398716153-GTC-78-PREPARACION-DE-MEEDIOS-DE-CULTIVO-pdf

GUÍA TÉCNICA
COLOMBIANA
GTC
78
2002-08-28
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS
PARA ANIMALES.
GUÍA PARA LA PREPARACIÓN Y PRODUCCIÓN
DE MEDIOS DE CULTIVO. GUÍA GENERAL PARA
EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA LA
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN
EL LABORATORIO
E:
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS.
GUIDELINES
OF
PREPARATION
AND
PRODUCTION OF CULTURE MEDIA- PART 1 GENERAL
GUIDELINES ON QUALITY ASSURANCE FOR THE
PREPARATION
OF
CULTURE
MEDIA
IN
THE
LABORATORY
CORRESPONDENCIA:
esta guía es una adopción idéntica
(IDT) por traducción de la ISO/TS
11133-1:2000 Microbiology of food and
animal feeding stuffs-guidelines of
preparation and production of culture
media. Part 1. General guidelines on
quality assurance for the preparation of
culture media in the laboratory.
DESCRIPTORES:
microbiologia de alimentos; análisis
microbiológico; alimento para animales;
alimento.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado
14237
Bogotá,
D.C.
Tel.
6078888
Fax
2221435
Prohibida su reproducción
Editada 2002-09-16
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional
de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
l ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector
gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los
mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La GTC 78, fue ratificada por el Consejo Directivo el 2002-08-27.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través
de su participación en el Comité Técnico 000031 de Microbiología.
ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A.
ALPINA S.A.
ASINAL LTDA
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE
MICROBIOLOGÍA
AVESCO
BAVARIA S.A.
BIOCONTROL
BIOQUILAB LTDA
CENICAÑA
COMPAÑÍA NACIONAL DE
CHOCOLATES S.A.
COOPERATIVA DE GANADEROS DE
CARTAGENA LTDA.
CREPES & WAFLES
FRIGORÍFICO SUIZO S.A.
GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
INGENIO PROVIDENCIA S.A.
INSTITUTO COLOMBIANO
AGROPECUARIO
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
IVONNE BERNIER LABORATORIO
LTDA.
LABORATORIO BIOCONTROL
LESNIAK E.U
LEVAPAN S.A.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE
COLOMBIA S.A.
NULAB LTDA.
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE
FLUIDOS LTDA.
QUIOS LTDA.
TRES M. COLOMBIA S.A.
UNIVERSIDAD JAVERIANA
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
ALGARRA S.A.
AQUALAB
ALGARRA
AQUALAB
ASESORIAS MICROBIOLÓGICAS
AVESCO
CONSULTORA BEATRIZ DEL PILAR
MACÍAS
CARULLA VIVERO S.A.
CASA LUKER S.A.
CERVECERÍA LEONA
COLOMBINA S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE LEVADURAS
LEVAPAN
CONGELAGRO
CONSULTORIAS MICROBIOLÓGICAS
DISA S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ
FABRICA DE ESPECIAS Y
CONDIMENTOS EL REY
FRESENIUS MEDICAL CARE
FRIGORIFICOS COLOMBIANOS S.A.
FRIGORIFICOS SUIZO S.A.
CONSULTOR NARDA PABÓN
CONSULTOR MARIA CLEMENCIA MORA
CONSULTOR ANA MARÍA MORALES
INGENIO PICHICHI S.A.
INGENIO PROVIDENCIA
INGENIO RIOPAILA
INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA
DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS
INVIMA
LABORATORIO PROCALIDAD
LABORATORIOS GRAM
LLOREDA GRASAS S.A.
MINISTERIO DE SALUD
NESTLE DE COLOMBIA S.A.
PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL
PASSIFLORA COLOMBIANA S.A.
PRODUCTORA DE JUGOS S.A
QUALA S.A.
QUIOS LTDA.
RICA RONDO
TECNIMICRO LABORATORIO DE
ANÁLISIS
UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PÚBLICA
UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
VIKINGOS S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
GTC 78
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES.
GUÍA PARA LA PREPARACIÓN Y PRODUCCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.
GUÍA GENERAL PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LA
PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio de microbiología, muchos ensayos y procedimientos dependen de que los
medios de cultivo sean homogéneos y produzcan resultados reproducibles. Los medios de
cultivo se usan con todas las técnicas de cultivo tradicionales y también en muchas técnicas
alternas. En el comercio se pueden obtener muchas fórmulas de medios de cultivo, y en la
literatura se describen muchas más, diseñadas para fines de crecimiento específico. Además,
en los laboratorios donde se hacen exámenes microbiológicos de alimentos, el objetivo
principal es mantener, resucitar, hacer crecer, detectar y/o enumerar una gran variedad de
microorganismos. Los requisitos del medio son específicos tanto para la muestra como para los
organismos que se detectarán. Los medios de cultivo que cumplan criterios establecidos de
desempeño son, por lo tanto, un requisito previo de cualquier trabajo microbiológico confiable.
Es aconsejable hacer suficientes ensayos para demostrar: i) la aceptabilidad de cada lote del
medio; y ii) que el medio es “adecuado para el fin”; y iii) que el medio pueda producir resultados
consistentes.
