TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS MICROBIOLÓGICOS Manual de prácticas Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 1 Preparaciones microscópicas en fresco Objetivo: Realizar preparaciones en fresco a partir de cada una de las muestras proporcionadas y recolectadas con el fin de observar al microscopio los diferentes tipos de microorganismos presentes en ellas. Introducción: Los microorganismos tienen la capacidad de adaptarse en medios ambientes con condiciones adversas como lo pueden ser la temperatura, el pH, la humedad, fuente de carbono limitada, etc. Sin embargo, en medios como los alimentos, frutas y estanques de agua, encuentran las condiciones propicias para su desarrollo y su crecimiento se verá favorecido en tiempos relativamente cortos, trayendo consigo el deterioro de estos alimentos. Los microorganismos responsables del deterioro de los alimentos y aquellos que de manera natural forman parte de ellos (como en la leche) pueden ser observados fácilmente al microscopio ayudándose para este fin de diferentes técnicas utilizadas en microbiología. Fundamento El microscopio óptico es el instrumento que se emplea con mayor frecuencia en los laboratorios de microbiología, debido a que proporciona una imagen amplificada o agrandada del objeto en estudio, permitiendo observar organismos y estructuras invisibles a simple vista. Son capaces de lograr una amplificación de hasta miles veces el tamaño del objeto. Los microscopios ópticos emplean lentes diseñados para desviar y enfocar los rayos de luz, produciendo imágenes aumentadas de objetos pequeños. Presenta lentes en el condensador, en los objetivos y en los oculares. El lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la muestra. Los rayos de luz que chocan con los objetos (microorganismos) que hay en la muestra y se “curvan”, son conducidos al lente del objetivo para formar una imagen aumentada del objeto. La lente del ocular magnifica más esta imagen primaria. El aumento total se calcula multiplicando los aumentos del objetivo y del ocular. La resolución de un microscopio óptico se determina por la apertura numérica de su sistema de lentes y la longitud de onda de la luz empleada; la resolución máxima es de aproximadamente 0.2 m. El microscopio ordinario se denomina de campo claro porque forma una imagen oscura frente a un fondo claro. Procedimiento Preparaciones frescas entre portaobjetos y cubreobjetos 1. Flamee una de las caras de un portaobjetos (fig. 1) y colóquelo en la mesa con la cara flameada hacia arriba. 2. Esterilice el asa de platino a la flama del mechero (fig. 2). 1 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Figura 1 Figura 2 3. Retire el tapón del tubo que tiene la muestra, utilice para ello, el dedo meñique (fig. 3), flamee la boca del tubo (fig. 4), tome la muestra con el asa, flamee nuevamente la boca del tubo y tápelo. Coloque el tubo en la gradilla y la asada de muestra en la cara flameada del portaobjetos (fig. 5), esterilice nuevamente el asa de platino y déjela en la mesa. Figura 3 Figura 4 Figura 5 4. Para cubrir la preparación ponga en contacto el borde del cubreobjetos con la gota de muestra y déjelo caer por su propio peso, para evitar la formación de burbujas de aire. Puede sellar con vaselina para evitar la evaporación. 2 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos 5. Proceda en igual forma para las siguientes muestras; pero si se trata de una muestra en medio sólido, coloque previamente una gota de agua en el portaobjetos y con ella emulsione la muestra. Observe todas las preparaciones con objetivos secos (10x y 40x). Dibuje los campos observados con el objetivo de 40x. Preparaciones en fresco por el método de la gota pendiente 1. Aplique un poco de vaselina alrededor de la depresión de un portaobjetos excavado (fig. 6), y con la ayuda del asa coloque en condiciones de esterilidad, una gota del cultivo en el centro de un cubreobjetos limpio (fig. 7). Portaobjetos excavado Excavación Vaselina Gotita del cultivo Cubreobjetos Figura 6 Figura 7 2. Coloque el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando de que la excavación quede sobre la gota de cultivo. Haga presión sobre los bordes para que la vaselina selle el cubreobjetos con el portaobjetos. 3. Invierta cuidadosamente el portaobjetos de manera que el cubreobjetos quede hacia arriba y la gota de cultivo quede colgada en el centro de la excavación del portaobjetos cuidando de que la gota no se caiga, lo que es fácil de lograr si se trabaja con gotas pequeñas (fig. 8). Fig. 8 4. Para hacer la observación se sugiere enfocar primero el borde de la gota con objetivos secos y poca iluminación para observar las bacterias y su posible movilidad. Dibuje los campos observados con el objetivo de 40x. Disposición de Residuos: Las muestras se tiran al drenaje después de esterilizarse en autoclave. 3 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 2 Preparaciones microscópicas secas, fijas y teñidas. Tinción simple Objetivo Conocer las diferentes técnicas de tinción microbiológicas y las ventajas de cada una de ellas. Realizar preparaciones secas de diferentes microorganismos, fijarlas y teñirlas, aplicando técnicas de tinción simple para observar la morfología y agrupación de los microorganismos. Introducción Con el microscopio de campo claro, las muestras se visualizan gracias a las diferencias de contraste entre ellas y el medio que las rodea; debido a que las células absorben o dispersan la luz en diferentes grados. Muchas células son difíciles de observar debido a la falta de contraste. En los microorganismos pigmentados su color añade contraste y mejora la visualización de las células, pero como la mayoría de los microorganismos son incoloros, se suelen fijar y teñir antes de su observación. Fundamento Los colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y cada tipo de colorante tiene afinidad por determinados componentes celulares. En la mayoría de los colorantes el color reside en el ion positivo (colorantes básicos o catiónicos) y se combinan fuertemente con constituyentes celulares cargados negativamente, como la pared celular. Como en el caso del azul de metileno, cuya sal es el cloruro de azul de metileno, que se disocia en ión cloruro cargado negativamente y azul de metileno, ión cargado positivamente, siendo éste el que tiene color. Los colorantes ácidos o aniónicos son aquellos en los que el color reside en el ión negativo. Los colorantes tienen diferencias en el grado o proporción con que tiñen los microorganismos y así los menos reactivos requieren de más tiempo de contacto con la célula para teñirla y los más reactivos de menos tiempo. Después de depositar adecuadamente la muestra en un portaobjetos limpio y desengrasado, se deja secar al aire y enseguida se procede a la fijación, proceso necesario para evitar que las muestras sufran alteraciones en las operaciones siguientes durante la tinción. A esta preparación se le conoce como Frotis. Se conocen diferentes tipos de fijadores, entre los cuales están: - Los físicos como el calor, el frío, y la desecación. - Los químicos como el alcohol, el éter, el formol, etc. Una preparación seca y fijada (frotis) está lista para el proceso de tinción. Si la tinción se realiza empleando un solo colorante se denomina tinción simple, y si se lleva a cabo aplicando dos o más colorantes se le llama tinción diferencial. 4 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Existen dos tipos de tinciones simples: - La tinción directa, donde se tiñe la pared del microorganismo resaltando la célula completa y el campo se observa claro. - La tinción negativa o indirecta, donde se tiñe el campo y los microorganismos se observan como zonas claras. Las cápsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes celulares, por ese motivo se utiliza el método de tinción negativa para su observación. Se emplea tinta china (suspensión de partículas de carbono) o nigrosina (colorante ácido), que constituyen una suspensión coloidal que no puede penetrar a través de la cápsula, sino que precipita alrededor de ella; de este modo, esta estructura se ve como un halo refringente alrededor de los microorganismos sobre un fondo oscuro o negro. Procedimiento Realización de un frotis: 1. Flamee una de las caras de un portaobjetos y colóquelo en la mesa con la cara flameada hacia arriba. 2. Esterilice el asa de platino, tome una asada de la muestra y extiéndala suavemente en una superficie aproximada de 0.5 * 2.0 cm (fig. 9). - Si se trabaja con una muestra sólida, coloque previamente una gota de agua desmineralizada sobre el portaobjetos, emulsione la asada de la muestra con la gota y extienda. 