UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE AGRONOMÍA PROYECTO “Azospirillum brasilense, microorganismo fijador de nitrógeno en gramíneas” PRESENTADO POR: ROYS ALARCÓN HERNÁNDEZ, ERLIN CARRERA CARRERA, YERSON CABANILLAS QUISPE, KARIN COLORADO ARAUJO, MAYELI NÚÑEZ HERNÁNDEZ ASESOR: Ing. EDUARDO TORRES CARRANZA CAJAMARCA – PERÚ 1 Índice Índice ................................................................................................................................................. 2 Resumen ........................................................................................................................................... 3 I. Introducción............................................................................................................................. 4 II. Objetivos................................................................................................................................... 6 2.1. Objetivo general.............................................................................................................. 6 2.2. Objetivos específicos .................................................................................................... 6 Marco teórico....................................................................................................................... 7 III. 3.1. Antecedentes de investigación .................................................................................. 7 3.2. Bases teóricas................................................................................................................. 9 3.2.1. Aspectos generales de Azospirillum brasilense ........................................... 9 3.2.2. Obtención de Azospirillum brasilense ........................................................... 10 Resultados y discusión .................................................................................................. 12 IV. 4.1. Efectos de Azospirillum brasilense en cultivos ................................................... 12 4.1.1. Colonización de las raíces ................................................................................. 12 4.1.2. Asociación bacteria-planta ................................................................................ 12 4.1.3. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal ...................................... 12 4.1.4. Efectos de inoculación (PGPR) ........................................................................ 13 V. Conclusiones......................................................................................................................... 14 VI. Referencias bibliográficas ............................................................................................. 15 2 Resumen Azospirillum se trata de una rizobacteria cosmopolita, capaz de promover el crecimiento vegetal de una variedad de cultivos de interés agronómico. En la actualidad se conocen 21 especies, siendo la más estudiada Azospirillum brasilense. Se ha reportado el efecto del uso de la bacteria en cultivos de maíz, habiéndose determinado el mismo en parámetros como ser la altura de la planta y el tamaño radicular, incluido un aumento de la cantidad de nitrógeno fijado de la atmósfera. De forma similar, en cultivos de sorgo y trigo, se ha reportado un beneficio significativo en peso de materia seca de la planta, relacionado con el aumento en el rendimiento de grano por hectárea. El mecanismo principal por el cual Azospirillum mejora el crecimiento vegetal es la producción de fitohormonas, principalmente el ácido-3-indol acético (AIA), el cual es generado en la planta, y le otorga acción en diversas funciones. 3 I. Introducción Para evitar o minimizar el impacto del uso de los fertilizantes químicos en el ambiente es necesario contar con información básica acerca de los requerimientos nutricionales específicos de los cultivos y de la eficiencia relativa de las distintas fuentes de fertilizantes. Con la finalidad de aportar los elementos requeridos para el crecimiento de las plantas y del estatus nutricional actual de las tierras de cultivo. El empleo de fertilizantes nitrogenados puede ser reducido de manera sustancial por la aplicación de algunas medidas, tales como un preciso estudio del estatus actual del suelo, la aplicación de microorganismo benéficos del suelo, así como una mayor utilización de especies leguminosas. El nitrógeno es uno de los elementos esenciales en la nutrición de las plantas, siendo uno de los factores limitantes más comunes en la producción del cultivo (Paredes 2013). Este elemento es considerado como el motor de crecimiento de la planta. Una vez que la planta absorbe este nutriente lo acumula como nitrato en los tejidos de la hoja, y es el encargado de motorizar la síntesis del complejo hormonal del crecimiento. En las últimas