Estos tres criterios son parte esencial de los procedimientos de control interno de calidad y, con
la documentación adecuada, permitirán una vigilancia efectiva del medio de cultivo y
contribuirán a la producción de datos tanto precisos.
1.
OBJETO
Esta guía proporciona la terminología general relacionada con el aseguramiento de la calidad
en la preparación de medios de cultivo, y especifica los requisitos mínimos para un análisis
microbiológico de productos destinados al consumo humano o de alimento para animales.
Estos requisitos se aplican a tres categorías de medios de cultivo usados en los laboratorios
donde se preparan o se usan medios de cultivo para análisis microbiológicos:
-
medios fabricados comercialmente y listos para usar;
-
medio preparado a partir de fórmulas deshidratadas disponibles comercialmente
(bien sea un medio completo para recuento en placa como por ejemplo agar
Plate Count o un medio basal al cual se le agregan suplementos como por
ejemplo agar Baird-Parker); y
1
GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
2.
GTC 78
medio preparado por componentes individuales.
REFERENCIAS NORMATIVAS
Esta guía incorpora, con referencias fechadas o no fechadas, disposiciones provenientes de
otras publicaciones. Tales referencias normativas se citan en los lugares adecuados del texto y
las publicaciones aparecen a continuación. En el caso de referencias fechadas, solamente se
harán correcciones o revisiones a esta guía cuando se corrijan o revisen dichas referencias.
Para referencias no fechadas se aplica la última edición de la publicación de referencia.
EN 1659:1996, In Vitro Diagnostics Sistems. Culture Media for Microbiology. Terms and
Definitions.
EN 12322:1999, In Vitro Diagnostics Medical Devices. Culture Media for Microbiology.
Performance Criteria for Culture Media.
ISO 8402:1994, Quality Management and Quality Assurance-Vocabulary
3.
TERMINOLOGÍA
3.1
GENERALIDADES
Esta sección contiene las definiciones generales relacionadas con aseguramiento de la calidad,
así como diferentes grupos de terminología relacionada con medios de cultivo y cultivos de
control (cepas de referencia). Las normas citadas entre paréntesis indican que el texto es
idéntico al citado.
3.2
TERMINOLOGÍA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
3.2.1
aseguramiento de la calidad
todas las actividades, programadas y sistemáticas, implementadas como parte del sistema de
calidad, las cuales demuestran según necesidades, la suficiente confianza en que esa entidad
cumplirá los requisitos de calidad.
[ISO 8402]
3.2.1.1
parte de la gestión de la calidad orientada a proporcionar confianza respecto al cumplimiento
de los requisitos de la calidad.
3.2.2
control de calidad
técnicas y actividades operativas que se usan para cumplir los requisitos de calidad.
[ISO 8402].
3.2.3
control interno de la calidad
programa continuo del control del trabajo del laboratorio, preparado por el mismo y basado en
el análisis y seguimiento del control y, si fuera necesario, acciones correctivas.
2
GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
GTC 78
3.2.4
lote de medio de cultivo
unidad de un medio susceptible de investigación hasta sus orígenes, relacionada con una
cantidad definida de producto en bruto, producto terminado o final, la cual tiene una clase y
calidad homogénea y ha satisfecho los requisitos de producción (control del proceso) y los
ensayos de aseguramiento de la calidad, se ha producido dentro de un período de producción
definido y se le ha asignado el mismo número.
[EN 12322]
3.2.5
desempeño del medio de cultivo
la respuesta de un medio de cultivo a los organismos de ensayo, en condiciones definidas.
3.3
TERMINOLOGÍA DEL MEDIO DE CULTIVO
3.3.1
medio de cultivo
fórmula de sustancias, en forma líquida, semisólida o sólida, formada por constituyentes
naturales y/o sintéticos, diseñados para resistir la multiplicación o preservar la viabilidad de los
microorganismos.
NOTA Cuando este término se usa en relación con palabras compuestas, con frecuencia se expresa como “medio”
(por ejemplo, medio enriquecido).
[EN 1659]
3.3.2
medio de cultivo clasificado por composición
3.3.2.1
medio de cultivo definido químicamente
medio de cultivo formado únicamente por constituyentes definidos químicamente (por ejemplo,
estructura molecular y grado de pureza conocidos).
[EN 1659]
3.3.2.2
medio de cultivo químicamente incompleto
medio de cultivo formado total o parcialmente por materiales naturales, procesados, o de otra
forma, cuya composición química no está totalmente definida.
NOTA Para los distintos componentes químicamente indefinidos que se usan en los medios de cultivo,
ISO/TC34/SC9 especifica designaciones armónicas
Véase el Anexo A.
3.3.3
clasificación del medio de cultivo según la consistencia
3.3.3.1
medio de cultivo líquido
medio de cultivo formado por una solución acuosa con uno o varios constituyentes (por
ejemplo, agua peptonada, caldo nutritivo).
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GTC 78
NOTA 1
En algunos casos se agregan partículas sólidas al medio de cultivo líquido.
NOTA 2
El medio líquido en tubos, frascos o botellas se conoce, frecuentemente, como “caldo”.
[EN 1659]
3.3.3.2
medio de cultivo sólido y semisólido
medio de cultivo líquido, el cual contiene materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar,
gelatina, etc.) en diferentes concentraciones.