3. Deje secar al aire el portaobjetos. 4. Fije cada una de las preparaciones, pasándolas 5 o 6 veces rápidamente por la parte superior de la flama del mechero (fig. 10). - Al fijar, el calor no debe de resultar muy intenso, lo que se puede lograr comprobando el calor del portaobjetos, en el dorso de la mano, que no ha de dar la sensación de quemadura. Fig. 9 Fig. 10 Tinción directa: 1. Coloque el frotis sobre dos varillas de vidrio paralelas en un recipiente adecuado (Fig. 11). Puede unir las varillas por los extremos con pedazos de manguera cortos. 5 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Figura 11 2. Con la ayuda de un gotero, cubra el frotis con solución colorante. Si se emplea azul de metileno déjelo actuar por un minuto (tiempo de contacto), si se emplea cristal violeta déjelo actuar por 30 segundos. 3. Lave con agua desmineralizada el frotis teñido usando una pizeta o un frasco gotero. 4. Seque la preparación con papel filtro sin llegar a frotarla, únicamente presiónela suavemente. 5. Observe la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) y dibuje los campos observados. Utilice aceite de inmersión. Tinción indirecta: 1. Sobre un extremo de la cara de un portaobjetos coloque con el asa, dos gotas de cultivo. 2. Añada una gota pequeña de solución de tinta china o nigrosina y mezcle con las gotas del cultivo. 3. Extienda la mezcla con el borde de otro portaobjetos formando una capa fina (fig 12). Muestra con colorante Figura 12 4. Deje secar al aire. 5. Observe la preparación con el objetivo de 100x. Utilice aceite de inmersión Disposición de Residuos: Los residuos de la tinción se depositan en el contenedor de Colorantes y Lugol. Los residuos de las muestras son regresados a la Auxiliaría del Laboratorio. Los frotis se lavan y se desengrasan con alcohol. 6 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 3 Preparaciones microscópicas secas, fijas y teñidas. Tinción diferencial Objetivo Conocer las diferentes técnicas de tinción microbiológicas y las ventajas de cada una de ellas. Realizar frotis de diferentes microorganismos y teñirlos aplicando técnicas de tinción diferenciales para poner en evidencia diferentes estructuras celulares o diferencias tintoriales entre las bacterias. Introducción La tinción diferencial permite distinguir entre diferentes tipos de bacterias y también poner de manifiesto ciertas estructuras de la morfología bacteriana. En estas tinciones se emplean más de un colorante y depende de las diferencias físicas y químicas de los microorganismos; se conocen varias técnicas con distintos fines, siendo las más comunes la tinción de Gram, tinción de esporas y tinción de cápsulas. Fundamento Tinción de Gram Esta técnica tiene una importancia especial, ya que además de dar información acerca de la morfología y agrupación de las bacterias, permite distinguir entre aquellas que tienen una morfología similar, de acuerdo a las diferentes reacciones que éstas presentan frente al procedimiento de tinción; las cuales se atribuyen a la composición química de las capas superficiales de la bacteria o de su pared celular, obteniéndose así una clasificación artificial de las bacterias en GramPositivas, aquellas que resultan capaces de retener el complejo formado por el cristal violeta (colorante primario) y el lugol (mordiente) tiñéndose de color morado-azul y GramNegativas, aquellas que se decoloran con el alcohol (agente decolorante) y se tiñen con safranina (colorante de contraste) observándose de color rojo-rosa. Se puede decir que en general las bacterias Gram Positivas, reaccionan de manera diferente que las Gram Negativas, cuando se les expone a una gran variedad de agentes físicos y químicos. Para la realización de la técnica, se utilizan dos colorantes, un mordiente y un agente decolorante. El colorante primario es básico, el cristal violeta, el mordiente es una mezcla de yodo - yoduro y tiene como finalidad incrementar la afinidad entre el colorante primario y la célula, el agente decolorante como lo es el alcohol ó una mezcla de alcohol - acetona sirve para retirar de la célula el colorante no fijado, la facilidad para decolorarse varía de unas células a otras y por último el colorante de contraste que debe de ser de un color diferente al primario ya que esta destinado a teñir las células que se decoloran; permitiendo diferenciarlas. Se conocen varias modificaciones a esta técnica, aquí se utilizará la modificación de Hucker que se considera de las más seguras. 7 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Tinción de Esporas Esta tinción diferencial ayuda a proporcionar el contraste necesario para la observación de ciertas estructuras de la célula bacteriana, como lo son las esporas, con la finalidad de facilitar su identificación. La observación de esporas bacterianas, permite, además de conocer su presencia, tener idea de su forma, posición y tamaño dentro de la célula vegetativa. Las esporas son difíciles de colorear, pero una vez teñidas resisten fuertemente la decoloración. Para realizar la tinción, se requiere de métodos especiales para lograr la penetración del colorante primario, se recurre al calor (Método de Dorner) o a la exposición prolongada al colorante (Método de Bartholomew Mittwer). Tinción de Cápsulas Para poner de manifiesto la presencia de cápsulas en las bacterias, se puede recurrir a diferentes técnicas, todas ellas, están enfocadas a resolver el problema de la diferente afinidad a los colorantes que presenta la cápsula, en comparación con los constituyentes de la célula. El método de Anthony, colorea la célula y el fondo del campo, mas no la cápsula, de manera que ésta se observa por contraste; en el método de Leifson la cápsula admite un contra colorante de forma tal que la cápsula se observa teñida y además se cuenta con el recurso de la coloración negativa, utilizando tinta china. Sin duda que la mejor técnica para demostrar la cápsula, será la que la tiña, de manera que se contraste con respecto a la célula y el resto del campo. Procedimiento Tinción de Gram 1. Prepare un frotis de cada una de las muestras. 2. Tiña con cristal violeta y déjelo actuar durante un minuto, retire el exceso de colorante. 3. Lave con agua. 4. Cubra el frotis con solución de lugol y déjelo actuar por un minuto. 5. Lave con agua. 6. Decolore con alcohol etílico al 96% hasta que este no suelte más colorante (aproximadamente por 30 segundos). 7. Lave con agua. 8. Cubra con safranina por 30 segundos y retire el exceso de colorante. 9. Lave con agua 10. Dejar secar al aire o seque entre papel filtro sin llegar a tallar la preparación. 11. Observar al microscopio con el objetivo de 100x ( inmersión ) Interpretación: - Las Bacterias Gram positivas se observan de un color morado– azul. - Las Bacterias Gram negativas se observan de un color rojo – rosa. Tinción de esporas mediante la técnica de Bartholomew Mittwer 1. Prepare un frotis de la muestra. 8 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos 2. Cubrir el frotis con solución acuosa de verde de malaquita durante 10 minutos. 3. Lavar con agua. 4. Cubrirlos con solución acuosa de safranina al 0.25 % durante 15 segundos. 5. Lavar con agua. 6. 7. Dejar secar al aireo con papel filtro. 7. Observe la preparación con el objetivo de 100x. Interpretación: - La espora se tiñe de verde. - La célula vegetativa se tiñe de rojo. Tinción de cápsulas mediante la técnica de Anthony 1. Prepare un frotis a partir de la muestra. 2. Cubrir la preparación con solución colorante de cristal violeta por 30 segundos. 3. Lavar con solución de CuSO4 al 20 %. 4. Dejar secar al aire. 5. Observar con el objetivo de 100x. - Nota: El frotis no debe de ser fijado por calor, únicamente debe dejarse secar al aire. Interpretación: - La cápsula se observa sin teñir. - La célula se tiñe intensamente de morado. - El fondo del campo se observa de color morado. Disposición de residuos Los residuos de la tinción se depositan en el contenedor de Colorantes y Lugol. Los residuos de las muestras son regresados a la Auxiliaría del Laboratorio. Los frotis se lavan y se desengrasan con alcohol. 