décadas, la producción agrícola ha aumentado, trayendo consigo consecuencias para el medio ambiente y en este sentido, las fuentes de contaminación por nitratos en suelos y aguas (superficiales y subterráneas), se asocian mayoritariamente a actividades agrícolas con la utilización de fertilizantes inorgánicos (García et al. 2011). Una solución alternativa para reducir estos problemas ambientales y aumentar la rentabilidad del cultivo es la asociación de plantas con bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) que existen en el suelo. De este modo, el uso de alternativas sostenibles para la nutrición vegetal, a ejemplo de la exploración del potencial de la fijación biológica de nitrógeno atmosférico (FBN), se vuelve fundamental para aumentar la productividad de las plantas. La FBN es realizada por las bacterias diazotróficas, comúnmente conocidas como bacterias promotoras de crecimiento de plantas (BPCPs). La FBN ocurre por la conversión del 4 nitrógeno atmosférico (N2) en otras sustancias nitrogenadas, con incorporación por la planta através de la síntesis de proteína y ácidos nucleicos. Melgar y Torres (2007) sostienen que existen asociaciones importantes que han demostrado un potencial económico alto, como el caso de la asociación de cultivos con Azospirillum, pudiendo suplir hasta el 20% a 30% de nitrógeno que la planta necesita. Aunque en el caso particular de Azospirillum, está demostrado que el efecto beneficioso de la asociación es debido mayoritariamente a la capacidad que posee la bacteria de producir fitohormonas que determinan un mayor desarrollo del sistema radicular y, por tanto, la posibilidad de explorar un volumen más amplio del suelo. A continuación, detallaremos temas relacionados con el Azospirillum y su múltiple importancia en los cultivos. 5 II. Objetivos 2.1. Objetivo general Analizar los efectos de Azospirillum brasilense como microorganismo fijador de nitrógeno en gramíneas. 2.2. Objetivos específicos Caracterizar morfológicamente las bacterias seleccionadas como promotoras de crecimiento vegetal. Explicar el proceso de fijación de nitrógeno de la bacteria en cultivos de gramíneas. Describir el efecto promotor de crecimiento vegetal de la bacteria Azospirillum brasiliense. 6 III. Marco teórico 3.1. Antecedentes de investigación 3.1.1. Impacto de la inoculación con Azospirillum brasilense sobre el flujo interno de N y C en plantas jóvenes de cebada. Se observó que la inoculación con A. brasilense aumentó el peso seco de las hojas y del vástago de las plantas jóvenes de cebada independientemente del estatus de N de las mismas. Al estudiar los diferentes tejidos, se observó en las raíces un mayor contenido de nitratos y proteínas en las plantas inoculadas, pero sólo en aquellas cultivadas con alto contenido de N evidenciándose así una interacción entre estos parámetros; no observándose diferencias en los contenidos de aminoácidos y azúcares (Ciolfi, F., Contino, J., y Criado, M. 2017). 3.1.2. Efecto promotor del crecimiento vegetal de cepas de Azospirilum s.p. en el cultivo de arroz El género Azospirillum ha sido utilizado como agente promotor del crecimiento vegetal, debido a su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico y producir auxinas del tipo ácido indolacético. Se emplearon cepas nativas aisladas y de referencia, a las que se les determinó su capacidad de producir compuestos indólicos mediante la técnica colorimétrica derivada de Salkowski y la capacidad de fijación de nitrógeno, mediante el ensayo de reducción de acetileno. Se obtuvieron resultados positivos para todas las cepas, que resultaron productoras de compuestos indólicos en un rango de 2,75-8.6 µg. mL-1 y con una capacidad de fijar nitrógeno de 164.17-384.9 nmol.h-1·5 mL-1 (Heydrich, Mayra & Hernández, Annia, 2007). 7 3.1.3. Impacto de Azospirillum brasilense, una rizobacteria que estimula la producción del ácido indol acético como el mecanismo de mejora del crecimiento de las plantas en los cultivos agrícolas. Azospirillum brasilense presenta una alternativa en la recuperación de suelos erosionados, debido a su efecto benéfico en inoculación de cultivos de interés agronómico. El mecanismo principal de este efecto es debido a fitohormonas como el AIA del cual se conoce las rutas dependientes de aminoácido triptófano (TRP) y se propone una ruta independiente de él. Sin embargo, se desconocen aún diversas características de la ruta que abren posibilidad a futuras investigaciones en la manipulación de la misma (Saavedra, D., Martínez, H., Rosero, C., Cuenca, G., Fernández, R., y Moreira, A. 2017). 