NOTA 1 Debido al uso mundial de medios de cultivo solidificados con agar-agar, con frecuencia se usa el término
“agar” como sinónimo de medio de cultivo sólido y, por lo tanto, en relación con adjetivos, por ejemplo: “agar para
recuento en placa”.
NOTA 2 Con frecuencia, los medios de cultivo sólidos, vertidos en cajas petri, se denominan comúnmente
“placas”. Además, los medios de cultivo sólidos, vertidos en tubos que permanecen en posición inclinada mientras se
solidifica el medio, se conocen como “inclinados”.
[EN 1659]
3.3.4
clasificación según su uso
3.3.4.1
medio de transporte
medio de cultivo diseñado para preservar y mantener la viabilidad de microorganismos durante
el período entre la toma de la muestra y su procesamiento en el laboratorio.
[EN 1659]
NOTA Usualmente, el medio de transporte contiene sustancias que no permiten la multiplicación de
microorganismos pero aseguran su preservación (por ejemplo, medio de transporte Stuart o Amies).
3.3.4.2
medio de preservación
medio de cultivo desarrollado para la preservación y el mantenimiento de microorganismos
durante largos periodos de tiempo, que permite la recuperación después de este período (por
ejemplo, medio de huevo Dorset).
3.3.4.3
medio de resucitación
medio de cultivo que permite a microorganismos estresados y lesionados repararse y recuperar
su capacidad de crecimiento normal sin promover necesariamente su multiplicación.
[EN 1659]
3.3.4.4
medio de enriquecimiento
medio de cultivo predominantemente líquido, el cual debido a su composición, proporciona
condiciones particularmente favorables para la multiplicación de los microorganismos.
[EN 1659]
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3.3.4.4.1
medio de enriquecimiento selectivo
medio que promueve el crecimiento de microorganismos específicos, al tiempo que inhibe, total
o parcialmente, el crecimiento de otros microorganismos (por ejemplo, medio RappaportVassiliadis).
3.3.4.4.2
medio de enriquecimiento no selectivo
medio enriquecido, el cual promueve el crecimiento de la mayoría de los microorganismos (por
ejemplo, caldo nutritivo).
3.3.4.5
medio de aislamiento
medio de cultivo sólido o semisólido, el cual promueve el crecimiento de microorganismos.
3.3.4.5.1
medio de aislamiento selectivo
medio que promueve el crecimiento de microorganismos específicos, al tiempo que inhibe otros
microorganismos (por ejemplo, agar PALCAM, agar MacConkey).
[EN 1659]
3.3.4.5.2
medio de aislamiento no selectivo
medio que no está diseñado para inhibir selectivamente microorganismos (por ejemplo, agar
nutritivo).
[EN 1659]
3.3.4.6
medio diferencial
medio de cultivo que permite el ensayo de una o varias características fisiológicas o
bioquímicas de los microorganismos para su identificación (por ejemplo, medio de urea, agar
Kligler).
NOTA Los medios diferenciales que se pueden usar como medio de aislamiento, se conocen como medio de
aislamiento o diferencial (por ejemplo, agar xilosa-lisisna-desoxicolato XLD).
[EN 1659]
3.3.4.7
medio de identificación
medio de cultivo diseñado para producir una reacción específica de identificación, que no
requiere ningún ensayo adicional para confirmación.
NOTA El medio de identificación que se puede usar como medio de aislamiento se conoce como medio de
aislamiento o identificación.
[EN 1659]
3.3.4.8
medio de múltiples usos
medios de cultivo a los cuales se les puede asignar distintas categorías; Ej.: el agar sangre es
un medio de resucitación, de acuerdo con el numeral 3.3.4.3; un medio de aislamiento, de
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acuerdo con el numeral 3.3.4.5; y un medio diferencial, de acuerdo con el numeral 3.3.4.6, el
cual se usa para detectar hemólisis.
3.3.5
clasificación del medio de cultivo según el método de preparación
3.3.5.1
medio listo para usar
medio de cultivo suministrado en recipientes listos para usar (por ejemplo, cajas Petri o tubos u
otros recipientes):
-
un medio completo listo para usar;
-
un medio incompleto al cual se agregan componentes hábiles al momento de usarlo.
3.3.5.2
medio de cultivo preparado con fórmulas comerciales deshidratadas
medio de cultivo seco que no está listo para usar inmediatamente (por ejemplo, en polvo,
granulado, productos liofilizados). La rehidratación dará una de dos clases de medio:
-
Medio completo listo para usar;
-
Medio incompleto al cual se agregan componentes hábiles al momento de
usarlo.
3.3.5.3
medio de cultivo preparado en el laboratorio con componentes individuales
3.4
TERMINOLOGÍA PARA LOS ORGANISMOS DE ENSAYO
3.4.1
generalidades
se trata de microorganismos utilizados, generalmente, para control de calidad y ensayo del
comportamiento del medio de cultivo. Se definen de acuerdo con su fuente, así:
3.4.2
cepa de referencia
microorganismo definido, por lo menos, en cuanto a género y especie, catalogado y descrito de
acuerdo con sus características y, preferiblemente; con la indicación de su origen.