9 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 4 Preparación de medios de cultivo Objetivo Aprender a preparar medios de cultivo que se emplean en las diferentes prácticas de esta Unidad de Aprendizaje Introducción Los medios de cultivo, tienen como objeto proporcionar a los microorganismos los requerimientos nutricionales, fuera de su hábitat normal; necesarios para su aislamiento y cultivo. Las condiciones que debe cumplir un medio de cultivo para resultar adecuado son: Tener la calidad y cantidad de las sustancias requeridas. Ausencia de sustancias inhibidoras para el microorganismo, además debe de ser esterilizado antes de su inoculación. Fundamento Respecto a la composición química de los medios de cultivo, estos pueden ser: Sintéticos o Químicamente definidos: cuando se conoce la composición química y la concentración de sus constituyentes; ya que para su fabricación se emplean productos químicos, relativamente puros, estos se seleccionan de acuerdo con las necesidades nutricionales de cada microorganismo en particular, así un microorganismo heterótrofo requiere de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y sales inorgánicas; quizá algunos más exigentes requieren de vitaminas, purinas, aminoácidos, etc. No sintéticos o Complejos: son aquellos que no se conoce su composición química exacta, ya que la mayoría de ellos son digeridos ácidos o enzimáticos de diversos tejidos: vegetales, carnes, caseína, y células de levaduras, que pueden proporcionar fuentes ricas de polipéptidos, aminoácidos, sales minerales, o vitaminas; ejemplos de estos serían: peptona, triptona, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, etc.A pesar de que estos digeridos contienen carbohidratos en cierta proporción, se acostumbra suplementarlos con un azúcar adicional. De acuerdo con su consistencia se conocen tres tipos de medios de cultivo: - Medios líquidos - Medios sólidos - Medios semisólidos El agente solidificante que se emplea comúnmente es el agar agar a una concentración por lo general de 1.2-1.5% en medios sólidos y de 0.3-0.7% en medios semisólidos. El agar es una sustancia obtenida apartir de una alga marina, se dispone de él en forma de polvo seco en estado de pureza, ya que químicamente en un galactano, (carbohidrato complejo) formado por moléculas de galactosa, y resistente a la acción de la bacterias, lo cual es unaventaja, ya que no se agrega a los medios 10 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos como alimento, sino solamente como agente solidificante. El gel de sílice es un recurso cuando se requiere cultivar bacterias autótrofas, en donde se requiere excluir la materia orgánica. Recomendaciones Generales para la preparación de los medios de cultivo - El equipo y material de vidrio empleados en la preparación de los medios de cultivo deberán estar limpios y exentos de sustancias como los detergentes. - Pesar o medir con exactitud cada uno de los componentes del medio de cultivo en un recipiente adecuado (por ejemplo: vidrios de reloj). - Mantener siempre tapados los frascos que contienen los medios de cultivo deshidratados para evitar la hidratación. - El agua empleada para la preparación debe de ser desmineralizada. - Preparar los medios de cultivo conforme a las indicaciones del fabricante; las cuales vienen indicadas en el frasco del cultivo o en la ficha técnica del medio. - Si se desea preparar un medio sólido, es necesario calentar para disolver el Agar. Se recomienda hacerlo en baño María, no directo sobre la llama o plancha de calentamiento. Se pueden emplear agitadores magnéticos. Disposición de residuos No se generan residuos 11 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 5 Esterilización de medios de cultivo y material de laboratorio Objetivo Conocer y aplicar los métodos de esterilización por calor seco y calor húmedo Esterilizar por calor húmedo los medios de cultivo. Esterilizar por calor seco el material de vidrio. Introducción La esterilización es un proceso mediante el cual se logra la destrucción de toda forma de vida microbiana. En el laboratorio de Microbiología es una práctica común la esterilización de medios de cultivo y material que se utilizará para promover el desarrollo de los microorganismos, asegurando así que los microorganismos presentes en un cultivo son los que se encontraban en la muestra y no en el material o en el entorno. Además es un proceso que también se utiliza para destruir los microorganismos de los cultivos que serán desechados. La esterilización puede llevarse a cabo mediante diferentes métodos, la elección de éste dependerá de la naturaleza de lo que se desea esterilizar. Los métodos más ampliamente utilizados emplean calor para lograr la esterilización, y éstos se clasifican en aquellos que utilizan calor húmedo y los que emplean calor seco. De los métodos donde se aplica calor húmedo, la esterilización con vapor de agua a presión es el más usado, y el equipo que se emplea es el autoclave. El procedimiento habitual es usar una temperatura de 121 °C, para lo cual se 2 necesita una presión de 15 psi (libras/pulgada ). En estas condiciones es suficiente un tratamiento de 15 min para eliminar las esporas de bacterias, que son las más resistentes. Este método es el de elección para esterilizar medios de cultivo y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se descompongan a temperaturas superiores a 100 °C, si esto último ocurre se recomienda esterilizar por tindalización, método en el cual se emplea calor húmedo pero a presión atmosférica normal, o bien, por filtración. La estufa de esterilización u Horno Pasteur se utiliza para esterilizar empleando calor seco. La temperatura varía entre 120 y 180 °C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. Es posible esterilizar por este método material de vidrio e instrumental metálico, así como sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias viscosas no volátiles. Por lo general se emplea una temperatura de ~170 °C por un período de tiempo de 2 h, aunque el tiempo puede reducirse al incrementar la temperatura; sin embargo, es necesario considerar que el papel y el algodón no se pueden esterilizar a más de 190 °C. La esterilización por calor seco también se puede efectuar mediante la incineración o fuego directo. Cuando se lleva al rojo, en el área de reducción de la llama del 12 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos mechero el material de metal, como asas bacteriológicas y pinzas de disección, la acción directa de la llama elimina los microorganismos. Este material debe enfriarse en un área aséptica antes de su uso. Fundamento La destrucción de los microorganismos por acción del vapor de agua a presión se logra por la desnaturalización de las proteínas celulares, mientras que con el calor seco se consigue por la desecación de las células, efectos tóxicos por niveles altos de electrolitos, así como por procesos de oxidación de lípidos y fusión de membranas. Procedimiento Esterilización de medios de cultivo 1. Coloque los tubos y matraces con medios de cultivo en una canastilla metálica. - La tapa de los tubos de rosca debe quedar entreabierta para permitir la entrada del vapor de agua. - Los matraces no deben ser llenados a más de 2/3 de su capacidad. - Cubra los tapones de algodón con papel periódico para evitar que se humedezcan. 2. Adicione agua desmineralizada en el autoclave hasta el nivel adecuado (hasta que sobrepase las resistencias del equipo). 3. Introduzca la canastilla metálica al autoclave. 4. Cierre el autoclave y verifique que la válvula de salida de vapor se encuentre abierta. 5. Encienda el autoclave y espere a que salga todo el aire del interior de la autoclave, para alcanzar las condiciones de esterilización requeridas. 6. Cierre la válvula cuando el desprendimiento de vapor de agua sea continuo (generalmente se logra unos minutos después de haber alcanzado una temperatura de 100 °C). 7. Revise la temperatura en el termómetro del autoclave, y cuando llegue a 121 °C (15 psi en el manómetro) registre el tiempo. 8. Mantenga a 121 °C por 15 min. 9. Apague el autoclave y de tiempo para que ésta se enfríe y la presión baje a cero. 10. Abra la válvula de salida de vapor para permitir la liberación del vapor restante. 11. Abra el autoclave y con precaución (aún está caliente) retire el material. 12. Cierre bien los tubos de tapón de rosca mientras se encuentran calientes. - Si el agar de los tubos lo requiere inclinado, espere a que se enfríen un poco más, colóquelos sobre una superficie que le permita obtener el grado de inclinación deseado y déjelos solidificar. 13. Una vez que los medios alcancen la temperatura ambiente consérvelos en refrigeración hasta su uso. 13 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Esterilización de material de vidrio 1. Introduzca el material a esterilizar previamente envuelto en papel y las pipetas además con su filtro de algodón, en una estufa de esterilización. 