3.1.4. Biofertilización de Azospirillum spp. y rendimiento de grano de maíz, sorgo y trigo. La biofertilización de Azospirillum spp. demostró beneficios potenciales únicamente en la producción de grano de sorgo, en particular las cepas de A. brasilense VS7 y VS-9 al tener un efecto 55 y 49% superior que el testigo fertilizado con nitrógeno. Estos resultados también demostraron la afinidad existente entre cepa y genotipo vegetal, una relación que merecer mayor atención en trabajos de investigación por desarrollar (Rangel, J., Ramírez, R., Cervantes, F., Mendoza, M., García, E., y Rivera, G. 2014). 8 3.2. Bases teóricas 3.2.1. Aspectos generales de Azospirillum brasilense El nombre Azospirillum proviene del francés Azote, que significa nitrógeno y del grupo Spirillum, pequeña espiral. Es una bacteria alfa-proteobacteria gran negativa, fijadora de nitrógeno, descrita por primera vez en Brasil (en una publicación en 1978) por el grupo de Johanna Döbereiner. A. brasilense es capaz de fijar nitrógeno en presencia de niveles bajos de oxígeno, lo que lo convierte en un diazótrofo microaeróbico (Parra, Y., y Cuevas, F. 2001). La morfología de las células depende de las condiciones nutricionales y edad del cultivo. Se observan formas eses y vibroides de 0.8 a 1 x 2 a 5 micrómetros de tamaño; se asocia además la aparición de formas quísticas o en C, como vía de resistencia a las condiciones de estrés y del mismo modo como mecanismo de supervivencia en la rizosfera. Contienen gránulos de poli-ß-hidroxibutirato (PHB) como material de reserva y un sistema muy eficiente de adquisición de hierro a través de sideróforos, que le permite secuestrarlo en la rizosfera (Parra, Y., y Cuevas, F. 2001). Igualmente, la presencia de una respuesta quimiotáctica a diferentes compuestos, asociada a la existencia de vías metabólicas alternativas, convierten a Azospirillum en un organismo competitivo y nutricionalmente versátil, pues le permiten consumir una amplia variedad de ácidos orgánicos, azúcares, aminoácidos y compuestos aromáticos que se encuentran disponibles en la rizosfera (Parra, y. 2001). 9 3.2.2. Obtención de Azospirillum brasilense Las bacterias del género Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raíz de una muy amplia variedad de plantas y de sus rizosferas, incluyendo cereales como maíz, trigo, arroz sorgo y avena. La adaptación de Azospirillum al futuro ambiente rizosférico probablemente se inicia con la germinación de las semillas, la cual exuda infinidad de compuestos orgánicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudación de compuestos será a través de las raíces durante el desarrollo de la planta (Martos, P. 2012). 3.2.2.1. Aislamiento Azospirillum es aislado de la rizosfera de una gran variedad de plantas y pastos forrajeros como Poa pratensis. El medio de cultivo utilizado universalmente para obtener un óptimo crecimiento de este género bacteriano corresponde a un sustrato denominado NFb (nitrogen free broth) utilizando malato como fuente de carbono. Las bacterias después haber sido cultivadas en sustrato NFb, se siembran en un agar selectivo, para bacterias del género Azospirillum, denominado rojo congo ácido málico, donde las colonias adquieren una coloración rojo escarlata, consistencia seca y abundante crecimiento (Schoebitz, M. 2006). 3.2.2.2. Identificación El género Azospirillum presenta una morfología vibroide, pleomorfismo y movimiento en espiral. Posee un flagelo polar y corresponde a bacterias Gram negativas. Estas bacterias se caracterizan por que son 10 Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), son fijadoras biológicas de nitrógeno (FBN), además por su producción de fitohormonas y su capacidad para adherirse a cualquier sistema de raíces. Respecto, a las sustancias responsables de provocar el efecto promotor del crecimiento vegetal corresponden a: auxinas, giberelinas y citoquininas (Schoebitz, M. 2006). 11 IV. Resultados y discusión 4.1. Efectos de Azospirillum brasilense en cultivos 4.1.1. Colonización de las raíces Se da gracias a que Azospirillum posee un flagelo polar que lo utiliza para desplazarse en medios líquidos, mediante el cual migra hacia las raíces y se adhiere a la superficie radicular. Bajo condiciones de medios sólidos se induce la expresión de múltiples flagelos laterales. Son estas estructuras laterales las que permiten a la bacteria adherirse a las raíces. Sin embargo, el éxito colonizador de Azospirillum reside en el proceso indispensable llamado “quimiotaxis”. Un evento que da lugar a una fuerte atracción entre las bacterias con las raíces de las plantas a través de sus propios exudados radiculares. Entre los compuestos que se ven involucrados están el malato, succinato y fructosa (Schoebitz, M. 2006). 4.1.2. Asociación bacteria-planta Los lugares de colonización de Azospirillum corresponden a las áreas de elongación celular en la zona radical y las bases de los pelos radiculares. Los compuestos responsables de la asociación efectiva entre planta-bacteria son las proteínas y polisacáridos de la membrana exterior de Azospirillum (Schoebitz, M. 2006). 4.1.3. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal Está relacionado con la fijación biológica del nitrógeno, el cual promueve el crecimiento de cereales y pastos forrajeros. Asimismo, se atribuye a la liberación de fitohormonas, responsable del mejor crecimiento de maíz y de la parte aérea de las plantas. Siendo el mecanismo más estudiado la producción de auxinas, especialmente el ácido indol acético (AIA). Mismo que es producido por las 12 bacterias logrando un aumento en el contenido de fitohormonas de las plantas, generando la estimulación del crecimiento (Schoebitz, M. 2006). En cuanto a la síntesis del AIA, esta dado por las bacterias PGPR. La importancia de esta auxina se concentra en la contribución del “pool” endógeno de hormonas de la planta, imitando el efecto de la aplicación de AIA exógeno. Es así como, el AIA bacteriano estimularía el desarrollo del sistema radical y el crecimiento general de la planta huésped. Cabe mencionar identificaremos bacterias altamente productoras de auxinas cuando promuevan la formación de raíces laterales o el desarrollo de pelos absorbentes (Schoebitz, M. 2006). 4.1.4. Efectos de inoculación con Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) En la inoculación a pastos y cereales forrajeros se han obtenido efectos positivos, tales como: aumento en rendimiento de granos y contenido de materia seca. En cuanto, a los efectos de inoculación en campo son positivos, cuando existen niveles intermedios de fertilización NPK, indicando que la inoculación de bacterias promotoras de crecimiento vegetal no reemplaza la fertilización artificial. No obstante, mejora su utilización, incrementando los niveles de productividad con un menor gasto de fertilizante. La inoculación con A. brasilense en gramíneas en condiciones de campo provocó el incremento en la altura de las plantas y aumento en el rendimiento de grano y paja. Mientras que, en gramíneas se identificaron aumentos en elongación, superficie radicular y peso seco de raíz (Schoebitz, M. 2006). 13 V. Conclusiones La inoculación con A.brasilense modifica el flujo interno de N en las plantas jóvenes . Sin embargo, si bien la inoculación con esta cepa aumenta la tasa de exportación de aminoácidos de manera independiente a la disponibilidad de N en el suelo, modifica el contenido de proteínas en los diferentes tejidos según el estatus de N. El Azospirillum posee un flagelo polar que lo utiliza para desplazarse en medios líquidos, mediante el cual migra hacia las raíces y se adhiere a la superficie radicular residiendo en una “quimiotaxis”. Los compuestos responsables de la asociación efectiva entre planta-bacteria son las proteínas y polisacáridos de la membrana exterior de Azospirillum. Azospirillum brasilense al ser una bacteria cosmopolita le otorga el beneficio de competir a nivel de la rizosfera frente a otros microorganismos. A. brasilense se caracteriza como Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), fijadores biológicos de nitrógeno (FBN), además por su producción de fitohormonas y su capacidad para adherirse a cualquier sistema de raíces 14 VI. Referencias bibliográficas Acebo, Y., Rives, N., Heydrich, M., y Hernández, A. (2007). Efecto promotor del crecimiento vegetal de cepas de Azospirillum sp. En el cultivo de arroz. Revista de cultivos tropicales de INCA, 28(3), pp. 29-32. Ciolfi, F., Contino, J., y criado, M. (2017). Impacto de la inoculación con Azospirillum brasilense sobre el flujo interno de N y C en plantas jóvenes de cebada. Revista de Agrotecnia. Martos, P. (2012). Estudio sobre la influencia de la inoculación de las rizobacterias Azospirillum bransilense y Pseudomonas fluorescens sobre el desarrollo morfológico y el contenido de aceites esenciales en las especies aromáticas ocimum basilicum var. genovese, ocimum basilicum var. mínimum, petroselinum sativum var. lisa y salvia officinalis (Tesis de pregrado). Universidad Politecnica de Madrid, Madrid. Parra, Y., y Cuevas, F. (2001). Potencialidades de azospirillum como inoculante para la agricultura. Revista cultivos tropicales de INCA, 23(3), pp. 31-41. Rangel, José., Ramírez, R., Cervantes, F., Mendoza, M., García, E., y Rivera, G. (2014). Biofertilización de Azospirillum spp. y rendimiento de grano de maíz, sorgo y trigo. Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias, 46(2), pp. 231-238 Universidad Nacional de Cuyo Mendoza, Argentina 15 Saavedra, D., Martínez, H., Rosero, C., Cuenca, G., Fernández, R., y Moreira, A. (2017). Rizobacterias que promueven el desarrollo e incremento en productividad de Glycine max L. Revista Ciencia y Tecnología, 10(1), 7-15 Schoebitz, M. (2006). Aislamiento y caracterización de bacterias promotoras de crecimiento vegetal de la rizósfera de Lolium perenne L. de suelo volcánico (modelo género Azospirillum spp) (Tesis de pregrado). Universidad Austral de Chile, Chile. 16