[EN 12322]
3.4.3
cepa madre
un conjunto de cultivos separados e idénticos, obtenidos en el laboratorio a partir de un solo
subcultivo de la cepa de referencia, bien sea en el laboratorio o de un proveedor.
[EN 12322]
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3.4.4
cultivo de trabajo
un subcultivo primario de un stock de la cepa de referencia (3.4.3)
4.
PRÁCTICAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
4.1
DOCUMENTACIÓN
4.1.1 Documentación requerida del fabricante
Se recomienda que el fabricante suministre los siguientes detalles:
-
nombre del medio, componentes individuales y cualquier suplemento, así como
sus códigos de producto;
-
códigos del lote;
-
valor pH del medio antes de usarlo;
-
información de almacenamiento y fecha de vencimiento;
-
cualquier ensayo de evaluación de comportamiento y el organismo de ensayo
utilizado;
-
hoja de datos técnicos;
-
certificado de control de calidad;
-
datos de seguridad y/o riesgos, cuando sea necesario.
4.1.2 Lista de verificación del laboratorio
Verificaciones del laboratorio al recibir el medio:
4.2
-
nombre del medio y código del lote;
-
fecha de recibo;
-
fecha de vencimiento;
-
condición e integridad del envase.
ALMACENAMIENTO
4.2.1 Generalidades
En todos los casos, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante, cuando estén
disponibles, relacionadas con las condiciones de almacenamiento, fecha de vencimiento y uso.
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4.2.2 Gestión y control de calidad de medios deshidratados y suplementos
Usualmente, el medio se compra al fabricante. Se entregan en forma de polvo deshidratado o
gránulos, en recipientes sellados, los suplementos de las distintas sustancias selectivas o de
diagnóstico vienen en forma liofilizada o líquida. Sin embargo, es aconsejable programar la
compra para que haya una rotación regular de existencias (por ejemplo, lo primero que entra es
lo primero que sale). Para mantener un inventario eficiente, se aconseja que las verificaciones
adicionales incluyan:
-
nueva verificación del sello;
-
fecha cuando se abrió inicialmente;
-
evaluación visual del contenido de los envases abiertos.
Especialmente, después de abrir un envase nuevo, la calidad del medio dependerá del
ambiente del almacenamiento. El cambio en el flujo del polvo, la falta de homogeneidad,
apelmazamiento, el cambio de color, etc., indican pérdida de calidad del medio deshidratado.
Es aconsejable desechar cualquier medio deshidratado que haya absorbido humedad o
muestre cambios obvios de su apariencia física.
4.2.3 Medio suministrado comercialmente y listo para usar
Se siguen las instrucciones del fabricante con respecto de las condiciones de almacenamiento,
la fecha de vencimiento y el uso.
4.2.4 Medio preparado con fórmulas deshidratadas, disponibles comercialmente, y
componentes básicos individuales
La vida útil de esta clase de medios es variable. Por lo tanto, es difícil indicar los límites
generales de tiempos de almacenamiento de los medios preparados. Las normas
internacionales o nacionales específicas pueden estipular las condiciones de la vida útil.
Se aconseja proteger los medios de cultivo esterilizados, dispensados en cajas, tubos o frascos
y los reactivos que no se usen inmediatamente, contra la luz y la desecación.
Es aconsejable mantener en un refrigerador no más de 3 meses, o a temperatura ambiente no
más de 1 mes, en condiciones que eviten modificaciones en su composición, los medios
estériles, parcialmente completos, como, por ejemplo, los medios a los cuales se agregan los
componentes finales inmediatamente antes de usarlos; excepto si se ha establecido una fecha
de vencimiento, o si la norma nacional o internacional lo especifica. Sin embargo, se
recomienda que los medios a los cuales se han agregado suplementos lábiles selectivos, se
usen el mismo día que se preparan. Se recomienda no guardar los medios sólidos que
contengan reactivos químicos y/o substancias lábiles, para volverlos a fundir.
Es recomendable que no se usen los lotes de medios que presenten características como
cambios de color, signos de evaporación, deshidratación, o crecimiento microbiano,
Se recomienda que, antes de usar o antes de calentar adicionalmente, se equilibre el medio de
cultivo a la temperatura ambiente.
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GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
4.3
GTC 78
PREPARACIÓN DEL MEDIO EN EL LABORATORIO
4.3.1 Generalidades
La preparación exacta del medio de cultivo es uno de los pasos fundamentales del examen
microbiológico con el cual se recomienda especial cuidado.
Se respetarán las buenas prácticas de laboratorio y se seguirán las instrucciones del fabricante
para el manejo de medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que
contengan materiales peligrosos como, por ejemplo, sales biliares y otros agentes selectivos.
Cuando se prepare el medio con formulaciones comerciales deshidratadas, se recomienda
seguir las instrucciones del fabricante en forma precisa. Se recomienda documentar todos los
datos relevantescomo, por ejemplo, peso/volumen, pH, fecha de preparación, condiciones de
esterilización, operario.
Cuando se trate de medios preparados con componentes individuales, se recomienda seguir
exactamente la fórmula y registrar todos los detalles, como se indica en el numeral 4.2.1,
además de la identificación completa como, por ejemplo, código y número de lote de todos los
componentes que se usen.