2. Encienda la estufa y permita que alcance una temperatura de 170 °C. 3. Registre el tiempo y mantenga dos horas a esta temperatura. 4. Apague la estufa y retire el material con el equipo de protección adecuado, o bien, espere a que se enfríe para retirarlo. El método utilizado para envolver el material deberá garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento. Si se desea, el material de vidrio también se puede esterilizar por calor húmedo. Al terminar de esterilizar hay que permitir que el papel se seque completamente ya que si se manipula estando húmedo se puede llegar a romper y se perdería la esterilidad del material. Disposición de residuos En esta práctica no se generan residuos. El agua del autoclave puede usarse nuevamente. 14 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 6 Aislamiento por estría cruzada Objetivo Conocer y aplicar la técnica de aislamiento mediante estría cruzada para la obtención de cultivos puros de bacterias a partir de una muestra problema. Introducción En la naturaleza, los microorganismos viven asociados a otros en conjuntos llamados poblaciones; estas poblaciones por lo general están formadas por diferentes tipos de microorganismos. Si queremos estudiar las características bioquímicas, fisiológicas y genéticas de un microorganismo en particular, es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra y obtenerlo en cultivo puro. Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene sólo un tipo de microorganismo. Existen varias técnicas para lograr la separación o aislamiento de los microorganismos presentes en la naturaleza o en un cultivo mixto basándose en la obtención de colonias aisladas y en sus características. De manera general los métodos de aislamiento incluyen: 1. Separación física de los microorganismos, lo cual se puede lograr mediante las técnicas de: - Dilución y siembra en placa - Inoculación y transferencia - Estría cruzada 2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales. Sin embargo, frecuentemente se emplean combinaciones de las técnicas anteriores para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados. La elección de la técnica de aislamiento depende del tipo de microorganismo que se desea aislar. No todas las técnicas resultan adecuadas para el aislamiento de los diversos grupos microbianos. La técnica de dilución y siembra en placa es de utilidad para el aislamiento de cualquier tipo de microorganismo, no así la técnica de estría cruzada, que resulta una técnica rápida y simple, pero se aplica principalmente para el aislamiento de bacterias y levaduras. Fundamento Las técnicas de aislamiento se basan en la separación de los microorganismos presentes en una muestra, empleando un medio de cultivo sólido, en el cuál las células quedarán inmovilizadas y crecerán formando masas aisladas visibles, llamadas colonias. En la técnica de estría cruzada la muestra se extiende sobre la superficie de un medio solidificado en una placa de Petri, empleando para ello el asa bacteriológica. Al ir estriando sobre la placa, los microorganismos presentes en el asa se irán dispersando hasta obtener células aisladas, las cuales formarán las colonias. 15 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Con el fin de conseguir una mejor separación de las células, el estriado se realiza en diferentes direcciones (por campos), donde antes de cambiar de dirección el estriado, el asa se esteriliza a la flama y a continuación una porción de la última estría realizada, se estría sobre el siguiente campo. A partir de una colonia aislada se resiembra asépticamente para obtener el cultivo puro. Procedimiento 1. Fundir el agar nutritivo preparado y esterilizado anteriormente, en un baño de agua a ebullición. 2. Preparar un frotis de la muestra problema y teñir al Gram. 3. Revisar si el medio se ha fundido y permitir que se tempere. 4. Observar al microscopio el frotis teñido y registrar sus observaciones. 5. Vaciar el agar nutritivo temperado en una caja de Petri estéril (20 ml aproximadamente) y esperar a que solidifique. 6. Dividir la caja en 3 campos por la parte posterior con un marcador permanente (fig 13). Puede dividirla en 5 campos. Campo 1 Figura 13 Campo 2 Campo 3 7. Esterilizar el asa bacteriológica al mechero y permitir que se enfríe para tomar la muestra. 8. Inocular la muestra por estría, deslizando el asa por el primer campo. Se recomienda mantener el asa aplanada contra el agar. 9. Esterilizar el asa al mechero antes de cambiar la dirección del estriado al segundo campo y permitir que se enfríe. 10. Deslizar el asa atravesando el primer campo una sola vez, para arrastrar parte de la muestra y distribuirla en el segundo campo. 11. Repetir los pasos 9 y 10 hasta concluir la siembra de todos los campos en que dividió la caja (fig 14). 12. Incubar en posición invertida a 37 °C por 24 - 48 h. 13. Después de la incubación, observar las características de las colonias desarrolladas en cuanto a forma, tamaño, elevación, color, borde, etc., sin destapar la caja y registre sus observaciones. Si requiere destaparla hágalo en condiciones de asepsia. 14. Preparar un frotis de cada una de las diferentes tipos de colonias obtenidas y teñir al Gram. 15. Observar al microscopio y registrar sus observaciones. 16 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos 16. Una vez observada la pureza de las colonias, inocular un tubo con agar inclinado a partir de cada una de las colonias aisladas de las que preparó frotis y marcar adecuadamente los mismos. 17. Incubar en las condiciones descritas anteriormente. 18. Describir el crecimiento y confirmar su pureza. 19. Cubrir el tapón con parafilm y conservar en refrigeración para su posterior identificación. Figura 14: el asa indica el lugar donde se debe comenzar a realizar cada estriado. Disposición de residuos Los residuos generados en la tinción de Gram se desechan en el colector especial para Colorantes y Lugol que se encuentra en el laboratorio. Una vez concluido el aislamiento y teniendo los cultivos puros, esterilizar la muestra problema y la caja con el cultivo en autoclave. El líquido se desecha en el drenaje y el agar solidificado se deposita en bolsa roja en el contenedor correspondiente. Si el agua del autoclave está sucia, vaciar y limpiar el autoclave. El agua se tira al drenaje. 17 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 7 Aislamiento por dilución y siembra en placa Objetivo Conocer y aplicar la técnica de aislamiento mediante dilución y siembra en placa para la obtención de cultivos puros de hongos filamentosos a partir de una muestra problema. Introducción Las técnicas de aislamiento se basan en la separación de los microorganismos presentes en una muestra, empleando un medio de cultivo sólido, de tal manera que después de la incubación cada microorganismo genere una colonia. Este procedimiento se utiliza generalmente para muestras donde se sospecha la presencia de mezclas de microorganismos como hongos, levaduras o bacterias y la competencia por los nutrientes puede ser una limitante de crecimiento de algunos de ellos. Los hongos filamentosos y las levaduras son un grupo de microorganismos eucarióticos que se caracterizan por la presencia de pared celular, ausencia de clorofila, no móviles, aunque algunos producen esporas móviles, heterótrofos o quimioorganotrofos, se reproducen mediante esporas asexuales o sexuales. Algunos son benéficos para el hombre, ya que se utilizan en fermentaciones para la producción de vitaminas, ácidos orgánicos y antibióticos, entre otros productos; sin embargo, existen otros que son perjudiciales, ya que pueden ocasionar pérdidas económicas debido a que causan enfermedades a plantas y animales, incluso al hombre. Las técnicas más empleadas para el aislamiento de este tipo de microorganismos son la dilución y siembra en placa y la inoculación y transferencia. Como medio de cultivo se pueden emplear Patata Dextrosa Agar (PDA), Agar Saboraud Dextrosa (SDA) o Czapek Dox Agar, además se recomienda la adición de agentes antimicrobianos para evitar el crecimiento de bacterias que puedan interferir en el crecimiento de éstos. Como se desarrollan lentamente, se recomienda incubar por un período de tiempo de 5 a 7 días, a su temperatura óptima de desarrollo, 28 °C. Fundamento La técnica de dilución y siembra en placa consiste en efectuar una serie de diluciones decimales a partir de una muestra, inoculando 1 ml de las diluciones realizadas en una caja de Petri y añadiendo posteriormente medio de cultivo estéril de acuerdo al microorganismo que se desea aislar y posteriormente llevar a incubar en condiciones adecuadas. 