÁCTICO: DESARROLLO DE LA PRÁCTICA: EXPERIMENTO A:DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO CEH: COLESTEROL ESTERASA Fundamentos del Método: COD: COLESTEROL OXIDASA POD: PEROXIDASA El colesterol es oxidado enzimáticamente por colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis enzimática de los ésteres COLESTEROL ESTER DE COLESTEROL ÁC. GRASOS mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa COLESTEROL 4- COLESTENONA del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinonimina roja 4-AMINOFENAZONA FENOL con absorbancia máxima a 505 QUINONIMINA nm. PROCEDIMIENTO: En tres tubos colocar: Tubos TUBOS BLANCO ESTANDAR MUESTRA ESTANDAR … 20UL … MUESTRA … … 20UL REACTIVO DE TRABAJO 2ML 2ML 2ML 2000 uL Reactiv o 20 uL Standa r 2000 uL Reactiv o 2000 uL Reactiv o 20 uL Muesr a B S 2 3 M 1 4 Incubar 10 minutos en baño de agua a 37ºC. Leer en el espectrofotómetro a 505 nm. B 5 M S 6 7 CALCULO DE RESULTADOS: Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor de calibración. Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg% mg% colesterol = 𝐴𝑏𝑠. 𝑀 𝐴𝑏𝑠.𝑆 Conc. S VALORES DE REFERENCIA: Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y de ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores “normales”, pues la norma promedio de una población no necesariamente refleja ausencia de riesgo patológico en el caso de colesterol. Menos de 200 mg% 200mg% a 239 mg% Mayor de 240 mg% valor deseable valor frontera (moderadamente elevado) valor elevado Experimento B: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO Fundamentos del Método El presente es un método birreactivo homogéneo para la determinación de HDLcolesterol. 1. En la primera etapa de la reacción se solubiliza y consume el colesterol libre asociado a proteínas distintas de HDL, en una reacción que involucra a colesterol oxidasa (CHO) y catalasa (CAT), dando lugar a un producto no coloreado. 2. En una segunda etapa, un agente específico (azida) bloquea la acción de CAT y un detergente solubiliza específicamente las HDL. 3. El HDL-colesterol es así liberado para reaccionar con colesterol esterasa (CHE), CHO, 4-AAP (4-amino antipirina) y N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3toluidina disódica (TOOS), dando un producto coloreado que se lee a 540600 nm. LDL. VLDL. QUILOMICRONES QUILOMICRONES PRODUCTOS INCOLOROS DE LDL, VLDL Y HDL- COLESTEROL HDL- COLESTEROL SOLUBILIZADA HDL- COLESTEROL COLEST-4-EN-3-ONA+H2 O2 H2O2 + TOOS +4-AAP DESARROLLO DE COLOR PROCEDIMIENTO • En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo Precipitante. Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. • Dejar 15 minutos en refrigeración. No colocar en el congelador. • Centrifugar a 3000 rpm. • Usar el sobrenadante como muestra. precipitado 500 Ul suero 50 Ul precipitante SOBRENADANTE HDL PROCEDIMIENTO: En tres tubos colocar: TUBOS BLANCO ESTANDAR MUESTRA ESTANDAR … 20UL … SOBRENADANTE … … 100UL REACTIVO DE TRABAJO 2ML 2ML 2ML 2000 uL Reactiv o 20 uL Standa r 2000 uL Reactiv o 2000 uL Reactiv o 100 uL sobrenadant e B S 2 3 M 1 4 Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC. Leer en el espectrofotómetro a 505 nm. B 5 M S 6 7 CALCULO DE RESULTADOS: Calcular la concentración de colesterol HDL en suero, aplicando el método del factor de calibración. Considerar que la concentración del standard de colesterol HDL es de 47.6 mg% VALORES DE REFERENCIA mg% HDL colesterol = 𝐴𝑏𝑠. 𝑀 𝐴𝑏𝑠.𝑆 Conc. S Los valores esperados de HDL-colesterol son los siguientes: Varones: 30 - 70 mg/dl Mujeres: 30 - 85 mg/dl El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de HDL - colesterol: 40 - 60 mg/dl Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. No obstante, valores mayores de 40 mg/dl se consideran recomendables y los que se encuentren por encima de 60 mg/dl se han considerado como protectores. Por el contrario, valores de HDL-colesterol por debajo de 40 mg/dl se consideran como índice significativo de riesgo de enfermedad cardíaca coronaria. Experimento C: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO Fundamentos del Método El presente método es un ensayo homogéneo sin precipitación, en dos pasos. En el primero, se agrega un tensoactivo (Reactivo A) que solubiliza las partículas lipoproteìcas no-LDL. El colesterol liberado es consumido por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una reacción sin desarrollo de color. Un segundo tensoactivos (Reactivo B) solubiliza las partículas de LDL formándose, por la presencia de enzimas y un Reactivo cromogénico, un color proporcional a la cantidad de LDL colesterol presente en la muestra. PROCEDIMIENTO • En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y añadir 0,1 ml de Reactivo Precipitante. Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C. Centrifugar a 3000 rpm. Usar el sobrenadante como muestra. precipitado 200 Ul suero 100 Ul precipitante SOBRENADANTE LDL PROCEDIMIENTO: En tres tubos colocar: TUBOS BLANCO ESTANDAR MUESTRA ESTANDAR … 20UL … SOBRENADANTE … … 100UL REACTIVO DE TRABAJO 2ML 2ML 2ML 2000 uL Reactivo 2000 uL Reactiv o 2000 uL Reactivo 20 uL Standar 100 uL sobrenadante B S 2 3 M 1 4 Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC. Leer en el espectrofotómetro a 505 nm. B 5 M S 6 7 CALCULO DE RESULTADOS : LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración) La concentración del standard es de 62.4 mg%. VALORES DE REFERENCIA Riesgo bajo o nulo: Menor de 129 mg% Riesgo moderado: 130 a 189 mg% Riesgo elevado : ≥190 mg% No obstante, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Se tomo la muestra a un paciente para determinar el colesterol total, HDL y LDL obteniéndose las lecturas de las absorbancias de los diferentes tubos debidamente rotulados. Realizar los cálculos: Blanco = 0.048 Estándar = 0.345 Muestra colesterol = 0.246 Muestra HDL = 0.295 Muestra LDL = 0.187