4.3.2 Agua
Se recomienda usar agua destilada o agua de calidad equivalente, es decir, libre de
substancias que pudieran inhibir o influenciar el crecimiento de microorganismos en las
condiciones del ensayo. Si el agua destilada se prepara con agua clorada, se recomienda
neutralizar el cloro antes de destilarla.
Se aconseja guardar el agua destilada en recipientes fabricados, preferiblemente, con
materiales inertes (vidrio neutro, polietileno, etc.), y del cual se debe demostrar, antes de su
uso inicial, que está libre de cualquier sustancia inhibitoria.
NOTA
En algunos casos puede ser necesario usar agua recién preparada, libre de dióxido de carbono disuelto.
Para considerar que el agua destilada es de buena calidad, es aconsejable que ésta tenga una
resistividad no inferior a 300 000 Ωcm.
PRECAUCIÓN
El agua procesada por intercambio de iones (desionizada) puede tener
un alto contenido de microorganismos; por lo tanto, no es aconsejable usar esta agua sin
verificar que el contenido de microorganismos en el agua sea bajo. Se recomienda consultar
con el fabricante la mejor manera de reducir al mínimo la contaminación microbiana. El agua
desionizada esterilizada por filtrado todavía puede contener sustancias que inhiben el
crecimiento de ciertos microorganismos. Ref. ACTM aguas para laboratorio.
4.3.3 Pesaje y rehidratación
Se pesa cuidadosamente la cantidad adecuada de medio deshidratado (teniendo cuidado de
no inhalar el polvo, especialmente cuando el medio contiene substancias tóxicas) y se agrega
progresivamente la cantidad necesaria de agua, evitando que se formen grumos.
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GTC 78
4.3.4 Disolución y dispersión
Se aconseja disolver el medio deshidratado rápidamente mezclando instantánea y
repetidamente con calentamiento posterior, si fuera necesario. El medio que contiene agar se
debe dejar hidratar antes de calentar y luego mezclar para disolverlo. Cuando el medio se
prepare con componentes individuales, es aconsejable agregar cada componente por separado
y dejar disolver antes de completar el volumen definitivo.
4.3.5 Medida y ajuste del pH
Se mide el pH con un medidor de pH y se ajusta, si es necesario: por ejemplo, cuando el medio
se prepara en el laboratorio con componentes individuales para que, después de esterilizar y
enfriar a 25 ºC el medio tenga el pH requerido ± 0,2 unidades de pH, excepto si se requiere otra
cosa. Normalmente, el ajuste se hace con una solución de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l)
de Hidróxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de ácido
clorhídrico (HCl).
NOTA Los medios fabricados comercialmente pueden presentar cambios significativos de pH, antes y después de
pasarlos por el autoclave. Sin embargo, siempre y cuando se use agua destilada o desionizada, de buena calidad,
no deberá ser necesario ajustar el pH antes de pasar por el autoclave.
4.3.6 Vertido
Se vierte el medio en los recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del
medio.
4.3.7 Esterilización
4.3.7.1 Generalidades
Se puede esterilizar el medio de cultivo y los reactivos por calor húmedo (véase el numeral
4.3.7.2), o se puede esterilizar por filtración (véase el numeral 4.3.7.3 ).
Para ciertos medios no es necesario esterilizar en autoclave, sino que se pueden usar después
de hervirlos. Por ejemplo, los medios para Enterobacteriaceae que contienen verde brillante
son particularmente sensibles al calor y a la luz, es aconsejable enfriarlos rápidamente después
de hervirlos y protegerlos de la luz fuerte. Además, algunos reactivos se pueden usar sin
esterilizar (véase la respectiva norma nacional, internacional o las instrucciones del fabricante).
4.3.7.2 Esterilización por calor húmedo
La esterilización por calor húmedo se hace en un autoclave o preparador de medio. La
operación en el autoclave demora, generalmente, 15 min a 121 °C. Cuando los volúmenes son
superiores a 1 000 ml, se adapta el ciclo de esterilización como sea necesario. En todos los
casos se recomienda seguir las instrucciones contenidas en la norma internacional, nacional o
las instrucciones del fabricante. Se recomienda monitorear el comportamiento del autoclave
para asegurar que se alcanza la temperatura deseada en condiciones típicas de carga. Se
recomienda, para tal fin, el uso de cinta indicadora y termocuplas.
NOTA Se puede presentar exceso de calentamiento cuando se procesan grandes volúmenes de medio (>1 000 ml) en
un autoclave.
Es esencial controlar la eficacia de la esterilización.
10
GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
GTC 78
Después de calentar, es esencial enfriar el medio de manera que se evite el exceso de
ebullición. Esto es importante con medios sensibles, como, por ejemplo, volúmenes medios,
grandes y medio para Enterobacteriaceae.
4.3.7.3 Esterilización por filtración
Se puede esterilizar por filtración en condiciones de vacío o a presión. Se usan membranas y
los elementos del filtro estériles con un diámetro de poro de 0,22 µm. Se siguen las
instrucciones del fabricante con respecto al uso de los elementos del filtro o a las membranas
compradas ya esterilizadas. Las distintas partes del aparato de filtrado, ensambladas o no, se
esterilizan en el autoclave durante 15 min a 121 °C. Si es necesario, se pueden ensamblar en
forma aséptica en una cámara de flujo laminar, después de esterilizar en el autoclave.