18 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Procedimiento 1. Se pone a fundir al agar estéril en baño María y posteriormente se mantiene entre 45 - 50°C en baño de temperatura. 2. Se colocan las cajas de Petri cerca del mechero y se etiquetan con el número de muestra y numero de dilución correspondiente. Se marcan los tubos con solución salina para hacer las diluciones con el número de dilución. 3. Se agita la muestra para homogenizar y se toma 1 ml con una pipeta estéril y se coloca en el primer tubo de solución salina (dilución primaria,1:10). Este tubo se agita vigorosamente y se toma con una pipeta nueva 1 ml para una caja de Petri y 1 ml para el segundo tubo de solución salina (dilución 1:100). Se agita este tubo de nueva cuenta y se toma 1 ml para una caja de Petri y para el tercer tubo de solución salina (dilución 1:1000). Por último se toma 1 ml de este tubo y se coloca en una caja de Petri. (ver figura 15) Figura 15. Diagrama de Dilución y Siembra en placa 4. Se acomodan las cajas de Petri listas para vaciar el agar y se vacía de 1520 ml de agar fundido. Se mueven las cajas sobre la mesa 6 veces a la izquierda y 6 veces a la derecha y posteriormente hacia arriba y hacia abajo para homogenizar correctamente la muestras con el agar, teniendo cuidado de no derramar el agar. Dejar solidificar sobre la mesa y posteriormente llevar a incubar en posición invertida a 28 °C de 3 a 5 días. 5. Preparar un montaje en azul de lactofenol y observar las características microscópicas del hongo filamentoso con objetivos secos. Localizar hifas en las preparaciones y determinar si están septadas o no, además de localizar estructuras especiales como conidióforos, esporangióforos, esporas y tipo de éstas. Dibujar los campos característicos observados. 6. Seleccionar una colonia característica y sembrar por rasgadura un tubo con PDA inclinado para la obtención del cultivo puro del hongo. 19 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos 7. Incubar en las condiciones anteriormente descritas. 8. Conservar en refrigeración para su posterior identificación. Disposición de residuos Las cajas se envuelven en papel y se esterilizan junto a los tubos y pipetas como material sucio. Al finalizar el proceso de esterilización los restos de agar se tiran en bolsa roja y en el contenedor correspondiente y las soluciones se tiran en el drenaje. 20 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 8 Métodos para la identificación de bacterias Objetivo Conocer la metodología empleada para lograr la identificación de una bacteria. Realizar algunas pruebas bioquímicas para identificar género y especie de las bacterias obtenidas en cultivo puro en la práctica 6. Introducción Para identificar grupos microbianos se utilizan con frecuencia medios específicos para los géneros bacterianos que se desea identificar, ya sean medios de enriquecimiento y medios de propagación (si el género en especial se encuentra en baja proporción respecto a los demás géneros presentes en la muestra), medios selectivos y diferenciales y medios de cultivo especiales. La selección de uno o varios medios de cultivo para la identificación dependerá de las características fisiológicas y metabólicas del género que se investiga. Dentro de las pruebas utilizadas para la identificación en trabajos de rutina se incluye las características macroscópicas o de cultivo, las microscópicas y las metabólicas o pruebas bioquímicas. En algunos casos, para identificar variedad o serotipo se determinan también características antigénicas y de manera más específica, en investigación principalmente, se realizan estudios a nivel de DNA. Las características de cultivo se determinan utilizando medios de cultivo básicos, de enriquecimiento (ej. Agar Sangre), selectivos (p. ej. Agar S 110, Agar EMB) o diferenciales (p. ej. Agar Sangre, EMB). Las características que se observan incluyen: forma, tamaño, borde, elevación, textura, color, producción de pigmentos, cambios en el medio de cultivo. Las características microscópicas incluyen morfología, agrupación y tinción de Gram, ocasionalmente si se sospecha de un género en particular que se caracteriza por producción de esporas, cápsulas, gránulos metacromáticos, o por poseer flagelos, se realizan tinciones diferenciales para investigar la presencia de estas estructuras. Las características metabólicas se determinan utilizando medios de cultivo especiales, que no pueden ser clasificados como medios de enriquecimiento, selectivos o diferenciales. Estos medios de cultivo nos permiten conocer la actividad bioquímica de los microorganismos, por ejemplo: caldo base rojo fenol con glucosa, agar triple azúcar con hierro (TSI), agar con lisina y hierro (LIA), medio de motilidad para indol y sulfuro (SIM), agar con citrato de Simmons. Existe una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas para la identificación de géneros microbianos y para diferenciación de especies. La naturaleza de la muestra y las características macroscópicas y microscópicas del cultivo puro, proporcionan información referente al tipo de microorganismo que podemos encontrar, y consideramos la información anterior para seleccionar las pruebas bioquímicas a efectuar. 21 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Fundamento Las pruebas bioquímicas proporcionan información de gran valor para la identificación de las bacterias en base a la capacidad que poseen éstas para metabolizar o descomponer ciertos sustratos presentes en los medios de cultivo utilizados para realizar las pruebas. El microorganismo que se desea identificar es inoculado en una serie de medios de cultivo y después de incubar en las condiciones adecuadas para su desarrollo, se investiga la presencia de alguno de los productos que se habrán generado por acción de las enzimas producidas por el microorganismo, o bien se investiga la ausencia del sustrato. La reacción metabólica se puede detectar mediante la observación de cambios en el medio de cultivo (de color, producción de gas, de precipitado), o bien, en ocasiones es necesario añadir algún reactivo después de la incubación para revelar la presencia del producto o la ausencia del sustrato. Por ejemplo, el medio de sacarosa con rojo de fenol, permite determinar la capacidad del microorganismo para fermentar la sacarosa ya que el medio cambia a amarillo si el microorganismo fermenta la sacarosa y produce ácido, además si en el medio se coloca un tubo Durham invertido es posible determinar si se produce gas en la fermentación. El medio SIM es un medio semisólido que se utiliza para diferenciar enterobacterias, y en el mismo tubo se puede determinar si el microorganismo es móvil, si produce indol y sulfuro de hidrógeno. La movilidad se aprecia si aparece turbidez más allá de la línea de siembra (se inocula por picadura). El medio de cultivo contiene triptofano (constituyente de la peptona), el cual puede ser oxidado por la triptofanasa, produciendo indol. La presencia de indol se detecta por formación de un complejo rojo al adicionar al medio de cultivo unas gotas del reactivo de Kovac’s, el cual contiene p- dimetilaminobenzaldehído. La producción de sulfuro de hidrógeno se detecta porque en el medio se forma un precipitado negro de sulfuro de hierro. Procedimiento 1. En la primera sesión de esta práctica preparar los medios de cultivo y material a utilizar. a) Si su cultivo puro es de cocos Gram (+): - Producción de pigmento en el medio selectivo para estafilococos S110. - Producción de hemolisinas en Agar Sangre. - Producción de coagulasa en Caldo BHI. - Producción de catalasa en Caldo Nutritivo. - Producción de gelatinasa en Gelatina Nutritiva. b) Si su cultivo puro es de bacilos Gram (+): - Producción de amilasas en Agar Almidón. - Producción de hemolisinas en Agar Sangre. - Producción de catalasa en Caldo Nutritivo. - Fermentación u oxidación de lactosa en CLRF. 22 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos - Motilidad en medio de SIM, y mediante preparación en gota pendiente. - Tinción diferencial para esporas. c) Si su cultivo puro es de bacilos Gram (-): - Fermentación de lactosa en Agar EMB. - Producción de indol, sulfuro y motilidad en medio de SIM. - Prueba de Rojo de Metilo y VogesProskauer en Caldo MR- VP. Prueba de utilización de citratos en medio de Simmons. - Prueba de descarboxilación de lisina y producción de sulfuro en el medio LIA. - Prueba de fermentación de carbohidratos, producción de sulfuro y gas en el medio TSI. - Producción de gelatinasa en Gelatina Nutritiva. - Producción de pigmentos en Caldo Nutritivo. 