NOTA Algunas membranas de filtro pueden retener proteínas (por ejemplo antibióticos). Para obtener la
concentración correcta, se recomienda que el usuario humedezca previamente el filtro.
4.3.7.4 Monitoreo
Después de esterilizar, por autoclave, hirviendo o filtrando, se recomienda monitorear todos los
medios, en particular con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia.
4.3.8 Preparación de suplementos
Se recomienda manejar con cuidado los suplementos fabricados que contienen agentes
tóxicos, para evitar la dispersión del polvo, el cual puede causar reacciones alérgicas u otra
clase de reacciones al personal del laboratorio. Se recomienda tomar las precauciones
necesarias y seguir las instrucciones del fabricante. No es aconsejable usarlos cuando haya
vencido su vida útil, la cual, para antibióticos, generalmente es el mismo día. Las soluciones
antibióticas se pueden guardar, en algunas circunstancias, congeladas en alícuotas
convenientes pero no se es aconsejable volver a congelar después de descongelar. Es
recomendable que el usuario consulte con el fabricante la posible pérdida de actividad por
congelamiento o que la pruebe él mismo.
4.4
PREPARACIÓN PARA USO
4.4.1
Fundido del medio de cultivo agar
Se funde el medio de cultivo colocándolo en un baño de agua hirviendo, o con otro proceso
cuyos resultados sean idénticos (por ejemplo, flujo de vapor por el autoclave). Se recomienda
volver a calentar en el menor tiempo posible los medios que se han pasado previamente por el
autoclave, para mantener la calidad del medio. Se aconseja evitar que el medio se caliente
demasiado, y retirar cuando se ha fundido. Se enfría el medio fundido hasta 47 °C ± 2 °C en un
baño de agua controlado con termostato, hasta cuando se use. El tiempo necesario para
alcanzar 47 °C depende de la clase de medio, el volumen y la cantidad de unidades en el baño
de agua. Se aconseja usar el medio fundido tan pronto como sea posible, pero se recomienda
que no se guarde más de 4 horas. Nunca es recomendable usar un medio de cultivo a una
temperatura superior a los 50 °C.
4.4.2 Desaireación del medio de cultivo
Si es necesario, inmediatamente antes de usar, se calienta el medio de cultivo en agua caliente
o bajo flujo de vapor, durante 15 min, con la tapa floja; después de calentar, se cierra bien la
tapa y se enfría el medio rápidamente a la temperatura de operación.
11
GUIA TÉCNICA COLOMBIANA
GTC 78
4.4.3 Adición de suplementos
Los suplementos termolábiles agregan al medio después de enfriarlo a 47 °C ± 2 °C. Los
suplementos refrigerados estériles pueden hacer que el agar se gelatinice o forme hojuelas
transparentes, por lo tanto se permite que el suplemento estéril llegue a la temperatura
ambiente antes de agregarlo al medio. Se mezclan bien y suavemente todos los suplementos
con el medio, luego se distribuyen en los recipientes tan pronto como sea posible.
4.4.4 Preparación y almacenamiento de los medios en cajas Petri
Se vierte el medio de cultivo en cajas Petri hasta obtener un espesor no inferior a 2 mm (por
ejemplo, en cajas de 90 mm se requieren normalmente 15 ml). Se deja enfriar y solidificar el
agar colocando las cajas Petri, tapadas, en una superficie horizontal fría.
NOTA
Durante la incubación el medio agar perderá humedad. Una pérdida de más de 15 % del contenido de
agua puede afectar adversamente el crecimiento de microorganismos, en algunas circunstancias. Los factores que
influyen en la pérdida de agua son: la composición del medio, la cantidad de medio en los platos, la clase de
incubadora, por ejemplo, con ventilador o de otra clase, la humedad de la atmósfera en la incubadora, la posición y
la cantidad de cajas en la incubadora y la temperatura de la incubadora.
Se usa el medio solidificado inmediatamente, o se guarda en condiciones que eviten
modificaciones en su composición, por ejemplo, en un sitio oscuro y/o en el refrigerador de 4 °C
a 12 °C, en bolsas cerradas, durante una semana como máximo, o como indique el fabricante o
la norma específica. Se rotulan las cajas en la base, con la fecha de preparación y/o la fecha de
vencimiento y la identificación. Se pueden usar códigos que cumplan este requisito.
La vida útil de las cajas llenas, aumentará si se guardan en bolsas plásticas selladas. Para
evitar que se presenten condensados, las cajas deben estar frías antes de colocarlas en las
bolsas. No es aconsejable secar la superficie de las cajas de agar antes de guardarlas en frío.
En general, para inocular un medio de cultivo sólido, se secan las cajas, preferiblemente
retirando las tapas y con la superficie del agar hacia abajo, en un horno a temperatura entre 25 °C
y 50 °C, o en un gabinete de flujo laminar, hasta que desaparezcan las goticas de la superficie
del medio. se aconseja no secar demasiado. Se recomienda guardar y usar las cajas de agar
listas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4.4.5 Incubación
Se recomienda no apilar las cajas en pilas de más de 6 y dejar espacio para que circule el aire
y se equilibre la temperatura de incubación tan rápido como sea posible. Cuando el medio sea
líquido, el tiempo necesario para alcanzar la temperatura de incubación depende de varios
factores, como, por ejemplo, el volumen, la carga, el recipiente, la clase de incubadora. Cuando
se usen jarras anaeróbicas puede ser necesario apilar más de 6 cajas.
4.5
ELIMINACIÓN DEL MEDIO
Se recomienda eliminar tanto los medios contaminados como los que no se hayan utilizado en
forma segura, de acuerdo con las regulaciones locales o nacionales.
5.
CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO
5.1
CONTROL DE CALIDAD FÍSICO - QUÍMICO
Es aconsejable que los ensayos de laboratorio incluyan lo siguiente, como mínimo:
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-
GTC 78
valor pH medido entre 20 °C y 25 °C;
y mediante observación:
5.2
-
cantidad con la que se llenó y/o espesor de la capa;
-
color;
-
claridad/presencia de artefactos ópticos;
-
estabilidad / consistencia/humedad del gel.
CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLÓGICO
5.2.1 Esterilidad
Es aconsejable que se pruebe la esterilidad de una cantidad adecuada de cada lote.
5.2.2 Organismos de ensayo
Se recomienda que el conjunto de organismos de ensayo contenga sólo microorganismos de
características estables, representativos de su especie, los cuales son confiables para
demostrar el comportamiento óptimo de un medio preparado en un laboratorio en particular. Se
recomienda que los organismos de ensayo contengan, primordialmente, cepas disponibles en
las colecciones de cepas de control, pero también se pueden incluir cepas bien caracterizadas,
aisladas por el laboratorio. Es aconsejable que el laboratorio examine y registre las
características relevantes del cultivo en existencia, y se renueve la cepa si se presentaran
características atípicas. Es preferible usar cepas que se han originado en alimentos, aunque no
todas las colecciones de cultivos suministran esos datos sobre su origen.
Los organismos de ensayo de cada medio pueden incluir:
cepas positivas robustas, con características típicas;
-
cepas positivas de crecimiento débil (por ejemplo, de naturaleza más sensible);
-
cepas bioquímicas no reactivas, por ejemplo, aquellas con diferente fermentación
o reacciones a la fluorescencia;
-
cepas totalmente inhibidas.
NOTA El Equipo de Trabajo en Medios de Cultivo del Comité Internacional para la Microbiología de Alimentos
(WPCM) prescribió una colección válida de cepas de ensayo para evaluación de medios (1).
5.2.3 Medios y reactivos listos para usar
Los fabricantes de medios disponibles en el comercio y listos para usar, especialmente los
aprobados bajo las normas ISO 9001, tendrán un programa de calidad y podrán usar el
certificado de calidad para los medios que suministran. En esas condiciones el usuario no
tendrá que hacer ensayos extensos con tales medios, sino que deberá asegurar que se
mantienen las condiciones de almacenamiento.
13
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5.2.4 Medios preparados con formulaciones deshidratadas disponibles en el comercio
Para los fines de esta parte de la guía , los ensayos cualitativos de cada lote son un requisito
mínimo pero, si se hacen exámenes cuantitativos de muestras, estos darán mayor seguridad
en cuanto a la calidad del medio. Para los medios que tienen indicadores o agentes selectivos,
es adecuado usar una sola sepa positiva de ensayo. Con los medios que no contienen
indicadores o agentes selectivos, es aconsejable utilizar cepas que demuestran la función del o
de los indicadores y su selectividad. Con los medios complejos, como, por ejemplo, medios con
suplementos agregados, es aconsejable verificar, en cada lote, las cepas con las
características indicadas en el numeral 5.2.2, Cuando se trate de medios listos para usar, a los
cuales se han agregado suplementos preparados en el laboratorio, es aconsejable proceder de
la misma manera.
5.2.5 Medios preparados con componentes básicos individuales
Se recomienda que además de los ensayos cualitativos descritos en el numeral 5.2.4 se hagan
algunos ensayos cuantitativos, usando técnicas como la técnica modificada, Miles & Misra (1),
o placa en espiral con el fin de monitorear las tendencias de la calidad de los materiales
básicos, la productividad del medio y los protocolos de producción del laboratorio.
NOTA Estas son pautas mínimas, en la práctica, los alimentos pueden contener microorganismos estresados. Se
recomienda tener en cuenta la idoneidad del medio, con respecto a la recuperación de células estresadas. Para
información sobre preservación, técnicas de mantenimiento y colecciones de cepas de control, ver el Anexo B.
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ANEXO A
(Informativo)
DESIGNACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO EN LAS NORMAS
SOBRE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS Y ALIMENTOS
PARA ANIMALES
A.1
GENERALIDADES
Con el fin de armonizar la descripción de los distintos componentes de los medios de cultivo de
los métodos microbiológicos normales, la norma ISO/TC 34/SC 9 “Alimentos y productos
agrícolas – Microbiología”, designó las categorías de los componentes relacionados en las
secciones A2 hasta A5.