2. Inocular un tubo con caldo nutritivo a partir del cultivo puro bacteriano aislado en prácticas anteriores e incubar a 37°C por 24-48 h. 3. Investigar en la bibliografía el fundamento, observación e interpretación de las pruebas bioquímicas que le correspondan de acuerdo al tipo de microorganismo que tiene en su cultivo puro. 4. La segunda sesión de prácticas inocular los medios de cultivo para efectuar las pruebas bioquímicas a partir del cultivo en medio líquido preparado la sesión anterior, y llevar a incubación de 24-48 h a 37 °C. 5. La tercera sesión de prácticas observar e interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas. 6. Para las pruebas de indol, VogesProskauer, coagulasa y catalasa añada los reactivos necesarios previo a la observación (información obtenida en la consulta bibliográfica de la primera sesión de prácticas), también recuerde que antes de observar la prueba de la gelatinasa debe llevar a refrigeración. Disposición de residuos Una vez concluida la práctica y entregado su reporte, esterilizar todo el material empleado en autoclave. Los cultivos líquidos se desechan en el drenaje y el agar solidificado se deposita en bolsa roja y en el contenedor correspondiente. Si el agua del autoclave está sucia, vaciar y limpiar el autoclave. El agua se tira al drenaje. 23 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 9 Identificación de hongos filamentosos Objetivo Conocer la metodología empleada para lograr la identificación de un hongo filamentoso. Identificar el género al que pertenece el hongo filamentoso aislado en la Práctica No. 7. Introducción Es muy importante la identificación del género y la especie de un hongo filamentoso, ya que esto nos permite conocer las aplicaciones que se le pueden dar a este microorganismo. Por ejemplo, en el área biotecnológica, para saber que tipos de productos o enzimas puede producir, que contaminantes puede degradar, entre otras utilidades; si es de importancia médica, es necesaria su identificación para que el médico pueda hacer un diagnóstico más preciso y determinar el tratamiento a seguir. Además, si es fitopatógeno, la identificación es necesaria para determinar las acciones a seguir para controlar la infección en el cultivo de las plantas. Fundamento Su identificación se basa tanto en observaciones macroscópicas (crecimiento sobre una caja Petri) como microscópicas (generalmente, microcultivo de Henrici). Las observaciones se deben realizar diariamente para detectar los cambios de coloración (observación macroscópica) y cambios morfológicos (observación microscópica) que suceden durante el crecimiento del hongo y poder determinar las estructuras de importancia taxonómica. Estas observaciones también sirven para saber el tiempo que tarda el hongo en crecer, factor muy importante en un proceso industrial. Características observadas a nivel microscópico: - Hifas: septadas o no. - Micelio: claro u oscuro (ahumado), coloreado o incoloro. - Que se produzcan esporas sexuales o no, y en caso de que se produzcan, de que tipo: ascosporas, basidiosporas, oosporas o zigosporas. - Clase de esporas asexuales: esporangiosporas, conidios o artrosporas (oidios). - Caracteres de las cabezuelas de esporas: - Esporangios: Tamaño, color, forma y localización. - Conidios: conidios simples o en cadenas, formados por gemación o en masas; forma y disposición de las esterigmas o fiálides; apelmazamiento de los conidios. - Aspecto de los esporangióforos o conidióforos: - Simples o ramificados, tipo de ramificación. - Tamaño y forma de la columela apical del conidióforo. - Conidióforos aislados o en haces. - Aspecto microscópico de las esporas asexuales, especialmente los conidios: - Forma, tamaño, color. 24 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos - Lisos o rugosos. Mono, bi o multicelulares. Presencia de estructuras o esporas esenciales: Estolones, rizoides, células basales, clamidosporas, esclerocios, etc. Procedimiento Microcultivo de Henrici 1. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado unas gotas de PDA estéril y fundido previamente preparado. 2. Inocular el hongo que desea identificar en el centro del agar antes que éste solidifique y colocar encima un cubreobjetos. 3. Sellar tres lados de la preparación ya sea con parafina previamente fundida empleando un hisopo de madera, o bien, con esmalte para uñas. 4. Colocar la preparación con el extremo no sellado hacia abajo, en un vaso de precipitado que contenga algodón humedecido con agua (fig. 16). Figura 16. Microcutivo de Henrici 5. Incubar a 28 °C de 5 a 7 días 6. Realizar diariamente la observación microscópica de esta preparación en 10x y 40x, para detectar los cambios morfológicos que suceden durante el crecimiento del hongo, y poder identificar las estructuras de importancia taxonómica. Registrar y dibujar las observaciones. - Revise que algodón permanezca húmedo durante todo el tiempo que mantiene el hongo en incubación. Observación macroscópica 1. Vaciar 15-20 ml de PDA fundido en una capa Petri estéril y esperar a que solidifique. 2. Tomar con el asa esporas del hongo que se desea identificar y sembrar en la caja Petri por rasgadura en forma de X (figura 17). 25 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Figura 17 3. Incubar a 28 °C de 5 a 7 días. 4. Realizar diariamente las observaciones de la caja, describiendo el tamaño, forma y tipo de la colonia, así como las características del micelio, si es algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio, el color del micelio, de las esporas, cambios en el medio de cultivo, etc. 5. En el último día de observación, realizar la técnica de la cinta adhesiva para la observación microscópica del hongo con el fin de comprobar la pureza. Técnica de la cinta adhesiva para observación microscópica de hongos filamentosos 1. Colocar una gota de azul de lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio y desengrasado. 2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente de 3 a 5 cm y tomarlo por los extremos con el lado del pegamento hacia afuera. 3. Destapar la caja cerca del mechero y presionar suavemente con la cinta, la orilla de la colonia. 4. Colocar la cinta sobre la gota de azul de lactofenol, poniendo en contacto con el colorante las estructuras adheridas en la cinta. 5. Observar al microscopio con objetivos secos. Con los resultados obtenidos, consulte en bibliografía y reporte el género al que pertenece el hongo filamentoso que aisló en la práctica No. 7. Disposición de residuos Una vez concluida la práctica y entregado su reporte, esterilizar el cultivo puro, el microcultivo y la caja Petri en autoclave antes de desecharlos. Los residuos del montaje en azul de lactofenol se desechan en el contenedor de material de vidrio impregnado con sustancias peligrosas. 26 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 10 Curva de crecimiento microbiano Objetivo Conocer las etapas que se presentan al colocar un microorganismo en condiciones adecuadas para su desarrollo. Determinar el crecimiento microbiano mediante conteo de células y turbidimetría para obtener la curva de crecimiento. Calcular el tiempo de generación del microorganismo. Introducción Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de división celular hay aumento en el tamaño y peso de la célula. Mientras que cuando el crecimiento es seguido de división celular hay unaumento en el número de células. Es importante distinguir entre el crecimiento de células individuales y el crecimiento de poblaciones,ya que en los microorganismos debido a su pequeño tamaño no se hacen estudiosde crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones. El crecimiento de una población es el aumento del número de células como consecuencia deun crecimiento individual y posterior división. Éste ocurre de unamanera exponencial, a su vez, esto es una consecuencia del hecho de que cada célula se divide dando dos células hijas, las cuales al dividirse darán cada una doscélulas hijas, así es que en cada período de división la población se duplica. La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generación (g) y estese define como el tiempo que tarda una población en duplicarse. Si consideramos que entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo final (tf), han transcurrido n generaciones, entonces: g = tf-to/n Por tanto el número de células final (Nf) será n Nf= número de células iniciales x 2 A partir de esta fórmula obtendremos n y podremos sustituirla en g = tf-to/n n= log Nf–N0/ log 2 Para estimar el tiempo de generación es necesario determinar la cantidad de microorganismos al inicio y al final del período de incubación, y si se requiere obtener una curva de crecimiento es necesario estimar la cantidad de microorganismos en intervalos de tiempo definidos. Fundamento Los métodos directos de cuantificación de microorganismos permiten establecer la población total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rápidos aunque no es posible diferenciar a las células vivas de las muertas. Entre estos métodos tenemos la turbidimetría y el conteo de células. 