A.2
A.3
A.4
PEPTONAS
-
digestión enzimática de caseina2);
-
digestión enzimática de fríjol de soya;
-
digestión enzimática de tejidos animales3)
-
digestión enzimática de la gelatina;
-
digestión enzimática de tejidos de plantas y animales:
EXTRACTOS
-
extracto de carne;
-
extracto de cerebro-corazón;
-
extracto de levadura;
-
bilis de buey para bacteriología;
-
sales biliares;
AGAR
-
agar bacteriológico;
2)
Incluye la digestión péptica y tríptica de caseína.
3)
Incluye peptona de carne, digestión peptónica de carne, digestión pancreática de carne
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A.5
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OTROS
-
emulsión de yema de huevo;
-
leche en polvo descremada;
-
hidrolizado de caseína.
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ANEXO B
(Informativo)
PAUTAS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS DE CONTROL
B.1
GENERALIDADES
Se dispone de varios métodos, por ejemplo, liofilización, almacenamiento en perlas a -70 ºC, o
el uso de nitrógeno líquido para preservar y mantener con éxito todos los microorganismos
relevantes para la microbiología de los alimentos. Es posible que un método no sea adecuado
para todas las cepas.
Estas pautas se presentan en la figura B.1.
B.2
CEPAS DE REFERENCIA DE FUENTES COMERCIALES
Si se compran cepas de referencia de colecciones de referencia o a proveedores aprobados
por las normas ISO 9001 y se guardan en sus recipientes originales, se recomienda seguir las
instrucciones del fabricante para su cultivo y uso.
B.3
CEPA MADRE
LABORATORIO
-
EXISTENCIAS
DE
REFERENCIA
PREPARADAS
EN
EL
Se recomienda mantener y manejar la existencia de cultivos de cepas de referencia (B2) para
fines de control de calidad y ensayos de tal manera que se reduzca al mínimo la posibilidad de
contaminación cruzada, mutación o alteración de las características típicas. Se aconseja
guardar la existencia de cepas madre en múltiples alícuotas y ultra congelar (-70 ºC) o liofilizar.
Es aconsejable documentar perfectamente las características de crecimiento de cada medio en
el cual se usarán como organismos de ensayo.
B.4
CULTIVOS DE TRABAJO
Los cultivos de trabajo se preparan con cepas madre, ultracongeladas congeladas (B3). Se
recomienda manejar las alícuotas de tal manera que se evite la posible contaminación cruzada
de las cepas madre y/o su deterioro. Se recomienda preparar los cultivos de trabajo volviendo a
suspender una alícuota de la existencia de referencia en un medio de crecimiento no selectivo
e incubándolo para que produzca una fase de cultivo estacionaria.
Se recomienda seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante cuando se trate de
sistemas comerciales para preservación.
NOTA Se recomienda no hacer sub-cultivos de cultivos de trabajo. Sin embargo, se pueden usar los cultivos de
trabajo más de una vez, siempre y cuando se manejen y se guarden, no más de una semana, adecuadamente, para
evitar, por ejemplo, contaminación cruzada y/o deterioro..
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Cepa de referencia
Obtenido a partir de una colección de cultivos de referencia
liofilizados y a vacio. Microorganismo definido por lo menos a
nivel de género y especie, catalogado y descrito de acuerdo
con sus características y, preferiblemente; indicando su origen
Cepa madre
Serie de alicuotas de cultivos idénticos obtenidos en el
laboratorio a partir de solo subcultivo de la cepa de referencia
Cultivo de trabajo
Un subcultivo primario de un stock de la cepa de referencia
Figura B.1
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ANEXO C
(Informativo)
Aseguramiento de la Calidad de los medios de cultivo – solución de problemas
Anormal
Agar con defecto de solidificación
pH incorrecto
Color anormal
Formación de precipitados
Inhibición del medio/ Baja producción
Pobre selectividad
Razón posible
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Bajo pH causado por la hidrólisis ácida.
Mal pesaje del agar.
Agar sin disolver.
Deficiente mezclado de ingredientes
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Calidad del agua deficiente.
Contaminación extraña de químicos.
Medida de pH a una temperatura incorrecta.
Mala calibración del potenciómetro.
Mala calidad del medio deshidratado.
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Calidad del agua deficiente.
Mala calidad del medio deshidratado.
pH incorrecto.
Contaminación extraña.
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Calidad del agua deficiente.
Mala calidad del medio deshidratado.
Falta de control de pH
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Mala calidad del medio deshidratado.
Calidad del agua deficiente.
Formulación incorrecta por ejemplo ingredientes mal pesados,
error en la concentración de los suplementos..
Sobrecalentamiento del medio durante la preparación.
Mala calidad del medio deshidratado.
Formulación incorrecta
Suplementos añadidos incorrectamente, por ejemplo, cuando el
medio está muy caliente o por error en la concentración.
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BIBLIOGRAFÍA
[1]
Culture media for Foood Microbiology. Progress in Industrial Microbiology, Vol.34
(1995). Eds. Corry J.E.L., Curtis, G.D.W and Baird, R.M. Elsevier, Amsterdam.
[2]
ISO 9001:2000, Quality management systems- Requirements.
DOCUMENTO DE REFERENCIA
ISO/ TS11133-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines of preparation and
production of culture media- Part 1 general guidelines on quality assurance for the preparation
of culture media in the laboratory.
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