27 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Turbidimetría La turbidimetría se basa en el hecho que la cantidad de microorganismos en una suspensión microbiana está directamente relacionada con la turbidez o densidad óptica. La metodología es útil con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamaño de unos cuantos micrómetros, características que les permiten mantenerse suspendidos y homogéneamente distribuídos; en tanto que con microorganismos de mayor tamaño y con aquellos productores de polisacáridos esta metodología no es adecuada. Conteo microscópico Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitómetros, cámara de Neubauer). Estas cámaras consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Fig. 18. Cámara de Neubauer y área de conteo Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el representar gráficamente el crecimiento microbiano. La curva presenta distintas fases: - Fase de latencia ó lag: período de adaptación de un microorganismo a un nuevo medio de cultivo. Fase exponencial o logarítmica: aumento regular de la población que se duplica a intervalos regulares de tiempo (td). Fase estacionaria: cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes, por acumulación de productos tóxicos, etc. Fase de declinación o muerte: el número de células que mueren es mayor que el número de células que se dividen. Las propiedades de un microorganismo dependerán de la fase de la curva en que se encuentren (por ejemplo la producción de antibióticos se lleva a cabo en la fase estacionaria). 28 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Procedimiento Primera sesión de la práctica 1. Por equipo, preparar 150 ml de caldo Dextrosa Sabouraud en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y 80 ml en un matraz de 125 ml. 2. Preparar 13 tubos con rosca de 16*100 para esterilizarlos. Etiquetarlos del 0 al 12. 3. Del matraz con los 80 ml de caldo, transferir 4.5 ml de caldo a cada uno de los tubos marcados con los números del 6 al 12. Los otros seis tubos se esterilizarán vacíos (tubos marcados del 0 al 5). 4. Envolver 15 pipetas para esterilizar, 1 de 10 ml, 7 de 5 ml y 7 de 1 ml. 5. Esterilizar los matraces y los tubos con medio por calor húmedo y del demás material de vidrio por calor seco. Segunda sesión 1. Inocular (8:00 a.m.) con un cultivo de Saccharomyces cerevisiae ajustado a una D.O. de 0.6 el matraz con los 150 ml de caldo. El inóculo se adicionará al 2.5-10% con respecto al volumen del medio. 2. Inmediatamente después de inoculado el matraz agitar y muestrear la primera muestra (tiempo 0). Tomar 3 ml de muestra, depositarlos en el tubo 0 y congelarlo. 3. Continuar muestreando cada hora 3 ml y depositándolos en el tubo correspondiente hasta la hora 5 (tubo 5), a partir de la hora 6 muestrear 0.5 ml cada hora y transferirlos al tubo correspondiente hasta la hora 12. Tercera sesión 1. Descongelar las muestras y homogenizar fuertemente. 2. De cada tubo, tomar 2 ml y leer en el espectrofotómetro a una Absorbancia de 600 nm. Para el blanco, tomar 2 ml de caldo del matraz de 125 ml. Si se requiere, diluir las muestras con caldo nutritivo para que la absorbancia sea menos a 1.0 y sea más fiable el resultado. 3. Utilizar la cámara de Neubauer para la cuenta directa al microscopio de cada una de las muestras. Diluir la muestra con caldo en caso de ser necesario. 4. Realizar gráficas donde relacione los valores de A600nm, UFC/ml y no. de células contra el tiempo de incubación. Considerar las diluciones realizadas a la hora de graficar los resultados. 5. Identifique las etapas de la curva de crecimiento en las gráficas obtenidas. 6. Determine el tiempo de generación. Disposición de Residuos: Las muestras se tiran al drenaje después de esterilizarse en autoclave. Las pipetas empleadas para los muestreos se esterilizan por calor húmedo antes de lavarse. Los cultivos se esterilizan en autoclave y se desechan en bolsa roja. 29 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 11 Esterilización por filtración. Conteo microbiano en membrana Objetivo El alumno utilizará otro método de esterilización para medios de cultivo con ingredientes termolábiles, y además utilizará este método para obtener el número de microorganismos presentes en una muestra. Introducción Aunque el calor es la forma más efectiva y común para la esterilización de medios de cultivo líquidos, en algunos casos no resulta aceptable su utilización en medios que contienen sustancias sensibles al calor, por lo cual se recurre a otros métodos como la filtración. Ésta se utiliza para esterilizar soluciones oleosas o líquidos termolábiles como aceites, soluciones oftálmicas e intravenosas que contienen antibióticos como principios activos, componentes de medios de cultivo celulares como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos). Se usan filtros de membrana, los cuales son discos de ésteres de celulosa con poros tan pequeños que impiden el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamaño de poro. Estos filtros son desechables. También se usan en el análisis microbiológico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua. Fundamento Los filtros eliminan las bacterias por retención debido al tamaño del poro del filtro, lo cual nos permite poner en evidencia el número de estas cultivándolas en un medio de cultivo adecuado donde se desarrollarán y nos indicarán el número de las mismas. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz del filtro debido a efectos electrostáticos. Cabe señalar que este método es aplicable en la cuantificación de microorganismos sólo en muestras que se sospecha una baja carga microbiana. Procedimiento 1. El equipo se envuelve en papel y se esteriliza por calor húmedo. 2. Montar el equipo de filtración (base del filtro, matraz y embudo) a un lado del mechero para seguir manteniendo la esterilidad, ver figura 19. 3. Desmontar el embudo y colocar la membrana filtrante con ayuda de unas pinzas de disección estériles (flameadas) y colocar el embudo. 4. Si se realizará un conteo microbiano se vacía un volumen medido de la muestra (normalmente 100 ml), o si se esterilizará un medio de cultivo solamente se vacía. 30 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Figura 19. Montaje del equipo de filtración 5. Encender la bomba de vacío y cuidar que la presión no rompa el filtro. Al terminar de pasar el líquido, apagar la bomba de vacío. 6. Si se realizará el conteo, desmontar con mucho cuidado el embudo y con unas pinzas flameadas (estériles) tomar la membrana y depositarla en una caja de Petri con medio de cultivo estéril solidificado. Llevar a incubar por 24 horas a 35°C y finalmente contar el número de colonias presentes. - Reportar como _____ UFC por el volumen de muestra filtrado. 7. Si se esterilizó un medio de cultivo, retirar el equipo de filtración del matraz Kitazato y transferir el medio estéril a un matraz Erlen Meyer previamente esterilizado. 8. Verificar que el filtrado se encuentra estéril, inoculando 1 ml del filtrado en condiciones de asepsia y pipeta estéril en un tubo con 4 ml de caldo nutritivo y llevar a incubar a 37°C por 24 – 48 h y observar. Debe permanecer transparente. Disposición de residuos La caja se envuelve en papel y se esteriliza como material sucio. Al finalizar el proceso de esterilización los restos de agar se desechan en bolsa roja al contenedor correspondiente. El etanol donde se colocaron las pinzas antes de flamear se deposita en el contenedor C, de solventes no halogenados. 31 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 12 Esterilización por agentes químicos Objetivo El alumno evaluará algunos agentes químicos utilizados para desinfectar y esterilizar materiales o superficies del laboratorio. Introducción La presencia de un agente químico que destruye o inhibe el desarrollo de microorganismos es útil debido a que en el laboratorio de microbiología se requiere eliminar todos los microorganismos presentes en una superficie o para poner en evidencia la presencia de otros microorganismos que nos permiten determinar el grado o nivel de limpieza en áreas o equipos que serán utilizados para procesar alimentos o productos que se puedan ver afectados por la presencia de microorganismos. Estos agentes antimicrobianos afectan al crecimiento de varias formas y se consideran: bacteriostáticos, cuando inhiben el crecimiento de los microorganismos pero no los destruyen y bactericidas, cuando evitan la proliferación e inducen la muerte. Esta clasificación puede ser arbitraria ya que un agente puede ser bacteriostático a una concentración y si éstase aumenta se convierte en bactericida y viceversa. Fundamento Para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los desinfectantes se pueden emplear diferentes técnicas: de dilución en tubo, de la placa de agar y del coeficiente fenólico. Esta práctica consiste en una modificación de la técnica de dilución en tubo. Se estandariza la cantidad de medio de cultivo y de inóculo, y se adicionan diferentes volúmenes del agente químico para determinar el menor volumen de agente antimicrobiano al cual se inhibe el crecimiento. El crecimiento se determina por la turbidez que se genera en el tubo después de 24 h de incubación de los tubos en las condiciones óptimas para el microorganismo de prueba. Debido a que algunos agentes antimicrobianos pueden provocar cierto grado de turbidez, se debe tener un control del medio de cultivo y el agente químico. Adicionalmente, se debe tener un control de cultivo, que nos permita identificar que la inhibición del crecimiento se debe al agente antimicrobiano y no a otro factor externo, por esto se debe tener un tubo en el que sólo se coloca el microorganismo de prueba en el medio de cultivo y se incuba en las mismas condiciones que los que tienen el agente antimicrobiano. Aquellos tubos que no presenten crecimiento (ausencia de turbidez) indican la dilución a la cual ese agente químico mata al microorganismo. utilizado como prueba cuando este microorganismo es expuesto al agente químico durante ese período de tiempo. 32 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Procedimiento 1. Para cada agente químico a probar, se preparan 5 tubos con 5 ml de medio de cultivo estéril. Se prepara un tubo adicional que se utilizará como control de crecimiento. 2. En un matraz se colocan 100 ml del agente químico a probar a la concentración deseada o recomentada por el fabricante y se le añade 1 ml del cultivo del microorganismo de prueba. 3. Se deja actuar por un minuto y al cumplirse este se toma una asada de muestra del matraz y se coloca en uno de los tubos con medio estéril. 4. Se repite este procedimiento para los 2, 5 y 10 minutos colocando una asada en un tubo con medio estéril. - Incluir un tubo con una asada del producto de prueba sin microorganismo para evaluar posible presencia de turbidez. - Los tiempos de muestreo se pueden muestrear de acuerdo al tiempo de acción recomendado por el fabricante del producto. 5. Incubar todos los tubos a 35° C por 24-48 horas. 6. Observar y registrar los resultados. 7. Comparar los resultados obtenidos para los diferentes agentes químicos. Disposición de residuos Los tubos y pipetas se esterilizan como material sucio. Al finalizar el proceso de esterilización los restos de las soluciones se tiran en el drenaje. 33 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Práctica No. 13 Esterilización por Luz Ultravioleta Objetivo El alumno conocerá y aprenderá el procedimiento para esterilizar superficies de mesas, áreas cerradas o instrumental de trabajo sensible a los agentes químicos utilizando luz U.V. Introducción Existen algunos materiales que no pueden esterilizarse por calor o filtración, por lo que se recurre a las radiaciones como método de esterilización. Sin embargo, no todas las radiaciones son efectivas para lograr este objetivo, como es el caso de las radiaciones UV. Éstas no son un método satisfactorio para la esterilización por su bajo poder de penetración, pero son muy efectivas para mantener mesas de trabajo o áreas cerradas como cuartos asépticos en condiciones idóneas para trabajar. Fundamento La radiación UV daña el material genético o DNA (ácido desoxirribonucleico) de las células. La luz UV penetra la pared y la membrana de la célula, provocando una reestructuración molecular a nivel del DNA, evitando así su reproducción. Si una célula no puede reproducirse, se considera muerta. En esta práctica se expondrán al efecto de la irradiación UV los microorganismos presentes en dos placas de Petri, una destapada y la otra cubierta, por un tiempo determinado. Posteriormente se incubarán en las condiciones adecuadas para determinar si hubo crecimiento. La placa que estará cubierta tiene como finalidad la demostración de la poca penetración de la luz UV. Procedimiento 1. Inocular 2 cajas de Petri, por estría en toda la superficie del agar utilizando un hisopo, con un cultivo de Escherichia coli de 24- 48 horas. 2. Colocar las cajas de Petri inoculadas, una destapada y la otra tapada por un espacio de 10 a 60 min, en la campana de flujo laminar con la luz UV encendida. Al terminar el tiempo de exposición tapar la caja y llevar a incubar las 2 cajas a 35° C por 24 horas. 3. Observar el crecimiento en las cajas y registrar sus resultados. 4. Comparar los resultados obtenidos en los diferentes tiempos de exposición Disposición de residuos El hisopo se manejará como material sucio. Las cajas se envuelven en papel y se esterilizan junto al hisopo en autoclave. Al finalizar el proceso de esterilización los restos de agar se depositan en bolsa roja en el contenedor correspondiente y el hisopo en bolsa roja en el contenedor de material no anatómico. La muestra problema una vez esterilizada se tira en el drenaje. 34 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos Bibliografía - Ausbel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A. y Struhl K. Short Protocols in Molecular Biology. Wiley & Sons Company. 1995. - Balbás P, Bolívar F. Ingeniería Genética y Biotecnología. Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos. Washington DC, 1989. th - Barnett, H. L. and Hunter B.B., Ilustrated Genera of Imperfect Fungi, 4 Edition, 1998. ISBN 0-89054-192-2. - Becker, J.M., Caldwell, G.A. and E. A. Zachgo. Biotechnology. A Laboratory nd Course. 2 - Edition. Academic Press. U.S.A., 1996. Bernabei, D. Seguridad. Manual para el laboratorio. E. Merck, Editor. Alemania, 1994. - Bimboim H.C. and J. Doly. Nucl. Acid. Res. 7.1513. 1979. - Goeddel David V. (Editor). Gene Expression Technology. Methods in Enzimology. Vol. 185. Academic Press Inc. 1991. - Kimmel A. R. and Breger S. L. Guide to Molecular Cloning Techniques. Academic Press Inc. 1987. - Krieg, N. R., J. G., Holt, et. al., Bergey´s. Manual of Systematic Bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore, U.S.A., 1994. ISBN 0-683-00603-7. - Izquierdo Rojo, M. Ingeniería Genética. Ediciones Pirámide, S.A. Madrid, 1993. - Madigan, M.T., J. M. Martinko y J. Parker. Brock Biología de los Microorganismos, 10ª. Edición. Pearson Prentice Hall, 2004. ISBN 84-2053679-2. - Material bibliográfico de BIO RAD Biotechnology Explorer, y especificaciones del kit de transformación. 166-0003EDU. - Molecular Cloning: A laboratory manual. Sambrook, Joseph and Russell, David W. 3rd Edition. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York. ISBN 0-87969-576-5. - Prescott, L.M., J.P. Harley y D.A. Klein. Microbiología. 4ª. ed. McGraw - Hill. Interamericana. 2003. ISBN 84-486-0261-7. - NOM-092-SSA1-1994.Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. 35 Manual de Técnicas y Procedimientos Microbiológicos - NOM-110-SSA1-1994. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. - Reglamento General de Laboratorios. Facultad de Ciencias Químicas. Monterrrey, N.L. 1998. - Rodríguez, Raymond L. and Tait, R. C. (1983). Recombinant DNA techniques: An Introdution. The Benjamín/Cummings Publishing Company, Inc. - Secuencia del DNA de Fago : - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&li st_uids=9626243&dopt=GenBank&WebEnv=0PH8cuFkdZ9t2Gf6aMZddo7556 %40264C181A78E77DD0_0184SID&WebEnvRq=1 Secuencia del pBR322: - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=208958 Secuencia del pGlo: http://srv2.lycoming.edu/~newman/bioinformatics/pglo.seq Smith, C. A. y Wood, E. J. Biología Molecular y Biotecnología. Addison-Wesley Iberoamericana. U.S.A. 1998. 36
